RU2321860C2 - Способ для определения уровня эндотоксина в растворе гемоглобина - Google Patents
Способ для определения уровня эндотоксина в растворе гемоглобина Download PDFInfo
- Publication number
- RU2321860C2 RU2321860C2 RU2005101339/15A RU2005101339A RU2321860C2 RU 2321860 C2 RU2321860 C2 RU 2321860C2 RU 2005101339/15 A RU2005101339/15 A RU 2005101339/15A RU 2005101339 A RU2005101339 A RU 2005101339A RU 2321860 C2 RU2321860 C2 RU 2321860C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- endotoxin
- hemoglobin
- solution
- lal
- determination
- Prior art date
Links
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 title claims abstract description 87
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 title claims abstract description 76
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 title claims abstract description 76
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 36
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 49
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 36
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims abstract description 27
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims abstract description 27
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 241000239218 Limulus Species 0.000 claims abstract description 5
- 108010072542 endotoxin binding proteins Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims abstract 4
- 239000003633 blood substitute Substances 0.000 claims description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 2
- 238000011138 biotechnological process Methods 0.000 claims 1
- 238000011082 depyrogenation Methods 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 abstract 1
- 231100000284 endotoxic Toxicity 0.000 abstract 1
- 230000002346 endotoxic effect Effects 0.000 abstract 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 13
- 238000012454 limulus amebocyte lysate test Methods 0.000 description 10
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 10
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 9
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 8
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 7
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 6
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 6
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 5
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 5
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 5
- 239000012480 LAL reagent Substances 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 108010093965 Polymyxin B Proteins 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000001879 gelation Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 229920000024 polymyxin B Polymers 0.000 description 3
- 229960005266 polymyxin b Drugs 0.000 description 3
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 3-[3-[3,5-dihydroxy-6-methyl-4-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]oxydecanoyloxy]decanoic acid;hydrate Chemical compound O.OC1C(OC(CC(=O)OC(CCCCCCC)CC(O)=O)CCCCCCC)OC(C)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(C)O1 HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010014824 Endotoxic shock Diseases 0.000 description 1
- 102000000429 Factor XII Human genes 0.000 description 1
- 108010080865 Factor XII Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 241000239220 Limulus polyphemus Species 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 1
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 206010054094 Tumour necrosis Diseases 0.000 description 1
- 206010047139 Vasoconstriction Diseases 0.000 description 1
- 206010000210 abortion Diseases 0.000 description 1
- 231100000176 abortion Toxicity 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000002473 artificial blood Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000005388 borosilicate glass Substances 0.000 description 1
- 230000036471 bradycardia Effects 0.000 description 1
- 208000006218 bradycardia Diseases 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000003889 chemical engineering Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 208000009190 disseminated intravascular coagulation Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 201000002364 leukopenia Diseases 0.000 description 1
- 231100001022 leukopenia Toxicity 0.000 description 1
- 150000002617 leukotrienes Chemical class 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000000873 masking effect Effects 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000011020 pilot scale process Methods 0.000 description 1
- 230000033885 plasminogen activation Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000005476 soldering Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 230000025033 vasoconstriction Effects 0.000 description 1
- 230000024883 vasodilation Effects 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/579—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving limulus lysate
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
Abstract
Изобретение относится к способу определения уровня эндотоксина в растворе окрашенных белков, более конкретно к способу количественного определения эндотоксина в 10% растворе гемоглобина. Способ определения уровня эндотоксина в растворе гемоглобина включает применение кинетического турбидиметрического LAL (Limulus amoebocyte lysate) анализа при длине волны 650 или 660 нм с использованием оптического фильтра, при этом он содержит следующие стадии модификации образца: а) разведение 10% вес/объем раствора гемоглобина до концентрации 10 мг/мл; b) инкубирование полученного разведения в пределах температуры 60-80°С в течение 10-20 минут; с) разведение инкубированного раствора LAL-водой вплоть до концентрации 2,5 мг/мл; d) тестирование полученного раствора с применением кинетического турбидиметрического LAL анализа при длине волны 650 или 660 нм с использованием оптического фильтра; е) считывание полученных концентраций эндотоксина со стандартной кривой, полученной для кинетического турбидиметрического LAL анализа. Изобретение позволяет разработать способ определения уровня эндотоксина в растворе окрашенных белков, при помощи которого преодолеваются недостатки известных до сих пор методов, т.к. белки, в том числе и гемоглобин, в основном интерферируют с тест-системой и дают ложноположительные или ложноотрицательные результаты. 3 з.п. ф-лы, 3 табл., 2 ил.
Description
Область техники
Изобретение является способом и относится к определению уровня эндотоксина в растворе окрашенных белков, более конкретно относится к способу количественного определения эндотоксина в 10% растворе гемоглобина. Способ является простым, обладает отличной чувствительностью и воспроизводимостью и является существенным то, что его можно применить в растворе гемоглобина несмотря на мешающие факторы.
Техническая проблема
Технической проблемой в настоящем изобретении является обеспечение такого способа определения уровня эндотоксина в растворе окрашенных белков, при помощи которого преодолеваются недостатки известных до сих пор методов.
Учитывая то, что пациенту с большой кровопотерей при инфузии "искусственной крови" следует ввести большой объем раствора гемоглобина, загрязнение гемоглобина бактериальными липополисахаридами (ЛПС) может быть основным препятствием для клинического применения раствора этого белка в качестве "кровезаменителя". Определение эндотоксина тестом "Limulus amoebocyte lysate-LAL" в растворах белков осложнено тем фактом, что белки, в том числе и гемоглобин, в основном интерферируют с тест-системой и дают ложноположительные или ложноотрицательные результаты.
Эндотоксины представляют собой самые значительные пирогены в фармацевтической промышленности. Это липополисахаридные (ЛПС) комплексы большого молекулярного веса в составе внешней мембраны грамотрицательных бактерий, обладающие витальной функцией в выживании бактерий. ЛПС является единым гликолипидом, обнаруженным только во внешней мембране грамотрицательных бактерий. Учитывая их связь с грамотрицательными бактериями, эндотоксины распространены повсюду, как и бактерии: в воздухе, воде и пище. Биологические эффекты эндотоксина разнообразны, и они представлены в таблице.
| Таблица 1 Биологические действия и эффекты эндотоксина (Wako Pure Chemical Industries Ltd. Biological activities, 1992, In: Technical Bulletin: Endotoxin Test System, p.2). |
|
| А. В организме Пирогенность |
Аборт |
| Летальная токсичность | Потеря массы тела |
| Активность Швартцмана Эндотоксический шок |
Индукция неспецифичной устойчивости к инфекциям |
| Лейкопения | Индукция интерферонов |
| Агрегация тромбоцитов | Активность некроза опухоли |
| Понижение уровня глюкозы в крови | Адъювантная активность Индукция толерантности к эндоктосинам |
| Вазоконстрикция и вазодилятация | |
| В. В клетках Активация макрофагов |
С. В молекулах Активация комплементов |
| Созревание предшественников Т- и В-лимфоцитов Митогенная активность В-лимфоцитов |
Активация фактора XII |
| Продуцирование медиаторов | Активация плазминогенов |
| интерферона, фактора некроза опухоли, простагландина, колоностимулирующего фактора, лейкотриенов, интерлейкина-1 | Гелеобразование лизата Limulus |
Высокий уровень чистоты раствора белков для парентерального применения необходим, так как в клинической практике даже очень небольшие количества эндотоксина могут вызвать у пациента многочисленные побочные последствия. 18 января 1980 года (38 FR 1404) лизат амебоцита краба-мечехвоста - Limulus polyphemus признан FDA биологическим продуктом, который можно использовать для определения эндотоксина вместо теста на кроликах. Тест на пирогенность, проводимый на кроликах, пригоден для применения в фармацевтической промышленности, так как кролики показывают одинаковую чувствительность к ЛПС, как и люди, и с помощью данного теста можно обнаружить различные виды пирогенов. Основным недостатком данного теста являются проблемы его проведения, использование подопытных животных со всеми их характеристиками и высокая стоимость. К настоящему времени разработаны многочисленные тест-системы для детекции эндотоксина, но только LAL-тест является удовлетворящей альтернативой USP (United States Pharmacopoeia № 25, 2002) тесту на кроликах.
Сущность LAL-теста состоит в ферментативной реакции, происходящей между лизатами и эндотоксином, при этом образуется помутнение, т.е. гель. Преимущества LAL-текста, из-за которых его все чаще используют в фармацевтической промышленности: высокая чувствительность, очень быстрое проведение теста и низкая стоимость. Кроме этого, тест на кроликах, традиционный метод для детекции пирогенов, дает частичные результаты, так как наблюдаются только эффекты пирогенов. Тест на кроликах не может дать данных о дополнительных осложнениях, которые могут появиться вследствие освобождения эндотоксинов в катаболических процессах маскирующего их компонента или при накоплении эндотоксинов.
Процесс выделения гемоглобина из старых эритроцитов и его очистки, описанный в патенте DE 19707508, Bugarski и Dovezenski, "Verfahren zur Herstellung von Hemoglobin", 31.05.2000 года, который находится в собственности "Хемофарм Концерн", разработан для его применения в качестве носителя кислорода, т.е. "кровезаменителя". Гемоглобин, полученный данным способом, имеет хорошие характеристики относительно связывания, переноса и освобождения кислорода и является потенционально идеальным заменителем эритроцитов. Получением "кровезаменителя" занимается несколько компаний в мире, но в клинической практике такие препараты гемоглобина еще не используются из-за значительных проблем с токсичностью: гипертензия, брадикардия, лихорадка, диссеминированное внутрисосудистое свертывание и т.п. Повышение биологической активности ЛПС под влиянием гемоглобина представляет серьезный клинический риск. Является ли токсичность следствием свойств гемоглобина самого по себе или возможного наличия контаминантов (стромальные фосфолипиды или эндотоксины), еще не выяснено полностью и данные литературы достаточно противоречивы. Например, при введении кроликам гемоглобина, контаминированного ЛПС, он приводит к повышению смертности по сравнению с чистым гемоглобином, что указывает на роль эндотоксина в in vivo токсичности гемоглобина. Кроме этих результатов существуют данные о синергической токсичности ЛПС и гемоглобина.
В ходе работы по выделению и очистке гемоглобина из старых эритроцитов необходимо проводить оперативный контроль в течение процесса производства и контроль окончательного препарата гемоглобина на возможность наличия/отсутствия эндотоксина. Определение эндотоксина в окончательном препарате гемоглобина можно выполнять при проведении на кроликах теста на пирогенность, но количественное определение уровня эндотоксинов возможно только при применении LAL-теста.
Уровень эндотоксина выражается в единицах эндотоксина (Endotoxin Unit, EU - Эндотоксиновая единица, ЭЕ), и это активность, которую имеет 0,1 нг референсного стандарта US, серия EC-6 (FDA), т.е. серия G (USP 25). В одном флаконе EC-6 содержится 10 000 ЭЕ.
Уровень техники
Определение уровня эндотоксина в растворе гемоглобина является значимой проблемой, преимущественно для компаний, занимающихся получением "кровезаменителей" на основе гемоглобина. Многолетнее сотрудничество между Службой исследования "Хемофарм Концерн", Институтом медицинского исследования и Кафедрой химической инженерии в проекте "Кровезаменитель на основе гемоглобина" привело к созданию потенциально успешного "кровезаменителя". Результатом данного сотрудничества является патент DE 19707508, Bugarski и Dovezenski, Verfahren zur Herstellung von Hemoglobin, 31.05.2000 г.
Несколько биотехнологических компаний в мире тоже занимаются проблематикой "кровезаменителя", и судя по доступной литературе у них имеются разработанные методы для определения эндотоксина в растворах гемоглобина. Но в отличие от настоящего изобретения во всех указанных работах, раствор гемоглобина не анализировали в аспекте "коммерческого" препарата, т.е. нигде не применяли (или это не было упомянуто) требования фармакопей (European Pharmacopoeia № IV, раздел 2.6.14, 2002 г. и USP № 25, раздел 85, 2002), относящиеся к применению LAL-теста у коммерческих препаратов: предел эндотоксина, максимальное допустимое разбавление и положительный контроль продукта.
В работе Roth et al., "Production of modified crosslinked cell-free hemoglobin for human use: the role of quantitative determination of endotoxin contamination", 1993, Transfusion, 33(11):919-24, для тестирования раствора гемоглобина использовали способ LAL гель-сгусток. Определяли предел концентраций гемоглобина 1 мкг/мл - 100 мг/мл, что соответствует концентрациям растворов, тестированных в опытах авторов изобретения, но задается вопрос - как можно отличить ситуацию, в которой гемоглобин усиливает тест, от ситуации, в которой гемоглобин контаминирован эндотоксинами - в обеих ситуациях получается положительная реакция.
В работе Kaca et al., "Human hemoglobin increases the biological activity of bacterial lipopolysaccharides in activation of Limulus amebocyte lysate and stimulation of tissue factor production by endothelial cells in vitro, 1994, Journal of Endotoxin Research, 1, 243-252", использованы способы LAL гель-сгусток и хромогенный. Тестировали растворы гемоглобина с концентрациями 0,01-1 мг/мл, инкубация смеси образец-лизат продолжалась 90 минут, а поглощение измеряли при длине волны 620 нм. Самая высокая тестированная концентрация (1 мг/мл), ниже концентраций, тестированных в опытах авторов изобретения, что значительно облегчает проведение испытаний.
В работе Kaca et al., "Hemoglobin, a newly recognized lipopolysaccharide (LPS)-binding protein that enhances LPS biological activity", 1994, J. Biol. Chem. 7. 269(40):25078-84, использованы способы LAL гель-сгусток и хромогенный. Тестировали растворы гемоглобина концентрациями 0,2-2 мг/мл, а поглощение измеряли при длине волны 405 нм. Самая высокая тестированная концентрация (2 мг/мл), чуть более высокая, чем в предыдущей работе, но тем не менее более низкая, чем концентрация, которую следует тестировать по требованиям USP 25 и EP IV.
В работе Winslow et al., "Pilot-scale preparation of hemoglobin solutions", 1994, In: Methods in Enzimology, Vol.231. 3-16, использовали LAL-кинетический турбидиметрический анализ. Для получения стандартной кривой вместо LAL-воды использовали раствор гемоглобина, а потом с полученной таким образом кривой отсчитывали концентрации эндотоксина в тестированных образцах гемоглобина. Поскольку подробности способа не указаны, не выяснено с какими концентрациями гемоглобина проводились тесты.
В работе Tani et al., "Endotoxin removed from hemoglobin solution using Polymyxin-B immobilized fibre (PMX-F) followed by a new turbidimetric endotoxin assay" (1992, Biomat., Art. Cells & Immob. Biotech. 20(2-4), 457-462), использован LAL кинетический турбидиметрический анализ. Для получения стандартной кривой вместо LAL-воды использовали раствор гемоглобина и поглощение измеряли при длине волны 660 нм. Потом с полученной таким образом кривой отсчитывали концентрации эндотоксина в тестированных образцах гемоглобина. Данный подход больше всех похож на подход, использованный в настоящем изобретении, но вместо инкубации здесь использовали полимиксин в, обладающий большей аффинностью к эндотоксинам, чем гемоглобин, и поэтому он связывает их в растворе.
В патенте US 005084558 A, Rausch и Feola, 1992, «Extra pure semi-synthetic blood substitute», в способе определения «кровезаменителя», для тестирования эндотоксина использовали хромогенный метод в 10% растворе гемоглобина (10 г/100 мл). Поскольку подробности не указаны, то не выяснено, соблюдены ли при проведении испытания требования USP 25 и ЕР IV.
Краткое описание фигур
На фиг.1 представлена гистограмма восстановления положительного контроля продукта для различных разведении образца гемоглобина, тестированных LAL кинетическим турбидиметрическим анализом при длине волны 650 нм с использованием соответствующего фильтра.
На фиг.2 представлена гистограмма восстановления положительного контроля у продукта для различных разбавлении образца гемоглобина, тестированных LAL кинетическим турбидиметрическим анализом при длине волны 660 нм с использованием соответствующего фильтра.
Описание решения технической проблемы
Изобретение относится к способу количественного определения эндотоксина, который является простым в рутинном применении, обладает отличной чувствительностью и воспроизводимостью и, что важно, его можно применить на образцах гемоглобина несмотря на мешающие факторы. Для количественного анализа уровня эндотоксинов в образцах гемоглобина был использован кинетическо-турбидиметрический LAL (Limulus amoebocyte lysate) анализ, т.е. анализ с использованием лизата амебоцитов Limulus, при длинах волн 650 и 660 нм. Эти длины волн выбраны исходя из того факта, что гемоглобин не поглощает свет в этой части спектра и, следовательно, не может влиять на результаты LAL анализа. Кроме того, в одной из работ уровня техники (Tani et al., Endotoxin removed from hemoglobin solution using Polymyxin-B immobilized fibre (PMX-F) followed by a new turbidimetric endotoxin assay (1992, Biomat., Art. Cells&Immob. Biotech. 20 (2-4), 457-462)), уровень эндотоксинов определен при длине волн 660 нм. В этой связи появилась потребность проведения испытаний при длине волн 650 и 660 нм с целью установления возможных различий в эффективности теста при этих двух длинах волн (пример 1 и пример 2).
Все процедуры LAL-теста выполнены по рекомендациям производителя аппаратов и реактивов (Charles River Endosafe) так, чтобы удовлетворить требованиям фармакопеи (ЕР IV, раздел 2.6.14, 2002):
- Лабораторная посуда
Лабораторная посуда, использованная в опытах, изготовлена из боросиликатного стекла, не абсорбирующего эндотоксин (C.R. Endosafe). После использования пробирки и пипетки промывают дистиллированной водой, высушивают и проводят депирогенизацию в фольге при температуре 180°С в течение 4 часов (endotoxin-free). Реакционные кюветы являются одноразовыми и после использования их выбрасывают. Вода, используемая в опытах, является качества LAL Reagent Water (LRW), что значит, что она имеет ≤0,01 ЭЕ/мл (сертификат C.R. Endosafe).
- Совместимость контрольного стандарта эндотоксинов и лизатов
В работе использованы совместимые серии контрольного стандарта эндотоксина (CSE) и LAL реактива (лизатов) производителя "C.R. Endosafe". Совместимость подтверждается сертификатами производителя, в которых указан и способ растворения стандарта эндотоксина для достижения соответствующей начальной концентрации по отношению к данному лизату. Лизаты растворяли по инструкциям производителя.
- Способ
Концентрацию эндотоксина в растворе гемоглобина в образце определяли с применением кинетического турбидиметрического анализа LAL-теста. Кинетический турбидиметрический анализ является способом LAL-теста, в котором количество эндотоксина в образце определяется на основании времени, необходимого для достижения смесью образец-лизат заранее заданной степени помутнения (заданное турбидиметрическое время).
- Аппаратура
В опытах уровень эндотоксина определяли с использованием аппарата ATi-320 производителя "C.R. Endosafe". Аппарат состоит из сухого инкубатора (37±1°C) с источником света, фотодетектора и комплекта программного обеспечения для анализа данных (ATi-Ana). Стандартную кривую делали с контрольным стандартом эндотоксина (CSE) в диапазоне концентраций 1 ЭЕ/мл-0,01 ЭЕ/мл. Продолжительность теста 60 минут, начальное значение OD-0,02, и при использовании соответствующих фильтров измеряли поглощение при длинах волн 650 и 660 нм. После завершения теста анализ данных выполняли посредством программного обеспеченя ATi-Ana, производителя "C.R. Endosafe".
- Достоверность стандартной кривой
Стандартную кривую получали каждый день и с нее отсчитывали значения эндотоксина в образцах. Стандартную кривую считали достоверной, если она удовлетворяла следующим критериям:
- коэффициент корреляции полученной кривой r≤-0,98;
- наклон кривой в пределах -0,1 и -1,0;
- максимальное допустимое отклонение каждого отдельного значения стандарта эндотоксина по отношению к среднему значению данной концентрации составляет ≤10%.
- Максимальное допустимое разведение
Максимальное допустимое разведение (MVD) является самым большим разбавлением, которое можно применить на образце с целью удаления мешающих факторов, но чтобы возможно присутствующие в образце эндоксины не разбавились настолько, чтобы тест-система не могла их обнаружить. Значение MVD вычисляли по следующей формуле:
MVD = концентрация продукта · K/λ · M
Максимальное допустимое разведение для 10%-ного раствора гемоглобина тестировали по отношению к стандартной кривой, последняя точка (λ) 0,01 ЭЕ/мл которой составляет 40. Это значит, что тестированный образец начальной концентрацией 10 г/100 мл можно разбавлять 40 раз (чтобы преодолеть влияние мешающих факторов), а чтобы возможные присутствующие в образце эндотоксины не разбавились более пределов детекции тест-системы.
- Влияние мешающих факторов у образцов в LAL-тесте
Чтобы результаты теста на бактериальные эндотоксины были достоверными, необходимо проверить влияние мешающих факторов раствора гемоглобина в LAL-реакции. Влияние является переменным и часто очень трудно установить его самые важные механизмы. Влияние может проявиться как ингибирование (чувствительность теста по некоторым причинам уменьшена, и это вызывает удлинение ожидаемого времени гелеобразования) или как усиление (приводит к повышению чувствительности теста и понижению времени гелеобразования). С целью определения влияния к образцу прибавляют определенное количество эндотоксина (положительный контроль продуктов, англ. spike - спайк) и потом наблюдают за способностью тест-системы обнаружить дополнительное количество эндотоксина. Параллельно тестируют и чистые ("без спайка") образцы. Если средняя концентрация эндотоксина в положительном контроле образца (спайке), вычисленная по отношению к стандартной кривой и уменьшенная на значение измеримых эндогенных эндотоксинов в чистом образце, в пределах 50-200% по отношению к известной концентрации положительного контроля продукта, образец не влияет на LAL-тест. Данное среднее значение эндотоксина называется восстановление спайка (spike recovery), и оно является основным критерием достоверности LAL-теста для определенного образца.
Значение спайка для количественной техники, т.е. количество CSE, прибавляемое к образцу, определяют на основании Pass/Fail Cutoff (PFC) значения:
PFC = EL × концентрация продукта/r
где:
EL (ЭЕ/мл) - предельная концентрация эндотоксина в продукте по требованиям фармакопеи (EP IV); поскольку предельная концентрация эндотоксина для гемоглобина не определена фармакопеей, ее вычисляют следующим способом:
EL = K/M = 5,95 ЭЕ/г гемоглобина = 0,595 ЭЕ/мл раствора гемоглобина
где:
K - максимально допустимая доза эндотоксина для людей; для парентеральных препаратов K=5,0 М.Е/кг;
M - максимальная доза препарата/кг массы тела, которую назначают в течение одного часа; для 10% раствора гемоглобина данная доза соответствует дозе, назначаемой кроликам в тесте на пирогенность и составляет 0,84 г/кг массы тела;
концентрация продукта - в случае гемоглобина, дозу которого определяют как массу по отношению к массе тела, концентрация соответствует значению 100 мг/мл;
r - разбавление продукта, для неразбавленного продукта составляет 1.
Если значение PFC≤1,0, значение спайка должно находиться в пределах 0,1-0,5 ЭЕ/мл; если значение PFC>1,0, значение спайка должно находиться в диапазоне 1,0-5,0 ЭЕ/мл. Поскольку для 10% раствора гемоглобина PFC<1,0, ко всем образцам гемоглобина, тестированным кинетическим турбидиметрическим и хромогенным методами, прибавляли по 0,5 ЭЕ/мл.
Пример 1. Кинетический турбидиметрический метод, поглощение при длине волны 650 нм
Из CSE (выделенный из Е. coli, серия ЕС-5) с начальной концентрацией 2000 ЭЕ/мл, приготовлена серия разбавлении CSE в LRW с пределами концентраций 5,0-1,0-0,5-0,1-0,01 ЭЕ/мл. Концентрации 1,0-0,01 ЭЕ/мл использовали для получения стандартной кривой с поглощением при длине волны 650 нм при применении соответствующего фильтра, а концентрацию 5 ЭЕ/мл - для образцов, у которых проводят «спайк». Полученная стандартная кривая удовлетворяет таким же критериям линейности, как и стандартная кривая при длине волны 405 нм.
10%-ные растворы (10 г/100 мл = 100 мг/мл) гемоглобина для тестирования (НВ/1 и НВ/2) разбавляют в 10 раз (обозначены соответственно как НВ/1/10 и НВ/2/10). Эти растворы затем инкубируют при температуре 60-80°С в течение 10-20 минут. Инкубированный раствор НВ/1/10 разбавляют до общей степени разведения в 40 раз, что соответствует концентрации 2,5 мг/мл. Инкубированный раствор НВ/2/10 разбавляют до следующих конечных разведении: 20 (5,0 мг/мл), 40 (2,5 мг/мл), 80 (1,25 мг/мл) и 160 (0,625 мг/мл). Все серии разбавлении белков проводят с LRW так, что степень разведения в шаге не превышает 1:10. По 0,1 мл HB/1/1, HB/1/40, HB/2/1, HB/2/10, HB/2/20, HB/2/40, HB/2/80 и HB/2/160 помещают в 4 кюветки для каждой пробы. В две кюветки для всех образцов прибавляют 0,01 мл CSE с концентрацией 5,0 ЭЕ/мл, чтобы получить значение спайка 0,5 ЭЕ/мл. Затем во все кюветки прибавляют по 0,1 мл соответствующего лизата. Все кюветки помещают в аппарат для перемешивания и потом помещают в аппарат ATi-320, в котором их инкубируют при 37±1°C в течение 60 минут при длине волны 650 нм, используя соответствующий фильтр.
Уровень эндотоксина в различных разведениях гемоглобина определяют считыванием со стандартной кривой. Результаты теста образца гемоглобина представлены в таблице 2.
| Таблица 2 | ||||
| Разведение | Восстановление спайка (%) | Средняя концентрация (ЭЕ/мл) | CV | |
| Образец | ||||
| HB/1/1 | 1 | ---- ---- |
### 0,0007 |
### 14,487 |
| 3,6 7,5 |
0,0181 0,0380 |
11,648 21,326 |
||
| HB/1/40 | 40 | ---- ---- |
### ### |
### ### |
| 73,7 70,5 |
14,7344 14,6383 |
3,064 0,000 |
||
| HB/2/1 | 1 | ---- | ### | ### |
| 0,0 | ### | ### | ||
| HB/2/10 | 10 | ---- | 0,9819 | 1,003 |
| 36,4 | 2,8007 | 1,263 | ||
| HB/2/20 | 20 | ---- | 1,1749 | 5,000 |
| 69,8 | 8,1500 | 2,800 | ||
| HB/2/40 | 40 | ---- ---- |
1,3612 0,8878 |
2,816 1,043 |
| 60,6 80,62 |
13,4758 17,5201 |
1,252 2,857 |
||
| HB/2/80 | 80 | ---- | 3,7812 | 0,000 |
| 69,0 | 31,3862 | 1,386 | ||
| HB/2/160 | 160 | ---- | 17,9241 | 26,541 |
| 119,7 | 113,683 | 11,575 | ||
Учитывая то, что по MVD 10% раствор гемоглобина можно разбавлять не более 40 раз, то результаты, показывающие удовлетворящее восстановление спайка для разведения в 40 раз, можно считать достоверными.
Пример 2.
Кинетический турбидиметрический метод, поглощение при длине волны 660 нм
Из CSE (выделенный из E. coli, серия EC-5) с начальной концентрацией 2000 ЭЕ/мл приготовлена серия разбавлений CSE в LRW с пределами концентраций 5,0-1,0-0,5-0,1-0,01 ЭЕ/мл. Концентрации 1,0-0,01 ЭЕ/мл использовали для получения стандартной кривой с поглощением при длине волны 660 нм при применении соответствующего фильтра, а концентрацию 5 ЭЕ/мл - для образцов, у которых проводят спайк. Полученная стандартная кривая удовлетворяет таким же критериям линейности, как и стандартная кривая при длине волны 405 нм.
10%-ные растворы (10 г/100 мл = 100 мг/мл) гемоглобина для тестирования (НВ/1 и НВ/2) разбавляют в 10 раз (обозначены соответственно как НВ/1/10 и НВ/2/10). Эти растворы затем инкубируют при температуре 60-80°С в течение 10-20 минут. Инкубированный раствор НВ/1/10 разбавляют до общей степени разведения в 40 раз, что соответствует концентрации 2,5 мг/мл. Инкубированный раствор НВ/2/10 разбавляют до следующих конечных разведении: 20 (5,0 мг/мл), 40 (2,5 мг/мл) и 160 (0,625 мг/мл). Все серии разбавлении белков проводят с LRW так, что степень разведения в шаге не превышает 1:10. По 0,1 мл НВ/1/1, НВ/1/40, НВ/2/1, НВ/2/10, НВ/2/20, НВ/2/40 и НВ/2/160 помещают в 4 кюветки для каждой пробы. В две кюветки для всех образцов прибавляют 0,01 мл CSE с концентрацией 5,0 ЭЕ/мл, чтобы получить значение спайка 0,5 ЭЕ/мл. Во все кюветки потом прибавляют по 0,1 мл соответствующего лизата. Все кюветки помещают в аппарат для смешивания и затем помещают в аппарат ATi-320, в котором их инкубируют при 37±1°С в течение 60 минут при длине волны 660 нм, используя соответствующий фильтр.
Уровень эндотоксина в различных разведениях гемоглобина определен считыванием со стандартной кривой. Результаты теста образца гемоглобина представлены в таблице 3.
| Таблица 3 | ||||
| Разведение | Восстановление спайка (%) | Средняя концентрация (ЭЕ/мл) | CV (%) | |
| Образец | ||||
| НВ/1/1 | 1 | ---- | ### | ### |
| 1,1 | 0,0056 | 20,011 | ||
| НВ/1/40 | 40 | ---- | ### | ### |
| ---- | ### | ### | ||
| 79,3 | 15,8632 | 1,339 | ||
| 99,7 | 0,0056 | 20,011 | ||
| НВ/2/1 | 1 | ---- | 0,0760 | ### |
| 40,4 | 0,2779 | 0,000 | ||
| НВ/2/10 | 10 | ---- | 3,0387 | 6,076 |
| 21,0 | 4,0893 | 4,638 | ||
| НВ/2/20 | 20 | ---- | 7,4377 | 29,832 |
| 3,1 | 7,7489 | 0,000 | ||
| НВ/2/40 | 40 | ---- | 0,8878 | 1,043 |
| ---- | 2,2901 | 25,743 | ||
| 55,9 | 12,0734 | 3,669 | ||
| 64,4 | 15,1664 | 0,000 | ||
| НВ/2/160 | 160 | ---- | 10,8896 | 13,232 |
| 69,8 | 66,7553 | 6,300 | ||
Учитывая то, что по MVD 10% раствор гемоглобина можно разбавлять не более 40 раз, то результаты, показывающие удовлетворяющее восстановление спайка для разведения в 40 раз, можно считать достоверными.
На основании результатов, представленных в Примерах 1 и 2, ясно, что при соответствующих указанных модификациях уровень эндотоксинов в растворе гемоглобина можно определить с одинаковой точностью и надежностью при обоих длинах волн, т.е. 650 и 660 нм.
Claims (4)
1. Способ определения уровня эндотоксина в растворе гемоглобина, включающий применение кинетического турбидиметрического LAL - Limulus amoebocyte lysate анализа при длине волны 650 нм или 660 нм с использованием оптического фильтра, отличающийся тем, что он содержит следующие стадии модификации образца:
a) разведение 10% вес/объем раствора гемоглобина до концентрации 10 мг/мл;
b) инкубирование полученного разведения в пределах температуры 60-80°С в течение 10-20 мин;
c) разведение инкубированного раствора LAL-водой вплоть до концентрации 2,5 мг/мл;
d) тестирование полученного раствора с применением кинетического турбидиметрического LAL анализа при длине волны 650 нм или 660 нм, с использованием оптического фильтра;
e) считывание полученных концентраций эндотоксина со стандартной кривой, полученной для кинетического турбидиметрического LAL анализа.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что его используют для определения уровня эндотоксина в препаратах типа «кровезаменитель» на основе гемоглобина.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что его используют для определения уровня эндотоксина при оперативном контроле производства и очистки гемоглобина.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что его используют для оценки депирогенизации в биотехнологических процессах, в которых осуществляется продуцирование белков.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| YUP047202 | 2002-06-21 | ||
| YUP-472/02 | 2002-06-21 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2005101339A RU2005101339A (ru) | 2005-06-10 |
| RU2321860C2 true RU2321860C2 (ru) | 2008-04-10 |
Family
ID=30001200
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2005101339/15A RU2321860C2 (ru) | 2002-06-21 | 2003-03-11 | Способ для определения уровня эндотоксина в растворе гемоглобина |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| AU (1) | AU2003215035A1 (ru) |
| RU (1) | RU2321860C2 (ru) |
| WO (1) | WO2004001419A1 (ru) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100383528C (zh) * | 2004-07-02 | 2008-04-23 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种通过测定浊度值来进行细菌内毒素检查的方法 |
| CN109030486A (zh) * | 2018-09-28 | 2018-12-18 | 润方（北京）生物医药研究院有限公司 | 一种血红蛋白样品的细菌内毒素检测方法 |
| CN115944293B (zh) * | 2023-03-15 | 2023-05-16 | 汶上县人民医院 | 一种基于神经网络的肾脏透析用血红蛋白水平预测系统 |
| CN118033138A (zh) * | 2024-02-06 | 2024-05-14 | 天津市医疗器械质量监督检验中心 | 胶原蛋白海绵的细菌内毒素含量的检测方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5480866A (en) * | 1992-02-19 | 1996-01-02 | Duke University | Hemoproteins for inhibition of nitric oxide-mediated hypotension and septic shock |
| RU2101702C1 (ru) * | 1995-06-14 | 1998-01-10 | Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им.акад.И.П.Павлова | Способ определения реактивного лизиса клеток |
| US5905141A (en) * | 1986-11-10 | 1999-05-18 | Biopure Corporation | Ultra pure hemoglobin solutions and blood substitutes |
| RU2147238C1 (ru) * | 1998-05-13 | 2000-04-10 | Институт клинической иммунологии СО РАМН | Способ лечения бактериальной инфекции |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5084558A (en) * | 1987-10-13 | 1992-01-28 | Biopure Corporation | Extra pure semi-synthetic blood substitute |
| CA2339274C (en) * | 1998-08-10 | 2008-11-04 | University Of Manitoba | Artificial test soil |
-
2003
- 2003-03-11 AU AU2003215035A patent/AU2003215035A1/en not_active Abandoned
- 2003-03-11 WO PCT/YU2003/000007 patent/WO2004001419A1/en not_active Ceased
- 2003-03-11 RU RU2005101339/15A patent/RU2321860C2/ru active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5905141A (en) * | 1986-11-10 | 1999-05-18 | Biopure Corporation | Ultra pure hemoglobin solutions and blood substitutes |
| US5480866A (en) * | 1992-02-19 | 1996-01-02 | Duke University | Hemoproteins for inhibition of nitric oxide-mediated hypotension and septic shock |
| RU2101702C1 (ru) * | 1995-06-14 | 1998-01-10 | Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им.акад.И.П.Павлова | Способ определения реактивного лизиса клеток |
| RU2147238C1 (ru) * | 1998-05-13 | 2000-04-10 | Институт клинической иммунологии СО РАМН | Способ лечения бактериальной инфекции |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| TANI et al. Endotoxin removed from hemoglobin solution using Polymyxin-B immobilized fibre (PMX-F) followed by a new turbidimetric endotoxin assay. Biomater. Artif. Cell Immobilization Biotechnol. 1992; 20 (2-4): 457-462. * |
| YOKOTA M. et al. A simple turbidimetric time assay of the endotoxin in plasma. J. of Biochemical and Biophysical Methods. Vol.18, no. 2, 1989, p.97-104. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2003215035A1 (en) | 2004-01-06 |
| RU2005101339A (ru) | 2005-06-10 |
| WO2004001419A1 (en) | 2003-12-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11906521B2 (en) | Method of detecting an endotoxin using limulus amebocyte lysate substantially free of coagulogen | |
| US11221335B2 (en) | Heat-treated limulus amebocyte lysates | |
| JP7724762B2 (ja) | コアギュローゲンを含まない、清澄化リムルスアメボサイトライセート | |
| US5378610A (en) | Method for assaying endotoxin in serum or plasma using limulus amoebocyte lysate | |
| EP0333187B1 (en) | Process for preparing reagent for measuring endotoxin | |
| RU2321860C2 (ru) | Способ для определения уровня эндотоксина в растворе гемоглобина | |
| WO1999019355A1 (en) | Factor g reduced amebocyte lysates for detection of bacterial endotoxins | |
| Sheraba et al. | Advanced approaches for endotoxin detection and removal from snake antivenoms | |
| Williams | Limulus amebocyte lysate discovery, mechanism, and application | |
| Roth et al. | [6] Measurement of endotoxin levels in hemoglobin preparations | |
| JP3614849B2 (ja) | 前処理剤、前処理方法、前処理された試料による測定法、測定用キット及び試料の判定方法 | |
| JPH11178599A (ja) | エンドトキシン又は／及びペプチドグリカン測定用試薬 | |
| HK40006346B (zh) | 利用基本上不含凝固蛋白原的鲎阿米巴样细胞溶解物检测内毒素的方法 | |
| JPH10185924A (ja) | リムルス反応活性化物質、この物質の不活化方法及び測定方法並びにリムルス反応測定方法 | |
| JPH02192A (ja) | 新規合成基質 |