[go: up one dir, main page]

RU2311925C1 - Способ получения диагностического аллергена - Google Patents

Способ получения диагностического аллергена Download PDF

Info

Publication number
RU2311925C1
RU2311925C1 RU2006114119/15A RU2006114119A RU2311925C1 RU 2311925 C1 RU2311925 C1 RU 2311925C1 RU 2006114119/15 A RU2006114119/15 A RU 2006114119/15A RU 2006114119 A RU2006114119 A RU 2006114119A RU 2311925 C1 RU2311925 C1 RU 2311925C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
ether
allergen
minutes
extraction
mixture
Prior art date
Application number
RU2006114119/15A
Other languages
English (en)
Inventor
Валентина Михайловна Бержец (RU)
Валентина Михайловна Бержец
Нина Сергеевна Петрова (RU)
Нина Сергеевна Петрова
Ольга В чеславовна Радикова (RU)
Ольга Вячеславовна Радикова
Ирина Сергеевна Кропотова (RU)
Ирина Сергеевна Кропотова
Original Assignee
Государственное учреждение Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова Российской академии медицинских наук
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Государственное учреждение Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова Российской академии медицинских наук filed Critical Государственное учреждение Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова Российской академии медицинских наук
Priority to RU2006114119/15A priority Critical patent/RU2311925C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2311925C1 publication Critical patent/RU2311925C1/ru

Links

Landscapes

  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

Изобретение относится к фармакологии и медицине, конкретно к способу получения диагностического аллергена из тараканов. Способ включает щелочную экстракцию исходного сырья с последующим центрифугированием, фильтрованием и стерилизующей фильтрацией целевого продукта, при этом в качестве исходного сырья используют смесь замороженных тараканов, которые измельчают, после измельчения добавляют эфир, встряхивают, фильтруют, высушивают до полного испарения эфира, растирают до порошкообразного состояния и к полученному порошку повторно добавляют эфир, сушат до полного испарения эфира, затем проводят щелочную экстракцию, перемешивают экстрагируемый материал и ежедневно в течение 3 суток встряхивают трижды по 30 минут с интервалом 1,5 часа, в интервалах между встряхиванием хранят при температуре от 2 до 10°С, после экстракции надосадочную жидкость сливают, центрифугируют, а после стерилизующей фильтрации стерильный раствор аллергена выдерживают от 1 до 3 месяцев при температуре от 2 до 10°С. Изобретение обеспечивает расширение номенклатуры диагностических аллергенов и создание высокоэффективного препарата для диагностических заболеваний, вызванных сенсибилизацией к тараканам.

Description

Изобретение относится к фармакологии и медицине, конкретно к способу получения диагностического аллергена из тараканов Blatella germanica.
Известен способ получения диагностического аллергена, включающий щелочную экстракцию исходного сырья, в качестве которой используют культуру клещей домашней пыли Дерматофагоидес фарина или Дерматофагоидес птерниссинус и водно-солевую экстракцию исходного сырья (RU 2265450, А61К 39/00, 2005 г.).
Основной причиной круглогодичных респираторных аллергозов (бронхиальная астма, аллергические бронхиты, аллергические конъюктивиты и др.) являются аллергены жилища человека. В состав основного из них - домашней пыли - входят продукты жизнедеятельности различных организмов, спутников биоценоза человека: клещи, насекомые, домашние животные и др. Последнее десятилетие исследователями обращено внимание, как на причину аллергозов, на тараканов, которые встречаются в жилище человека во всех регионах мира. Показано, что 60-80% больных бронхиальной астмой сенсибилизировано к тараканам; максимальные цифры приводятся для США и Японии, несколько ниже для стран Ближнего Востока - Израиль.
На территории СНГ подобных исследований не проводилось, имеются лишь косвенные данные о высокой частоте встречаемости IgE-антител к тараканам у детей, однако они получены с помощью зарубежных тест-систем. Основная причина этого - отсутствие аллергена. С другой стороны, препараты дальнего зарубежья носят преимущественно разовый характер и нуждаются в более подробной физико-химической характеристики и стандартизации. Такая работа в настоящее время активно проводится за рубежом.
Для диагностики повышенной чувствительности к тараканам необходим аллерген, который можно использовать как для постановки кожных проб, так и для использования в реакциях ин витро. Такого аллергена в отечественной аллергологической практике нет.
Расширение номенклатуры производимых препаратов для диагностики аллергических состояний является актуальной задачей практического здравоохранения. К препаратам, которые необходимы для решения данной проблемы, относится и аллерген из тараканов, разработанный в ГУ НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН.
Техническим результатом изобретения является расширение номенклатуры диагностических аллергенов и создание высокоэффективного препарата для диагностики заболеваний, вызванных сенсибилизацией к тараканам.
Для достижения указанного технического результата в способе получения диагностического аллергена, включающем щелочную экстракцию исходного сырья с последующим центрифугированием, фильтрованием и стерилизующей фильтрацией целевого продукта, согласно изобретению в качестве исходного сырья используют смесь замороженных тараканов, которые измельчают, после измельчения добавляют эфир в соотношении 1:3, встряхивают 10 минут, фильтруют, высушивают до полного испарения эфира, растирают до порошкообразного состояния и к полученному порошку повторно добавляют эфир, используя на 60 грамм сырья 300 мл эфира, сушат до полного испарения эфира, затем проводят щелочную экстракцию при рН 7,0-7,2, перемешивают экстрагируемый материал в течение 30-40 минут и ежедневно в течение 3 суток встряхивают трижды по 30 минут с интервалом 1,5 часа, в интервалах между встряхиванием хранят при температуре от 2 до 10°С, после экстракции надосадочную жидкость сливают, центрифугируют при 5000-6000 об/мин в течение 30-40 минут, фильтруют, а после стерилизующей фильтрации стерильный раствор аллергена выдерживают от 1 до 3 месяцев при температуре от 2 до 10°С.
Сущность изобретения поясняется следующим примером.
Пример. Диагностический аллерген из тараканов разработан в ГУ НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН.
Для получения диагностического аллергена в качестве исходного сырья используют смесь замороженных тараканов. Навеску тараканов из морозильной камеры переносят в фарфоровую ступку и мелко нарезают ножницам. Добавляют эфир в соотношении 1:3, встряхивают 10 минут, смесь фильтруют через бумажный фильтр и оставляют в вытяжном шкафу до полного испарения эфира. Измельчение частично обезжиренного сырья производят в фарфоровой ступке, растирая до порошкообразного состояния. Полученный порошок подвергают вторичному обезжириванию, которое производят в стеклянных банках с притертыми пробками, используя на 60 грамм сырья 300 мл эфира. Полностью обезжиренное сырье рассыпают на эмалированные лотки с фильтровальной бумагой и сушат в вытяжном шкафу до полного испарения эфира. Порошок аллергена помещают в фарфоровую ступку вместимостью 0,5 литра и добавляют 100 мл экстрагирующей жидкости. Экстрагирующей жидкостью может быть любой буферный раствор, имеющий рН 7,0-7,2. Порошок растирают пестиком до гомогенной суспензии и переносят в бутыль вместимостью 3 литра, в которую затем добавляют еще 1,9 литра экстрагирующей жидкости. Содержимое бутыли осторожно перемешивают и оставляют на 30-40 минут, после чего контролируют значение рН. Коррекцию рН проводят добавлением 1,0 моль/л раствора гидроокиси натрия или 0,1 моль/л раствора соляной кислоты до значения рН 7,0-7,2. В последующие три дня для более полного извлечения белково-полисахаридных комплексов проводят следующий режим обработки: ежедневно бутыль с экстрагируемым материалом помещают на аппарат для встряхивания жидкостей в сосудах трижды по 30 минут с интервалом 1,5 часа. В интервалах между встряхиваниями бутыль с экстрагируемым материалом должна находиться в холодильной камере при температуре от 2 до 10°С. Ежедневно проводят коррекцию рН аллергенного экстракта до 7,0-7,2. После окончания экстрагирования надосадочную жидкость сливают и осуществляют центрифугирование на рефрежираторной центрифуге при 5000-6000 об/мин в течение 30-40 минут с последующей фильтрацией через бумажный фильтр. Далее проводят стерилизующую фильтрацию. В день проведения данной операции необходимо отконтроллировать значение рН аллергенного экстракта. Проводят контроль маточного раствора аллергена: в тот же или на следующей день с соблюдением всех правил асептики отбирают из бутыли пробы для контроля: посев на стерильность, проверку значения рН, который должен иметь величину 7,0-7,2. Визуально оценивают физические свойства: препарат должен быть прозрачным, без посторонних включений, темно-коричневого цвета. Содержание единиц белкового азота определяют по методу Несслера. Стерильный раствор аллергена для стабилизации физических биологических свойств выдерживают от 1 до 3 месяцев при температуре от 2 до 10°С. В тех случаях, когда содержание единиц белкового азота в маточном растворе аллергена превышает 10000 PNU/мл, маточный раствор аллергена разводят стерильной экстрагирующей жидкостью.
После разлива аллергена получают готовую форму препарата.
Полученный препарат изучали с учетом поставленных целей и задач. На первых этапах провели лабораторное изучение псевдоаллергических и неспецифических иммунных свойств препарата. Так как «псевдосвойства» имеют дозозависимость, экстракт тел тараканов брали в различных концентрациях: для культуры лимфоцитов таким образом, чтобы конечное содержание его составило 100, 500, 10000 мкг/мл (по белку), для непрямого теста дегрануляции тучных клеток - 100, 500, 10000 мкг/мл для аллергена, вносимого в систему «тучные клетки крысы - сыворотка больного». Ни одна из испытанных концентраций аллергена не вызывала достоверного прироста ИЛ2Р-позитивных лимфоцитов (2,3±0,65; 3,2±0,65; 3,9±0,88 для концентраций 100, 500, 1000 мкг/мл). Отдельные высокие значения прироста активированных лимфоцитов можно отнести за счет систематической ошибки метода. С другой стороны, с учетом того, что данная реакция отражают сенсибилизацию организма безотносительно к ее характеру, указанные пациенты могли быть чувствительны к тараканам, не по реагиновому типу. Для дальнейшей работы выбрали минимальную концентрацию аллергена - 100 мкг/мл. По результатам исследований сделано предположение об отсутствии у полученного препарата неспецифических иммуногенных свойств, которые присущи многим иммуногенным и аллергенным субстанциям. Оценку псевдоаллергенных свойств экстракта проводили в непрямом тесте дегрануляции тучных клеток перитонеальной жидкости крыс с сыворотками тех же доноров. Ни у одной из испытуемых сывороток доноров не зарегистрировано превышения границы нормы. Однако прослеживаются тенденции к росту псевдоаллергических свойств с повышением концентрации белка в препарате аллергена: если различия в проценте дегранулированных клеток для концентраций 100 мкг/мл и 500 мкг/мл статистически не достоверны (р<0,05), то для концентраций 100 мкг/мл и 1000 мкг/мл - достоверны (р<0,05).
Имеет место некоторая тенденция к увеличению числа активированных лимфоцитов в контрольных культурах, что может быть связано с их меньшей устойчивостью. Средние уровни прироста ИЛ2Р-позитивных лимфоцитов оказалось достоверно выше у больных, чем у здоровых (4,8±0,75% против 2,3±0,65%, р<0,001). Результаты теста активации лимфоцитов у 11 больных (44%) могут быть отнесены к высокодостоверным диагностическим классам, свидетельствующим о наличии сенсибилизации организма.
Средний процент дегрануляции тучных клеток крыс составил 30,6±3,42%, что превышает критическую величину в 30%. Иными словами даже в общей группе больных тест оказался положительным. У 12 больных (48%) показатели НДТК свидетельствуют о присутствии реагиновых антител в сыворотке.
В настоящее время проводится работа по более тонкой характеристике полученного аллергена. Поскольку аналоги подобных исследований в странах СНГ отсутствуют, необходимо привести некоторые предварительные результаты работы. Проводили гель-хроматографию на колонке (35±1,5 см), заполненной сефадексом G-75. На колонку наносили 800 мкг препарата, элюцию проводили 0,15М фосфатным буфером рН 7,4; скорость элюции 20 мл/ч. Образец элюировался двумя основными пиками, что достаточно необычно, поскольку наносили цельный экстракт тел аллергенов. Причем последний пик по объему выхода совпадает с выходом 0,25% раствора фенола, что позволяет идентифицировать его именно с ним. При нанесении на колонку чистого сывороточного альбумина оказалось, что он элюируется единым пиком, предшествуя первому пику препарата, можно думать о том, что молекулярная масса элюируемого белка ниже, чем чистого сывороточного альбумина (то есть меньше 60-70 кДа). Подобные рассуждения подтверждаются и данными диск-электрофореза: выявлена только одна полоса в грубом экстракте тел тараканов - иными словами, при используемом методе экстракции в водную фазу переходит только один белок из массы белков таракана. Идентичная по электрофоретической подвижности полоса присутствует только в одной пробе (фракция 6, которая совпадает с первым пиком). В других трубках аналогичных полос выявлено не было. Белковая фракция в препарате аллергена обладает большей подвижностью в электрическом поле, чем молекулы чистого сывороточного альбумина. Это свидетельствует, с одной стороны, о меньшей молекулярной массе имеющего белка, а с другой - о кислом его характере (движение к положительно заряженному полюсу). С концентрированными хроматографическими фракциями был поставлен тест непрямой дегрануляции тучных клеток крыс, в котором использованы сыворотки больных бронхиальной астмой, имевшим сильные скарификационные пробы и положительный результат в этой реакции с цельным экстрактом аллергена. Аллергенная активность присутствовала в концентрированной фракции 6.

Claims (1)

  1. Способ получения диагностического аллергена, включающий щелочную экстракцию исходного сырья с последующим центрифугированием, фильтрованием и стерилизующей фильтрацией целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве исходного сырья используют смесь замороженных тараканов, которые измельчают, после измельчения добавляют эфир в соотношении 1:3, встряхивают 10 мин, фильтруют, высушивают до полного испарения эфира, растирают до порошкообразного состояния, и к полученному порошку повторно добавляют эфир, используя на 60 г сырья 300 мл эфира, сушат до полного испарения эфира, затем проводят щелочную экстракцию при рН 7,0-7,2, перемешивают экстрагируемый материал в течение 30-40 мин и ежедневно в течение 3 суток встряхивают трижды по 30 мин с интервалом 1,5 ч, в интервалах между встряхиванием хранят при температуре от 2 до 10°С, после экстракции надосадочную жидкость сливают, центрифугируют при 5000-6000 об./мин в течение 30-40 мин, фильтруют, а после стерилизующей фильтрации стерильный раствор аллергена выдерживают от 1 до 3 месяцев при температуре от 2 до 10°С.
RU2006114119/15A 2006-04-27 2006-04-27 Способ получения диагностического аллергена RU2311925C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2006114119/15A RU2311925C1 (ru) 2006-04-27 2006-04-27 Способ получения диагностического аллергена

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2006114119/15A RU2311925C1 (ru) 2006-04-27 2006-04-27 Способ получения диагностического аллергена

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2311925C1 true RU2311925C1 (ru) 2007-12-10

Family

ID=38903748

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2006114119/15A RU2311925C1 (ru) 2006-04-27 2006-04-27 Способ получения диагностического аллергена

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2311925C1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2428197C1 (ru) * 2009-12-18 2011-09-10 Учреждение Российской академии медицинских наук научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН (НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН) Способ получения диагностического аллергена

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3953588A (en) * 1972-12-11 1976-04-27 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung Process for the production of allergen-containing extracts
RU2131263C1 (ru) * 1997-03-27 1999-06-10 Курская государственная сельскохозяйственная академия им.проф.И.И.Иванова Способ получения туберкулина
RU2265450C2 (ru) * 2003-08-28 2005-12-10 Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН Способ получения клещевого аллергена для постановки диагностической пробы

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3953588A (en) * 1972-12-11 1976-04-27 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung Process for the production of allergen-containing extracts
RU2131263C1 (ru) * 1997-03-27 1999-06-10 Курская государственная сельскохозяйственная академия им.проф.И.И.Иванова Способ получения туберкулина
RU2265450C2 (ru) * 2003-08-28 2005-12-10 Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН Способ получения клещевого аллергена для постановки диагностической пробы

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2428197C1 (ru) * 2009-12-18 2011-09-10 Учреждение Российской академии медицинских наук научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН (НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН) Способ получения диагностического аллергена

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kumari et al. Invitro anti-inflammatory and anti-artheritic property of Rhizopora mucronata leaves
He et al. Ginseng (Panax ginseng Meyer) oligopeptides regulate innate and adaptive immune responses in mice via increased macrophage phagocytosis capacity, NK cell activity and Th cells secretion
CN102258780B (zh) 一种螨变应原冻干疫苗及其制备方法
CN109400742A (zh) 一种齿瓣石斛精制多糖及其制备方法和应用
CN116948961B (zh) 一种白细胞提取物、抗皱紧致面霜及其制备方法
US20130251698A1 (en) Composition and method for affecting cytokines and nf-kb
RU2311925C1 (ru) Способ получения диагностического аллергена
US20090117216A9 (en) Composition and use of phyto-percolate for treatment of disease
RU2033796C1 (ru) Пептидсодержащая фракция из селезенки млекопитающих, обладающая иммуностимулирующей активностью и способ ее получения
WO2007065024A2 (en) Composition and use of phyto-percolate for treatment of disease
CN102154434B (zh) 一种测定引起类过敏反应的物质的方法
WO2006113925A2 (en) Composition and use of phyto-percolate for treatment of disease
RU2373947C1 (ru) Способ получения диагностического аллергена из пыльцы растений
RU2240810C2 (ru) Эмбриональный противоопухолевый модулятор мкртчяна, способ его получения и применения
CN110100945B (zh) 一种汉麻降血脂肽组合物及其应用
CN110064052B (zh) 一种英国梧桐花粉变应原浸提物、其浸液及其制备方法
RU2428197C1 (ru) Способ получения диагностического аллергена
Sharma et al. INDIAN PAPER WASP ROPALIDIA MARGINATA VENOM TOXIN PEPTIDES: BIOLOGICAL EFFECTS AND ITS IMPACT ON GLYCOGEN LEVEL IN LIVER, GASTROCNEMIUS MUSCLE, RECTUS ABDOMINIS, ATRIA AND VENTRICLE IN ALBINO MICE
Sharma et al. Indian Paper Wasp Ropalidia Marginata Venom Toxin Peptides Induced Effects on Glycogen Level in Liver, Gastrocnemius Muscle, Rectus Abdominis, Atria and Ventricle in Albino Mice
RU2341272C1 (ru) Средство для неспецифической иммунотерапии
US10391135B2 (en) Inhibition of formation of amyloid β-protein fibrils using cactus mucilage extracts
RU2827855C1 (ru) Инъекционное средство для снижения заболеваемости и повышения продуктивности телят
JP4581082B2 (ja) 自己免疫増強剤、その製造方法及びそれを用いた化粧料
James et al. In vitro study on inhibition of glycosylation of methanolic leaf extract of Hibiscus cannabinus
CN1042493C (zh) 人胎胸腺素的制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20150428

NF4A Reinstatement of patent

Effective date: 20160610