RU2399381C2

RU2399381C2 - Использование лектинов для активации олигомеризации гликопротеидов и антигенных молекул

Info

Publication number: RU2399381C2
Application number: RU2005130173/15A
Authority: RU
Inventors: Джеймс Р. ЗАБРЕКИ (US); Джеймс Р. ЗАБРЕКИ; Стефен А. МОНКС (US); Стефен А. МОНКС
Original assignee: Антидженикс Инк.
Priority date: 2003-02-28
Filing date: 2004-02-27
Publication date: 2010-09-20
Also published as: ES2395126T3; AU2004268497A1; WO2005020936A2; EP1603936B1; EP1603936A2; ATE553113T1; CA2517396A1; US20040258705A1; RU2005130173A; WO2005020936A3; CN1780850A; EP1603936A4; KR20060026004A

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии и касается использования лектина или лектинподобных молекул для активации олигомеризации гликопротеидов и антигенных молекул. Сущность изобретения включает композицию, представленную одним или несколькими нековалентными комплексами, вызывающими иммунный ответ у пациента, где каждый комплекс содержит белок теплового шока, антигенную молекулу и лектин и где белок теплового шока гликозилирован и где белок теплового шока и антигенная молекула происходят из опухолевой ткани. Также предоставлены методы изготовления подобных молекулярных комплексов и методы использования композиций, включающих такие молекулярные комплексы для профилактики и лечения рака и инфекционных заболеваний. Преимущество изобретения заключается в усилении активности. 8 н. и 26 з.п. ф-лы, 2 табл., 13 ил.

Description

Эта заявка испрашивает приоритет предварительной заявки США №60/450721, поданной 28 февраля 2003 г., которая включена здесь в виде ссылки в полном объеме.

1. ВВЕДЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к областям биотерапии, иммунотерапии и иммуномодуляции, опосредованной стресс-протеином. Более подробно, настоящее изобретение касается композиций и методов с использованием молекулярных комплексов, содержащих лектин или лектинподобные молекулы, связанные с иммунологически и/или биологически активными молекулами, для усиления профилактического и/или лечебного воздействия иммунологически и/или биологически активных молекул при профилактике или лечении заболеваний, особенно при профилактике или лечении рака или инфекционных болезней.

2. УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Цитирование или обсуждение ссылки здесь не должны быть рассмотрены как допущение, что они являются уровнем техники существующего изобретения.

2.1. Иммунные ответы и представление антигена

Иммунная система организма реагирует двумя типами ответа на воздействие патогенов или других опасных факторов - гуморальным ответом и клеточно-опосредованным ответом (См. Alberts, B. et al., 1994, Molecular Biology of the Cell, 1195-96). Когда дремлющие В-клетки активируются антигеном к пролиферации и созреванию в клетки, секретирующие антитела, они продуцируют и секретируют антитела с уникальным антиген-связывающим участком. Эта реакция секреции антител известна как гуморальный ответ. С другой стороны, различные ответы Т-клеток в совокупности называются клеточно-опосредованными иммунными реакциями. Существует два основных класса Т-клеток - цитотоксические Т-клетки и Т-клетки-хелперы. Цитотоксические Т-клетки непосредственно уничтожают клетки, которые инфицированы вирусом или некоторыми другими внутриклеточными микроорганизмами. В отличие от них Т-клетки-хелперы помогают стимулировать ответы других клеток: например, они помогают активации макрофагов, дендроцитов и В-клеток (См. Alberts, B. et al., выше, at 1228). Как цитотоксические Т-клетки, так и Т-клетки-хелперы распознают антиген в форме пептидных фрагментов, которые образуются при деградации чужеродных белковых антигенов внутри клетки-мишени, и оба типа Т-клеток, поэтому, зависят от молекул главного комплекса гистосовместимости (MHC), которые связывают эти пептидные фрагменты, переносят их к поверхности клетки и представляют их Т-клеткам. Молекулы МНС обычно обнаруживаются в изобилии на антиген-представляющих клетках (АРС).

Антиген-представляющие клетки (АРС), такие как макрофаги и дендроциты, являются ключевыми компонентами врожденного и приобретенного иммунных ответов. Антигены в основном «презентируются» Т- или В-клетками на поверхности других клеток, антиген-представляющих клеток (АРС). Антиген-представляющие клетки способны улавливать циркулирующие в лимфе и крови антигены и, после интернализации и деградации, презентировать (представлять) антигенные пептидные фрагменты, связанные с расположенными на поверхности клетки молекулами главного комплекса гистосовместимости (MHC), Т-клеткам. После этого антиген-представляющие клетки способны активировать Т-клетки (клеточно-опосредованный ответ) к клональной экспансии, и эти дочерние клетки могут развиваться или в цитотоксические Т-клетки, или Т-клетки-хелперы, которые в свою очередь активизируют B-клетки (гуморальная реакция) с подобным, связанным с МНС, антигеном, приводя к клональной экспансии и продукции специфических антител (см. Alberts, B. et al., выше, at 1238-45).

Выявлено два типа антиген-процессирующего механизма. Первый тип вызывает поглощение белков антиген-представляющими клетками посредством эндоцитоза, фрагментацию антигена внутри везикул, ассоциацию со II классом молекул МНС и экспрессию на поверхности клетки. Этот комплекс распознается Т-клетками-хелперами, продуцирующими СD4. Другой тип используется для белков, таких как вирусные антигены, которые синтезируются внутри клетки и, вероятно, вовлечены в фрагментацию белков в цитоплазме. Пептиды, произведенные этим способом, связываются с I классом молекул МНС и распознаются цитотоксичными Т-клетками, экспрессирующими CD8 (см. Alberts, B. et al., выше, at 1233-34).

Стимуляция Т-клеток включает множество соучаствующих молекул, экспрессируемых как Т-клетками, так и антиген-представляющими клетками. Cочетанно стимулирующие молекулы - это те вспомогательные молекулы, которые вызывают рост и активацию Т-клетки. В ответ на стимуляцию cочетанно-стимулирующие молекулы индуцируют высвобождение цитокинов, таких как интерлейкин 1 (IL-1) или интерлейкин 2 (IL-2), интерферон и т.д., которые промотируют развитие Т-клеток и экспрессию поверхностных рецепторов (см. Paul, 1989, Fundamental Immunology, 109-10).

Обычно, APC находятся в состоянии покоя и требуют активации для своего действия. Идентификация сигналов, которые активизируют APC, - важный и неразрешенный вопрос (см. Banchereau, et al., 1998, Nature, 392:245-252; Medzhitov, et al., 1998, Curr Opin Immunol, 10:12-15).

2.2. Белки теплового шока

Белки теплового шока (HSP), также называемые белками стресса, были изначально идентифицированы как белки, синтезируемые клетками в ответ на тепловой шок. Известно приблизительно десять семейств HSP, и каждое семейство состоит из от одного до пяти тесно связанных белков. Srivastava, 2002, Annu. Rev. Immunol. 20:395-425. Многие представители этих семейств были найдены позднее, как индуцируемые в ответ на другие стрессовые раздражители, включая питательную депривацию, метаболический сбой, кислородные радикалы, и инфекцию внутриклеточными патогенами (см. Welch, May 1993, Scientific American, 56-64; Young, 1990, Annu. Rev. Immunol, 8:401-420; Craig, 1993, Science, 260:1902-1903; Gething et al., 1992, Nature, 355:33-45; Lindquist et al., 1988, Annu. Rev. Genetics, 22:631-677).

Белки теплового шока экспрессируются во всех клетках, во всех формах жизни и в разнообразных внутриклеточных локализациях, то есть они экспрессируются в цитозоле прокариотов и в цитозоле, ядрах, эндоплазматическом ретикулуме (ER), митохондриях и хлоропластах эукариотов. Srivastava, 2002, Annu. Rev. Immunol. 20:395-425. Белки теплового шока также составляют отдельную самую обильную группу белков в клетках. Они экспрессируются в больших количествах в нормальных условиях, вне теплового шока, и их экспрессия может быть мощно стимулирована к намного большим уровням в результате теплового шока или других форм стресса.

Белки теплового шока, среди прочего, являются наиболее стабильными из существующих. Например, DnaK, Hsp70 из E. coli имеет приблизительно 50%-ную идентичность аминокислотной последовательности с белками Hsp70 из экскориаций (Bardwell et al., 1984, Proc. Natl Acad. Sci, 81:848-852). Семейства Hsp60 и Hsp90 также показывают аналогично высокие уровни внутрисемейной сохранности (Hickey et al., 1989, Mol. Cell. Biol, 9:2615-2626; Jindal, 1989, Mol. Cell Biol, 9:2279-2283). Кроме того, было выявлено, что семейства Hsp60, Hsp70 и Hsp90 состоят из белков, которые родственны стрессовым белкам по своей последовательности, например, имеющим больше чем 35%-ную аминокислотную идентичность, но чьи уровни экспрессии не изменены под воздействием стресса.

Исследования клеточной реакции на тепловой шок и другие физиологические воздействия показали, что HSP обладают функциями, такими как скручивание и денатурация белков, деградация белков, сборка в комплексы из множества субъединиц, термотолерантность, устойчивость к появлению мутаций и другие. Srivastava, 2002, Annu. Rev. Immunol. 20:395-425. Белки теплового шока выполняют различные виды функций сопровождения. Например, члены семейства Hsp70, расположенного в цитоплазме клетки, ядре, митохондриях или эндоплазматическом ретикулуме (Lindquist et al., 1988, Ann. Rev. Genetics, 22:631-677) вовлечены в процесс презентации антигенов в клетки иммунной системы, а также участвуют в переносе, скручивании белков и сборке белковых комплексов в обычных клетках. Белки теплового шока способны связывать белки или пептиды и высвобождать связанные белки или пептиды в присутствии аденозинтрифосфата (АТФ) или при низком уровне рН.

2.3. Иммуногенность HPS-пептидных комплексов

Srivastava и др. демонстрировал иммунный ответ у имбредных мышей на саркомы, вызванные воздействием метилхлорантрена (1988, Immunol. Today, 9:78-83). В этих исследованиях было выявлено, что молекулы, ответственные за индивидуально отличную иммуногенность этих опухолей, были гликопротеидами 96 кДa (gp96) и внутриклеточными белками от 84 до 86 кДa (Srivastava et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:3407-3411; Ullrich et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:3121-3125). Иммунизация мышей gp96 или p84/86, изолированными из специфической опухоли, направляла иммунитет мышей к той же специфической опухоли, а не к антигенно отличным опухолям. Изоляция и исследование генов, кодирующих gp96 и p84/86, выявили существенное соответствие между ними и показали, что gp96 и p84/86 были, соответственно, находящимися в эндоплазматическом ретикулуме и цитозоле копиями тех же самых белков теплового шока (Srivastava et al., 1988, Immunogenetics, 28:205-207; Srivastava et al., 1991, Curr. Top. Microbiol Immunol, 167:109-123). В дальнейшем, Hsp70 был использован для активации иммунитета к опухоли, из которой этот протеин был выделен, но не к опухолям, отличным по антигенному составу. Однако Hsp70, обедненный по пептидам, как выявлено, теряет свою иммуногенную активность (Udono and Srivastava, 1993, J. Exp. Med., 178:1391-1396). Эти наблюдения позволили предположить, что белки теплового шока, по существу, не являются иммуногенными, но формируют нековалентные комплексы с антигенными пептидами, и комплексы могут активировать специфический иммунитет к антигенным пептидам (Srivastava, 1993, Adv. Cancer Res., 62:153-177; Udono et al., 1994, J. Immunol, 152:5398-5403; Suto et al., 1995, Science, 269:1585-1588).

Белок теплового шока gp96 сопровождает широкое множество пептидов в зависимости от источника, из которого выделен gp96 (для обзора см. Srivastava et al., 1998, Immunity, 8:657-665). Полученный из опухоли gp96 несет опухолевые антигенные пептиды (Ishii et al., 1999, J. Immunology, 162:1303-1309); gp96, выделенный из инфицированных вирусом клеток, несет вирусные антигенные детерминанты (Suto and Srivastava, 1995, Science, 269:1585-1588; Nieland et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:1800-1805), а gp96, выделенный из клеток, инфицированных вирусами с модельными антигенами типа овальбумина или β-галактозидазы, связан с соответствующими антигенными детерминантами (Arnold et al., 1995, J. Exp. Med., 182:885-889; Breloer et al., 1998, Eur. J. Immunol., 28:1016-1021). Ассоциация gp96 с пептидами происходит in vivo (Menoret and Srivastava, 1999, Biochem. Biophys. Research Commim., 262:813-818). Комплексы Gp96-пептида, изолированные из клеток (Tamura et al., 1997, Science, 278:117-120) или воссозданные in vitro (Blachere et al., 1997, J. Exp. Med., 186:1183-1406), - превосходные иммуногены и широко используются для активации реакций CD8+ T-клеток, характерных для gp96-сопровождаемых антигенных пептидов.

Способность gp96-пептидных комплексов активировать иммунный ответ основана на переносе пептида к молекулам MHC класса I антиген-представляющих клеток (Suto and Srivastava, 1995, выше). Эндогенно синтезированные антигены, сопровождаемые gp96 в эндоплазматическом ретикулуме (ER), способны активировать антиген-специфичные CD8+ T-клетки (или MHC I-ограниченные CTL) in vivo; эта активация CD8+ T-клеток требует участия макрофагов. Хотя экзогенные антигены типично направляются по пути представления MHC II и активируют CD4+ ответы, экзогенно введенные gp96-пептидные комплексы способны активировать клеточный ответ CD8+ T-клеток. Suto and Srivastava, 1995, выше; Blachere et al., 1997, J. Exp. Med., 186:1315-22.

Ввиду того что чрезвычайно малое количество сопровождаемых gp96 антигенных пептидов требуется для иммунизации (Blachere et al., 1997, выше) и из-за строгой зависимости иммуногенности функционирующих антиген-представляющих клеток (APC) от gp96-пептидных комплексов (Udono et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:3077-3081), возникло предположение о наличии на APC рецепторов для gp96 (Srivastava et al., 1994, Immunogenetics, 39:93-98). Предположение было подтверждено, когда было показано, что α2 макроглобулиновый (α2M) рецептор CD91, связываясь с gp96 и α2M, также хорошо, как и антитела с CD91, полностью ингибирует представление антиген-представляющим клеткам пептидов, сопровождаемых gp96. Binder et al., 2000, Nat. Immunol. 1(2):151-55; Srivastava, 2002, Annu. Rev. Immunol. 20:395-425. Позднее было продемонстрировано, что CD91 активен как рецептор не только для gp96, но также и для hsp90, hsp70 и кальретикулина. Basu et al., 2001, Immunity 14(3):301-13.

Доказано, что пептиды, сопровождаемые HSP, могут быть представлены молекулам MHC II антиген-представляющих клеток в дополнение к представленным MHC I молекулам. Srivastava, 2002, Annu. Rev. Immunol. 20:395-425. Представление молекулам MHC II также происходит через рецептор CD91. Таким образом, предложено, что, как только HSP-пептидный комплекс взаимодействует с CD91, он может вступить в один или несколько различных путей транспортировки и процессинга. Srivastava, выше.

Белки теплового шока также участвуют во врожденном иммунитете. Воздействие антиген-представляющих клеток на gp96 (или другие HSP) приводит к секреции низких уровней TNFα антиген-представляющими клетками независимо от того, действительно ли молекулы gp96 связаны с антигенными пептидами. Suto and Srivastava, 1995, Science 269:1585-88. Позднее было доказано, что взаимодействие HSP, например gp96, hsp90, hsp70 и hsp60, с антиген-представляющими клетками может привести к ряду явлений, связанных с врожденным иммунитетом, таких как секреция воспалительных цитокинов TNFα, IL-1β, IL-12 и GM-CSF макрофагами; секреция хемокинов, например MCP 1, MIP-2 и RANTES, макрофагами; индукция индуцируемой синтазы окиси азота и продукция окиси азота макрофагами и DC; созревание DC соразмерно усиленной экспрессии MHC, B7-2 и молекул CD40 на GD11c+ клетках; миграция многочисленных DC (предположительно клеток Лангерганса) от места внедрения gp96 к дренирующим лимфатическим узлам и транслокация NFkB в ядра макрофагов и DC. Srivastava, 2002, Annu. Rev. Immunol. 20:395-425. Есть небольшое доказательство, что CD91 - это рецептор, вовлеченный в эти явления, и это намекало на то, что вовлечены и другие рецепторы. Ohashi et al., 2000, J. Immunol. 164(2):558-61; Panjwani et al., 2000, Cell Stress Chaperones 5:391; Srivastava, 2002, Annu. Rev. Immunol. 20:395-425.

Нековалентные комплексы белка теплового шока и пептида, очищенные от раковых клеток, могут использоваться для лечения и профилактики рака и были описаны в РСТ публикациях WO 96/10411 от 11 апреля 1996 г. и WO 97/10001 от 20 марта 1997 г. (Патент США №5750119 от 12 апреля 1998 г. и Патент США № 5837251 от 17 ноября 1998 г. соответственно, каждый из которых включен сюда в полном объеме в виде ссылки). Выделение и очистка комплексов стресс-протеин-антиген было описано, например, из инфицированных патогеном клеток, и они использовались для лечения и профилактики инфекции, вызванной патогенами, такими как вирусы и другие внутриклеточные патогены, включая бактерии, простейшие, грибы и паразиты (см., например, PCT публикацию WO 95/24923 от 21 сентября 1995 г.). Иммуногенные комплексы стресс-протеин-антиген могут также быть подготовлены in vitro путем образования комплекса стресс-протеина и антигенных пептидов, и использование таких комплексных соединений для лечения и профилактики рака и инфекционных болезней было описано в PCT публикации WO 97/10000 от 20 марта 1997 г. (Патент США № 6030618 от 29 февраля 2000 г.). Использование комплексов стресс-протеин-антиген для сенсибилизирования антиген-представляющих клеток in vitro для формирования приобретенного иммунитета описано в PCT публикации WO 97/10002 от 20 марта 1997 г. (см. также Патент США № 5985270 от 16 ноября 1999 г.).

Идентификация и исследование специфичных молекул или методов, которые способны увеличить иммуногенность HSP-опосредованного антигенного представления пептидов, смогут предоставить полезные реактивы и методы для активации специфического иммунитета посредством белков теплового шока и комплексов HSP-пептид и для разработки новых диагностических и терапевтических методов.

2.4. Лектины

Лектины - группа белков, найденных в растениях, животных, грибах, морских водорослях и бактериях, которые имеют общее свойство связываться со специфичными углеводными группами (см. Sharon et al., 1972, Science, 177:949). Они представляют собой структурно иной класс белков, и их характерное общее свойство - способность специфично и обратимо связывать углеводы и агглютинировать клетки, формируя поперечные связи между группами олигосахарида на поверхностях клеток. Sharon, 1993, Trends Biochem Sci 18(6):221-6. Лектины широко используются для диагностики и экспериментальных целей, например для идентификации мутировавших клеток в клеточных культурах, для определения групп крови, запуская агглютинацию эритроцитов, или для отображения поверхности клеточных мембран. Лектины также используются для очистки белков вследствие их способности специфично и обратимо связывать углеводы.

Некоторые лектины могут группироваться в различные семейства, такие как лектины из плодов бобовых или хлебных злаков, которые являются схожими по структуре, или животные лектины c-типа (Ca²⁺-зависимые), которые содержат гомологичные углеводные участки распознавания. Sharon, выше. Лектины плодов бобовых поразительно схожи в их первичных, вторичных и третичных структурах. Srinivas et al., 2001, Biochim. Biophy. Acta 1527:102-111. У всех известных в настоящее время лектинов плодов бобовых третичная структура построена из двух антипараллельных β-слоев, шестикратно скрученная плоская "задняя сторона" и семикратно скрученная искривленная "передняя сторона" β-слоя. Srinivas et at., выше. Эти слои, в свою очередь, связаны, с формированием так называемой "рулета с джемом" структуры. Несмотря на их схожесть на первичном, вторичном и третичном структурных уровнях лектины плодов бобовых показывают значительные различия в их четверичных структурах и способах организации мономеров в димерной/тетрамерной сборке. Srinivas et al., выше.

Конканавалин А (Con A), выделенный из канавалии мечевидной, был первым лектином семейства плодов бобовых, строение которого стало известным. Con A состоит из 237 аминокислот и имеет два участка, агрегирующих металл. Becker et al., 1975, J. Biol. Chem. 250:1513. При уровне рН 4,5-5,6 Соn А существует как единственный димер. McKenzie et al., 1972, Biochim. Biophys. Acta, 263:283. При рН выше 7 Con A является преимущественно тетрамерным. Wang et al., 1975, J. Biol. Chem. 250: 1490. Соn А реагирует с нередуцируемой D-глюкозой и D-маннозой. Smith et al., 1967, Arch. Biochem. Biophys., 121:88. В подобных реакциях α-метил-D-глюкопиранозид может выступать как конкурентный ингибитор. Smith et al., выше.

3. СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение предоставляет композиции, включающие один или несколько молекулярных комплексов, где каждый молекулярный комплекс включает лектин и иммунологически и/или биологически активный гликопротеид (включая гликопептид и гликополипептид). В одном варианте осуществления молекулярный комплекс включает лектин и иммунологически и/или биологически активный гликопротеид, который не является антигенной молекулой. Используемый здесь термин "антигенная молекула" относится к молекуле, которая имеет одну или несколько антигенных детерминант, в отношении которых желателен иммунный ответ у субъекта (например, в терапевтических целях). Неограниченные примеры антигенных молекул приводятся в разделе 5.2. В другом варианте осуществления молекулярный комплекс включает лектин и иммунологически и/или биологически активный гликопротеид, который является антигенной молекулой. В еще одном варианте осуществления молекулярный комплекс включает лектин, иммунологически и/или биологически активный гликопротеид, который не является антигенной молекулой, и антигенную молекулу, которая может быть или не быть гликопротеидом. В предпочтительном варианте осуществления иммунологически и/или биологически активная молекула является терапевтической. Также предоставлены методы применения подобных композиций и методы использования композиций для профилактики или лечения заболеваний (например, рака, инфекционного заболевания, анемии, заболеваний, связанных с недостаточностями гормона роста, ферментными недостаточностями, состояний иммунной супрессии) и для стимуляции иммунного ответа у субъекта, нуждающегося в этом. Хотя, без связи с какой-либо теорией, изобретение отчасти основано на открытии авторов, что лектин активирует олигомеризацию гликопротеидов (включая гликопептиды и гликополипептиды) или иммунологически и/или биологически активного комплекса, включающего один или несколько гликопротеидов, и что олигомеризованный комплекс проявляет возросшую биологическую активность (in vitro и in vivo) по сравнению с неолигомеризованными молекулами.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет один или несколько нековалентных молекулярных комплексов или композицию, включающую один или несколько нековалентных молекулярных комплексов, где каждый молекулярный комплекс включает лектин, связанный с иммунологически и/или биологически активным гликопротеидом, и где количество лектина, находящегося в композиции, относительно количества гликопротеида равно или больше чем 1 фг, 100 фг, 500 фг, 1 пг, 100 пг, 500 пг, 1 нг, 2 нг, 5 нг, 10 нг, 20 нг, 30 нг, 40 нг, 50 нг, 75 нг, 100 нг или 200 нг на микрограмм гликопротеида. В особом варианте осуществления количество лектина, находящегося в композиции, относительно количества гликопротеида составляет 40 нг-1000 нг, 50 нг-1000 нг, 50 нг-500 нг, 50 нг-250 нг или 100 нг-500 нг лектина на микрограмм гликопротеида. В другом варианте осуществления лектин находится в молярном избытке относительно гликопротеида. В одном варианте осуществления гликопротеид является антигенной молекулой. В особом варианте осуществления молекулярный комплекс изобретения включает лектин, гликопротеид, который является антигенной молекулой, и другую молекулу, такую как белок теплового шока ("HSP"), который может быть гликозилирован или нет. В другом варианте осуществления гликопротеид не является антигенной молекулой. В особом варианте осуществления гликопротеид является гликозилированным белком теплового шока. В еще одном варианте осуществления молекулярный комплекс изобретения включает лектин, гликопротеид, который не является антигенной молекулой, и антигенную молекулу (которая может быть или не быть гликопротеидом). В особом варианте осуществления антигенная молекула является белком (включая пептид и полипептид), который проявляет антигенность антигена определенного типа раковой опухоли или возбудителя инфекционного заболевания.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет один или несколько молекулярных комплексов или композицию, включающую один или несколько молекулярных комплексов, где каждый комплекс включает в себя белок теплового шока, антигенную молекулу и лектин, где белок теплового шока и/или антигенная молекула гликозилированы и где количество лектина, находящегося в комплексах, по отношению к количеству белка теплового шока равно или больше чем 5 нг, 10 нг, 20 нг, 30 нг, 40 нг, 50 нг, 75 нг, 100 нг или 200 нг на микрограмм белка теплового шока. Более предпочтительно, содержание лектина, находящегося в комплексе, по отношению к белку теплового шока 40 нг-1000 нг, 50 нг-1000 нг, 50 нг-500 нг, 100 нг-250 нг или 150 нг-200 нг лектина на микрограмм белка теплового шока. В некоторых вариантах осуществления содержание лектина, находящегося в комплексе, по отношению к белку теплового шока равно или меньше чем 5 нг на микрограмм белка теплового шока. Предпочтительное содержание лектина, находящегося в комплексе, по отношению к белку теплового шока 0,1 нг-5 нг, 0,2 нг-4 нг, 0,3 нг-3 нг, 0,5 нг-2 нг или 0,1 нг-1 нг лектина на микрограмм белка теплового шока.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение также предоставляет фармацевтическую композицию, включающую фармацевтически приемлемый носитель и один или несколько молекулярных комплексов, где каждый молекулярный комплекс включает лектин и иммунологически и/или биологически активный гликопротеид и где указанный гликопротеид образует олигомеры в указанном комплексном соединении в присутствии лектина. В одном варианте осуществления гликопротеид является антигенной молекулой. В особом варианте осуществления молекулярное комплексное соединение по изобретению включает лектин, гликопротеид, который является антигенной молекулой, и другую молекулу типа белка теплового шока ("HSP"), который может быть или не быть гликозилированным. В другом варианте осуществления гликопротеид не является антигенной молекулой. В особом варианте осуществления гликопротеид представлен гликозилированным белком теплового шока. В еще одном варианте осуществления молекулярное комплексное соединение по изобретению включает лектин, гликопротеид, который не является антигенной молекулой, и антигенную молекулу (которая может быть или не быть гликопротеидом). В более предпочтительном варианте осуществления антигенная молекула представлена белком (включая пептид и полипептид), который проявляет антигенные свойства антигена определенного типа раковой опухоли или возбудителя инфекционного заболевания. В некоторых вариантах осуществления гликопротеид представлен белком теплового шока, и количество присутствующего в композиции лектина по отношению к количеству белка теплового шока равно или больше чем 5 нг, 10 нг, 20 нг, 30 нг, 40 нг, 50 нг, 75 нг, 100 нг или 200 нг на микрограмм гликопротеида. Предпочтительное количество присутствующего в композиции лектина по отношению к количеству белка теплового шока составляет 40 нг-1000 нг, 50 нг-1000 нг, 50 нг-500 нг, 50 нг-250 нг или 100 нг-500 нг лектина на микрограмм белка теплового шока. В некоторых вариантах осуществления количество присутствующего в композиции лектина относительно количества белка теплового шока равно или меньше чем 5 нг на микрограмм белка теплового шока. Предпочтительное количество присутствующего в композиции лектина относительно количества белка теплового шока составляет 0,1 нг-5 нг, 0,1 нг-4 нг, 0,1 нг-3 нг, 0,1 нг-2 нг, 0,1 нг-1 нг, 0,5 нг-5 нг, 0,5 нг-3 нг или 1 нг-4 нг лектина на микрограмм гликопротеида. В некоторых вариантах осуществления гликопротеид не является белком теплового шока, и количество присутствующего в композиции лектина относительно количества гликопротеида равно или больше чем 1 фг, 100 фг, 500 фг, 1 пг, 100 пг, 500 пг, 1 нг, 2 нг, 5 нг, 10 нг, 20 нг, 30 нг, 40 нг, 50 нг, 75 нг, 100 нг или 200 нг на микрограмм гликопротеида.

В некоторых вариантах осуществления молекулярный комплекс изобретения включает лектин, связанный с гликозилированным белком теплового шока, в комплексе с антигенной молекулой (например, антигенным белком (включая антигенный пептид и полипептид)). Некоторые белки теплового шока изначально гликозилированы, включая gp96, GRP 170, кальретикулин и Bip (GRP78) и другие. Белки теплового шока, которые изначально не гликозилированы, могут также быть преобразованы в гликопротеид добавлением одного или нескольких сайтов гликозилирования, которые не присутствуют в нативных последовательностях аминокислот, формирующих белок теплового шока, с последующим добавлением углеводных групп или созданием HSP, содержащего последовательности пептида, которые связывают Con A (см. Scott et al., PNAS (1992) 89:5398-5402), или ковалентно соединяя HSP с Con A, используя химическую связь, известную в уровне техники. В некоторых других вариантах осуществления молекулярные комплексные соединения включают лектин, связанный с иммунологически и/или биологически активным гликопротеидом, который не является белком теплового шока. Все же в некоторых других вариантах осуществления молекулярные комплексные соединения включают лектин, связанный с иммунологически и/или биологически активным гликопротеидом, объединенным с белком теплового шока (который может быть или не быть гликозилирован). В некоторых вариантах молекулярный комплекс по изобретению является нековалентным комплексным соединением. В некоторых вариантах осуществления молекулярный комплекс по изобретению представлен ковалентным комплексным соединением.

В предпочтительном варианте осуществления лектин в молекулярных комплексах изобретения является связывающим маннозу лектином. В особом варианте осуществления лектин в молекулярных комплексах изобретения представлен Конканавалином А (Con A). В предпочтительном варианте осуществления белок теплового шока в молекулярных комплексах изобретения представлен gp96. В особом варианте осуществления молекулярные комплексы изобретения очищены.

Настоящее изобретение также предоставляет методы изготовления молекулярных комплексов изобретения. В некоторых вариантах осуществления лектин добавляется после гликопротеида или комплексного соединения гликопротеида с другой молекулой (например, гликозилированного HSP, связанного с антигенной молекулой) и очищается для олигомеризации гликопротеида. В некоторых вариантах осуществления лектин добавляется во время процесса очищения гликопротеида или комплексного соединения гликопротеида с другой молекулой (например, гликозилированного HSP, связанного с антигенной молекулой) для активации олигомеризации гликопротеида. В одном варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет метод изготовления одного или несколько нековалентных комплексных соединений, где каждое комплексное соединение включает белок теплового шока, антигенную молекулу и лектин и где указанные белки теплового шока гликозилированы; указанный метод включает следующие стадии: (a) закрепление указанного лектина на указанном белке теплового шока; и (b) объединение упомянутого белка теплового шока с антигенной молекулой. В другом варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет метод изготовления одного или нескольких нековалентных комплексных соединений, где каждое комплексное соединение включает белок теплового шока, антигенную молекулу и лектин и где вышеупомянутые белок теплового шока и/или антигенная молекула гликозилированы, указанный метод включает связывание лектина с одним или несколькими комплексами, каждый комплекс содержит белок теплового шока и антигенную молекулу, где указанный лектин не связан с твердой фазой. В особом варианте осуществления метод включает выделение комплексного соединения белка теплового шока и антигенной молекулы аффинной хроматографией на основе лектина до присоединения комплексного соединения к лектину. В другом особом варианте осуществления метод включает выделение указанного комплексного соединения белка теплового шока и антигенной молекулы методом очистки белка, без использования лектина, таким как аффинная хроматография с использованием антител, до присоединения комплексного соединения к лектину. Это изобретение в дальнейшем предоставляет композиции, изготовленные описанными методами.

Настоящее изобретение далее предоставляет метод профилактики или лечения заболеваний (например, рака, инфекционных болезней, анемии, заболеваний, связанных с недостаточностями гормона роста, ферментными недостаточностями, состояний иммунной супрессии и т.д.), включающий введение к субъекту, при необходимости, профилактической или терапевтически эффективной дозы композиции, включающей одно или больше нековалентных комплексных соединений, где каждый комплекс включает лектин, связанный с иммунологически и/или биологически активным гликопротеидом. В одном варианте осуществления гликопротеид является антигенной молекулой. В особом варианте осуществления комплексное соединение включает лектин, гликопротеид, который является антигенной молекулой, и другую молекулу типа белка теплового шока ("HSP"), которая может быть или не быть гликозилированной. В другом варианте осуществления гликопротеид не является антигенной молекулой. В особом варианте осуществления гликопротеид представлен гликозилированным белком теплового шока. В еще одном варианте осуществления молекулярное комплексное соединение по изобретению включает лектин, гликопротеид, который не является антигенной молекулой, и антигенную молекулу (которая может быть или не быть гликопротеидом). В особом варианте осуществления антигенная молекула - это белок (включая пептид и полипептид), который проявляет антигенную активность антигена определенного типа раковой опухоли или возбудителя инфекционной болезни. В композицию впоследствии может быть включен фармацевтически приемлемый носитель.

В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет метод профилактики или лечения заболеваний (например, рака, инфекционных болезней, анемии, заболеваний, связанных с недостаточностями гормона роста, ферментными недостаточностями, состояний иммунной супрессии и т.д.), включающий введение субъекту, при необходимости, профилактического или терапевтически эффективного количества композиции, включающей одно или несколько нековалентных комплексных соединений, где каждое комплексное соединение включает лектин, белок теплового шока и антигенную молекулу, где указанный белок теплового шока и/или антигенная молекула гликозилированы и где количество содержащегося лектина в композиции относительно количества белка теплового шока равно или больше чем 5 нг, 10 нг, 20 нг, 30 нг, 40 нг, 50 нг, 75 нг, 100 нг, или 200 нг на микрограмм белка теплового шока. Предпочтительно, количество содержащегося лектина в композиции относительно количества белка теплового шока составляет 40 нг-1000 нг, 50 нг-1000 нг, 50 нг-500 нг, 50 нг-250 нг или 100 нг-500 нг лектина на микрограмм белка теплового шока. В некоторых вариантах осуществления количество содержащегося лектина в композиции относительно количества белка теплового шока равно или меньше чем 5 нг на микрограмм белка теплового шока. Предпочтительно, количество содержащегося лектина в композиции относительно количества белка теплового шока составляет 0,1 нг-5 нг, 0,1 нг-4 нг, 0,1 нг-3 нг, 0,1 нг-2 нг, 0,1 нг-1 нг, 0,5 нг-5 нг, 0,5 нг-3 нг или 1 нг-4 нг лектина на микрограмм белка теплового шока. В композицию может впоследствии быть включен фармацевтически приемлемый носитель. В особом варианте осуществления антигенная молекула представлена белком, который проявляет антигенную активность антигена определенного типа раковой опухоли или антигена возбудителя инфекционной болезни.

В предпочтительном варианте осуществления иммунологически и/или биологически активный гликопротеид молекулярного комплексного соединения, например белок теплового шока, в комплексе с пептидом, который проявляет антигенные свойства антигена определенного типа раковой опухоли или антигена возбудителя инфекционной болезни, является аутогенным к субъекту; то есть он выделен непосредственно из клеток субъекта (например, приготовлен из биопсийной ткани опухоли пациента, когда требуется лечение рака). В качестве альтернативы молекулярное комплексное соединение может быть аллогенным к субъекту, к которому применяется композиция молекулярного комплексного соединения по изобретению. Альтернативно, молекулярное комплексное соединение изготавливается in vitro, например, из культуры клеток, которые рекомбинантно продуцируют белок теплового шока.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение касается методов и композиций для профилактики и лечения первичных и метастатических неопластических заболеваний, в дополнение к терапии раковых опухолей, композиции изобретения могут использоваться для профилактики определенных типов рака, например, у предрасположенных в результате семейного анамнеза субъектов или у субъектов с повышенным риском заболевания раком вследствие воздействия факторов окружающей среды.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет метод профилактики или лечения заболеваний (например, рака, инфекционных болезней, анемии, заболеваний, связанных с недостаточностями гормона роста, ферментными недостаточностями, состояний иммунной супрессии и т.д.), включая применение к пациенту, нуждающемуся в этом, профилактического или терапевтически эффективного количества композиции, включающей один или несколько молекулярных комплексов изобретения в комбинации с одним или несколькими профилактическими или терапевтическими агентами, кроме молекулярных комплексных соединений по изобретению. В одном варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет метод профилактики или лечения болезней (например, рака, инфекционных болезней, анемии, заболеваний, связанных с недостаточностями гормона роста, ферментными недостаточностями, состояний иммунологической супрессии и т.д.), включая введение к пациентам, при необходимости, профилактических или терапевтически эффективных количеств композиции, включающей один или несколько молекулярных комплексов изобретения и один или несколько усилителей иммунных реакций или модификаторов биологических реакций, включая цитокины, агонисты или антагонисты различных лигандов, рецепторы и сигнальные молекулы, иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты и адъюванты. В соответствии с этим аспектом изобретения композиции изобретения применяются в комбинированной терапии с одним или несколькими усилителями иммунных реакций или модификаторами биологических реакций. В другом варианте осуществления композиции изобретения применяются в комбинации с лучевой терапией или одним или несколькими химиотерапевтическими средствами для лечения рака. В еще одном варианте осуществления композиции изобретения применяются в комбинации с антивирусными, антибактериальными, фунгицидными, противопаразитарными средствами для лечения или профилактики инфекционных заболеваний.

Настоящее изобретение также предоставляет методы доставки одного или нескольких гликопротеидов или одного или нескольких комплексных соединений, включая гликопротеиды, в желательный участок или желательный тип клеток у субъекта, где указанный метод включает введение субъекту одного или нескольких молекулярных комплексных соединений, где каждый комплекс включает указанный гликопротеид и лектин. В особом варианте осуществления гликопротеид представлен антигенной молекулой.

Настоящее изобретение далее предоставляет наборы, включающие множество емкостей, каждая из которых включает фармацевтическое соединение или композицию, включающую дозу молекулярных комплексов изобретения, достаточную для однократного профилактического или терапевтического назначения. Изобретение также предоставляет наборы, включающие емкость, включающую иммунологически и/или биологически активный гликопротеид или его комплексное соединение, и емкость, включающую лектин. В особом варианте осуществления существующее изобретение предоставляет набор, включающий: (a) первая емкость, содержащая композицию, включающую совокупность нековалентных комплексных соединений, где каждый комплекс включает белок теплового шока и антигенную молекулу, где белок теплового шока и/или антигенная молекула гликозилированы; и (b) вторая емкость, содержащая очищенный лектин. Дополнительно, в наборы могут быть включены инструкции для приготовления олигомеризованного комплекса согласно методам изобретения.

Особые терапевтические режимы и фармацевтические композиции также предоставлены в изобретении.

4. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1. Последовательно повышенные уровни Con A в долях комплексных соединений человеческого gp96-пептида. Тканевые гомогенаты от четырех независимых образцов опухоли почки человека (от А до D) были приготовлены и обработаны с помощью колоночной хроматографии с конканавалином A. Элюат Con A был разделен, и половина материала отложена. Оставшаяся проба была буферно разделена в PBS (колонка PD-10), и затем обе пробы дальше очищены в отдельных DEAE колонках с получением двух согласованно гомогенизированных конечных продуктов - один полученный без буферного разделения (no Bx) между Con A и DEAE колонками и один произведенный с буферным разделением (Bx) между двумя колонками. Затем был использован чувствительный к обнаружению Con A ELISA для определения концентрации Con A в этих отдельных пробах комплекса gp96-пептид. Gp96, очищенный от общего гомогената, используя технологию, включающую стадию буферного разделения, имел более высокие уровни Con A, чем были у согласованно гомогенизированной пробы gp96, полученной с исключением стадии буферного обмена.

Фиг.2. Con А присутствует в олигомеризованном молекулярном комплексном соединении. Общий гомогенат из ткани химически индуцированной (Meth A) мышиной фибросаркомы был подготовлен и обработан посредством колоночной хроматографии Con А. Элюат Con A был разделен, и половина материала отложена. Остающаяся проба была буферно обменена в PBS, и затем обе пробы очищены с разделением на DEAE колонках, получая два сочетанно гомогенизированных конечных продукта - один полученный без буферного обмена (no Bx) и один полученный со стадией буферного обмена (Bx) между Con А и DEAE колонками. Обе пробы наряду с пробой свободного Con A (5 мкг, 50 мкг/мл) были SEC фракционированы на колонке Superdex 200 (верхнюю, среднюю, нижнюю соответственно). Собранные фракции были проанализированы на содержание gp96 в соответствии с SDS-PAGE (Фракции 1-8; вкладка) и содержание Con A в отдельных фракциях, оцененных прямым ELISA относительно Con A (фракции 1-14; схема). Небольшое количество Con А было найдено в препарате gp96, полученном без буферного обмена, в то время как gp96, полученный с буферным обменом, показал присутствие Con A во фракциях 1-5. Свободный Con A, элюируемый намного позже предлагаемого Con A, присутствующего в пробе Bx-gp96, не был свободен, а был связан с другими разновидностями с более высокой молекулярной массой.

Фиг.3. Con А является медиатором смещения позиции gp96 в элюции. Общий гомогенат из ткани индуцированной Meth А мышиной фибросаркомы был подготовлен и обработан с использованием процесса, который включал конканавалин А и хроматографию на DEAE колонках. Окончательно очищенный препарат gp96 был разделен на две части. К одной половине материала был добавлен экзогенный конканавалин А до конечной концентрации 50 мкг/мл; буфер был добавлен только к другой половине в качестве контроля, обе пробы культивировались при температуре 37°C в течение 2 часов и затем были SEC фракционированы (Superdex 200). Отдельные фракции были проанализированы на SDS-PAGE с помощью gp96 и конканавалин А-специфичного ELISA. Аналитические данные для материала, произведенного без буферного обмена, показаны на графике слева; данные о материале, к которому был добавлен Con A, - на правом графике. На левом графике пик gp96 находится во фракции 5, и уровни конканавалина A, как выявлено специфичным ELISA, низки. На правом графике (с добавлением Con A) определяется два пика gp96, как показано на SDS-PAGE (вкладка; пиковые фракции 3 (показано стрелкой) и 5), и gp96 ELISA (фракции 3 и 5), так же как видимый пик Con A в центре фракции 3. Con А явился посредником смещения позиции gp96 в элюции.

Фиг.4. Con A коррелирует с активностью для человеческих выборок gp96 in vitro. Пробы gp96 от четырех независимых проб опухоли почки человека (от А до D) были подготовлены, как описано выше (см. фиг.1), образуя четыре парные пробы, отличающиеся только включением или отсутствием операции буферного обмена между Con A и DEAE колонками. Все восемь проб анализировались на содержание Con A (График A; также см. фиг.1) наряду с представлением антигена in vitro, используя систему CD71 (График B). В каждом случае материал, подготовленный по технологии, включающей операцию буферного обмена (и содержащий повышенные уровни Con A), имел более высокую активность по представлению антигена in vitro, чем проба, полученная от аналогичного гомогената опухоли, но подготовленная операцией, в которой стадия буферного обмена была исключена.

Фиг.5. Con А коррелирует с активностью в системе CT26 мышей in vitro. Пробы gp96 были подготовлены от двух независимых проб мышиной опухоли CT26 (Препараты A и B) так, как описано выше при получении проб от человеческой опухоли (см. фиг.1). Все четыре пробы анализировались на содержание Con A (График A) и на представление антигена с использованием системы CT26 in vitro (График B). В каждом случае материал, подготовленный технологией, включающей стадию буферного обмена (и имеющий увеличенное количество Con A), имел более высокую активность in vitro по представлению антигена, чем проба, полученная от соответствующего гомогената опухоли и подготовленная операцией, в которой была опущена стадия буферного обмена.

Фиг.6. Con А коррелирует с анализом in vitro представления Meth А и in vivo активностью в модели защиты Мeth А рака мышей. Два отдельных Меth А gp96 препарата были подготовлены из общего гомогената опухоли (описано выше на Изображении 1), образуя парную пробу, отличающуюся только по включению или отсутствию буферной обменной операции между Con А и DEAE колонками. Эти пробы анализировались Con A ELISA на содержание Con A (График A), активность пробы представления Меth А in vitro (График B) и in vivo пробы защиты Meth A опухоли в дозе 10 мкг (График C). Меth А gp96, полученный по технологии, включающей стадию буферного обмена между Con A и DEAE колонками, увеличил содержание Con A в in vitro представлении антигена и в in vivo активности защиты опухоли выше, чем в подготовленном по технологии, в которой была пропущена стадия буферного обмена.

Фиг.7. Экзогенный Con A увеличивает активность gp96 в CD71 пробе представления in vitro. Человеческая ткань печени была гомогенизирована и центрифугировалась, образуя 11К супернатант, который был разделен на 3 идентичных пробы и обработан различными методами. Две доли были обработаны через Con A колоночную хроматографию, элюат Con A был разделен, и половина материала отложена. Остающаяся проба была буферно обменена в PBS, и затем обе пробы очищены в отдельных DEAE колонках, образуя два сочетанно-гомогенизированных конечных продукта - один произведенный без буферного обмена (no Вх - проба A) и один произведенный со стадией буферного обмена (Вх - проба B) между Con А и DEAE колонками. Gp96 от сохраненного 11K супернатанта был очищен, используя gp96-специфичную scFv колонку, как описано (Arnold-Schild et al., Cancel-Research, 2000, 60(15):4175-4178), и элюат сконцентрирован с получением пробы D. Все пробы были проанализированы на содержание Con A с использованием Con A-специфичного ELISA и на in vitro представление антигена в системе CD71 с концентрацией белка 75 мкг/мл. Для соответствующих отобранных пар материал, произведенный по технологии, включающей стадию буферного обмена (проба #1; содержание Con A 7,5 нг/мкг общего белка), был более активным in vitro, чем материал, произведенный по технологии, в которой стадия буферного обмена была исключена (проба A; содержание Con A 0,43 нг/мкг общего белка). Материал, произведенный одностадийным методом, в котором не использовалась стадия колоночной очистки Con A (scFv gp96; 0 нг/мкг), имел низкую активность in vitro, подобную пробе A. Прибавление экзогенных Con A к пробам A и C до уровней, эквивалентных пробе B (7,5 нг Con A/мкг общего белка), увеличило удельную активность представления антигена in vitro до уровня, присутствующего в пробе B. Этот уровень Con A не оказывал никакого воздействия на отдельные Т-клетки.

Фиг.8. Олигомерная разновидность проявляет метил-α-D-маннопиранозидную (α-ММ) чувствительность. Проба Меth А gp96 была очищена по стандартной технологии очистки, включая Con A и хроматографию DEAE (без буферного обмена), и белок был проанализирован с аналитической SEC, используя колонку Superose 6 (Pharmacia), что показало, что белковый препарат содержит прежде всего димерный gp96 (gp96 T=0). Con А был добавлен (в конечной концентрации 50 мкг/мл) к кратному количеству gp96 из этой пробы (в концентрации 500 мкг/мл), проба культивирована в реальном времени, и были взяты почасовые пробы (с T=1 по T=5) и анализированы SEC. Проба, включающая только Con A, была также обработана. Добавление Con А опосредовало изменение позиции пика димера gp96 в элюции, который только немного изменился после первого временного промежутка. Один gp96 не изменялся в течение этого интервала времени (gp96 T=5). По достижении конечной временной точки были взяты две отдельных определенных количественных пробы итоговой пятичасовой пробы, а также равный объем PBS или PBS, содержащего 10% добавленного α-ММ. Затем каждая проба была повторно проанализирована SEC. Никаких изменений в пробе, к которой была добавлена PBS, выявлено не было (не показано). Добавление α-ММ диссоциировало высокомолекулярное комплексное соединение (gp96+con А T=5+α-ММ), приводя к профильному сходству SEC с оригинальной пробой gp96 (gp96 T=0 или T=5).

Фиг.9. Низкое стехиометрическое соотношение Con А: gp96 опосредует чувствительное к SEC смещение позиции элюции gp96. Gp96 из опухоли почки человека был очищен по стандартной технологии очистки, включая Con А и хроматографию DEAE, и белок анализирован аналитической SEC, используя колонку Superose 6 (Pharmacia). Con А был добавлен в конечной концентрации 0,005-50 мкг/мл к gp96 (180 мкг/мл), проба культивирована при комнатной температуре в течение одного часа и анализирована SEC. Стехиометрии ~1 Con A: 10 gp96 способны генерировать чувствительное к SEC смещение позиции элюции gp96.

Фиг.10. Добавление метил-α-D-маннопиранозида вызывает зависимое от концентрации уменьшение активности CT26 по представлению антигена in vitro. Проба CT26-производных gp96 (подготовленных по технологии Bx) наряду с точно контролируемым 9-мерным пептидом (SPSYVYHQF) были культивированы в течение 30 минут в присутствии 50, 100 или 400 мM α-ММ, предварительно разбавленными (1 к 5) в микротитровальной чашке в гнездах с RAW264.7 APC клеток и AH1-специфичных Т-клеток. Пробы были культивированы в течение ночи, и результирующие супернатанты анализированы специфичным ELISA. α-ММ вызвал дозозависимое уменьшение представления антигена в CT26 и не оказал влияния на Т-клеточное распознавание положительного контроля 9-мерного пептида.

Фиг.11. Добавление Con A в течение очистки Hsp-пептида вызывает титруемое увеличение активности отторжения опухоли HSPPC-96.

Фиг.12. Con A увеличивает активность gp96 по отторжению опухоли. (A) Con A, добавленный в течение очистки Hsp-пептида. (B) Con A, добавленный к конечному продукту.

Фиг.13. Con A увеличивает активность отторжения опухоли HSPPC-96, который был очищен иммуноаффинной колонкой.

5. ДЕТАЛИЗИРОВАННОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к использованию лектина для стимуляции олигомеризации гликопротеида(ов) или иммунологически и/или биологически активного комплексного соединения, включающего гликопротеид(ы). Предпочтительно, биологическая активность гликопротеида является лечебной для субъекта, которому он вводится. В частности, изобретение предоставляет одно или несколько молекулярных комплексных соединений или композиций, включающих одно или больше молекулярных комплексных соединений, где каждое молекулярное комплексное соединение включает лектин и иммунологически активный (то есть иммуногенный) и/или биологически активный гликопротеид (включая гликопептид и гликополипептид). Как будет очевидно специалисту, термины, представленные в единственном числе, такие как лектин, гликопротеид или любая другая молекула, когда используется в контексте комплексного соединения (то есть как составляющая комплексного соединения), относятся к "по крайней мере одному" лектину, "по крайней мере одному" гликопротеиду или "по крайней мере одной" любой другой молекуле соответственно, если явно не обозначено иначе. В некоторых вариантах осуществления молекулярные комплексные соединения по изобретению являются нековалентными молекулярными комплексными соединениями. В некоторых воплощениях молекулярные комплексные соединения по изобретению являются ковалентными молекулярными комплексными соединениями. Также предоставлены методы получения молекулярных комплексных соединений и методы использования молекулярных комплексных соединений или композиций, включающих такие молекулярные комплексы для профилактики и лечения различных болезней (например, рака, инфекционных болезней, анемии, заболеваний, связанных с дефицитами гормона роста, ферментной недостаточностью, состояний иммунной супрессии и т.д.) и для активации иммунного ответа у субъекта, нуждающегося в этом. Изобретение полезно в различных ситуациях, включая, но не ограничиваясь теми, где желательно модулировать биологическую активность иммунотерапевтической и/или биологически активной молекулы; улучшить доставку вакцины в антиген-представляющие клетки через специфичный и/или дополнительный рецептор- или не-рецептор-опосредованные процессы; улучшить доставку иммунотерапевтической и/или биологически активной молекулы к интересующей цели; улучшить полезные характеристики иммунотерапевтической молекулы; или для захвата вторичных иммунотерапевтических/иммуноактивных молекул и доставки их в антиген-представляющую клетку через специфический рецептор-опосредованный захват и в других случаях.

Используемые здесь, если не обозначено иначе, термины "молекула", "комплекс", "молекулярное комплексное соединение", "гликопротеид", "гликопептид", "белок теплового шока", "гликозилированный белок теплового шока" и "лектин", когда используются в единственном числе, также охватывают множество молекул и могут иметь отношение к совокупности упомянутых молекул.

Используемый здесь, если не обозначено иначе, термин "гликопротеид" относится к молекуле, включающей белок и один или несколько углеводных фрагментов. Гликопротеид может быть или гликопротеидом естественного происхождения, или сформированным синтетическим процессом гликозилирования, то есть процессом, при котором углевод присоединяется к белковой молекуле. Гликопротеид может быть или гликопептидом или гликополипептидом. Неограниченное число примеров естественно встречающихся гликопротеидов включают, но без ограничения, гормоны роста человека, эритропоэтин (EPO), антитела, активатор тканевого плазминогена (tPA), колониестимулирующий фактор гранулоцитов (G-CSF), колониестимулирующий фактор гранулоцитов-макрофагов (GM-CSF), глюкоцереброзидазу (Церезим™ от Genzyme) и другие. В предпочтительном варианте осуществления гликопротеид является белком теплового шока. В другом предпочтительном варианте осуществления гликопротеид представлен иммуноактивным белком теплового шока. Используемый здесь термин "иммуноактивный белок теплового шока" относится к белкам теплового шока, которые способны модулировать, предпочтительно усиливать иммунный ответ, предпочтительно иммунный ответ, направленный против антигенной молекулы, с которой белок теплового шока образует комплекс. Используемый здесь термин "антигенная молекула" относится к молекуле, которая образует одну или больше антигенных детерминант, в отношении которых иммунный ответ желателен у субъекта (например, для терапевтических целей). Неограниченные примеры антигенных молекул даются в Разделе 5.2. В предпочтительном варианте осуществления гликопротеид представлен гликозилированным белком теплового шока, включая gp96, GRP170, кальретикулин, Bip (GRP78) и другие. Предпочтительно, гликозилированным белком теплового шока является gp96. В определенных вариантах осуществления гликопротеид может также быть антигенной молекулой, которая может быть естественно образованным гликопротеидом или антигенной молекулой, которая конструируется в гликопротеид. Неограниченные примеры антигенных молекул описаны в Разделе 5.2. В некоторых воплощениях молекулярное комплексное соединение по изобретению включает лектин и гликопротеид, который не денатурирован.

Белок (включая пептид и полипептид) может быть генетически сконструирован как гликопротеид путем добавления одного или больше сайтов гликозилирования, которые не присутствуют в нативной последовательности аминокислот и рекомбинантной экспрессии белка в клетке организма, которая может гликозилировать белки. Гликозилирование белка обычно или N-сопряженная или O-сопряженная. Термин "N-сопряженная" относится к случаю присоединения углеводной группы к боковой цепи остатка аспарагина. Трипептидные последовательности аспарагин-Х-серин и аспарагин-Х-треонин, где Х представляет собой любую аминокислоту, исключая пролин, являются распознающими последовательностями для ферментативного присоединения углеводной группы к боковой цепи аспарагина. Таким образом, наличие любой из этих трипептидных последовательностей в полипептиде создает потенциальный сайт гликозилирования. Термин "гликозилирование O-сопряженная" относится к добавлению одного из сахаров типа N-ацетилгалактозамина, галактозы или ксилозы к гидроксиламинокислоте, обычно сывороточной или треонину, хотя 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин может также использоваться.

Добавление сайтов гликозилирования может быть достигнуто различными способами. Например, последовательность аминокислот белка или интересующего пептида может быть изменена так, что будет содержать один или больше вышеописанных трипептидных последовательностей (для сайтов N-опосредованного гликозилирования). Преобразование может также быть осуществлено прибавлением или замещением одного или нескольких остатков серина или треонина к нативной последовательности (для сайтов O-опосредованного гликозилирования). Последовательность аминокислот может быть необязательно преобразована посредством изменений на уровне ДНК, в частности мутированием ДНК, кодирующей интересующий белок в предварительно отобранных основаниях, так что полученные кодоны будут осуществлять трансляцию в направлении желаемых аминокислот. Мутации ДНК могут быть осуществлены, например, с использованием методов, описанных в патенте США № 5364934.

Другой способ увеличения количества углеводных фрагментов в белке (включая пептид и полипептид) осуществляется путем химического или ферментативного соединения гликозидов с белком. В зависимости от используемого метода соединения сахар(а) может(гут) быть присоединен(ы) к (a) аргинину и гистидину, (b) свободным карбоксильным группам, (c) свободным сульфгидрильным группам, таким как имеющимся у цистеина, (d) свободным гидроксильным группам, таким как имеющимся у серина, треонина или гидроксипролина, (e) ароматическим остаткам, таким как имеющимся у фенилаланина, тирозина или триптофана, или (f) амидной группе глутамина. Могут быть использованы любые методы, известные в данной области, такие как методы, описанные в международной публикации № WO 87/05330 и в Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., стр. 259-306 (1981). Как только один или несколько углеводов присоединяются к белку, лектин может формировать комплексное соединение с белком, прикрепляясь к углеводным фрагментам.

В некоторых вариантах осуществления изобретения гликопротеид проявляет антигенную активность антигена определенного типа раковой опухоли или антигена возбудителя инфекционного заболевания. В некоторых других вариантах осуществления изобретения гликопротеид не проявляет антигенную активность антигена определенного типа раковой опухоли или антигена возбудителя инфекционного заболевания. В некоторых вариантах осуществления гликопротеид представлен белком теплового шока и белком, который сопровождает белок теплового шока (in vivo), или объединен с проявлением антигенной активности антигена определенного типа раковой опухоли или антигена возбудителя инфекционного заболевания.

Используемый здесь термин "антигенная активность" относится к способности молекулы связывать антитело или молекулы главного комплекса гистосовместимости. Используемое здесь словосочетание "антигена определенного типа раковой опухоли " относится к типу клеток ткани, формирующей опухоль, например молочная железа, легкое, яичник. В одном варианте осуществления антигенная молекула проявляет антигенную активность антигена инфекционного агента. В другом варианте осуществления антигенная молекула проявляет антигенную активность антигена, продуцируемого в более высоком количестве в раковой клетке относительно его экспрессии в нераковой клетке указанного типа клеток. В другом варианте осуществления антигенная молекула является специфическим антигеном опухоли или связанным с опухолью антигеном. В другом варианте осуществления молекулярное комплексное соединение очищено. В еще одном варианте осуществления очищенное молекулярное комплексное соединение включает лектин, связанный с белком теплового шока, и антигенную молекулу возбудителя инфекции или антиген, повышенно продуцируемый в раковой клетке относительно его экспрессии в нераковой клетке указанного типа клеток.

В данной области известны многие лектины. Термин "лектин" относится к совокупности белков, которые проявляют общее свойство связываться со специфичными углеводными группами. Лектин может быть выделен из природных источников, таких как растения, животные, грибы, морские водоросли и бактерии, или он может синтезироваться химическим способом. В определенных вариантах осуществления лектины поперечно связаны друг с другом любым методом, известным в области техники, формируя димер или олигомер для использования в настоящем изобретении. В предпочтительном варианте осуществления молекула лектина представлена маннозо-связывающим лектином, который может быть таким, но не ограничиваясь указанными, как внесенные в список в Таблице 1. Лектины доступны в продаже от многих коммерческих продавцов, таких как Sigma (см. вебсайт Sigma sigmaaldrich.com/Brands/Sigma/Enzyme_Explorer_Home/Lectin_for_life_Science.html). В предпочтительном варианте осуществления лектин представлен конканавалином A (Con A).

Таблица 1
Примеры лектинов
Продукт Sigma No.:	ЛЕКТИН:	Мол. Масса (кДа):	Под- группы:	Специфичная группа крови:	Специфичный углевод:	Митогенная активность:
L5640	Agaricus bisporus	58,5	-	-	β-gal(1->3)galNAc
L4141	Anguilla anguilla	40	2	H	α-L-Fuc
L0881	Arachis hypogaea	120	4	T	β-gal(1->3)galNAc
L7759	конъюгат
L6135	конъюгат
L7381	конъюгат
L3766	конъюгат
L6646	конъюгат
L3515	Artocarpus integrifolia	42	4	T	α-gal->Ome	(+)
L4650	конъюгат
L5147	конъюгат
Bandeiraea Simplicifolia
L2380	BS-I	114	4	A, B	α-gal, α-galNAc
L3759	конъюгат
L9381	конъюгат
L5264	конъюгат
L1509	BS-I-A4	114	4	A	α-galNAc
L0890	конъюгат
L3019	BS-I-B4	114	4	B	α-gal
L5391	конъюгат
L2140	конъюгат
L2895	конъюгат
L6013	Bauhinia purpurea	195	4	-	β-gal(1->3)galNAc	(+)
L9637	Caragana arborescens	60; 120(c)	2; 4	-	GalNAc
L3141	Cicer arietinum	44	2	-	Fetuin
L2638	Codium fragile	60	4	-	GalNAc
L7275	Конканавалин А	102	4	-	α-man, α-glc	(+)
L6397	конъюгат
C2272	конъюгат
C7642	конъюгат
C6904	конъюгат
C9017	конъюгат
L5021	конъюгат
L3642	конъюгат
C7898	конъюгат
L3885	Сукцинил-конканавалин A	51	2	-	α-man, α-glc	(+) (d)
L9385	конъюгат
L2766	Datura stramonium	86	2(α&β)α	-	(glcNAc)2
L2785	Dolichos biflorus	140	4	A1	α-galNAc
L1287	конъюгат
L6533	конъюгат
L9142	конъюгат
L9658	конъюгат
L9894	конъюгат
L2142	Erythrina corallodendron	60	2	-	β-gal(1->4)glcNAc	(+)
L5390	Erythrina cristagalli	56,8	2(α&β)a	-	β-gal(1->4)glcNAc
L7400	Euonymus europaeus	166	4(α&β)a	B,H	α-gal(1->3)gal	(+)
L8725	Galanthus nivalis	52	4	(h)	non-reduc. D-man
L8775	конъюгат
L1395	Глицин максимальный	110	4	-	galNAc	(+) (b)
L2650	конъюгат
L4511	конъюгат
L1105	конъюгат
L6635	Helix aspersa	79	-	A	galNAc
L8764	конъюгат
L3382	Helix pomatia	79	6	A	galNAc
L6387	конъюгат
L6512	конъюгат
L1034	конъюгат
L1261	конъюгат
L9267	Lens culinaris	49	2	-	α-man	(+)
L4143	конъюгат
L9262	конъюгат
L0511	конъюгат
L2263	Limulus polyphemus	400	18	-	NeuNAc
L2886	Lycopersicon esculentum	71	-	-	(glcNAc)3	(+)(e)
L0651	конъюгат
L0401	конъюгат
L8025	Maackia amurensis	130	2(α&β)	O	сиаловая кислота	(+)
L6141	Maclura pomifera	40-43	2(α&β)a	-	α-gal, α-galNAc
L4401	конъюгат
L2013	конъюгат
L5650	Narcissus pseudonarcissus	26	2	(h)	α-D-man
L3138	Рhaseolus coccineus	112	4	-	-
L4389	конъюгат
Phaseolus Vulgaris
L8629	PHA-E	128	4	-	олигосахарид	(+)
L6139	конъюгат
L2769	PHA-L	126	4	-	олигосахарид	(+)
L8754	PHA-P
L2646	PHA-M
L9379	Phytolacca americana	32f	-	-	(glcNAc)3	(+)
L2882	конъюгат
L5380	Pisum sativum	49	4(α&β)a	-	α-man	(+)
L0770	конъюгат
L9895	Синегойная палочка (PA-I)	13-13,7	-	-	gal
L2138	Psophocarpus tetragonolobus	35	1	-	galNAc, gal
L3139	конъюгат
L3014	конъюгат
L3264	конъюгат
Ricinus Communis
L7886	Агглютинин, RCA₁₂₀	120	4	-	β-gal
L2390	конъюгат
L2758	конъюгат
L9514	Рицин, A цепь
L4022	Рицин, A цепь, дегликозилирован
L9639	Рицин, B цепь
L6890	Sambucus nigra
L4266	Solanum tuberosum
L9254	Tetragonolobus purpureas	120(A), 58(B), 117(C)	4;2;4	H	α-L-fuc
L5759	конъюгат
L3134	конъюгат
L5644	конъюгат
L9640	Triticum vulgaris	36	2	-	(glcNAc)2, NeuNAc	(+)
L3892	конъюгат
L0390	конъюгат
L5142	конъюгат
L4895	конъюгат
L9884	конъюгат
L1894	конъюгат
L1882	конъюгат
Ulex Europaeus
L5505	UEAI	68	-	H	α-L-fuc
L8146	конъюгат
L8262	конъюгат
L9006	конъюгат
L4889	конъюгат
L6263	Vicia faba	50	4(α&β)a	-	man, glc	(+)
L4011	Vicia villosa	139	4a	A₁+T_n	galNAc
L9388	конъюгат
L7513	Изолектин B4	143	4	T_n	galNAc
L7888	конъюгат
L2662	Viscum album	115g	4(α&β)a	-	β-gal
	Wisteria floribunda	68	2	-	galNAc
L1516	конъюгат
L2016	Редуцированный	34	1	-	galNAc
L1766	конъюгат

Настоящее изобретение предоставляет молекулярные комплексные соединения, включающие лектин и гликопротеид (который может быть или не быть антигенной молекулой), и молекулярные комплексные соединения, включающие лектин, гликопротеид, а также молекулу (например, антигенную молекулу), которая не является гликопротеидом. Каждый молекулярный комплекс изобретения может включать одну или несколько молекул гликопротеида, одну или несколько молекул лектина и одну или несколько антигенных молекул, если они присутствуют в комплексном соединении. Предпочтительно, комплексное соединение включает более чем одну молекулу гликопротеида, которые формируют олигомеры в присутствии лектина. Когда молекулярные комплексы включают несколько гликопротеидов, гликопротеиды могут не быть гомогенными, то есть некоторые из гликопротеидов в совокупности являются антигенными молекулами, а некоторые из гликопротеидов не являются антигенными молекулами. Стехиометрия компонентов молекулярного комплекса изобретения может быть представлена соотношениями (g): (l): (a), где (g), (l) и (a) могут быть любыми целыми числами, и (g) - количество молекул гликопротеида (который может быть или не быть антигенной молекулой) в комплексном соединении, (l) - количество молекул лектина в комплексном соединении, и (a) - количество других молекул (например, антигенных молекул, не являющихся гликопротеидами) в комплексном соединении. В комплексных соединениях, где нет никаких других молекул (например, нет антигенных молекул, не являющихся гликопротеидами), а=0. Например, молекулярное комплексное соединение может включать один гликопротеид (который может быть или не быть антигенной молекулой) и один лектин. В другом примере молекулярное комплексное соединение может включать один лектин, два белка теплового шока и две антигенные молекулы. Существует много комбинаций, которые охватываются настоящим изобретением. В предпочтительном варианте осуществления l больше чем g, то есть количество присутствующих лектинов в молекулярном комплексе больше, чем количество гликопротеидов, которые присутствуют в молекулярном комплексе. В некоторых вариантах осуществления мольное отношение между гликопротеидом и лектином - 3:1, 2:1 или 1:1. В предпочтительном варианте осуществления лектин представляет собой Con A в форме тетрамера, и к каждой молекуле тетрамера Con A присоединено три, два или один гликопротеид(а).

Соответственно, в одном варианте осуществления изобретение предоставляет гомогенную совокупность комплексных соединений, где стехиометрические отношения (g):(l):(a) для всех комплексных соединений идентичны или приблизительно равны. В другом варианте осуществления изобретение предоставляет совокупность комплексных соединений, где комплексные соединения имеют больше чем одно соотношение (g):(l):(a) или соотношения не известны для всех комплексных соединений в совокупности, то есть стехиометрия компонентов молекулярного комплексного соединения по изобретению может изменяться в молекулярных комплексных соединениях в совокупности. В вариантах осуществления изобретения, где стехиометрические отношения комплексного соединения или совокупности комплексных соединений не были определены, массовые соотношения каждого компонента могут использоваться в большинстве случаев для характеристики комплексного соединения или совокупности комплексных соединений. Например, совокупность комплексных соединений может быть охарактеризована и таким образом отличена от других совокупностей относительными количествами лектинов и гликопротеидов (включая белки теплового шока). Примеры таких комплексных соединений и методов для определения массовых соотношений приведены ниже в Разделе 5.4. В некоторых вариантах осуществления комплексное соединение, включающее белок теплового шока, лектин и антигенную молекулу, где количество лектина относительно белка теплового шока больше или равно 5 нг, 10 нг, 20 нг, 30 нг, 40 нг, 50 нг, 75 нг, 100 нг или 200 нг на микрограмм белка теплового шока, является предпочтительным. В других вариантах осуществления комплексное соединение, включающее белок теплового шока, лектин и антигенную молекулу, где количество лектина относительно белка теплового шока меньше или равно 5 нг, 4 нг, 3 нг, 2 нг или 1 нг, является предпочтительным.

В предпочтительном варианте осуществления молекулярное комплексное соединение включает лектин, гликозилированный белок теплового шока и белок, который проявляет антигенную активность антигена определенного типа раковой опухоли или антигена возбудителя инфекционного заболевания. В другом предпочтительном варианте осуществления молекулярное комплексное соединение включает лектин и иммунологически и/или биологически активный гликопротеид, где указанный иммунологически и/или биологически активный гликопротеид может быть человеческими гормонами роста, эритропоэтином (EPO), терапевтическими антителами, тканевым активатором плазмогена (tPA), колониестимулирующим фактором гранулоцитов (G-CSF), колониестимулирующим фактором гранулоцитов-макрофагов (GM-CSF), Церезимом™ (Genzyme) и другими веществами. В другом предпочтительном варианте осуществления молекулярное комплексное соединение включает лектин и иммунологически и/или биологически активный гликопротеид, где указанный иммунологически и/или биологически активный гликопротеид представлен антигенной молекулой.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет один или больше молекулярных комплексов, каждое комплексное соединение включает лектин и иммунологически и/или биологически активный гликопротеид, где лектин формирует олигомеры с гликопротеидом и где количество присутствующего лектина в комплексном соединении относительно количества гликопротеида равно или больше чем 1 фг, 100 фг, 500 фг, 1 пг, 100 пг, 500 пг, 1 нг, 2 нг, 5 нг, 10 нг, 20 нг, 30 нг, 40 нг, 50 нг, 75 нг, 100 нг или 200 нг на микрограмм гликопротеида. Предпочтительно, количество присутствующего лектина в комплексе относительно количества гликопротеида составляет 40 нг-1000 нг, 50 нг-1000 нг, 50 нг-500 нг, 100 нг-250 нг или 150 нг-200 нг лектина на микрограмм гликопротеида. В некоторых вариантах осуществления количество присутствующего лектина в комплексном соединении относительно количества гликопротеида равно или меньше чем 5 нг на микрограмм гликопротеида. Предпочтительное содержание лектина, находящегося в комплексном соединении, относительно количества гликопротеида составляет между 0,1 нг-5 нг, 0,2 нг-4 нг, 0,3 нг-3 нг, 0,5 нг-2 нг или 0,1 нг-1 нг лектина на микрограмм гликопротеида. Молекулярное комплексное соединение может в дальнейшем включать одну или больше других молекул, предпочтительно белки (включая пептиды и полипептиды), которые проявляют антигенную активность антигена определенного типа раковой опухоли или антигена возбудителя инфекционного заболевания. В некоторых вариантах осуществления гликопротеид представлен белком теплового шока. В некоторых вариантах осуществления гликопротеид не является белком теплового шока. В некоторых вариантах осуществления гликопротеид является антигенной молекулой. В некоторых вариантах осуществления гликопротеид не является антигенной молекулой.

Настоящее изобретение также предоставляет одно или несколько молекулярных комплексных соединений, каждое комплексное соединение включает белок теплового шока, антигенную молекулу и лектин, где количество присутствующего в комплексе лектина относительно количества белка теплового шока равно или больше чем 5 нг, 10 нг, 20 нг, 30 нг, 40 нг, 50 нг, 75 нг, 100 нг или 200 нг на микрограмм белка теплового шока. Предпочтительно, количество присутствующего в комплексном соединении лектина относительно количества белка теплового шока составляет 40 нг-1000 нг, 50 нг-1000 нг, 50 нг-500 нг, 100 нг-250 нг или 150 нг-200 нг лектина на микрограмм белка теплового шока. В некоторых вариантах осуществления количество присутствующего в комплексном соединении лектина относительно количества белка теплового шока равно или меньше чем 5 нг на микрограмм белка теплового шока. Предпочтительно, количество присутствующего в комплексном соединении лектина относительно количества белка теплового шока составляет между 0,1 нг-5 нг, 0,2 нг-4 нг, 0,5 нг-3 нг, 0,5 нг-2 нг или 0,1 нг-1 нг лектина на микрограмм белка теплового шока.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет фармацевтическую композицию, включающую одно или несколько молекулярных комплексных соединений и фармацевтически допустимый носитель, где каждое молекулярное комплексное соединение - нековалентное комплексное соединение, включающее лектин и иммунологически и/или биологический активный гликопротеид. В некоторых вариантах осуществления гликопротеид представлен белком теплового шока, и количество присутствующего в комплексном соединении лектина относительно количества белка теплового шока равно или больше чем 5 нг, 10 нг, 20 нг, 30 нг, 40 нг, 50 нг, 75 нг, 100 нг или 200 нг на микрограмм белка теплового шока. Предпочтительно, количество присутствующего в комплексном соединении лектина относительно количества белка теплового шока - 40 нг-1000 нг, 50 нг-1000 нг, 50 нг-500 нг, 100 нг-250 нг или 150 нг-200 нг лектина на микрограмм белка теплового шока. В некоторых вариантах осуществления количество присутствующего в комплексном соединении лектина относительно количества белка теплового шока равно или меньше чем 5 нг на микрограмм белка теплового шока. Предпочтительно, количество присутствующего в комплексном соединении лектина относительно количества белка теплового шока составляет 0,1 нг-5 нг, 0,2 нг-4 нг, 0,3 нг-3 нг, 0,5 нг-2 нг или 0,1 нг-1 нг лектина на микрограмм белка теплового шока. Молекулярное комплексное соединение может в дальнейшем включить одну или несколько молекул, предпочтительно, белков, которые проявляют антигенную активность антигена определенного типа раковой опухоли или антигена возбудителя инфекционного заболевания.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет очищенную совокупность молекулярных комплексных соединений, в которых каждый комплекс включает иммунологически и/или биологически активный гликопротеид и лектин. В некоторых вариантах осуществления гликопротеид является белком теплового шока, и количество присутствующего в совокупности лектина относительно количества белка теплового шока равно или больше чем 5 нг, 10 нг, 20 нг, 30 нг, 40 нг, 50 нг, 75 нг, 100 нг или 200 нг на микрограмм белка теплового шока. Предпочтительно, количество присутствующего в совокупности лектина относительно количества белка теплового шока - 40 нг-1000 нг, 50 нг-1000 нг, 50 нг-500 нг, 100 нг-250 нг или 150 нг-200 нг лектина на микрограмм белка теплового шока. В некоторых вариантах осуществления количество присутствующего в совокупности лектина относительно количества белка теплового шока равно или меньше чем 5 нг на микрограмм белка теплового шока. Предпочтительно, количество присутствующего в совокупности лектина относительно количества белка теплового шока 0,1 нг-5 нг, 0,2 нг-4 нг, 0,3 нг-3 нг, 0,5 нг-2 нг или 0,1 нг-10 нг лектина на микрограмм белка теплового шока. Молекулярное комплексное соединение может далее включить одну или несколько молекул, например белки (включая пептиды и полипептиды), которые проявляют антигенную активность антигена определенного типа раковой опухоли или антигена возбудителя инфекционного заболевания. В одном варианте осуществления молекулярные комплексные соединения совокупности включают одну и ту же антигенную молекулу. В другом варианте осуществления молекулярные комплексные соединения совокупности включают другую антигенную молекулу. Также предоставленная изобретением является очищенная совокупность молекулярных комплексных соединений, включающих лектин, связанный с комплексным соединением, очищенным от рекомбинантной клетки, в которой каждое комплексное соединение включает гликопротеид, связанный с белком, проявляющим антигенную активность антигена определенного типа раковой опухоли или антигена возбудителя инфекционного заболевания.

Настоящее изобретение также предоставляет способы получения композиции, которая является наиболее иммуногенной против определенного заболевания (например, против определенного типа раковой опухоли или возбудителя инфекционного заболевания), включая операцию присоединения молекул лектина для стимуляции олигомеризации молекулярного комплексного соединения, где указанное молекулярное комплексное соединение изготовлено методом, описанным в разделе 5.1.-5.4. описания, или методом, известным в уровне техники. В одном варианте осуществления олигомеризованое молекулярное комплексное соединение включает лектин и иммунологически и/или биологически активный гликопротеид (который может быть или не быть антигенной молекулой). В другом варианте осуществления олигомеризованый молекулярный комплекс включает лектин, гликопротеид и антигенную молекулу, где указанная антигенная молекула проявляет антигенную активность антигена определенного типа раковой опухоли или антигена возбудителя инфекционного заболевания. В другом варианте осуществления олигомеризованное молекулярное комплексное соединение включает лектин, белок теплового шока и иммунологически и/или биологически активный гликопротеид. В еще одном варианте осуществления молекулярное комплексное соединение включает лектин, гликозилированный белок теплового шока и антигенную молекулу, где указанная антигенная молекула проявляет антигенную активность антигена определенного типа раковой опухоли или антигена возбудителя инфекционного заболевания. Изобретение далее предоставляет композиции, изготовленные описанными методами.

В одном варианте осуществления стадии подготовки иммунологически и/или биологически активного гликопротеида или комплексного соединения, включающего иммунологически и/или биологически активный гликопротеид, связанный с одной или большим количеством других молекул, которые не являются лектинами, не включают использование лектинов, таких как лектинов, связанных с твердой фазой, обычно используемых в хроматографии на колонках. Лектин добавлен к иммунологически и/или биологически активному гликопротеиду или комплексному препарату для стимуляции олигомеризации гликопротеидов. В другом варианте осуществления добавление лектина является одной из стадий или частью стадии при получении иммунологически и/или биологически активного гликопротеида (или гликопротеида, связанного с одной или большим числом других молекул, которые не являются лектином), где количество добавленного лектина достаточно, чтобы вызвать олигомеризацию препарата и произвести конечный продукт или продукты. В некоторых вариантах осуществления молекулярное комплексное соединение включает белок теплового шока и лектин, и лектин добавлен так, что количество лектина, находящегося в конечном продукте(ах), относительно количества белка теплового шока равно или больше чем 5 нг, 10 нг, 20 нг, 30 нг, 40 нг, 50 нг, 75 нг, 100 нг или 200 нг на микрограмм белка теплового шока. Предпочтительно, количество лектина, присутствующего в конечном продукте(ах), относительно количества белка теплового шока составляет 40 нг-1000 нг, 50 нг-1000 нг, 50 нг-500 нг, 100 нг-250 нг или 150 нг-200 нг лектина на микрограмм белка теплового шока. В некоторых вариантах осуществления количества добавленного лектина достаточно, чтобы вызвать олигомеризацию препарата и получить конечный продукт или продукты, где количество находящегося лектина в конечном продукте(ах) относительно количества белка теплового шока равно или меньше чем 5 нг на микрограмм белка теплового шока. Предпочтительно, количество присутствующего в конечном продукте (ах) лектина относительно количества белка теплового шока находится между 0,1 нг-5 нг, 0,2 нг-4 нг, 0,3 нг-3 нг, 0,5 нг-2 нг или 0,1 нг-1 нг лектина на микрограмм белка теплового шока. В предпочтительном варианте осуществления лектин является Con А.

В предпочтительном варианте осуществления указанный гликопротеид - гликозилированный белок теплового шока (Hsp), включающий и естественно встречающиеся гликозилированные белки теплового шока (например, gp96, GRP170, кальретикулин, Bip (GRP78) или их комбинацию), и белки теплового шока, которые естественно не гликозилированы, а преобразованы в гликопротеид добавлением одного или нескольких сайтов гликозилирования, которые не присутствуют в нативных последовательностях, кодирующих белок теплового шока, сопровождаемым присоединением углеводных групп. Иммунологически и/или биологически активное комплексное соединение может дополнительно включать молекулу, которая проявляет антигенную активность антигена определенного типа раковой опухоли или антигена возбудителя инфекционного заболевания. В вариантах осуществления, где антигенные молекулы представлены белками, связанными в комплекс с белками теплового шока in vivo, комплексные соединения могут быть изолированы от клеток (см. Раздел 5.1). Альтернативно, комплексное соединение белок теплового шока - антиген может быть получено in vitro из очищенных препаратов белков теплового шока и антигенных молекул (см. Раздел 5.3.). В этом варианте осуществления антигены раковых опухолей или возбудителей инфекции могут быть получены очисткой из естественных источников, химическим синтезом или рекомбинантно. Лектины могут формировать олигомеры и с in vivo и с in vitro произведенным комплексом "белок теплового шока-антиген" посредством in vitro технологических процедур, таких как описанные в Разделах 5.1.-5.4. В предпочтительном варианте осуществления указанный лектин является маннозо-связывающей молекулой лектина. Более предпочтительно, когда связанная маннозо-связывающая молекула лектина представлена конканавалином А (Con A).

Композиции и методы настоящего изобретения могут использоваться в различных ситуациях. Например, композиция изобретения может использоваться для усиления иммуногенности молекулярного комплексного соединения и/или формирования иммунного ответа у субъекта при лечении или профилактике заболевания (например, рака, инфекционного заболевания, анемии, заболеваний, связанных с недостаточностью гормона роста, ферментной недостаточностью или состояния иммунной супрессии). Используемый здесь термин "субъект" относится к животному, предпочтительно млекопитающему, более предпочтительно человеку, имеющему заболевание или имеющему склонность к болезни.

В соответствии с изобретением воздействие олигомеризованных иммунологически и/или биологически активных комплексных соединений на субъекта приводит к формированию, стимуляции, модуляции (включая усиление и низкоуровневую регуляцию) и/или поддержке иммунного ответа и/или биологической активности у субъекта, особенно в отношении антигенных белков, характерных для интересуемого источника антигена. Олигомеризованый комплекс может применяться в однократной дозе или в виде многократных доз. Профилактическая или терапевтическая доза может отличаться для различных субъектов и различных терапевтических или профилактических применений средства.

В одном варианте осуществления изобретение предоставляет метод индукции иммунного ответа субиммуногенным количеством вакцинной композиции, где олигомеризация способствует индукции иммунного ответа вакцинной композицией в количестве, которой иначе недостаточно для индукции иммунного ответа, когда используется без олигомеризации.

Настоящее изобретение может также использоваться для усиления биологической активности иммунотерапевтической и/или биологически активной молекулы при присоединении лектина для формирования олигомера. Используемый здесь термин "иммунотерапевтическая молекула" относится к молекуле, которая является частью иммунотерапевтического комплексного соединения. Используемый здесь термин "олигомер" относится к комплексу из двух или нескольких элементов (например, комплексное соединение, включающее одну молекулу лектина и одну молекулу HSP, или комплексное соединение, включающее одну молекулу лектина и две молекулы HSP, и т.д.). В одном варианте осуществления олигомер изобретения - это димер, включающий иммунотерапевтические и/или биологически активные молекулы и лектин. В другом варианте осуществления иммунотерапевтические и/или биологически активные молекулы формируют разновидности более высокого порядка, то есть олигомер с более чем двумя субъединицами. Согласно изобретению олигомеризация иммунотерапевтической и/или биологически активной молекулы увеличивает ее биологическую активность. В предпочтительном варианте осуществления олигомер изобретения включает молекулу лектина и gp96.

Настоящее изобретение может быть также применено для увеличения поглощения вакцины антиген-представляющими клетками (APC) путем рецептор-опосредованных процессов, в то время как, не ограниченное какой-либо теорией, одно из возможных объяснений увеличенного вакцинного поглощения в APC путем рецептор-опосредованных процессов является то, что большее число субъединиц олигомера в иммунологически и/или биологически активном комплексном соединении увеличивает взаимодействия с рецепторами на поверхности антиген-представляющих клеток по сравнению с неолигомеризованным комплексным соединением, где только одна субъединица взаимодействует с рецептором. В специфичном варианте осуществления рецептором является CD91.

Настоящее изобретение может также быть применено для усиления поглощения вакцины в антиген-представляющих клетках посредством явлений, не опосредованных рецептором. Некоторые иммунологически и/или биологически активные комплексные соединения, включающие гликопротеиды, не функционируют через опосредованные рецептором явления. Кроме того, даже когда иммунологически и/или биологически активное комплексное соединение проявляет некоторые из его функций через опосредуемые рецептором явления, оно может, тем не менее, проявлять те же самые или некоторые другие функции через явления, не опосредованные рецептором. Например, белок теплового шока, связавший антигенные пептиды, может быть захвачен антиген-представляющими клетками с помощью явлений, не опосредованных рецептором, включая, но не ограничиваясь указанным, пиноцитоз, фагоцитоз, неспецифичные взаимодействия с компонентами поверхности клетки и других явлений с последующим поглощением и/или транслокацией комплексов Hsp-пептид через мембрану клетки. В соответствии с изобретением олигомеризация будет усиливать такое поглощение. Олигомеризация биологически активных молекул также увеличивает их доставку к целевому участку.

В специфичном варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет метод доставки антигенной молекулы в иммунную систему субъекта, включая применение молекулярного комплекса, включающего лектин и указанную антигенную молекулу, где антигенная молекула является или естественно встречающимся гликопротеидом или белком, который был создан, как гликопротеид.

Настоящее изобретение может также использоваться для улучшения адъювантных свойств иммунотерапевтической молекулы. Используемый здесь термин "адъювантные свойства" относится к способностям неантигенного вещества, которое, в комбинации с антигеном усиливает иммунный ответ, например, индуцируя воспалительную реакцию, которая приводит к локальному поступлению иммуноактивных клеток, таких как антитело-продуцирующие клетки и Т-лимфоциты. Иммунотерапевтические молекулы с адъювантными свойствами используются терапевтически для получения вакцин, так как они увеличивают продукцию антител при малых количествах антигена и удлиняют период продукции антител и/или уровень клеточного иммунного ответа (например, Т-лимфоцитарного), в то время как, не связанная с какой-либо теорией, олигомеризация иммунотерапевтических и/или биологически активных молекул увеличивает их адъювантные свойства. Используемый здесь термин иммунотерапевтическая и/или биологически активная молекула относится к гликопротеиду (включая естественно встречающийся гликопротеид и химически синтезируемый гликопротеид). В предпочтительном варианте осуществления гликопротеид представлен гликозилированным белком теплового шока, включая gp96, GRP170, кальретикулин, Bip (GRP78) и другие или их комбинации.

Настоящее изобретение может также использоваться для улучшения доставки иммунотерапевтической и/или биологически активной молекулы. Не ограниченная какой-либо теорией, олигомеризация иммунотерапевтической и/или биологически активной молекулы может дать возможность комплексному соединению использовать альтернативные и более эффективные пути к областям воздействия (например, органы, такие как почки, легкие, печень, сердце; ткани; или клетки, такие как антиген-представляющие клетки, эритроциты ("RBC"), макрофаги, лимфоциты, или клетки, которые вовлечены в специфический сигнальный путь передачи).

Настоящее изобретение далее предоставляет метод поглощения вторичных иммунотерапевтических молекул и доставки указанных молекул в антиген-представляющую клетку посредством рецептор-опосредованного захвата у субъекта, включающий введение к субъекту композиции молекулярного комплекса, где указанный молекулярный комплекс включает первый гликопротеид, олигомеризованный со вторым гликопротеидом, в присутствии молекул лектина, где количество присутствующего в композиции лектина относительно количества гликопротеида равно или больше чем 5 нг, 10 нг, 20 нг, 30 нг, 40 нг, 50 нг, 75 нг, 100 нг или 200 нг на микрограмм гликопротеида. Предпочтительно, количество находящегося в композиции лектина относительно количества гликопротеида - 40 нг-1000 нг, 50 нг-1000 нг, 50 нг-500 нг, 100 нг-250 нг или 150 нг-200 нг лектина на микрограмм гликопротеида. В некоторых вариантах осуществления количество находящегося в композиции лектина относительно количества гликопротеида равно или меньше чем 5 нг на микрограмм гликопротеида. Предпочтительно, количество находящегося в композиции лектина относительно количества гликопротеида составляет между 0,1 нг-5 нг, 0,2 нг-4 нг, 0,5 нг-3 нг, 0,5 нг-2 нг или 0,1 нг-1 нг лектина на микрограмм гликопротеида. Молекулярное комплексное соединение может дополнительно включать одну или несколько молекул, предпочтительно пептидов, которые проявляют антигенную активность антигена определенного типа раковой опухоли или антигена возбудителя инфекционного заболевания. В одном варианте осуществления второй гликопротеид отличается от первого гликопротеида. В другом варианте осуществления первый гликопротеид может поглощаться антиген-представляющей клеткой, а второй гликопротеид обычно не может быть поглощен антиген-представляющей клеткой или другими клетками-мишенями, как описано ранее, и олигомеризация первого гликопротеида со вторым гликопротеидом позволяет второму гликопротеиду поглощаться антиген-представляющей клеткой.

В специфичном варианте осуществления первый гликопротеид - это элемент гликозилированного белка теплового шока, и второй гликопротеид выбран из той же самой группы, но он отличается от первого элемента. В другом варианте осуществления первый гликопротеид относится к группе гликозилированных белков теплового шока, и второй гликопротеид не является белком теплового шока. В другом варианте осуществления первый гликопротеид не является белком теплового шока, а второй гликопротеид представляет собой белок теплового шока. В еще одном варианте осуществления ни первый, ни второй гликопротеид не являются белками теплового шока. В предпочтительном варианте осуществления первый гликопротеид дополнительно связан с антигенной молекулой, которая проявляет антигенную активность антигена определенного типа раковой опухоли или антигена возбудителя инфекционного заболевания. В другом предпочтительном варианте осуществления второй гликопротеид дополнительно связан с антигенной молекулой, которая проявляет антигенную активность антигена определенного типа раковой опухоли или антигена возбудителя инфекционного заболевания.

Настоящее изобретение далее предоставляет способ лечения или профилактики заболевания (например, рака, инфекционного заболевания, анемии, иммуносупрессивных состояний, ферментных или гормональных дефицитов), включая введение субъекту, нуждающемуся в терапевтически или профилактически эффективном количестве композиции изобретения. В одном варианте осуществления композиция включает очищенное нековалентное комплексное соединение, включающее белок теплового шока, антигенную молекулу и молекулу лектина, где белок теплового шока и/или антигенная молекула гликозилированы, где антигенная молекула проявляет антигенную активность антигена указанного типа рака или антигена возбудителя указанной инфекционной болезни и где количество присутствующего в композиции лектина относительно количества белка теплового шока равно или больше чем 5 нг, 10 нг, 20 нг, 30 нг, 40 нг, 50 нг, 75 нг, 100 нг или 200 нг на микрограмм белка теплового шока. Предпочтительно, количество присутствующего в композиции лектина относительно количества белка теплового шока составляет 40 нг-1000 нг, 50 нг-1000 нг, 50 нг-500 нг, 100 нг-250 нг или 150 нг-200 нг лектина на микрограмм белка теплового шока. В некоторых вариантах осуществления количество присутствующего в композиции лектина относительно количества белка теплового шока равно или меньше чем 5 нг на микрограмм белка теплового шока. Предпочтительно, количество присутствующего в композиции лектина относительно количества белка теплового шока составляет между 0,1 нг-5 нг, 0,2 нг-4 нг, 0,3 нг-3 нг, 0,5 нг-2 нг или 0,1 нг-1 нг лектина на микрограмм белка теплового шока.

В другом варианте осуществления композиция представляет собой фармацевтическую композицию, включающую молекулярное комплексное соединение и фармацевтически приемлемый носитель, где молекулярное комплексное соединение включает белок теплового шока, антигенную молекулу и молекулу лектина, где белок теплового шока и/или антигенная молекула гликозилированы, где антигенная молекула проявляет антигенную активность антигена указанного типа рака или антигена возбудителя указанной инфекционной болезни и где количество находящегося в композиции лектина относительно количества белка теплового шока равно или больше чем 5 нг, 10 нг, 20 нг, 30 нг, 40 нг, 50 нг, 75 нг, 100 нг или 200 нг на микрограмм белка теплового шока. Предпочтительно, количество находящегося в композиции лектина относительно количества белка теплового шока составляет 40 нг-1000 нг, 50 нг-1000 нг, 50 нг-500 нг, 100 нг-250 нг или 150 нг-200 нг лектина на микрограмм белка теплового шока. В некоторых вариантах осуществления количество находящегося в композиции лектина относительно количества белка теплового шока равно или меньше чем 5 нг на микрограмм белка теплового шока. Предпочтительно, количество находящегося в композиции лектина относительно количества белка теплового шока составляет между 0,1 нг-5 нг, 0,2 нг-4 нг, 0,3 нг-3 нг, 0,5 нг-2 нг или 0,1 нг-1 нг лектина на микрограмм белка теплового шока.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение также предоставляет способ лечения или профилактики заболеваний (например, рака, инфекционных заболеваний, анемии, иммуносупрессивных состояний, ферментных или гормональных дефицитов), включающий введение субъекту при необходимости (a) одного или нескольких молекулярных комплексных соединений гликопротеида (например, гликозилированного Hsp), лектина и первой антигенной молекулы, где первая антигенная молекула проявляет антигенность антигена определенного типа рака или антигена возбудителя инфекционного заболевания и где антигенная молекула может быть или не быть гликозилированной, и где количество присутствующего в комплексных соединениях лектина относительно количества гликопротеида равно или больше чем 5 нг, 10 нг, 20 нг, 30 нг, 40 нг, 50 нг, 75 нг, 100 нг или 200 нг на микрограмм гликопротеида. Предпочтительно, количество присутствующего в комплексных соединениях лектина относительно количества гликопротеида составляет 40 нг-1000 нг, 50 нг-1000 нг, 50 нг-500 нг, 100 нг-250 нг или 150 нг-200 нг лектина на микрограмм гликопротеида. В некоторых вариантах осуществления количество находящегося в комплексных соединениях лектина относительно количества гликопротеида равно или меньше чем 5 нг на микрограмм гликопротеида. Предпочтительно, количество находящегося в комплексных соединениях лектина относительно количества гликопротеида составляет между 0,1 нг-5 нг, 0,2 нг-4 нг, 0,3 нг-3 нг, 0,5 нг-2 нг или 0,1 нг-1 нг лектина на микрограмм гликопротеида; и (b) до, во время или после введения молекулярного комплексного соединения введение субъекту композиции, включающей антиген-представляющие клетки, сенсибилизированные in vitro с сенсибилизирующим количеством второго молекулярного комплекса гликопротеида, связанного с молекулой лектина и второй антигенной молекулой, где указанная вторая антигенная молекула проявляет антигенность второго антигена указанного типа рака или второго антигена возбудителя указанной инфекционной болезни. АРС могут быть отобраны из числа антиген-представляющих клеток, известных в уровне техники, включая макрофаги, дендроциты, B-клетки и другие, а также их комбинации, и предпочтительно макрофаги. В одном варианте осуществления первое молекулярное комплексное соединение, такое же как и второе молекулярное комплексное соединение, используемое для сенсибилизации APC. В другом варианте осуществления первое молекулярное комплексное соединение отличается от второго молекулярного комплексного соединения, используемого для сенсибилизации APC. В специфичном варианте осуществления, где APC и композиции изобретения применяются одновременно, APC и композиция изобретения могут присутствовать в одной и той же композиции (включающей APC и молекулярные комплексы) или в разных композициях. Адоптивная иммунотерапия (использующая сенсибилизированные APC) в соответствии с изобретением допускает активацию иммунных антиген-представляющих клеток посредством инкубации с олигомеризованными молекулярыми комплексными соединениями. Предпочтительно до использования клеток in vivo выполняется измерение реактивности против опухоли или возбудителя инфекции in vitro. Это стимулирование in vitro, с последующим клональным отбором и/или экспансией, и назначение пациенту составляет полезную терапевтическую/профилактическую стратегию. В предпочтительном варианте осуществления гликопротеид представлен гликозилированным белком теплового шока.

В предпочтительном варианте осуществления иммунологически и/или биологически активная молекула молекулярного комплексного соединения, например белок теплового шока, связанный в комплекс с белком, который проявляет антигенность антигена определенного типа рака или антигена возбудителя инфекционного заболевания, является аутогенной для субъекта; то есть она выделена непосредственно из клеток субъекта (например, приготовлена от биопсий опухоли пациента, когда желательно лечение рака). Альтернативно, молекулярное комплексное соединение может быть аллогенным к субъекту, к которому применяется композиция молекулярного комплексного соединения по изобретению. Молекулярное комплексное соединение может быть приготовлено in vitro, например, из культивируемых клеток, которые рекомбинантно экспрессируют белок теплового шока. Белок теплового шока может быть естественно гликозилированным белком теплового шока (например, gp96, GRP170, кальретикулин, Bip (GRP78) или их комбинация), искусственно гликозилированным белком теплового шока, который преобразован в гликопротеид, или их комбинацией.

Экзогенные антигены и фрагменты и их производные для использования при комплексообразовании с гликопротеидами для создания специфичных комплексных соединений могут быть отобраны из тех, которые известны в уровне техники, так же как те, которые легко идентифицируются стандартными иммунологическими анализами, известными в данной области по способности связывать антитела или молекулы MHC (антигенность) или генерировать иммунный ответ (иммуногенность). Неограничивающие примеры экзогенных антигенов, помимо других, включают специфические антигены раковой опухоли, ассоциированные с раком антигены, антигены, экспрессируемые клеточной линией или субъектом, который инфицирован инфекционным агентом или инфицирован вирусом с геном, кодирующим специфический антиген опухоли, ассоциированный с опухолью антиген или антиген возбудителя инфекционного заболевания. Специфичные комплексные соединения гликопротеидов и антигенных молекул могут быть выделены из раковой опухоли или предраковой ткани пациента, или из линии раковых клеток, или могут быть произведены in vitro (как необходимо в варианте осуществления, в котором экзогенный антиген используется как антигенная молекула).

Настоящее изобретение далее предоставляет наборы, включающие множество емкостей, каждая из которых содержит фармацевтическое соединение или композицию, включающую дозу молекулярных комплексных соединений по изобретению, достаточную для однократного иммуногенного назначения. Изобретение также предоставляет наборы, включающие емкость, содержащую иммуноактивный гликопротеид или его комплексное соединение, и емкость, содержащую лектин. Дополнительно, в наборы могут быть включены инструкции для приготовления олигомеризованных комплексных соединений согласно методам изобретения.

В специфичном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам и композициям для профилактики и лечения первичных и метастатических неопластических болезней.

Терапевтические режимы и фармацевтические композиции изобретения могут быть использованы с другой лечебной или профилактической терапией, такой как другие усилители иммунного ответа или модификаторов биологического ответа, включая, но не ограничиваясь перечисленным, цитокины, агонисты или антагонисты различных лигандов, рецепторы и молекулы-передатчики сигналов, иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты и адъюванты. В соответствии с этим аспектом изобретения композиции изобретения применяются в комбинированной терапии с одним или несколькими усилителями иммунного ответа или модификаторами биологического ответа. В другом варианте осуществления композиции изобретения применяются с лучевой терапией или одним или несколькими химиотерапевтическими средствами для лечения рака.

В дополнение к терапии рака композиции изобретения могут использоваться для профилактики определенных типов рака, например, у субъектов, которые предрасположены в результате семейного анамнеза, или у субъектов с увеличенным риском к образованию рака вследствие экологических факторов.

Специфичные терапевтические режимы, фармацевтические композиции и наборы предоставлены изобретением.

5.1. Получение белка теплового шока

В некоторых вариантах осуществления изобретения молекулярное комплексное соединение включает лектин, связанный с гликозилированным белком теплового шока в комплексе с антигенной молекулой (например, один или несколько белков (включая пептиды и полипептиды), которые проявляют антигенность антигена определенного типа раковой опухоли или антигена возбудителя инфекционного заболевания). В некоторых других вариантах осуществления молекулярное комплексное соединение включает лектин, связанный с гликозилированным белком теплового шока. Белок теплового шока или комплексные соединения Hsp и антигенной молекулы могут быть приготовлены отдельно, а лектин добавлен как дополнительная стадия, для стимуляции олигомеризации Hsp или комплексных соединений Hsp и антигенной молекулы.

Белки теплового шока (Hsp) попеременно упомянуты здесь как шоковые белки и могут быть отобраны из любого клеточного белка, который удовлетворяет следующим критериям: это белок, внутриклеточная концентрация которого увеличивается, когда клетка подвергается стрессовым воздействиям; он способен к связыванию других белков; он способен к освобождению связанных белков в присутствии аденозинтрифосфата (АТФ) или при низком рН (например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6); и это белок, демонстрирующий по крайней мере 35%-ную гомологию с любым клеточным белком, имеющим любое из вышеупомянутых свойств. Неограниченные примеры белков теплового шока описаны в Srivastava, Nature Reviews (Immunology) 2:185-194 (2002), текст которого включен сюда в виде ссылки. В некоторых вариантах осуществления используются только естественно гликозилированные белки теплового шока, которые включают gp96, кальретикулин, GRP170, Bip (GRP78) или их нековалентные или ковалентные комплексные соединения и другие молекулы. В некоторых вариантах осуществления изобретения белок теплового шока преобразован в гликозилированный белок теплового шока добавлением одного или нескольких сайтов гликозилирования, которые не присутствуют в нативных последовательностях белка теплового шока, с последующим прибавлением углеводов.

В соответствии с методами, описанными здесь, каждое специфичное комплексное соединение Hsp-антиген (комплекс «Hsp-белок»), используемое в композиции изобретения, предпочтительно очищено в диапазонах 60-100 процентов от общего белка в мг или по крайней мере 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% от общего белка в мг. В другом варианте осуществления каждое специфичное комплексное соединение Hsp-антигенная молекула очищено до стандартной гомогенности при помощи электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия, как испытано.

В предпочтительном варианте осуществления нековалентные комплексные соединения белков теплового шока (например, hsp70, hsp90 и gp96) с белками очищены и приготовлены послеоперационно из опухолевых клеток, полученных от больного раком, для использования в качестве специфичных комплексных соединений в композициях по изобретению.

В соответствии с методами, описанными здесь, иммуногенные или антигенные протеины (включая пептиды и полипептиды), которые являются эндогенно связанными в комплекс с белками теплового шока или антигенам главного комплекса гистосовместимости, могут использоваться как специфичные антигенные молекулы. Например, такие белки могут быть получены для стимуляции цитотоксических реакций Т-клеток против различных опухолевых антигенов (например, тирозиназы, gp100, melan-A, gp75, муцинов и т.д.) и вирусных белков, включая белки вирусов иммунодефицита человека I типа (ВИЧ-I), иммунодефицита человека II типа (ВИЧ-II), гепатита A, гепатита B, гепатита C, гриппа, ветряной оспы, аденовируса, простого герпеса типа I (HSV-I), простого герпеса типа II (HSV-II), вируса чумы, риновируса, эховируса, ротавируса, респираторно синцитиального вируса, вируса папилломы, паповавируса, цитомегаловируса, эхиновируса, арбовируса, хантавируса, вируса коксаки, вируса эпидемического паротита, вируса кори, вируса краснухи, вируса полиомиелита и других. В варианте осуществления, где антигенные молекулы представлены белками, связанными в комплекс к белкам теплового шока in vivo, комплексные соединения могут быть выделены из клеток. Альтернативно, комплексные соединения могут быть получены in vitro из очищенных препаратов каждых из белков теплового шока и антигенных молекул. В некоторых вариантах осуществления антигенные молекулы - это экзогенные антигены и фрагменты и их производные.

В вариантах осуществления, в которых желательно использовать антигенные молекулы путем связывания в комплекс с белками теплового шока in vitro, белки теплового шока могут быть очищены для такого применения из эндогенных комплексов "Hsp-белок" в присутствии АТФ или низкого значения рН (1, 2, 3, 4, 5 или 6). Белки теплового шока могут также быть синтезированы химически или получены рекомбинантно. Описанные здесь протоколы могут использоваться для получения специфичных комплексов "Hsp-белок" или одних белков теплового шока из любых эукариотических клеток, например тканей, изолированных клеток или бессмертных линий эукариотических клеток, инфицированных предварительно отобранным внутриклеточным инфекционным агентом, опухолевых клеток или линий опухолевых клеток.

5.1.1 Подготовка и очистка Hsp 70 или комплексов белок-Hsp70

Очистка комплексных соединений "Hsp70-белок" была предварительно описана, см., например, Udono et al., 1993, J. Exp. Med. 178:1391-1396. Технологический процесс, который может быть использован, представленный посредством примера, но не ограничений, описан ниже.

Первоначально, опухолевые клетки суспедированы в 3-х объемах 1X литического буфера, состоящего из 30 мM бикарбоната натрия pH 7,5, 1 мM PMSF. Затем дебрис разрушен ультразвуком, на льду, до того момента, когда будет лизировано >99% клеток, что определяется микроскопическим исследованием. Как альтернатива разрушения ультразвуком, клетки могут быть лизированы механическим сдвигом, путем гомогенизации клеток в гомогенизаторе Dounce до того момента, когда будет лизировано >95% клеток.

После этого лизат центрифугировали при 1000g в течение 10 минут, чтобы удалить неразрушенные клетки, ядра и другие продукты распада клеток. Результирующий супернатант повторно центрифугировали при 100000g в течение 90 минут, супернатант собирали и затем смешивали с конканавалин-A-сефарозой, уравновешенной с солевым раствором фосфатного буфера (PBS), содержащим 2 мM Ca²⁺ и 2 мM Mg²⁺. Когда клетки были лизированы механическим сдвигом, супернатант был разбавлен равным объемом 2X литического буфера до смешивания с конканавалин-A-сефарозой. Затем супернатанту позволяли связаться с конканавалин-A-сефарозой в течение 2-3 часов при 4°C. Несвязавшийся материал собирали и диализировали в течение 36 часов (три раза, по 100 объемов каждый раз) на фоне 10 мM трис-ацетата pH 7,5, 0,1 мM ЭДТА, 10 мM хлорида натрия, 1 мM PMSF. Затем диализат центрифугировали при 17000 об/мин (ротор Sorvall SS34) в течение 20 минут. Затем результирующий супернатант был собран и нанесен на ВЭЖХ колонку Моно Q, уравновешенную 20 мM трис-ацетата рН 7,5, 20 мM хлорида натрия, 0,1 мM ЭДТА и 15 мM 2-меркаптоэтанола. Затем колонку обрабатывали градиентом хлорида натрия от 20 мM до 500 мM и затем элюированные фракции фракционировали электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) и характеризовали иммуноблоттингом с использованием соответствующего анти-HSP70 антитела (типа аналога N27F3-4, от StressGen).

Фракции, строго иммунореактивные с анти-HSP70 антителом, объединяли и комплексы "HSP70-белок" осаждали сульфатом аммония; специфично с отсечкой при 50%-70% сульфата аммония. Затем получившийся осадок собирали центрифугированием при 17000 об/мин (ротор SS34 Sorvall) и промывали 70%-ным сульфатом аммония. Промытый осадок затем растворяли и весь остаточный сульфат аммония удаляли фильтрацией в геле на колонке SephadexR G25 (Pharmacia). В случае необходимости, препарат HSP70, полученный таким образом, может быть повторно очищен с использованием ВЭЖХ колонки Моnо Q, как описано выше.

Используя этот метод, комплексное соединение "Hsp70-белок" может быть очищено до допустимой гомогенности. Обычно 1 мг комплексного соединения Hsp70-белок может быть получен из 1 г клеток/ткани.

Улучшенный метод очистки HSP70 включает контактирование клеточных белков с АТФ или негидролизуемым аналогом АТФ, прикрепленным к твердому субстрату, так что HSP70 в лизате может присоединяться к АТФ или негидролизуемому аналогу АТФ, и элюирование связанного HSP70. Предпочтительный метод использует хроматографию на колонках с АТФ, прикрепленным к твердой подложке (например, АТФ-агароза). Получающиеся препараты HSP70 высокоочищены и лишены белковых примесей. Выход HSP70 также существенно увеличен приблизительно больше чем в 10 раз.

Альтернативно, хроматография с негидролизуемыми аналогами АДФ, вместо АТФ, может использоваться для очистки комплексов "HSP70-белок". См. Peng et al., Journal of Immunological Methods 204:13-21 (1997), текст которой включен сюда в виде ссылки. В качестве примера, но без ограничения, очистка не содержащего белков HSP70 хроматографией на АТФ-агарозе может быть выполнена следующим образом: клетки Meth-А-саркомы (500 миллионов клеток) гомогенизируют в гипотоническом буфере и лизат центрифугируют при 100000g в течение 90 минут при 4°C. Супернатант наносится на колонку АТФ-агарозы. Колонка промывается в буфере и элюируется 5 объемами колонок 3 мM АТФ. HSP70 элюирует во фракциях со 2 по 10 от всех 15 фракций, которые элюируют. Элюируемые фракции анализируют при помощи SDS-PAGE. HSP70 может быть очищен до допустимой гомогенности, используя этот технологический процесс.

Альтернативно, Hsp70 или комплекс "Hsp70-белок" может быть очищен при использовании иммуноаффинных методов очистки, известных в данной области. Например, может использоваться Hsp70-специфичная scFv колонка. (См. Arnold-Schild et al., Cancer Research, 2000, 60 (15):4175-4178, включенная сюда в полном объеме. Хотя Arnold-Schild описывает gp96-специфичную scFv колонку, Hsp70-специфичная scFv колонка может быть получена эквивалентным методом.) Посредством примера, но не ограничиваясь им, очистка с использованием Hsp70-специфичной scFv колонки может быть осуществлена следующим образом: scFv анти-Hsp70 образуют пару с CNBr-активизированной сефарозой. Пробы, содержащие Hsp70 или комплекс Hsp70-белок, наносят на scFv анти-Hsp70 колонку. После экстенсивной промывки с PBS, Hsp70 или Hsp70-белок могут элюироваться PBS, 1,3М NaCl или 10 мM фосфатом натрия (рН 7,2).

Отделение белка от комплекса hsp70-белок может быть выполнено в присутствии АТФ или при низком рН. Эти два метода могут использоваться для элюции белка из комплекса hsp70-белок. Первый подход включает инкубацию комплексного препарата hsp70-белок в присутствии АТФ. Другой подход включает культивирование комплексного препарата hsp70-белок в буфере с низким уровнем рН (например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6). Эти методы и любые другие, известные в области техники, могут быть применены для отделения HSP и белка от комплекса Hsp-белок.

5.1.2 Приготовление и очистка Hsp90 или комплекса Hsp90-белок

Технологический процесс, который может использоваться, представленный здесь в виде неограничивающего примера, включает следующее.

Первоначально, клетки человека или млекопитающих суспендируют в 3 объемах 1X лизисного буфера, состоящего из буфера 5 мM фосфата натрия (рН 7), 150 мM хлорида натрия, 2 мМ хлористого кальция, 2 мМ хлористого магния и 1 мM фенилметилсульфонилфторида (PMSF). После этого дебрис разрушен ультразвуком, на льду, до того момента, когда будет лизировано >99% клеток, что определяется микроскопическим исследованием. Как альтернатива разрушения ультразвуком, клетки могут быть лизированы механическим сдвигом, и при этом подходе клетки обычно повторно суспендируют в 30 мM бикарбоната натрия (рН 7,5), 1 мM PMSF, культивируют на льду в течение 20 минут и затем гомогенизируют в гомогенизаторе Dounce до того момента, когда >95% клеток будут лизированы.

Затем лизат центрифугируют при 1000g в течение 10 минут для удаления неразрушенных клеток, ядер и других продуктов распада клеток. Получившийся супернатант повторно центрифугируют при 100000g в течение 90 минут, супернатант собирают и затем смешивают с конканавалин-А-сефарозой™, уравновешенной PBS, содержащей 2 мM Ca²⁺ и 2 мM Mg²⁺. Когда клетки были растворены механическим сдвиганием, супернатант был разбавлен равным объемом 2X литического буфера, до смешивания с конканавалином-А-сефарозой™. Затем супернатанту дали время, чтобы связаться с конканавалином-А-сефарозой™ в течение 2-3 часов в 4°C. Материал, который не связался, был собран и диализирован в течение 36 часов (три настройки, 100 объемов каждый раз) против 20 мM фосфата натрия (рН 7,4), 1 мM EDTA, 250 мM хлорида натрия, 1 мM PMSF. Затем диализат центрифугируют при 17000 об/мин (ротор Sorvall SS34) в течение 20 минут. Затем получившийся супернатант собирают и наносят на ионно-обменную хроматографическую колонку Моно Q FPLC™ (Pharmacia), уравновешенную буфером для диализа. Затем белки элюируют с солевым градиентом хлорида натрия от 200 мM до 600 мM.

Элюируемые фракции фракционируют при помощи SDS-PAGE и фракции, содержащие комплексы hsp90-белок, идентифицируют иммуноблоттингом с использованием анти-hsp90 антител, типа 3G3 (Аffinity Bioreagents). Комплексы Hsp90-белок могут быть очищены до допустимой гомогенности, используя этот технологический процесс. Как правило, 150-200 мкг комплекса hsp90-белок может быть получено из 1 г клеток/ткани.

Альтернативно, Hsp90 или комплекс Hsp90-белок может быть очищен с использованием любых иммуноаффинных методов очистки, известных в уровне техники. Например, может использоваться Hsp90-специфичная scFv колонка. (См. Arnold-Schild, включенная сюда во всей полноте. Хотя Arnold-Schild описывает gp96-специфичную scFv колонку, Hsp90-специфичная scFv колонка может быть произведена эквивалентным методом.) В виде примера, но без ограничений, очистка с использованием Hsp90-специфичной scFv колонки может быть выполнена следующим образом: scFv анти-Hsp90 присоединяют к CNBr-активизированной сефарозе. Пробы, содержащие Hsp90 или Hsp90-белковое комплексное соединение, наносят на scFv анти-Hsp70 колонку. После экстенсивной промывки PBS Hsp90 или Hsp90-белок могут быть элюированы PBS, 1,3М хлорида натрия или 10 мM фосфата натрия (pH 7,2).

Отделение белка от комплекса hsp90-белок может быть выполнено в присутствии АТФ при низком рН. Эти два метода могут использоваться для элюции белка из комплекса hsp90-белок. Первый подход включает культивирование препарата комплекса hsp90-белок в присутствии АТФ. Другой подход включает культивирование препарата комплекса hsp90-белок в буфере с низким рН (например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6). Эти методы и любые другие, известные в уровне техники, могут быть применены, чтобы отделить HSP и белок от комплекса Hsp-белок.

5.1.3 Приготовление и очистка Gp96 или комплексов Gp96-белок

Технологический процесс, который может использоваться, представленный здесь в виде ссылки в полном объеме, включает следующее.

Дебрис клеток человека или млекопитающих ресуспендируют в 3 объемах буфера, состоящего из буфера 30 мM бикарбоната натрия (рН 7,5) и 1 мM PMSF, и обеспечивают разбухание клеток на льду в течение 20 минут. Затем дебрис гомогенизируют в гомогенизаторе Dounce (соответствующий клиренс гомогенизатора изменяют соответственно каждому типу клеток) на льду до тех пор, пока >95% клеток лизируется.

Лизат центрифугируют при 1000g в течение 10 минут для удаления нераспавшихся клеток, ядер и других остатков. Супернатант от этой операции центрифугирования затем повторно центрифугируют при 100000g в течение 90 минут. Комплекс gp96-белок может быть выделен или из 100000 дебриса или из супернатанта.

Когда очищенный от супернатанта супернатант разбавлен равным объемом 2X литического буфера, супернатант смешивают в течение 2-3 часов при 4°C с конканавалином-А-сефарозой™, уравновешенным с PBS, содержащим 2 мM Ca²⁺ и 2 мM Mg²⁺. Затем суспензию наносят на колонку и промывают 1X литическим буфером до того момента, когда OD₂₈₀ упадет до начального уровня. Затем колонку промывают 1/3 объема слоя колонки 10% α-метилманнозидом (α-MM), растворенным в PBS, содержащим 2 мM Ca²⁺ и 2 мM Mg²⁺, колонку закрывают кусочком парафильма и культивируют при 37°C в течение 15 минут. Затем колонку охлаждают до комнатной температуры и удаляют парафильм от основания колонки. Пять объемов колонки буфера α-ММ вводят в колонку и элюат анализируют при помощи SDS-PAGE. Обычно полученный материал имеет приблизительно 60-95% чистоту, однако это зависит от типа клетки и используемого соотношения ткани к литическому буферу. Затем пробу наносят на ионообменную хроматографическую колонку Моно Q FPLC™ (Pharmacia), уравновешенную буфером, содержащим 5 мM фосфата натрия (рН 7). Затем белки элюируют из колонки при 0-1M градиенте хлорида натрия, и gp96 фракция элюируется между 400 мM и 550 мM хлорида натрия.

Технологический процесс, однако, может быть модифицирован двумя дополнительными операциями, используемыми или отдельно или в комбинации, последовательно производящими очевидно гомогенные комплексы gp96-белок. Одна дополнительная операция включает преципитацию сульфатом аммония до операции очистки конканавалина А, и другая дополнительная операция включает очистку на DEAE-сефарозе™ после операции очистки конканавалином А и вместо операции с Моно Q FPLC™.

В первой необязательной стадии, описанной посредством примера, выполняется следующее: супернатант, образующийся после операции центрифугирования в 100000g, переносят к конечному концентрированию 50% сульфатом аммония добавлением сульфата аммония. Сульфат аммония добавляют медленно, при мягком перемешивании раствора в мензурке, находящейся в емкости с водой и льдом. Раствор размешивался приблизительно от 1/2 до 12 часов при температуре 4°C, и полученный раствор центрифугируют при 6000 об/мин (ротор Sorvall SS34). Супернатант, образующийся после этой операции, удаляют, перемещают в 70% насыщенный сульфат аммония добавлением раствора сульфата аммония и центрифугируют при 6000 об/мин (ротор Sorvall SS34). Полученный дебрис от этой операции собирают и суспендируют в PBS, содержащем 70%-ный сульфат аммония, для промывки дебриса. Эту смесь центрифугируют при 6000 об/мин (ротор Sorvall SS34), а дебрис растворяют в PBS, содержащем 2 мM Ca²⁺ и Mg²⁺. Нерастворенный материал удаляют кратковременным центрифугированием при 15000 об/мин (ротор Sorvall SS34). Затем раствор смешивают с конканавалин-А-сефарозой™ и технологический процесс выполняют, как прежде.

Во второй необязательной стадии, описанной посредством примера, изложено следующее: содержащие gp96 фракции, элюированные из колонки с конканавалином А, объединены, и буфер заменен на буфер 5 мМ фосфата натрия (рН 7), 300 мM хлористого натрия путем диализа или предпочтительно буферным обменом на колонке Sephadex G25. После буферного обмена раствор смешивают с DEAE-сефарозой™, предварительно уравновешенной буфером 5 мМ фосфата натрия (рН 7), 300 мM хлористого натрия. Белковый раствор и гранулы осторожно смешивают в течение 1 часа и вводят в колонку. Затем колонку промывают буфером 5 мМ фосфата натрия (рН 7), 300 мM хлористого натрия, до снижения поглощения света при 280 нм до начального уровня. Затем связанный белок элюируют из колонки пятью объемами буфера 5 мМ фосфата натрия (рН 7), 700 мM хлорида натрия. Фракции, содержащие белок, объединяют и разбавляют буфером 5 мМ фосфата натрия (рН 7), с целью понижения концентрации соли до 175 мM. Затем результирующий материал непроизвольно наносят на ионообменную хроматографическую колонку Моно Q FPLC™ (Pharmacia), уравновешенную буфером 5 мМ фосфата натрия (рН 7) и белком, который связывается с ионообменной хроматографической колонкой Моно Q FPLC™ (Pharmacia), и затем элюируют из колонки 0-1M градиентом NaCl. Фракция gp96 элюирует между 400 мM и 550 мM NaCl.

Признано, что специалист может определить необходимость включения второй дополнительной операции в протокол очистки обычным экспериментированием. Кроме того, также известно, что эффект добавления каждой из необязательных операций будет зависеть от источника исходного материала.

Когда фракция gp96 выделена из 100000g дебриса, дебрис суспендируют в 5 объемах PBS, содержащего или 1% дезоксихолата натрия или 1% октил-глюкопиранозида (но без Mg²⁺ и Ca²⁺), и инкубируют на льду в течение 1 часа. Суспензию центрифугируют при 20000g в течение 30 минут и полученный супернатант диализируют против нескольких вариантов PBS (также без Mg²⁺ и Ca²⁺) для удаления детергента. Диализат центрифугируют при 100000g в течение 90 минут, супернатант собирают и к супернатанту добавляют кальций и магний, до достижения конечных концентраций 2 мM соответственно. Затем пробу очищают немодифицированным или модифицированным методом для выделения комплексного соединения "gp96-белок" из 100000g супернатанта, см. выше.

Комплексные соединения "gp96-белок" может быть очищен до стандартной гомогенности с использованием этой технологической процедуры. Около 10-20 мкг из gp96 может быть изолировано из 1 г клеток/ткани.

Альтернативно, gp96 или gp96-белок может быть очищен использованием любых иммуноаффинных методов очистки, известных в уровне техники. Например, Hsp96-специфичная scFv колонка может быть использована. (См. Арнольда-Schild, Cancer Research, 2000, 60 (15):4175-4178, включена во всей полноте путем ссылки.)

Отделение белка от комплексного соединения "gp96-белок" может быть выполнено в присутствии АТФ или при низком уровне рН (например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6). Эти два метода могут использоваться для элюции белка из комплексного соединения "gp96-белок". Первый метод включает инкубирование препарата комплекса "gp96-белок" в присутствии АТФ. Другой подход включает инкубирование препарата комплекса "gp96-белок" в буфере с низким уровнем рН. Эти методы и любые другие, известные в уровне техники, могут быть применены для отделения HSP и белка от комплексного соединения "gp96-белок".

5.1.4 Получение и очистка комплексов "Hsp110-белок"

Технологический процесс, описанный Wang et al., 2001, J. Immunol. 166 (1):490-7, который может быть применен, приведен в виде примера, а не ограничения, включает следующее.

Дебрис (40-60 мл) клеток или ткани, например клетки опухолевой ткани, гомогенизируют в 5 объемах гипотонического буфера (30 мН бикарбоната натрия, pH 7,2, и ингибиторы протеаз) гомогенизацией в аппарате Dounce. Лизат центрифугируют при 4500×g и затем при 100000×g в течение 2 часов. Если клетки или ткани имеют печеночное происхождение, полученный супернатант сначала наносят на синюю колонку сефарозы (Pharmacia) для удаления белка. В других случаях полученный супернатант наносят на колонку конканавалин-А-сефарозы (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), предварительно уравновешенную агрегирующим буфером (20 мM трис-HCl, рН 7,5; 100 мM NaCl; 1 мM MgCl₂; 1 мM CaCl₂; 1 мM MnCl₂; 15 мM 2-ME). Связанные белки элюируются с агрегирующим буфером, содержащим 15% α-D-o-метилманнозид (Sigma, St. Louis, MO).

Материал, связанный с конканавалин-А-сефарозой вначале диализируют против раствора 20 мM трис-HCl, рН 7,5, 100 мМ NaCl и 15 мМ 2-ME и затем наносят на колонку DEAE-сефарозы и элюируют солевым градиентом от 100 до 500 мМ NaCl. Фракции, содержащие hsp110, собирают, диализируют и загружают на колонку Моно Q (Pharmacia) 10/10, уравновешенную 20 мM трис-HCl, рН 7,5; 200 мM NaCl; 15 мM 2-ME. Связанные белки элюируют градиентом 200-500 мM NaCl. Фракции анализируют при помощи SDS-PAGE, с последующим иммуноблоттингом с Ab для Hsp110, как описано Wang et al., 1999, J. Immunol. 162:3378. Объединенные фракции, содержащие Hsp110, концентрируют на Centriplus (Amicon, Beverly, MA) и наносят на колонку Superose 12 (Pharmacia). Белки элюируют 40 мM трис-HCl, рН 8,0; 150 мM NaCl; 15 мM 2-ME с объемной скоростью потока 0,2 мл/мин.

Альтернативно, Hsp110 или Hsp110-белок может быть очищен с помощью любых иммуноаффинных методов очистки, известных в уровне техники. Например, может быть использована Hsp110-специфичная scFv колонка (См. Arnold-Schild et al., Cancer Research, 2000, 60 (15):4175-4178, приведенная здесь в полном объеме. Несмотря на то что Arnold-Schild описывает gp96-специфичную scFv колонку, Hsp110-специфичная scFv колонка может быть получена эквивалентным методом.) В качестве примера, но не ограничиваясь им, очистка с использованием Hsp110-специфичной scFv колонки может быть выполнена следующим образом: анти-Hsp110 scFv связывают с CNBr-активизированной сефарозой. Пробы, содержащие Hsp110 или комплекс Hsp110-белок, наносят на scFv анти-Hsp110 колонки. После длительной промывки PBS Hsp110 или комплекс Hsp110-белок может быть элюирован PBS, 1,3М NaCl или 10 мM фосфата натрия (рН 7,2).

5.1.5 Получение и очистка комплексов Grpl70-белок

Способ, описанный Wang et al., 2001, J. Immunol. 166 (1):490-7, который может быть применен, приведенный здесь в качестве неограничивающего примера, включает следующее.

Дебрис (40-60 мл) клеток или ткани, например клеток опухолевой ткани, гомогенизируют в 5 объемах гипотонического буфера (30 мН бикарбоната натрия, pH 7,2, и ингибиторы протеаз) в гомогенизаторе Dounce. Лизат центрифугируют при 4500×g и затем 100000×g в течение 2 часов. Если клетки или ткани имеют печеночное происхождение, полученный супернатант сначала наносят на синюю колонку сефарозы (Pharmacia) для удаления белка. В других случаях полученный супернатант наносят на колонку конканавалин-А-сефарозы (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), предварительно уравновешенную агрегирующим буфером (20мM трис-HCl, рН 7,5; 100 мM NaCl; 1 мM MgCl₂; 1 мM CaCl₂; 1 мM MnCl₂; 15 мM 2-ME). Связанные белки элюируют агрегирующим буфером, содержащим 15% α-D-o-метилманнозид (Sigma, St. Louis, MO).

Материал, связанный с конканавалин-А-сефарозой, сначала диализируют против 20 мМ трис-HCl, рН 7,5, и 150 мМ NaCl, затем наносят на колонку Моно Q и элюируют градиентом NaCl от 150 до 400 мМ. Объединенные фракции концентрируют и наносят на колонку Superose 12 (Pharmacia). Фракции, содержащие гомогенный grp170, собирают.

Альтернативно, GRP170 или комплекс GRP170-белок может быть очищен с помощью любых иммуноаффинных методов очистки, известных в уровне техники. Например, может быть использована GRP170-специфичная scFv колонка. (См. Amold-Schild et al., Cancer Research, 2000, 60 (15):4175-4178, приведенная здесь в полном объеме. Несмотря на то что Арнольд-Schild описывает gp96-специфичную scFv колонку, Hsp170-специфичная scFv колонка может быть изготовлена эквивалентным методом.) В качестве примера, но не ограничиваясь им, очистка с использованием Hsp170-специфичной scFv колонки может быть выполнена следующим образом: scFv анти-Hsp170 связывают с CNBr-активизированной сефарозой. Пробы, содержащие Hsp170 или комплекс Hsp170-белок, наносят на scFv анти-Hsp170 колонки. После длительной промывки PBS Hsp170 или комплекс Hsp170-белок может быть элюирован PBS, 1,3М NaCl или 10 мM фосфата натрия (рН 7,2).

5.1.6 Рекомбинантная экспрессия белков теплового шока

Методы, известные в уровне техники, могут использоваться для рекомбинантного получения белков теплового шока. Последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая белок теплового шока, может быть внесена в вектор экспрессии для размножения и экспрессии в клетках-хозяевах.

Экспрессирующая конструкция, используемая здесь, относится к последовательности нуклеотида, кодирующей HSP, операбельно связанный с одной или несколькими регулирующими областями, которые запускают экспрессию HSP в соответствующей клетке-хозяине. "Операбельно связанный" относится к ассоциации, в которой регулирующие области и экспрессируемая последовательность HSP соединены и расположены таким образом, чтобы разрешить транскрипцию и, в конечном итоге, трансляцию.

Регулирующие области, необходимые для транскрипции HSP, могут быть предоставлены вектором экспрессии. Инициирующий кодон трансляции (ATG) может также быть предоставлен, если в генной последовательности HSP недостает родственного инициирующего кодона для экспрессии. В совместимой системе хозяин-конструкция клеточные факторы транскрипции типа РНК-полимеразы будут связаны с регулирующими областями в экспрессирующей конструкции для осуществления транскрипции модифицированной последовательности HSP в организме-хозяине. Точная природа регулирующих областей, необходимых для генной экспрессии, может варьировать от вида клетки-хозяина. В целом, необходим промотор, который способен присоединять РНК-полимеразу и вызывать транскрипцию операбельно связанной последовательности нуклеиновой кислоты. Такие регулирующие области могут включать те 5' некодируемые последовательности, которые участвуют в инициации транскрипции и трансляции, типа бокса TATA, кэп-последовательности, последовательности CAAT и т.п. Некодируемая 3' область в кодируемой последовательности может содержать терминальные регулирующие последовательности транскрипции типа сайтов терминации и полиаденилирования.

Для присоединения последовательностей ДНК с функциями регулирования, таких как промоторы, к генной последовательности HSP или для вставки генной последовательности HSP в сайт клонирования вектора линкеры или адаптеры, предоставляющие подходящие совместимые сайты рестрикции, могут быть сшиты с хвостами кДНК способами, хорошо известными в уровне техники (Wu et al., 1987, Methods in Enzymol, 152:343-349). Гидролиз с рестриктазой может происходить в модификации для создания "тупых" хвостов путем отщепления или присоединения концевых групп одноцепочечной ДНК перед сшиванием. Альтернативно, желательный сайт рестриктазы может быть введен в фрагмент ДНК амплификацией ДНК при помощи ПЦР с праймерами, содержащими желательный сайт рестриктазы.

Экспрессирующая конструкция, включающая последовательность HSP, операбельно связанную с регулирующими областями, может быть непосредственно введена в надлежащие клетки-хозяева для экспрессии и продукции комплексных соединений "Hsp-пептид" без дальнейшего клонирования. См., например, Патент США № 5580859. Экспрессирующие конструкции могут также содержать последовательности ДНК, которые облегчают интеграцию последовательности HSP в геном клетки-хозяина, например, через гомологичную рекомбинацию. В этом случае необязательно использовать вектор экспрессии, включающий ориджин репликации, подходящий для надлежащих клеток-хозяев, для размножения и экспрессии HSP в клетках-хозяевах.

Множество векторов экспрессии, которые могут быть использованы, включает плазмиды, космиды, бактериофаги, мезофаги или модифицированные вирусы и др. Как правило, такие векторы экспрессии включают функциональный ориджин репликации для размножения вектора в соответствующей клетке-хозяине, один или несколько сайтов эндонуклеазы для вставки генной последовательности HSP и одного или нескольких маркеров селекции. Вектор экспрессии должен использоваться с совместимой клеткой-хозяином, которая может быть получена из прокариотического или эукариотического организма, включая бактерии, дрожжевые грибки, насекомых, млекопитающих и человека.

Кодирующая последовательность белка теплового шока может также быть изменена добавлением одного или нескольких сайтов гликозилирования, которые не присутствуют в нативной последовательности. Гликозилирование полипептидов является обычно или N-связанным или O-связанным. Термин "N-связанное" относится к добавлению углеводной молекулы к боковой цепи остатка аспарагина. Последовательности трипептида аспарагин-X-серин и аспарагин-X-треонин, где X - любая аминокислота кроме пролина, являются последовательностями узнавания для ферментативного присоединения углеводной молекулы к боковой цепи аспарагина. Таким образом, наличие любой из этих последовательностей трипептида в полипептиде создает потенциальный сайт гликозилирования. Термин "O-связанное гликозилирование" относится к добавлению одного из сахаров, таких как N-ацетилгалактозамин, галактоза или ксилоза, к гидроксиламинокислоте, обычно серину или треонину, хотя может также использоваться 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин.

Добавление сайтов гликозилирования может быть достигнуто различными способами. Например, альтерация может быть осуществлена путем изменений на уровне ДНК, особенно мутацией ДНК, кодирующей целевой белок или пептид в предварительно отобранных основаниях таким образом, что полученные кодоны будут осуществлять трансляцию желаемых аминокислот. Мутация(и) ДНК может быть осуществлена, используя методы, описанные в Патенте США № 5364934.

Для продолжительной продукции с высоким выходом должным образом процессированных белков теплового шока или комплексов "Hsp-белок" предпочтительна устойчивая экспрессия в клетках молочной железы. Линии клеток, которые стабильно экспрессируют HSP или комплексы "Hsp-белок", могут быть получены при использовании вектора, который содержит селектируемый маркер. В качестве неограничивающего примера, после введения экспрессирующих конструкций, рекомбинантные клетки могут быть оставлены для роста в течение 1-2 дней в обогащенных питательных средах, а затем перемещены в селективные питательные среды. Селектируемый маркер в экспрессирующей конструкции придает устойчивость к селекции и оптимально позволяет клеткам устойчиво интегрировать экспрессирующую конструкцию в их хромосомы, расти в культуре и размножаться в линиях клеток. Такие клетки могут культивироваться в течение длительного периода времени, и все это время непрерывно экспрессируются белки теплового шока.

Рекомбинантные клетки могут культивироваться при стандартных условиях температуры, инкубационного времени, оптической плотности и составов питательных сред. Однако условия для выращивания рекомбинантных клеток могут отличаться от таковых при экспрессии HSP и антигенных белков. Модифицированные условия культивирования и питательные среды могут также использоваться для усиления продукции Hsp. Например, рекомбинантные клетки, содержащие белки теплового шока с их когнатными промоторами могут быть подвергнуты нагреванию, или другому воздействию окружающей среды, или воздействию химического стресса. Любые методики, известные в уровне техники, могут быть применены для установления оптимальных условий для продукции HSP или комплексов "HSP-белок".

5.1.7 Пептидный синтез

Альтернативой получения Hsp рекомбинантными методиками является пептидный синтез. Например, весь Hsp или пептид, соответствующий части Hsp, может синтезироваться с использованием пептидного синтезатора. Может использоваться обычный пептидный синтез или другие протоколы синтеза, известные в уровне техники.

Пептиды, имеющие последовательность аминокислот белка теплового шока или его части, могут синтезироваться твердофазным пептидным синтезом, используя процессы, подобные описанным Merrifield, 1963, J. Am. Chem. Soc, 85:2149. В течение синтеза N-α-защищенные аминокислоты, имеющие защищенные боковые цепи, ступенчато добавляют к растущей цепи полипептида, связанной по ее C-концу, и к нерастворимой полимерной основе, то есть к гранулам полистирола. Пептиды синтезируются связыванием аминогруппы N-α-незащищенной аминокислоты с карбоксильной группой N-α-защищенной аминокислоты, которая была активизирована путем реагирования последней с реагентом, таким как дициклогексилкарбодиимид. Добавление свободной аминогруппы к активизированному карбоксилу приводит к формированию пептидной связи. Наиболее часто используются N-α-защитные группы, включающие Boc, которая является лабильной кислотой, и Fmoc, которая является лабильным основанием. Соответствующие химические реактивы, смолы, защитные группы, защищенные аминокислоты и реагенты детально известны в уровне техники и поэтому подробно здесь не рассматриваются (См., Atherton, et al., 1989, Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, and Bodanszky, 1993, Peptide Chemistry, A Practical Textbook, 2nd Ed., Springer-Verlag).

Один или несколько сайтов гликозилирования, которые не присутствуют в нативной последовательности, могут также быть добавлены во время синтеза. Например, аминокислотная последовательность целевого белка или пептида может быть изменена таким образом, что будет содержать одну или больше последовательностей трипептида (для сайтов N-сопряженного гликозилирования), описанных в разделе 5.1.6. Альтерация может также быть осуществлена добавлением или заменой одного или нескольких остатков серина или треонина в нативной последовательности (для сайтов O-сопряженного гликозилирования). Очистка получаемого белка теплового шока достигается использованием стандартных способов типа препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием проникания через гель, распределительной и/или ионообменной хроматографии. Подбор подходящих матриц и буферов известен в уровне техники и поэтому подробно здесь не описан.

5.2. Антигенные молекулы

Следующие подразделы предоставляют краткий обзор белков (включая пептиды и полипептиды), которые являются пригодными как антигенные/иммуногенные компоненты молекулярных комплексных соединений по изобретению, и как такие белки могут быть идентифицированы, например, для использования в рекомбинантной экспрессии пептидов для того, чтобы in vitro образовывать комплексы из белков теплового шока и антигенных молекул. Однако в практике настоящего изобретения не возникает потребности в идентификации антигенных(ой) молекул(ы) молекулярного комплекса, например, когда комплексное соединение "HSP-пептид" выделено непосредственно от злокачественной клетки или от ткани, инфицированной патогеном.

Антигенные детерминанты антигенной молекулы могут быть идентифицированы, используя методы, известные в уровне техники. Используемый здесь термин "антигенная детерминанта" относится к области антигенного пептида, которая соединяется или предположительно способна соединиться с антителом или молекулой главного комплекса гистосовместимости (MHC) субъекта. Предпочтительно, антигенная детерминанта, после присоединения к молекуле MHC, стимулирует in vivo иммунный ответ к антигенному пептиду. Пептиды настоящего изобретения содержат антигенные детерминанты, которые предположительно способны присоединять выбранные молекулы MHC и стимулировать иммунный ответ. Антигенные детерминанты пептида изобретения включают консервативные остатки, вовлеченные в связывание белков, кодируемых аллелями MHC. Антигенные детерминанты пептида, предположительно способные связывать молекулы MHC I класса, обычно состоят из 8-10 аминокислотных остатков, в то время как антигенные детерминанты пептида, предположительно способные связывать антигенные молекулы MHC класса II, обычно включают 10-20 остатков.

Неограниченное число примеров специфичных человеческих аллелей MHC, предположительно способных связать антигенные пептиды изобретения, включает следующие молекулы человеческого лейкоцитарного антигена (HLA): HLA-A1, HLA-A201, HLA-A203, HLA-A3, HLA-A2402, HLA-A26, HLA-B702, HLA-B8, HLA-B1510, HLA-B2705, HLA-B2709, HLA-B4402 и HLA-B5101 (Rammensee, et al., Immunogenetics 41, 178-228, 1995). Способность связывать молекулы MHC может быть измерена множеством различных методов, таких как ингибирование представления антигена (Sette, et al., J. Immunol. 141:3893, 1991), анализ сборки in vitro (Townsend, et al., Cell 62:285, 1990) и анализы, основанные на FACS с использованием мутантных клеток, таких как RMA.S (Melief, et al., Eur. J. Immunol. 21:2963, 1991).

В некоторых вариантах осуществления антигенная молекула представлена гликопротеидом и формирует олигомеры в присутствии лектина. В других вариантах осуществления антигенная молекула не является гликопротеидом (но другой элемент комплексного соединения является гликопротеидом). В некоторых вариантах осуществления антигенная молекула выделена из лизатов клеток. В некоторых вариантах осуществления антигенные молекулы являются синтезированными. В некоторых вариантах осуществления антигенная молекула преобразуется в гликопротеид, например, путем присоединения одного или нескольких сайтов гликозилирования, которые отсутствуют в нативной последовательности антигенной молекулы, сопровождаемого присоединением углеводов. См., например, Scott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5398-5402 (1992).

5.2.1 Выделение антигенных/иммуногенных компонентов

Установлено, что антигенные белки (включая пептиды и полипептиды) и/или компоненты могут элюироваться из комплексных соединений Hsp в присутствии АТФ или при низком уровне рН. Эти экспериментальные условия могут использоваться, чтобы выделять белки и/или антигенные компоненты из клеток, которые могут содержать потенциально полезные антигенные детерминанты. После выделения аминокислотная последовательность каждого антигенного белка может быть расшифрована, используя обычные приемы отщепления аминокислот. Подобные антигенные молекулы впоследствии могут быть получены химическим синтезом или рекомбинантными методами, очищены и in vitro объединены в комплексы с белками теплового шока для формирования комплексных соединений белков теплового шока по изобретению.

Также установлено, что потенциально иммуногенные белки могут элюироваться из комплексов "MHC-белок", используя методики, хорошо известные в уровне техники (Falk, K. et al., 1990 Nature 348:248-251; Elliott, T. et al., 1990, Nature 348:195-197; Falk, K. et al., 1991, Nature 351:290-296).

Таким образом, потенциально иммуногенные или антигенные белки могут быть выделены или из эндогенных комплексов "Hsp-белок" или из эндогенных комплексов "MHC-белок" для использования впоследствии в качестве антигенных молекул, связывая в комплекс с гликопротеидом in vitro, например гликозилированным белком теплового шока, с формированием молекулярных комплексных соединений по изобретению. Некоторые протоколы выделения пептидов и/или антигенных компонентов из этих комплексных соединений известны в уровне техники и описаны ниже.

5.2.2 Пептиды из комплексов "Hsp-пептид"

Для элюции пептида из комплексного соединения "Hsp-пептид" могут использоваться два метода.

Один метод предусматривает инкубацию комплексного соединения Hsp-пептид в присутствии АТФ. Другой метод предусматривает инкубацию комплексного соединения в буфере с низким рН.

Вкратце, интересующее комплексное соединение центрифугируется на Centricon 10 (Millipore) для удаления любого низкомолекулярного материала, слабосвязанного с комплексным соединением. Фракции с высокой молекулярной массой могут быть удалены и анализированы с помощью SDS-PAGE, в то время как низкомолекулярные фракции могут быть проанализированы с помощью ЖХВР, как описано ниже. В протоколе инкубации в присутствии АТФ комплексное соединение белка теплового шока большой молекулярной массы культивируют с 10 мM АТФ в течение 30 минут при комнатной температуре. В протоколе с низким уровнем рН (например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6) к комплексному соединению белка теплового шока добавляют уксусную кислоту или трифторуксусную кислоту (ТФК) до достижения конечной объемной концентрации 10%, и смесь культивируют при комнатной температуре, или на кипящей водяной бане, или при любой температуре между этими в течение 10 минут (см. Van Bleek, et al., 1990, Nature 348:213-216; и Li, et al., 1993, EMBO Journal 12:3143-3151).

Полученные пробы центрифугируют на Centricon 10, как упомянуто ранее. Выделяют высоко- и низкомолекулярные фракции. Остающиеся высокомолекулярные комплексные соединения "белок теплового шока-протеин" могут быть повторно инкубированы с АТФ или при низком уровне рН (например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6) для выделения любых остающихся пептидов.

Полученные низкомолекулярные фракции объединяют, концентрируют выпариванием и растворяют в 0,1% ТФК. Затем растворенный материал фракционируют обратнофазной жидкостной хроматографией высокого давления (ЖХВР) с использованием, например, обратнофазной колонки VYDAC CIS, уравновешенной 0,1% ТФК. Затем связанный материал элюируют при объемной скорости потока приблизительно 0,8 мл/мин, обрабатывая колонку линейным градиентом от 0 до 80% ацетонитрила в 0,1% ТФК. Элюция пептидов может быть проконтролирована с помощью OD210, и фракции, содержащие пептиды, собирают.

5.2.3 Пептиды из комплексных соединений "MHC-пептид"

Выделение потенциально иммуногенных пептидов из молекул MHC известно в уровне техники и поэтому подробно здесь не описано (см. Falk et al., 1990, Nature 348:248-251; Rotzsche et al., 1990, Nature 348:252-254; Elliott et al., 1990, Nature 348:191-197; Falk et al., 1991, Nature 351:290-296; Demotz et al., 1989, Nature 343:682-684; Rotzsche et al., 1990, Science 249:283-287, раскрытие которых включено здесь в виде ссылки.

Вкратце, комплексные соединения "MHC-пептид" могут быть выделены стандартным иммуноаффинным способом. Затем пептиды могут быть элюированы из комплексного соединения "MHC-пептид" инкубацией комплексных соединений в присутствии ТФК в приблизительной концентрации 0,1% в ацетонитриле. Элюируемые пептиды могут быть фракционированы и очищены обратнофазной ЖХВР, как указано выше.

Последовательности аминокислот элюируемых пептидов могут быть определены вручную или методиками автоматизированного секвенирования аминокислот, известными в уровне техники. Как только последовательность аминокислот потенциально защищенного пептида определена, пептид может синтезироваться в любом необходимом количестве, используя обычный синтез пептида или другие протоколы, хорошо известные в уровне техники.

Пептиды, имеющие такую же последовательность аминокислот, как выделенные выше, могут синтезироваться твердофазным пептидным синтезом, используя процедуры, подобные описанным Merrifield, 1963, J. Am. Chem. Soc., 85:2149. В течение синтеза N-α-защищенные аминокислоты, имеющие защищенные боковые цепи, постадийно добавляются к растущей цепи полипептида, связанной C-концом с нерастворимым полимерным основанием, то есть с гранулами полистирола. Пептиды синтезируются путем связывания аминогруппы N-α-незащищенной аминокислоты с карбоксильной группой N-α-защищенной аминокислоты, которая была активирована путем взаимодействия с реагентом типа дициклогексилкарбодиимида. Присоединение свободной аминогруппы к активированному карбоксилу приводит к формированию пептидной связи. Обычно используемые N-α-защитные группы включают Boc, являющуюся лабильной кислотой, и Fmoc, которая является лабильным основанием.

Вкратце, C-конец N-α-защищенной аминокислоты сначала присоединяется к гранулам полистирола. Затем удаляется N-α-защитная группа. Незащищенная α-аминогруппа присоединяется к активизированной α-карбоксильной группе следующей N-α-защищенной аминокислоты. Процесс повторяется, пока не синтезируется нужный пептид. Затем целевые пептиды отсоединяются от нерастворимого полимерного основания, и боковые цепи аминокислот освобождаются от защиты. Более длинные пептиды могут быть получены конденсацией защищенных фрагментов пептида. Соответствующие реактивы, смолы, защитные группы, защищенные аминокислоты и реагенты подробно известны в уровне техники и поэтому подробно здесь не описаны (см. Atherton, et at., 1989, Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, and Bodanszky, 1993, Peptide Chemistry, A Practical Textbook, 2nd Ed., Springer-Verlag).

Очистка полученных пептидов достигается при использовании обычных процедур типа препаративной гель-проникающей ЖХВР, раздельной и/или ионообменной хроматографии. Выбор адекватных матриксов и буферов известен в уровне техники и поэтому подробно здесь не описан.

5.2.4 Экзогенные антигенные молекулы

Молекулы, которые проявляют антигенность известного антигена инфекционного агента или онкоспецифичного или ассоциированного с опухолью антигена определенного типа раковой опухоли, например антигены или антигенные фрагменты, могут быть выбраны для применения в качестве антигенных молекул для связывания в комплекс с гликопротеидом и/или лектином из числа известных в уровне техники или имеющих определенную иммунологическим анализом способность присоединяться к антителам или молекулам MHC (антигенность) или генерировать иммунный ответ (иммуногенность). Чтобы определить иммуногенность или антигенность, по выявлению связывания с антителом, могут использоваться различные иммунологические анализы, известные в уровне техники, включая конкурентные и неконкурентные анализы с использованием методики типа радиоиммунных анализов, ELISA (иммуноферментный твердофазный анализ), "сэндвич" иммунологические анализы, иммунорадиометрические анализы, реакции преципитации-диффузии в геле, иммунодиффузные анализы, иммунологические анализы in vivo (например, с использованием коллоидного золота, ферментных или радиоизотопных маркеров), вестерн-блоттинги, реакции иммунопреципитации, реакции агглютинации (например, реакции гелевой агглютинации, реакции гемагглютинации), реакции связывания комплемента, реакции иммунофлюоресценции, реакции с протеином А, реакции иммуноэлектрофореза и т.д. В одном варианте осуществления связывание антител выявлено по обнаружению маркера на первичном антителе. В другом варианте осуществления первичное антитело выявлено по обнаружению присоединения вторичного антитела или реагента к первичному антителу. В другом варианте осуществления маркировано вторичное антитело. В уровне техники известно много способов обнаружения присоединения с помощью иммунологического анализа, которые предполагается использовать. В одном варианте осуществления для обнаружения иммуногенности T-клеточно-опосредованные реакции могут контролироваться стандартными методами, например анализом цитотоксичности in vitro или по реакции гиперчувствительности замедленного типа.

Потенциально полезные антигены или их производные для использования в качестве антигенных молекул могут также быть идентифицированы по различным критериям типа участия антигена в нейтрализации инвазионной способности инфекционного агента (там, где требуется вылечить или предотвратить заражение подобным инфекционным агентом) (Norrby, 1985, Summary, in Vaccines 85, Lerner, et al (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, p. 388-389) по типовой или групповой специфичности, по распознаванию с использованием иммунной сыворотки или иммунных клеток пациента и/или демонстрацией защитных эффектов антигенспецифичной иммунной сыворотки или иммунных клеток. Кроме того, где требуется вылечить или предотвратить болезнь, вызванную инфекционным агентом, кодируемая антигенная детерминанта антигена должна предпочтительно демонстрировать малую или нулевую степень антигенной вариации во времени или среди различных изолятов одного и того же патогенного фактора.

Предпочтительно там, где требуется лечение или профилактика рака, используются онкоспецифичные (то есть экспрессируемые в опухолевых клетках) или ассоциированные с опухолью антигены (то есть относительно повышенно экспрессируемые в опухолевых клетках) или их фрагменты или производные. Например, такие онкоспецифичные или онкоассоциированные антигены включают, без ограничения: KS 1/4 антиген пан-карциномы (Perez and Walker, 1990, J. Immunol. 142:3662-3667; Bumal, 1988, Hybridoma 7(4):407-415); антиген рака яичника (CA125) (CA125) (Yu, et al., 1991, Cancer Res. 51(2):468-475); простатический кислотный фосфат (Tailer, et al., 1990, Nucl. Acids Res. 18(16):4928); простатоспецифический антиген (Henttu and Vihko, 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 160(2):903-910; Israeli, et al., 1993, Cancer Res. 53:227-230); ассоциированный с меланомой антиген p97 (Estin, et al., 1989, J. Natl. Cancer Inst. 81(6):445-446); антиген меланомы gp75 (Vijayasardahl, et al., 1990, J. Exp. Med. 171(4):1375-1380); высокомолекулярный антиген меланомы (Natali, et al., 1987, Cancer 59:55-63) и простатоспецифичный мембранный антиген. Другие экзогенные антигены, которые могут образовывать комплексы с гликопротеидом, включают фрагменты или белки с высокой частотой мутаций в раковых клетках типа онкогенов (например, ras, в отдельных ras-мутантах с активацией мутаций, которые встречаются только в четырех аминокислотных остатках (12, 13, 59 или 61) (Gedde-Dahl et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24(2):410-414)) и гены супрессора опухоли (например, p53, для которого была идентифицирована разновидность мутантных или полиморфных антигенов p53 пептида, способных к стимулированию цитотоксической реакции Т-клеток (Gnjatic et al., 1995, Eur. J. Immunol. 25 (6):1638-1642)).

В специфичном варианте осуществления антиген или фрагмент или их производная, специфичная к опухоли, выбраны для образования комплекса с белками теплового шока, с формированием комплексного соединения "HSP-антиген" для олигомеризации и затем введения пациенту, имеющему эту опухоль.

Предпочтительно, там, где требуется лечение или профилактика вирусных заболеваний, используются молекулы, включающие антигенные детерминанты известных вирусов. Например, такие антигенные детерминанты могут быть получены от вирусов, включая гепатит типа A, гепатит типа B, гепатит типа C, грипп, ветряную оспу, аденовирус, вирус простого герпеса I типа (HSV-I), вирус простого герпеса II типа (HSV-II), чуму крупного рогатого скота, риновирус, эховирус, ротавирус, респираторно-синцитиальный вирус, вирус папилломы, паповавирус, цитомегаловирус, эхиновирус, арбовирус, хантавирус, вирус коксаки, вирус свинки, вирус кори, вирус краснухи, вирус полиомиелита, вирус иммунодефицита человека I типа (ВИЧ-I), вирус иммунодефицита человека II типа (ВИЧ-II) и др. Предпочтительно, там, где требуется лечение или профилактика бактериальных инфекций, используются молекулы, включающие антигенные детерминанты известных бактерий. Например, такие антигенные детерминанты могут быть получены от бактерий, включая, но не ограничиваясь, микобактерии, риккетсии, микоплазмы, нейссерии и легионеллы.

Предпочтительно, там, где требуется лечение или профилактика инфекций простейшими, используются молекулы, включающие антигенные детерминанты известного простейшего микроорганизма. Например, такие антигенные детерминанты могут быть получены от простейших, включая, но не ограничиваясь, таких как лейшмании, кокцидии, трипаносомы.

Предпочтительно, там, где требуется лечение или профилактика паразитарных инфекций, используются молекулы, включающие антигенные детерминанты известных паразитов. Например, такие антигенные детерминанты могут быть получены от паразитов, включая, но не ограничиваясь, таких как хламидии, риккетсии.

5.3. Получение комплексных соединений белка теплового шока и антигенной молекулы in vitro

В варианте осуществления, в котором специфичные комплексные соединения белков теплового шока и антигенных молекул, с которыми они являются эндогенно связанными in vivo, не используются, комплексные соединения белков теплового шока с антигенными молекулами получают in vitro. Как будет оценено специалистами, антигенные молекулы, выделенные в соответствии с вышеупомянутыми процедурами, или химически синтезируемые, или полученные рекомбинантно, могут быть восстановлены с различными очищенными естественными или рекомбинантными белками теплового шока in vitro для получения иммуногенного нековалентного комплекса белок теплового шока-антигенная молекула. Альтернативно, экзогенные антигены, или антигенные или иммуногенные фрагменты, или их производные могут формировать комплексы с белками теплового шока для использования в иммунотерапевтических или профилактических вакцинах по изобретению. Предпочтительный демонстрационный протокол формирования комплекса стресс-протеина и антигенной молекулы in vitro обсужден ниже.

До формирования комплекса белки теплового шока предварительно обрабатывают в присутствии АТФ или при низком уровне рН (например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6) для удаления любых пептидов, которые могут быть связаны с интересующим белком теплового шока. Когда обработка с АТФ произведена, избыточную АТФ удаляют из препарата путем добавления апираназы, как описано Levy, et at., 1991, Cell 67:265-274. Когда обработка при низком уровне рН произведена, буфер изменяют до нейтрального значения рН прибавлением модифицирующих реагентов.

Антигенные молекулы (1 мкг) и предварительно подготовленный белок теплового шока (9 мкг) смешивают для получения приблизительно 5 антигенных молекул: 1 молярное отношение белка теплового шока. Затем смесь инкубируют от 15 минут до 3 часов при 4°С до 45°C в соответствующем агрегирующем буфере, таком как содержащем 20 мM фосфата натрия, рН 7,2, 350 мM NaCl, 3 мM MgCl₂ и 1 мM фенилметилсульфонилфторида (PMSF). Препараты центрифугируют на Centricon 10 (Millipore) для удаления любого несвязанного пептида. Ассоциация пептидов с белками теплового шока может быть оценена путем SDS-PAGE. Это предпочтительный метод для образования in vitro комплексов пептидов, выделенных из комплексных соединений "MHC-пептид", и пептидов, диссоциированных из эндогенных комплексов "hsp-пептид".

В альтернативном варианте осуществления изобретения предпочтительном для создания комплексных соединений hsp70 с экзогенными антигенными молекулами типа белков, 5-10 микрограммов очищенного белка теплового шока инкубируют с равными молярными количествами антигенных молекул в буфере 20 мM фосфата натрия, рН 7,5, 0,5M NaCl, 3 мM MgCl₂ и 1 мM АДФ в объеме 100 микролитров при 37°C в течение 1 часа. Эта инкубационная смесь далее разбавлена в 1 мл фосфатно-буферного солевого раствора.

В альтернативном варианте осуществления изобретения, предпочтительном для создания комплексных соединений gp96 или hsp90 с пептидами, 5-10 микрограммов очищенного gp96 или hsp90 инкубируют с эквимолярными или избыточными количествами антигенного пептида в приемлемом буфере типа буфера, содержащего 20 мM фосфата натрия, рН 7,5, 0,5M NaCl, 3 нM MgCl₂ при 37-65°C в течение 5-20 мин. Этой инкубационной смеси позволяют охладиться при комнатной температуре и центрифугируют один или несколько раз, в случае необходимости, на Centricon 10 (Millipore), чтобы удалить любой несвязанный пептид.

Следующее образование комплексов иммуногенного стресс-протеина и антигенной молекулы может быть произвольно проанализировано in vitro, используя, например, смешанный анализ клетки-мишени лимфоцита (MLTC), описанный ниже. Как только иммуногенные комплексные соединения выделены, они затем могут быть произвольно охарактеризованы на животных моделях, используя предпочтительные протоколы воздействия и инертные наполнители, обсужденные ниже.

Как альтернатива нековалентным комплексным соединениям белков теплового шока и антигенных молекул, антигенные молекулы могут быть присоединены ковалентной связью к белкам теплового шока до введения согласно методам настоящего изобретения. Комплексные соединения "белок теплового шока-антигенная молекула" являются предпочтительно поперечносшитыми после их очистки от клеток или тканей, как описано в разделах с 5.1.1. по 5.1.4. В одном варианте осуществления белки теплового шока ковалентно соединены с антигенными молекулами перекрестным сшиванием. Химические методы сшивки хорошо известны в уровне техники. Например, в предпочтительном варианте осуществления может использоваться поперечная сшивка глутаральдегидом. Сшивка глутаральдегидом использовалась для формирования ковалентных комплексных соединений пептидов и hps (см. Barrios et al., 1992, Eur. J. Immunol. 22:1365-1372). Предпочтительно, 1-2 мг комплекса "белок теплового шока-антигенная молекула" поперечно сшивают в присутствии 0,002% глутаральдегида в течение 2 часов. Глутаральдегид удаляют диализом против фосфорнокислого буферного солевого раствора (РВS) в течение ночи (Lussow et al., 1991, Eur. J. Immunol. 21:2297-2302).

В другом варианте осуществления белок теплового шока и специфический антиген(ы) поперечно сшиты ультрафиолетовым (UV) перекрестным сшиванием.

В другом варианте осуществления получают рекомбинантные слитые белки, состоящие из последовательности белка теплового шока и последовательности антигенного пептида. Для производства такого рекомбинантного слитого белка создан вектор экспрессии, используя последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие белок теплового шока в соединении с последовательностями, кодирующими антиген, используя рекомбинантные методы, известные в уровне техники, типа описанных выше в разделе 5.1.6. Затем комплексы слияния "Hsp-антигенный пептид" экспрессируют и выделяют. Такие слитые белки могут использоваться для выявления иммунного ответа (Suzue et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:13146-51). Специфично конструируя часть антигенного пептида в молекуле, подобные слитые белки могут использоваться для выявления иммунного ответа и в иммунотерапии рака или инфекционных болезней.

5.4. Олигомеризация биологически активных комплексных соединений

В соответствии с настоящим изобретением лектин или подобные лектину молекулы формируют молекулярное комплексное соединение с иммунологически и/или биологически активными гликопротеидами. В некоторых вариантах осуществления гликопротеид - это белок теплового шока. В некоторых вариантах осуществления гликопротеид не является белком теплового шока. В некоторых вариантах осуществления гликопротеид - это антигенная молекула. В некоторых вариантах осуществления гликопротеид не является антигенной молекулой. В определенных вариантах осуществления молекулярное комплексное соединение может впоследствии включать одну или несколько молекул, которые не являются гликопротеидами. В специфичном варианте осуществления молекулярное комплексное соединение впоследствии включает антигенную молекулу. В специфичном варианте осуществления молекулярное комплексное соединение включает молекулу лектина, связанную с гликопротеидом и белком теплового шока. В другом варианте осуществления молекулярное комплексное соединение включает лектин, связанный с гликопротеидом, белком теплового шока и антигенной молекулой. В еще одном специфичном варианте осуществления молекулярное комплексное соединение включает молекулу лектина, связанную с гликозилированным белком теплового шока и антигенной молекулой, где указанный гликозилированный белок теплового шока может быть встречающимся в природе белком теплового шока (например, gp96, GRP170, кальретикулин и Bip (GRP78)) или не встречающимся в природе белком теплового шока, который преобразован в гликопротеид добавлением одного или нескольких сайтов гликозилирования, которые не присутствуют в нативных аминокислотных последовательностях, включающих белок теплового шока, сопровождаемый прибавлением углеводных групп. Комплексное соединение гликопротеида (например, белок теплового шока) и антигенной молекулы может быть нековалентным или ковалентным. Предпочтительно, лектин нековалентно присоединяется к одному или большему числу гликопротеидов или к комплексному соединению гликопротеида (например, белку теплового шока) и к одной или большему числу других молекул (например, антигенных молекул). В предпочтительном варианте осуществления молекула лектина - это маннозо-связывающая молекула лектина, включая, без ограничения, перечисленные в Таблице 1 и др. Более предпочтительно, если маннозо-связывающая молекула лектина представлена конканавалином А (Con A).

В предпочтительном варианте осуществления количество присутствующего в молекулярном комплексном соединении лектина больше, чем количество присутствующих в молекулярном комплексном соединении гликопротеидов. В некоторых вариантах осуществления молярное соотношение между гликопротеидом и лектином составляет 3:1, 2:1 или 1:1. В предпочтительном варианте осуществления лектин представлен конканавалином А в форме тетрамера, и к каждой молекуле тетрамера конканавалина А присоединено три, два или один гликопротеид(а).

Молекулярное комплексное соединение по изобретению может быть получено различными методами. В определенных вариантах осуществления молекулярное комплексное соединение получено in vivo, и молекулярное комплексное соединение выделено из клеток. В определенных вариантах осуществления молекулярное комплексное соединение получено in vitro из очищенных препаратов одного или нескольких компонентов молекулярного комплекса. Методики, которые могут использоваться для получения молекулярного комплексного соединения по изобретению, зависят от природы комплексного соединения. Неограничивающие примеры получения компонентов молекулярного комплексного соединения по изобретению предоставлены выше в разделах 5.1.-5.3. Могут быть также использованы другие методики очистки белков, известные в уровне техники, такие как, без ограничения, разделение адсорбцией, например хроматография, ионный обмен, неорганические адсорбенты, гидрофобные адсорбенты, фиксированная металлоаффинная хроматография, иммуноадсорбенты, хроматография лигандов и красителя, аффинная элюция из ионообменников и других адсорбентов; гель-фильтрация; электрофорезные методы; разделение в жидкой фазе и ультрафильтрация. См. Scopes, 1994, PROTEIN PURIFICATION PRINCIPLES AND PRACTICE, 3-rd ed., Springer, содержание которого включено здесь в виде ссылки.

Лектины могут быть добавлены на различных стадиях подготовки молекулярного комплексного соединения, например, до или после различных хроматографических стадий, используемых для очистки иммунологически и/или биологически активных молекул (например, комплексов Hsp-белок). Лектины могут быть добавлены в различных формах типа порошка или жидкого раствора. Различные лектины могут использоваться в комбинации для приготовления олигомеров по изобретению. Лектины могут также быть поперечно сшиты, используя хорошо известные в уровне техники методы, перед добавлением к молекулярному препарату по изобретению, для активации олигомеризации. В некоторых вариантах осуществления добавление лектинов является одной из стадий очистки молекулярного комплексного соединения. В некоторых вариантах осуществления сначала приготовлены другие компоненты молекулярного комплексного соединения, а лектины добавлены к конечному продукту для активации олигомеризации молекулярного комплексного соединения. В предпочтительном варианте осуществления молекулярное комплексное соединение по изобретению включает белок теплового шока, антигенную молекулу и лектин, где количество добавленного лектина достаточно для активации олигомеризации препарата и производства конечного продукта(ов), где количество присутствующего в конечном продукте(ах) лектина относительно количества белка теплового шока равно или больше чем 5 нг, 10 нг, 20 нг, 30 нг, 40 нг, 50 нг, 75 нг, 100 нг или 200 нг на микрограмм белка теплового шока. Предпочтительно, количество присутствующего в конечном продукте(ах) лектина относительно количества белка теплового шока - 40 нг-1000 нг, 50 нг-1000 нг, 50 нг-500 нг, 100 нг-250 нг или 150 нг-200 нг лектина на микрограмм белка теплового шока. В некоторых вариантах осуществления количество добавленного лектина достаточно для активации олигомеризации препарата и получения конечного продукта или продуктов, в которых количество присутствующего лектина в конечном продукте(ах) относительно количества белка теплового шока равно или меньше чем 5 нг на микрограмм белка теплового шока. Предпочтительно, количество присутствующего лектина в конечном продукте(ах) относительно количества белка теплового шока составляет между 0,1 нг-5 нг, 0,2 нг-4 нг, 0,3 нг-3 нг, 0,5 нг-2 нг или 0,1 нг-1 нг лектина на микрограмм гликопротеида.

Для подтверждения олигомеризации молекулярного комплексного соединения может использоваться любой анализ, известный в уровне техники. Например, может использоваться анализ SEC, где олигомеризованное молекулярное комплексное соединение элюируется в отличной фракции по сравнению с неолигомеризованным молекулярным комплексным соединением при колоночной очистке с исключением по размеру (например, см. раздел 7).

Для подтверждения наличия молекулы лектина в олигомере может использоваться любой анализ, известный в уровне техники, включая, без ограничения, любые иммуно-основанные методы, такие как ELISA, радиоиммунные анализы, иммунные сэндвич-анализы, иммунорадиометрические анализы, анализы иммунодиффузии, анализы иммунофлюоресценции, анализы иммуноэлектрофореза. Все эти анализы известны в уровне техники и подробно здесь не обсуждены (например, конканавалин А-специфичный ELISA, см. раздел 6).

Корреляция олигомеризации молекулярного комплексного соединения с его in vivo и in vitro активностями может быть продемонстрирована любым анализом, известным в уровне техники, включая те пробы, которые обнаруживают биологическую активность и/или иммуногенность молекулярных комплексных соединений по изобретению (типа описанных ниже в разделе 5.5 или других), анализы, в которых тестируют in vitro активность молекулярных комплексных соединений по изобретению (такие, как анализы представления, например in vitro анализ представления CD71, in vitro анализ представления Меth А и in vitro анализ представления антигена CT26, см. разделы с примерами ниже), и анализы, в которых тестируют in vivo активности молекулярных комплексных соединений по изобретению, используя модели на животных (например, in vivo анализ ингибирования Meth А-индуцированной опухоли, см. разделы с примерами ниже). В предпочтительном варианте осуществления используется анализ представления или анализ ингибирования опухоли.

5.5. Определение иммуногенности молекулярных комплексных соединений

Молекулярные комплексные соединения по изобретению могут быть необязательно исследованы на иммуногенность, используя любой известный в уровне техники метод. Например, может использоваться одна из следующих процедур.

5.5.1 Анализ MLTC

Мышам вводится некоторое количество молекулярного комплексного соединения по изобретению любым удобным способом. Как негативный контроль другим мышам вводятся, например, молекулярные комплексные соединения, не содержащие олигомеризованные гликопротеиды. Клетки, которые, как известно, содержат специфические антигены, например опухолевые клетки или клетки, пораженные возбудителем инфекционной болезни, могут служить позитивным контролем для анализа. Мышам вводят препараты дважды, с промежутком в 7-10 дней. Спустя десять дней после последней иммунизации удаляют селезенки и выделяют лимфоциты. Выделенные лимфоциты могут рестимулироваться впоследствии in vitro добавлением мертвых клеток, экспрессирующих интересующий антиген.

Например, 8×10⁶ иммунных клеток селезенки могут стимулироваться 4×10⁴ клетками, обработанными митомицином C или γ-облученными (5-10000 рад), содержащими интересующий антиген (или клетками, инфицированными вирусом с соответствующим геном, в зависимости от обстоятельств) в 3 мл питательной среды RPMI, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки. В определенных случаях 33%-ный супернатант культуры вторично смешанных лимфоцитов может быть включен в питательную среду как источник факторов роста Т-клеток (см. Glasebrook, et al., 1980, J. Exp. Med. 151:876). Для анализа первичной реакции цитотоксических Т-клеток после иммунизации клетки селезенки могут культивироваться без стимуляции. В некоторых экспериментах клетки селезенки иммунизированных мышей также могут рестимулироваться антигенно различными клетками для определения специфичности реакции цитотоксических Т-клеток.

Шесть дней спустя культуры тестируют на цитотоксичность в 4-часовом ⁵¹Cr-высвобождающем анализе (см. Palladino, et al., 1987, Cancer Res, 47:5074-5079 и Blachere, et al., 1993, J. Immunotherapy. 14:352-356). В этом анализе смешанную культуру лимфоцитов добавляют к суспензии клеток-мишеней в разных отношениях эффектор:мишень (E:T) (обычно от 1:1 до 40:1). Клетки-мишени предварительно мечены культивированием 1×10⁶ клеток-мишеней в питательной среде, содержащей 20 мКи ⁵¹Cr/мл в течение одного часа при 37°C. Клетки промывают три раза после мечения. Каждая точка анализа (отношение E:T) выполнена в трех повторностях с адекватными контролями, включенными для измерения спонтанного высвобождения ⁵¹Cr (лимфоциты не добавлены в анализ) и 100%-ного высвобождения (клетки лизированы детергентом). После культивирования клеточных смесей в течение 4 часов клетки осаждают центрифугированием при 200g в течение 5 минут. Количество высвобожденного в супернатант ⁵¹Cr измеряется гамма-счетчиком. Процентная цитотоксичность измеряется как количество импульсов в минуту для испытуемого образца за вычетом счета спонтанного высвобождения, разделенное на количество импульсов полного детергентного высвобождения за вычетом счета спонтанного высвобождения.

Чтобы блокировать каскад MHC класса I, к образцам для испытаний добавляется супернатант концентрированной гибридомы, полученный из клеток гибридомы K-44 (анти-MHC гибридома класса I), в конечной концентрации 12,5%.

5.5.2 Анализ CD4+ Т-клеточной пролиферации

Первичные Т-клетки получают из селезенки, свежей крови или CSF и очищают центрифугированием, используя FICOLL-PAQUE PLUS (Pharmacia, Upsalla, Швеция), как описано Kruse и Sebald, 1992, EMBO J. 11: 3237-3244. Мононуклеарные клетки периферической крови культивируют в течение 7-10 дней с лизатом клеток, экспрессирующих антигенную молекулу. Антиген-представляющие клетки могут быть добавлены к культуре за 24-48 часов до анализа для образования и представления антигена в лизате. Затем клетки собирают центрифугированием и промывают в среде RPMI1640 (GibcoBRL, Gaithersburg, Md.). 5×10⁴активированных Т-клеток на лунку (PHA-бласты) находятся в среде RPMI 1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 10 мМ HEPES, рН 7,5, 2 мМ L-глутамина, 100 ед./мл пенициллина G и 100 мкг/мл стрептомицина сульфата в 96-луночном планшете в течение 72 часов при 37°C, с 1/мКи ³H-тимидина (DuPont NEN, Boston, Mass.) на лунку в течение 6 часов, собирают и в сцинтилляционном счетчике TOPCOUNT (Packard Instrument Co., Meriden, Conn.) измеряют радиоактивность.

5.5.3 Анализ гуморального иммунного ответа

В определенном варианте осуществления изобретения иммуногенность молекулярного комплексного соединения по изобретению, включающего олигомеризованные гликопротеиды, определяется измерением количества антител, продуцируемых в ответ на введение комплексного соединения. В одном варианте осуществления чашки микротитратора (96-ячеечный иммунодиффузионный планшет II, Nunc) покрывают 50 мкл на лунку 0,75 мкг/мл раствором очищенной не-комплексной формы антигенного пептида, используемого в молекулярном комплексном соединении (например, Aβ42) в PBS при 4°C в течение 16 часов и при 20°C в течение 1 часа. Лунки освобождают и блокируют с 200 мкл PBS-T-BSA (PBS содержит 0,05% (об/об) TWEEN 20 и 1% (мас./об.) бычьего сывороточного альбумина) на лунку при 20°C в течение 1 часа, затем промываются 3 раза PBS-T. Пятьдесят мкл на лунку плазмы или CSF от животного (такого, как модельная мышь или человек), которое получило молекулярное комплексное соединение по изобретению, выдерживают при 20°C в течение 1 часа и чашки промывают 3 раза PBS-T. Затем калориметрически измеряют активность антитела антипептида после культивирования при 20°C в течение 1 часа с 50 мкл на лунку овечьим антимышиным или античеловеческим иммуноглобулином, как потребуется, конъюгированным с пероксидазой хрена (Amersham), разбавленным 1:1500 в PBS-T-BSA и (после 3 последующих промываний PBS-T, как описано выше) с 50 мкл o-фенилендиамина (OPD)-H₂O₂ раствора субстрата. Реакцию останавливают добавлением 150 мкл 2M H₂SO₄ после 5 минут и определяют поглощение света на фотометре Kontron SLT-210 (SLT Lab-instr., Zurich, Switzerland) на 492 нм (реф. 620 нм).

5.5.4 Анализ обнаружения цитокинов

CD4+ Т-клеточная пролиферативная реакция на HSP-комплексные соединения по изобретению может быть измерена обнаружением и количественным определением уровней специфических цитокинов. В одном варианте осуществления, например, внутриклеточные цитокины могут быть измерены анализом обнаружения IFN-γ, чтобы проверить комплексные соединения по изобретению на иммуногенность. Например, мононуклеарные клетки периферической крови субъекта, получившего комплексы лектин-HSP-пептид, стимулируют пептидными антигенами данной опухоли или пептидными антигенами возбудителя инфекционной болезни. Затем клетки окрашивают Т-клеточно-специфичными меченными антителами, обнаруживаемыми поточной цитометрией, например, FITC-сопряженными анти-CD8 и PerCP-меченными анти-CD4 антителами. После промывания клетки фиксируют, повышая их проницаемость, и они реагируют с меченными краской антителами, реактивными с человеческим IFN-γ(PE-анти-IFN-γ). Образцы анализируют поточной цитометрией, используя стандартные методики.

Как вариант иммунологический анализ на фильтре, иммуноферментный спот-анализ (ELISPOT) может использоваться для обнаружения специфичных цитокинов, окружающих Т-клетку. В одном варианте осуществления, например, чашка микротитратора из нитроцеллюлозы покрывается очищенными цитокин-специфичными первичными антителами, то есть анти-IFN-γ, и чашка защищается от неспецифического связывания другими белками. Образец мононуклеарных клеток крови, содержащих секретирующие цитокины клетки, полученные от субъекта, получившего комплексы лектин-HSP-пептид, разбавляют в лунках планшеты микротитра. Добавляют меченные, например, биотином вторичные антицитокин антитела. Затем может быть обнаружен комплекс цитокина и антитела, например фермент-конъюгированные стрептавидин-цитокин-секретирующие клетки можно увидеть как "пятна" визуальным, микроскопическим или электронным методами обнаружения.

5.5.5 Тетрамерный анализ

В другом варианте осуществления "тетрамер красящий" анализ (Altman et al., 1996, Science 274: 94-96) может использоваться для идентификации антиген-специфичных Т-клеток. Например, в одном варианте осуществления молекула MHC, содержащая специфичный пептидный антиген, такой как специфичный антиген опухоли, мультимеризуется с получением растворимых пептидных тетрамеров и маркируется, например, образованием комплекса со стрептавидином. Затем комплекс MHC-пептидный антиген смешивают с совокупностью Т-клеток, полученных от субъекта, которому вводится лектин-НSP-комплекс. Затем используют биотин для окрашивания Т-клеток, которые экспрессируют интересующий антиген, то есть специфический антиген опухоли.

5.6. Комбинация с восприимчивой иммунотерапией

Адоптивная (восприимчивая) иммунотерапия относится к терапевтическому подходу лечения опухолей или инфекционных болезней, когда иммунные клетки вводят субъекту с целью прямого или косвенного получения специфического иммунитета к опухолевым клеткам и/или антигенным компонентам, или регрессии опухоли, или лечения инфекционных болезней, в зависимости от обстоятельств. (См. Патент США № 5985270, выданный 16 ноября 1999, включенный здесь в виде ссылки в полном объеме.) Дополнительно, в соответствии с описанными здесь методами, APC сенсибилизируются молекулярным комплексным соединением по изобретению и применяются в восприимчивой иммунотерапии.

В одном варианте осуществления антиген-представляющие клетки (APC) для использования при восприимчивой иммунотерапии сенсибилизируются лектином, связанным с комплексом HSP с антигенными белками, приготовленным в соответствии с описанными здесь методами. Комплексы могут быть получены образованием комплексов из лектин-Hsp и антигенных белков, полученных по крайней мере из 50% различных белков или по крайней мере 100 различных белков, присутствующих в антигенных клетках или вирусных частицах, которые экспрессируют антигенную детерминанту возбудителя инфекционной болезни. Также комплексы могут быть получены: (a) подвергая белковый препарат, полученный из клеток указанного вида опухоли, или перевариванию протеазой, или связыванию с АТФ, гидрохлоридом гуанидиния и/или кислотой, чтобы получить совокупность антигенных пептидов, и (b) образованием комплексов из совокупности антигенных пептидов с лектин-Hsp.

В другом варианте осуществления терапия введением образованных in vitro комплексов из антигенных пептидов, HSP и лектинов, полученных методами по изобретению, может комбинироваться с восприимчивой иммунотерапией, использующей APC, сенсибилизированные комплексами HSP-антигенные пептиды, полученные любым известным в уровне техники методом (см., например, Патент США № 5985270), где антигенные пептиды экспрессируют желаемую антигенность (например, определенного вида опухоли или патогена). Сенсибилизированные APC могут вводиться одни, в комбинации с образованными in vitro комплексами из белков, HSP и лектинов, или до, или после их введения. В частности, использование сенсибилизированных APC для предотвращения и лечения опухолей может далее сочетаться с введением субъекту эффективного для указанных лечения или профилактики количества комплексов лектина и белка теплового шока с антигенными белками, где указанные комплексы были получены, как описано выше. Точно так же использование сенсибилизированных APC при лечении или профилактике инфекционной болезни может дополнительно сочетаться с введением субъекту эффективных для указанного лечения или профилактики доз комплексов, содержащих лектин, связанный с белками теплового шока и антигенными белками.

Кроме того, способы введения полученных in vitro молекулярных комплексных соединений по изобретению могут быть различны, включая, например, подкожный, внутривенный или внутримышечный, но внутрикожный предпочтителен. В другом специфичном варианте осуществления адоптивная иммунотерапия антиген-представляющими клетками, сенсибилизированными комплексными соединениями согласно настоящему изобретению, может комбинироваться с назначением лектина, связанного с комплексами HSP-антигенная молекула, полученного любым известным в уровне техники методом (см., например, Патенты США № 5750119, 5837251, 5961979, 5935576, публикации PCТ WO 94/14976 или WO 99/50303), где антигенные молекулы экспрессируют желаемую антигенность (например, определенного вида опухоли или патогена).

5.6.1 Получение макрофагов и антиген-представляющих клеток

Антиген-представляющие клетки (APC), включая макрофаги, дендроциты и В-клетки, предпочтительно получать путем продукции in vitro от стволовой клетки и клетки-предшественника из периферической крови человека или костного мозга, как описано Inaba, K., et al., l992, J.Exp. Med., 176:1693-1702.

APC могут быть получены любыми известными в уровне техники методами. В предпочтительном варианте используются макрофаги человека, полученные из клеток крови человека. Например, макрофаги могут быть получены следующим образом.

Мононуклеарные клетки выделяют из периферической крови пациента (предпочтительно пациента для лечения) центрифугированием в градиенте Ficoll-Hypaque и высевают на чашки с культурами тканей, которые перед этим покрывают сывороткой пациента или другой AB+ человеческой сывороткой. Клетки культивируют при 37°C в течение 1 часа, затем пипеткой удаляют неадгезировавшиеся клетки. К адгезировавшимся клеткам, оставшимся в чашке, добавляют холодный (4°C) 1 мМ EDTA в солевом фосфатном буфере и чашки оставляют при комнатной температуре на 15 минут. Клетки собирают, промывают буфером RPMI и суспендируют в буфере RPMI. Увеличение числа макрофагов может быть получено культивацией при 37°C с макрофагальным колониестимулирующим фактором (M-CSF); увеличение числа дендритных клеток может быть получено культивацией с гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором (GM-CSF), как подробно описано у Inaba, K., et al., 1992, J. Exp. Med., 176:1693-1702.

5.6.2 Сенсибилизирование макрофагов и антиген-представляющих клеток молекулярными комплексными соединениями по изобретению

APC сенсибилизируются молекулярными комплексными соединениями по изобретению, предпочтительно, путем культивации клеток с комплексными соединениями in vitro. APC сенсибилизируются комплексными соединениями, включающими гликопротеиды/гликопептиды, связанные с лектином и антигенными молекулами, путем ингибирования с комплексными соединениями in vitro при 37°C в течение от 15 минут до 24 часов. Например: 5×10⁴ макрофагов могут быть инкубированы с желаемой титрованной концентрацией Hsp, начиная со 150 мкг/мл и ниже, при 37°C в течение от 15 минут до 24 часов в 1 мл простой питательной среды RPMI. Клетки промывают три раза и ресуспендируют в физиологической питательной среде, предпочтительно стерильной, в удобной концентрации (например, 1×10⁷/мл) для введения пациенту. Предпочтительно, чтобы сенсибилизированные APC вводились пациенту, от которого они были взяты изначально (аутогенный вариант осуществления).

Также можно контролировать способность сенсибилизированных APC стимулировать, например, антиген-специфичный класс I-ограниченных цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) путем определения их способности стимулировать выделение фактора некроза опухоли СTL и их способности проявлять себя в качестве мишеней для таких CTL.

5.6.3 Реинфузия сенсибилизированных APC

APC, сенсибилизированные молекулярными комплексами, повторно системно вводятся пациенту, предпочтительно внутривенно, обычными клиническими способами. Эти активированные клетки вводятся повторно аутогенному пациенту, предпочтительно системным назначением. В целом пациенты получают приблизительно от 10⁶ до 10¹² сенсибилизированных макрофагов в зависимости от состояния пациента. В некоторых режимах пациенты могут дополнительно получить соответствующую дозу модификатора биологической реакции, включая, без ограничения, цитокины IFN-α; IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-6, TNF или другой цитокин-фактор роста.

5.7. Пассивная иммунотерапия

Композиции изобретения могут также использоваться для пассивной иммунотерапии против опухолей и инфекционных болезней. Пассивный иммунитет - это краткосрочная защита субъекта, полученная в результате введения подготовленных антител против гетерологичного организма. Например, композиции по изобретению, включающие комплексы Hsp-пептид, полученные из клеток, инфицированных инфекционным организмом и олигомеризованные с молекулами лектина, могут использоваться для получения иммунного ответа у субъекта; сыворотка субъекта может также использоваться для лечения или профилактики болезни, вызванной инфекционным организмом у другого субъекта.

5.8. Профилактика и лечение болезней

Далее настоящее изобретение рассматривает метод профилактики или лечения болезней (например, онкологических заболеваний, инфекционных болезней, анемии, заболеваний, связанных с дефицитом фактора роста, ферментной недостаточностью, иммунодефицитных состояний и т.д.), включая введение субъекту, нуждающемуся в этом, профилактически или терапевтически эффективного количества композиции, который включает один или несколько молекулярных комплексов, где каждый комплекс содержит лектин, связанный с иммунологически и/или биологически активным гликопротеидом. В одном варианте осуществления гликопротеид является антигенной молекулой. В определенном варианте осуществления комплекс включает лектин, гликопротеид, который является антигенной молекулой, и другую молекулу, такую как белок теплового шока, который может быть гликозилирован или нет. В другом варианте осуществления гликопротеид не является антигенной молекулой. В определенном варианте осуществления гликопротеид является гликозилированным белком теплового шока. В еще одном варианте осуществления молекулярное комплексное соединение по изобретению включает лектин, гликопротеид, который не является антигенной молекулой, и антигенную молекулу (которая может быть гликопротеидом или нет). В определенном варианте осуществления антигенная молекула является белком (включая пептид и полипептид), проявляющим антигенность антигена определенного вида опухоли или возбудителя инфекционной болезни. Далее композиции могут включать фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых вариантах осуществления субъектом является животное. В некоторых вариантах осуществления субъектом является млекопитающее. В некоторых вариантах осуществления субъектами являются сельскохозяйственные животные, такие как лошади, куры, овцы или свиньи. В некоторых вариантах осуществления субъектами являются домашние животные, такие как птицы, собаки или кошки. В предпочтительном варианте осуществления субъектом является человек.

В одном варианте осуществления под "лечением" понимается улучшение в течении болезни или по меньшей мере уменьшение одного из ее различимых симптомов. В другом варианте осуществления под "лечением" понимается улучшение по меньшей мере одного измеримого физического параметра, связанного с болезнью и не обязательно различимого субъектом. В еще одном варианте осуществления под "лечением" понимается замедление прогрессирования болезни, или физически, например стабилизация различимого симптома, или физиологически, например стабилизация физического параметра, или и то и другое. В еще одном варианте осуществления под "лечением" понимается отсрочка начала болезни.

В определенных вариантах осуществления композиции настоящего изобретения вводятся субъекту как профилактические средства. Здесь под "профилактикой" или "предотвращением" понимается уменьшение риска развития болезней, таких как опухоли или инфекционные болезни. В одном методе варианта осуществления композиции настоящего изобретения вводятся как профилактические средства субъекту с генетической предрасположенностью к опухоли. В другом методе варианта осуществления композиции настоящего изобретения вводятся как профилактические средства субъекту, на которого воздействуют канцерогенные вещества, включающие: химикаты и/или радиацию и др., или субъекту, имеющему контакт с возбудителями инфекционных болезней.

Например, в определенных вариантах осуществления введение композиций по изобретению приводит к ингибированию роста или сокращению числа злокачественных клеток или возбудителей инфекционных болезней как минимум на 99%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 60%, 50%, 45%, 40%, 45%, 35%, 30%, 25%, 20% или 10% относительно роста в отсутствие указанных композиций.

Композиции, приготовленные методами изобретения, включают комплексы лектина, связанного с гликопротеидом(ами), предпочтительно белком(ами) теплового шока. Кроме того, композиции могут включать совокупность антигенных пептидов (которые могут быть гликопротеидами или нет). Композиции по изобретению могут использоваться для вызова воспалительной реакции на месте опухоли, что в конечном счете приводит к регрессии опухоли у больных, получающих лечение. Композиции по изобретению могут повышать иммунитет у субъекта и вызвать специфический иммунитет против возбудителей инфекционных болезней или пренеопластических и неопластических клеток. Композиции по изобретению могут также использоваться для предотвращения возникновения и прогрессирования инфекционных болезней, а также для замедления роста и прогрессирования опухолей.

Комбинированная терапия предполагает использование молекулярных комплексных соединений по изобретению с другим способом предотвращения или лечения болезни, например опухолей, инфекционных болезней, анемии, заболеваний, связанных с дефицитом гормона роста, ферментной недостаточностью, иммунодефицитных состояний. Назначение комплексных соединений по изобретению может усилить эффект профилактических или терапевтических средств, таких как противоопухолевые или антибактериальные средства, и наоборот. Предпочтительно, чтобы дополнительный метод был основан не на лектине-HSP, то есть этот метод не должен включать ни HSP, ни лектин. Этот подход обычно называют комбинированной терапией, добавочной терапией или конъюнктивной терапией (эти термины здесь используются попеременно). При комбинированной терапии могут наблюдаться аддитивная мощность или аддитивный терапевтический эффект. Также могут ожидаться синергические результаты, когда терапевтическая эффективность больше, чем аддитивная. Комбинированная терапия может также обеспечить лучшие терапевтические показатели, чем назначение лечебного метода или комплексных соединений лектин-HSP в отдельности. Аддитивный или синергический эффект может позволить регулировать дозировку и/или частоту воздействия или и то и другое для уменьшения или предотвращения нежелательных или неблагоприятных эффектов.

Согласно изобретению молекулярные комплексные соединения по изобретению могут использоваться одни или в комбинации со многими другими способами лечения. Некоторые из таких способов особенно эффективны при определенных видах опухолей или инфекционных болезней и описаны в разделах 5.8.1 и 5.8.2. Многие другие способы влияют на иммунную систему и применяются в целом как при неопластических, так и при инфекционных болезнях.

В одном варианте осуществления молекулярные комплексные соединения по изобретению используются в комбинации с одним или несколькими модификаторами биологической реакции для лечения опухолей или инфекционных болезней. Одна группа модификаторов биологической реакции представляет собой цитокины. В одном таком варианте осуществления цитокин вводится субъектам, получающим молекулярные комплексные соединения по изобретению. В другом таком варианте осуществления молекулярные комплексные соединения вводятся субъекту, получающему химиотерапевтическое средство в комбинации с цитокином. В различных вариантах осуществления один или несколько цитокинов могут использоваться и выбраны из группы, состоящей из IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IFNα, IFNβ, IFNγ, TNFα, TNFβ, G-CSF, GM-CSF, TGF-β, IL-15, IL-18, GM-CSF, INF-γ, INF-α, SLC, эндотелиального моноцитарного активирующего протеина 2 (EMAP2), MIP-3α, MIP-3β или гена MHC, такого как HLA-B7. Кроме того, другие примеры цитокинов включают другие представители семейства TNF, включая, без ограничения, лиганд, стимулирующий TNF-α-связанный апоптоз (TRAIL), цитокин, стимулирующий TNF-α-связанную активацию (TRANCE), TNF-α-связанный слабый индуктор апоптоза (TWEAK), лиганд CD40 (CD40L), лимфотоксин альфа (LT-α), лимфотоксин бета (LT-β), лиганд OX40 (OX40L), лиганд Fas (FasL), лиганд CD27 (CD27L), лиганд CD30 (CD30L), 41BB лиганд (41BBL), APRIL, LIGHT, TL1, TNFSF16, TNFSF17 и AITR-L или их функциональные части. См., например, Kwon et al., 1999, Curr. Opin. Immunol. 11:340-345 для общего обзора семейства ТNF. Предпочтительно, чтобы молекулярные комплексы применялись до других методов лечения. В определенном варианте осуществления комплексные соединения по изобретению назначают субъекту, получающему циклофосфамид в комбинации с IL-12 для лечения опухоли.

В другом варианте осуществления молекулярные комплексные соединения по изобретению используются в комбинации с одним или несколькими модификаторами биологической реакции, которые являются агонистами или антагонистами различных лигандов, рецепторов и молекул передачи сигнала иммунной системы. Например, модификаторы биологической реакции включают, без ограничения, агонисты Toll-подобных рецепторов (TLR-2, TLR-7, TLR-8 и TLR-9); LPS; агонисты 41BB, OX40, ICOS, и CD40; и антагонисты лиганда Fas, PD1 и CTLA-4. Этими агонистами и антагонистами могут быть антитела, фрагменты антител, пептиды, пептидомиметики и полисахариды.

В еще одном варианте осуществления молекулярные комплексные соединения по изобретению используются в комбинации с одним или несколькими модификаторами биологической реакции, которые являются иммуностимулирующими нуклеиновыми кислотами. Такие нуклеиновые кислоты, многие из которых представляют собой олигонуклеотиды, включающие неметилированный мотив CpG, являются митогенными для лимфоцитов позвоночных и, как известно, усиливают иммунный ответ. См. Woolridge et al., 1997, Blood 89:2994-2998. Такие олигонуклеотиды описаны в Международных патентных публикациях WO 01/22972, WO 01/51083, WO 98/40100 и WO 99/61056, каждая из которых включена здесь в полном объме, так же как Патенты США № 6207646, 6194388, 6218371, 6239116, 6429199 и 6406705, каждый из которых включен здесь в полном объеме. Другие виды иммуностимулирующих олигонуклеотидов, таких как фосфоротиоатные олигодезоксинуклеотиды, содержащие YpG- и CpR-мотивы, описаны Kandimalla et al. в Bioorganic & Medicinal Chemistry 9:807-813 (2001), включены здесь в полном объеме в виде ссылки. Также охвачены иммуностимулирующие олигонуклеотиды с недостатком динуклеотидов CpG, которые, когда вводятся через слизистые оболочки (включая назначение малой дозы) или в больших дозах парентеральным путем, усиливают гуморальный иммунный ответ, часто в той же степени, как и нуклеиновые кислоты CpG, однако реакция была Th2-смещенной (IgGl>>IgG2a). См. Патентную публикацию США №20010044416 Al, которая включена здесь в виде ссылки в полном объеме. Определение активности иммуностимулирующих олигонуклеотидов может быть осуществлено, как описано в вышеупомянутых патентах и публикациях. Кроме того, иммуностимулирующие олигонуклеотиды могут быть модифицированы с помощью фосфатной основы, сахара, нуклеооснований и межнуклеотидных связей для модулирования активности. Такие модификации для них известны в уровне техники.

В еще одном варианте осуществления молекулярные комплексные соединения по изобретению используют в комбинации с одним или несколькими адъювантами. В определенном варианте осуществления молекулярные комплексные соединения по изобретению используются в комбинации с сапонином (например, QS-21) и/или иммуностимулирующим олигонуклеотидом (например, олигонуклеотидом, включающим по меньшей мере динуклеотид CpG). Адъювант(ы) может применяться отдельно или в составе смеси с комплексными соединениями по изобретению. Системный адъювант - адъювант, который может быть введен парентерально. Системные адъюванты включают адъюванты, создающие эффект депо, адъюванты, стимулирующие иммунную систему, и адъюванты, обеспечивающие и то, и другое. Адъювант, создающий эффект депо, в данном случае - адъювант, который вызывает медленное высвобождение антигена в организме, таким образом продлевая экспонирование иммунных клеток антигеном. Этот класс адъювантов включает, без ограничения, квасцы (например, гидроксид алюминия, фосфат алюминия); или соединения на основе эмульсии, включающие минеральное масло, неминеральное масло, эмульсию вода-в-масле или масло-в-воде-в масле, эмульсии масло-в-воде, такие как серия адъювантов Seppic ISA Montanide (например, Montanide ISA 720, AirLiquide, Paris, France); MF-59 (эмульсия сквален-в-воде, стабилизированная Span 85 и Tween 80; Chiron Corporation, Emeryville, California; и PROVAX (эмульсия масло-в-воде, содержащая стабилизирующий детергент и формирующее мицеллу средство; IDEC, Pharmaceuticals Corporation, San-Diego, California).

Другие адъюванты стимулируют иммунную систему, например вызывают продукцию и секрецию цитокинов или IgG иммунными клетками. Этот класс адъювантов включает: иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты, такие как олигонуклеотиды CpG; сапонины, выделенные от коры дерева Q.saponaria, такие как QS21; поли[ди(карбоксилатофенокси)]фосфазен (полимер PCPP; Институт исследования вирусов, США); производные липополисахаридов (LPS), такие как монофосфорил липида А (MPL; Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, Mont.), мурамилбипептид (MDP; Ribi) и треонил-мурамилбипептид (t-MDP; Ribi); OM 174 (дисахарид глюкозамина, связанный с липидом A; OM Pharma SA, Meyrin, Швейцария); аминоалкил глюкозаминидфосфатов (AGP, Corixa Corporation) и фактор элонгации лейшмании (очищенный белок лейшмании; Corixa Corporation, Seattle Wash).

Другие системные адъюванты представляют собой адъюванты, которые создают эффект депо и стимулируют иммунную систему. Это такие соединения, которые имеют обе идентифицированные выше функции системных адъювантов. Этот класс адъювантов включает: ISCOM (иммуностимулирующие комплексы, содержащие смешанные сапонины, липиды и формирующие частицы размером с вирус с порами, которые могут удерживать антиген; CSL, Мельбурн, Австралия); SB-AS2 (адъювантная система #2 SmithKline Beecham, которая является эмульсией масло-в-воде, содержащей MPL и QS21: SmithKline Beecham Biologicals [SBB], Rixensart, Бельгия); SB-AS4 (адъювантная система #4 SmithKline Beecham, которая содержит квасцы и MPL; SBB, Бельгия); неионные блок-сополимеры, которые формируют мицеллы, такие как CRL 1005 (они содержат линейную цепь гидрофобного полиокспропилена между цепями полиоксиэтилена; Vaxcel, Inc., Norcross, Ga.); и адъювантная композиция Syntex (SAF, эмульсия масло-в-воде, содержащая Tween 80 и неионный блок-сополимер; Syntex Chemicals, Inc., Boulder, Cоlо).

В соответствии с изобретением полезные мукозальные адъюванты - адъюванты, которые способны стимулировать иммунный ответ слизистой оболочки субъекта, когда они наносятся на поверхность слизистой оболочки вместе с комплексными соединениями по изобретению. Мукозальные адъюванты включают: нуклеиновые кислоты CpG (например, РСТ публикацию патентной заявки WO 99/61056), бактериальные токсины: например, холерный токсин (СТ), производные СТ, включая, без ограничения, СТ подгруппы В (CTB) (Wu et al., 1998, Tochikubo et al., 1998); CTD53 (от Val до Asp) (Fontana et al., 1995); CTK97 (от Val до Lys) (Fontana et al., 1995); CTK104 (от Tyr до Lys) (Fontana et al., 1995); CTD53/K63 (от Val до Asp, от Ser до Lys) (Fontana et al., 1995); CTH54 (от Arg до His) (Fontana et al., 1995); CTN107 (от His до Asр) (Fontana et al., 1995); CTE114 (от Ser до Glu) (Fontana et al., 1995); CTE112K (от Glu до Lys) (Yamamoto et al., 1997a); CTS61F (от Ser до Phe) (Yamamoto et al., 1997a, 1997b); CTS106 (от Pro до Lys) (Douce et al., 1997, Fontana et al., 1995); и CTK63 (от Ser до Lys) (Douce et al., 1997, Fontana et al., 1995), токсин Zonula occludens, zot, Escherichia coli термолабильный энтеротоксин, лабильный токсин (LT), производные LT, включая, без ограничения, LT подгруппу В (LТB) (Verweij et al., 1998); LT7K (от Arg до Lys) (Komase et al., 1998, Douce et al., 1995); LT61F (от Ser до Phe) (Komase et al., 1998); LT112K (от Glu до Lys) (Komase et al., 1998); LT118E (от Gly до Glu) (Komase et al., 1998); LT146E (от Arg до Glu) (Komase et al., 1998); LT192G (от Arg до Gly) (Komase et al., 1998); LTK63 (от Ser до Lys) (Marchetti et al., 1998, Douce et al., 1997, 1998, Di Tommaso et al., 1996); и LTR72 (от Ala до Arg) (Giuliani et al., 1998), токсин коклюша, PT (Lycke и др., 1992, Spangler BD, 1992, Freytag и Clemments, 1999, Roberts et al., 1995, Wilson et al., 1995), включая PT-9K/129G (Roberts et al., 1995, Cropley et al., 1995); производные токсина (см. ниже) (Hoemgren et al., 1993, Verweij et al., 1998, Rappuoli et al., 1995, Freytag и Clements, 1999); производные липида А (например, монофосфорил липида A, MPL) (Sasaki et al., 1998, Vancott et al., 1998); производные мурамил бипептида (MDP) (Fukushima et al., 1996, Ogawa et al., 1989, Michalek et al., 1983, Morisaki et al., 1983); белки наружной мембраны бактерий (например, внешний поверхностный белок А (OspA) липопротеин Borrelia burgdorferi, белок наружной мембраны Neisseria meningitidis) (Marinaro et al., 1999, Van de Verg et al., 1996); эмульсии масло-в-воде (например, MF59) (Barchfield et al., 1999, Verschoor et al., 1999, O'Hagan, 1998); соли алюминия (Isaka et al., 1998, 1999); и сапонины (например, QS21), Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Worster, Ме.) (Sasaki et al., 1998, MacNeal et al., 1998), ISCOM, MF-59 (эмульсия сквален-в-воде, стабилизированная Span 85 и Tween 80; Chiron Corporation, Emeryville, Calif.); ряд адъювантов Seppic ISA Montanide (например, Montanide ISA 720; AirLiquide, Paris, France); PROVAX (эмульсия масло-в-воде, содержащая стабилизирующий детергент и формирующее мицеллу средство; IDEC Pharmaceuticals Corporation, San Diego, Calif.); адъювантный препарат Syntext (SAF; Syntex Chemicals, Inc., Boulder, Cоlо.); поли[ди(карбоксилатофенокси)]фосфазен (полимер PCPP; Институт исследования вирусов, США) и фактор элонгации лейшмании (Corixa Corporation, Seattle, Wash.).

5.8.1 Опухоли-мишени

Введение композиций по изобретению, в чистом виде или с сенсибилизированными APC, стимулируют иммунитет человека и выявляют специфический иммунитет против пренеопластических и/или неопластических клеток. В данном случае пренеопластическая клетка является промежуточной формой между нормальной и неопластической клеткой. Морфологическое доказательство, основанное на многократных молекулярных биологических исследованиях, показывает, что пренеоплазия проходит множество стадий. Рост неопухолевой клетки обычно состоит из гиперплазии, метаплазии или, в частности - дисплазии (для обзора состояний, при которых происходит ненормальный рост, см. Robbins and Angell, 1976, Basic Pathology, 2d Ed., W.B. Saunders Co., Philadelphia, p. 68-79). Гиперплазия - это форма контролируемой клеточной пролиферации, которая приводит к увеличению количества клеток в ткани или органе, тем самым, ликвидируя альтерацию структуры или функции. Например, гиперплазия эндометрия часто предшествует раку матки. Метаплазия - это форма контролируемого роста клетки, когда зрелая или полностью дифференцированная клетка переходит в другой тип зрелой клетки. Метаплазия может происходить в клетках эпителиальной или соединительной ткани. Атипичная метаплазия включает несколько беспорядочный метапластический эпителий. Дисплазия - это частый предшественник рака, и найдена она главным образом в эпителии; это самая беспорядочная форма неопухолевого роста клетки, приводящая к потере однородности и нормальной архитектоники клеток. Диспластические клетки часто имеют ненормально большие, ярко окрашиваемые ядра и демонстрируют плеоморфизм. Для дисплазии характерно встречаться там, где существует хроническое раздражение или воспаление, ее часто обнаруживают в шейке матки, дыхательных путях, полости рта и желчном пузыре. Хотя пренеопластические процессы могут переходить в неоплазию, они могут в течение длительного времени оставаться стабильными и даже регрессировать, особенно если провоцирующий агент удален или если эти процессы подавляются иммунологической атакой организма. Опухоли, которые можно лечить настоящими соединениями изобретения, включают саркомы, карциномы человека и др. Саркомы и карциномы человека также чувствительны к специфической иммунотерапии АРС, сенсибилизированными олигомеризованными гликопротеидовыми комплексами.

В одном варианте осуществления комбинированная терапия в дополнение к воздействию молекулярных комплексных соединений по изобретению включает использование одного или нескольких способов, помогающих профилактике или лечению опухолей. Эти способы включают, без ограничения, использование химиотерапевтических, иммунотерапевтических, антиангиогенных средств, цитокинов, гормонов, антител, полинуклеотидов, лучевой терапии, фотодинамических терапевтических средств. В определенных вариантах осуществления комбинированную терапию можно применить для предотвращения рецидива опухоли, замедления метастазирования или для ингибирования роста и/или распространения опухоли или метастаза.

Опухоли, которые можно лечить или предотвращать методами настоящего изобретения, включают, без ограничения, саркомы и карциномы человека, например, фибросаркому, миксосаркому, липосаркому, хондросаркому, остеогенную саркому, хондрому, ангиосаркому, эндотелиосаркому, лимфангиосаркому, лимфангиоэндотелиосаркому, синовиому, мезотелиому, опухоль Юинга, лейомиосаркому, рабдомиосаркому, рак толстой кишки, рак поджелудочной железы, рак молочной железы, рак яичника, рак предстательной железы, плоскоклеточный рак, базальноклеточный рак, аденокарциному, рак потовой железы, рак сальной железы, папиллярный рак, папиллярную аденокарциному, цистаденокарциному, медуллярный рак, бронхогенный рак, рак почки, гепатому, рак желчного протока, хориокарциному, семиному, эмбриональный рак, опухоль Вильмса, рак шейки матки, опухоль яичка, рак легкого, мелкоклеточный рак легкого, рак мочевого пузыря, эпителиальный рак, глиому, астроцитому, медуллобластому, краниофарингиому, эпендимому, пинеалому, гемангиобластому, неврому слухового нерва, олигодендроглиому, менингиому, меланому, нейробластому, ретинобластому; лейкозы, например острый лимфолейкоз и острый миелолейкоз (миелобластический, промиелоцитарный, миеломоноцитарный, моноцитарный и эритролейкемию); хронический лейкоз (хронический миелоцитарный (гранулоцитарный) лейкоз и хронический лимфолейкоз); и истинную полицитемию, лимфому (ходжкинскую и неходжкинскую), множественную миелому, макроглобулинемию Вальденстрема, болезнь тяжелых цепей.

В другом варианте осуществления у пациента с опухолью иммунная система подавлена воздействием противоопухолевой терапии (например, лучевой, химиотерапией) еще до применения молекулярных комплексных соединений по изобретению или АРС, сенсибилизированных лектином-Hsp.

Есть много оснований считать иммунотерапию, предусмотренную в настоящем изобретении, желательной для применения ее больным с опухолями. Во-первых, хирургическое вмешательство с анестезией может привести к иммуносупрессии. При проведении адекватной иммунотерапии в предоперационный период эта иммуносупрессия может быть предотвращена или быть обратимой. Это приводит к меньшему количеству инфекционных осложнений и к ускоренному заживлению ран. Во-вторых, объем опухолевых клеток минимален после хирургического вмешательства, и иммунотерапия, вероятно, наиболее эффективна в такой ситуации. В-третьих, существует возможность попадания опухолевых клеток в кровоток во время операции, и эффективная иммунотерапия, примененная в это время, может устранить эти клетки.

Профилактические и терапевтические способы по изобретению направлены на повышение иммунологической защиты больных с опухолями как перед хирургическим вмешательством, так во время или после него. Они стимулируют специфический противоопухолевый иммунитет, объективно являющийся ингибитором опухоли, и вызывают клинически доказанную полную регрессию опухоли и ее ирадикацию. Способы по изобретению могут также применяться у людей с повышенным риском развития опухоли определенного типа, например с отягощенной наследственностью или находящихся под воздействием вредных экологических факторов.

В некоторых вариантах осуществления одно или несколько противоопухолевых средств в дополнение к молекулярным комплексным соединениям по изобретению вводят субъекту, нуждающемуся в этом, для лечения или предотвращения опухолей. Противоопухолевыми средствами являются любые молекулы или композиции, которые помогают в лечении доброкачественных и злокачественных опухолей. Примеры противоопухолевых средств, которые могут использоваться в методах настоящего изобретения, включают, без ограничения: ацивицин; акларубицин; акодазола гидрохлорид; акронин; адозелезин; алдезлейкин; алтретамин; амбомицин; аметантрона ацетат; аминоглютетимид; амсакрин; анастрозол; антрамицин; аспарагиназу; асперлин; азацитидин; азетепа; азотомицин; батимастат; бензодепа; бикалютамид; бизантрена гидрохлорид; бизнафида димезилат; бизелезин; блеомицина сульфат; брехинар натрия; бропиримин; бусульфан; кактиномицин; калюстерон; карацемид; карбетимер; карбоплатин; кармустин; карубицина гидрохлорид; карзелезин; цедефингол; хлорамбуцил; циролемицин; цисплатин; кладрибин; криснатола мезилат; циклофосфамид; цитарабин; дакарбазин; дактиномицин; даунорубицина гидрохлорид; децитабин; дексормаплатин; дезакванин; дезакванина мезилат; диазиквон; доцетаксел; доксорубицин; доксорубицина гидрохлорид; дролоксифен; дролоксифена цитрат; дромостанолона пропионат; дуазомицин; эдатрексат; эфлорнитина гидрохлорид; элсамитруцин; энлоплатин; энпромат; эпипропидин; эпирубицина гидрохлорид; эрбулозол; эзорубицина гидрохлорид; эстрамустин; эстрамустина натрий-фосфат; этанидазол; этопозид; этопозида фосфат; этоприн; фадрозола гидрохлорид; фазарабин; фенретинид; флоксуридин; флударабина фосфат; фторурацил; фторцитабин; фосквидон; натрия фостриецин; гемцитабин; гемцитабина гидрохлорид; гидроксиурею; идарубицина гидрохлорид; ифосфамид; илмофосин; интерлейкин II (включая рекомбинантный интерлейкин, или rIL2), альфа-2a интерферон; альфа-2b интерферон; альфа-n1 интерферон; альфа-n3 интерферон; бета-Iа интерферон; гамма-Ib интерферон; ипроплатин; иринотекана гидрохлорид; ланреотида ацетат; летрозол; леупролида ацетат; лиарозола гидрохлорид; лометрексол натрия; ломустин; лозоксантрона гидрохлорид; мазопрокол; маитансин; мехлоретамина гидрохлорид; мегестрола ацетат; меленгестрола ацетат; мелфалан; меногарил; меркаптопурин; метотрексат; метотрексат натрия; метоприн; метуредепа; митиндомид; митокарцин; митокромин; митогиллин; митомальцин; митомицин; митоспер; митотан; митоксантрона гидрохлорид; микофеноловую кислоту; нокодазол; ногаламицин; ормаплатин; оксизуран; паклитаксел; пегаспаргаз; пелиомицин; пентамустин; пепломицина сульфат; перфостамид; пипоброман; пипосульфан; пироксантрона гидрохлорид; пликамицин; пломестан; порфимер натрия; порфиромицин; преднимустин; прокарбазина гидрохлорид; пуромицин; пуромицина гидрохлорид; пиразофурин; рибоприн; роглетимид; сафингол; сафингола гидрохлорид; семустин; симтразен; спарфозат натрия; спарзомицин; спирогермания гидрохлорид; спиромустин; спироплатин; стрептонигрин; стрептозоцин; сулофенур; тализомицин; текогалан натрия; тегафур; телоксантрона гидрохлорид; темопорфин; тенипосид; тероксирон; тестолактон; тиамиприн; тиокванин; тиотепа; тиазофурин; тирапазамин; торемифена цитрат; трестолона ацетат; трицирибина фосфат; триметрексат; триметрексата глюкуронат; трипторелин; тубулозола гидрохлорид; иприт-урацила; уредепа; вапреотид; вертепорфин; винбластина сульфат; винкристина сульфат; виндезин; виндезина сульфат; винепидина сульфат; винглицината сульфат; винлейрозина сульфат; винорельбина тартрат; винрозидина сульфат; винзолидина сульфат; ворозол; зениплатин; зиностатин; зорубицина гидрохлорид.

Другие противоопухолевые препараты, которые могут использоваться, включают, без ограничения: 20-эпи-1,25 дигидроксивитамин D3; 5-этинилурацил; абиратерон; акларубицин; ацилфульвен; адеципенол; адозелезин; алдезлейкин; ALL-TK антагонисты; алтретамин; амбамустин; амидокс; амифостин; аминолевулиновую кислоту; амрубицин; амсакрин; анагрелид; анастрозол; андрографолид; ингибиторы ангиогенеза; антагонист D; антагонист G; антареликс; антидорзальный морфогенетический белок-1; антиандроген, рак предстательной железы; антиэстроген; антинеопластон; антисенсорные олигонуклеотиды; афидиколина глицинат; генные модуляторы апоптоза; регуляторы апоптоза; апуриновую кислоту; ara-CDP-DL-PTBA; аргинин дезаминазу; азулакрин; атаместан; атримустин; аксинастатин 1; аксинастатин 2; аксинастатин 3; азазетрон; азатоксин; азатирозин; производные баккатина III; баланол; батимастат; BCR/ABL антагонисты; бензохлорины; бензоилстауроспорин; производные беталактама; бета-алетин; бетакламицин B; бетулиновую кислоту; ингибитор bFGF; бикалютамид; бизантрен; бизазиридинилспермин; бизнафид; бистратен A; бизелезин; брефлат; бропиримин; будотитан; бутионина сульфоксимин; кальципотриол; кальфостин C; производные камптотецина; канарипокс IL-2; капецитабин; карбоксамидаминотриазол; карбоксиамидотриазол; CaRest M3; CARN 700; ингибитор, полученный из хряща; карзелезин; ингибиторы казеинкиназы (ICOS); кастаноспермин; цекропин B; цетрореликс; хлорины; хлорохиноксалина сульфамид; цикапрост; цис-порфирин; кладрибин; аналоги кломифена; клотримазол; коллисмицин A; коллисмицин B; комбретастатин A4; аналог комбретастатина; конагенин; крамбесцидин 816; криснатол; криптофицин 8; производные криптофицина А; курацин A; циклопентантрахиноны; циклоплатам; ципемицин; цитарабина окфосфат; цитолитический фактор; цитостатин; дакликсимаб; децитабин; дегидродидемнин B; дезлорелин; дексаметазон; дексифосфамид; дексразоксан; дексверапамил; диазиквон; дидемнин B; дидокс; диэтилнорспермин; дигидро-5-азацитидин; 9-дигидротаксол, 9-диоксамицин; бифенила спиромустин; доцетаксел; докозанол; долазетрон; доксифлуридин; дролоксифен; дронабинол; дуокармицин SA; эбселен; экомустин; эдельфосин; эдреколомаб; эфломитин; элемен; эмитефур; эпирубицин; эпристерид; аналог эстрамустина; агонисты эстрогена; антагонисты эстрогена; этанидазол; этопосида фосфат; экземестан; фадрозол; фазарабин; фенретинид; филграстим; финастерид; флавопиридол; флезеластин; флуастерон; флударабин; фтордауноруницина гидрохлорид; форфенимекс; форместан; фостриецин; фотемустин; гадолиния тексафирин; азотнокислый галлий; галоцитабин; ганиреликс; ингибиторы желатиназы; гемцитабин; ингибиторы глютатиона; гепсульфам; херегулин; бисацетамида циклогексан; гиперицин; ибандроновую кислоту; идарубицин; идоксифен; идрамантон; илмофосин; иломастат; имидазоакридоны; имиквимод; иммуностимулирующие пептиды; ингибитор рецепторов инсулиноподобного фактора роста-1; агонисты интерферона; интерфероны; интерлейкины; иобенгван; иододоксомбицин; 4-ипомеанол; ироплакт; ирсогладин; изобенгазол; изогомогаликондрин B; итазетрон; ясплакинолид; кагалалид F; ламелларин-N триацетат; ланреотид; леинамицин; ленограстим; лентинана сульфат; лептолстатин; летрозол; фактор, ингибирующий лейкоз; альфа-интерферон лейкоцита; леупролид+эстроген+прогестерон; леупрорелин; левамизол; лиарозол; линейный аналог полиамина; липофильный пептид дисахарида; липофильные платиновые соединения; лиссоклинамид 7; лобаплатин; ломбрицин; лометрексол; лонидамин; лозоксантрон; ловастатин; локсорибин; луртотекан; тексафирин лютеция; лизофиллин; лизирующие пептиды; маитансин; манностатин A; маримастат; мазопрокол; маспин; ингибиторы матрилизина; матричные ингибиторы металлопротеиназы; меногарил; мербарон; метерелин; метиониназу; метоклопрамид; ингибитор MIF; мифепристон; милтефосин; миримостим; двойную скрученную РНК; митоквазон; митолактол; аналоги митомицина; митонафид; митотоксин фактора роста фибробластов-сапорин; митоксантрон; мофаротен; молграмостим; моноклональные антитела, человеческий хориальный гонадотропин; монофосфорильный липид А+миобактериальной клеточной оболочки sk; мопидамол; генный ингибитор множественной лекарственной устойчивости; множественный опухолевый супрессор 1-базовой терапии; ипритное антиопухолевое средство; микапероксид B; экстракт микобактериальной клеточной оболочки; мириапорон; N-ацетилдиналин; N-замещенные бензамиды; нафарелин; нагрестип; налоксон+пентазоцин; напавин; нафтерпин; нартограстим; недаплатин; неморубицин; неридроновую кислоту; нейтральную эндопептидазу; нилутамид; низамицин; модуляторы окиси азота; антиоксидант нитроксида; нитруллин; O6-бензилгуанин; октреотид; окиценон; олигонуклеотиды; онапристон; ондансетрон; орацин; индуктор цитокина ротовой полости; ормаплатин; озатерон; оксалиплатин; оксауномицин; паклитаксел; аналоги паклитаксела; производные паклитаксела; палауамин; пальмитоилризоксин; памидроновую кислоту; панакситриол; паномифен; парабактин; пазеллиптин; пегаспаргаз; пелдезин; пентозана полисульфат-натрий; пентостатин; пентрозол; перфлуброн; перфосфамид; периллиловый спирт; феназиномицин; фенилацетат; ингибиторы фосфатазы; пицибанил; пилокарпина гидрохлорид; пирарубицин; пиритрексим; плацетин A; плацетин B; ингибитор активатора плазмогена; платиновое комплексное соединение; платиновые соединения; платино-триаминовые комплексы; порфимер натрия; порфиромицин; преднизолон; пропил бис-акридон; простагландин J2; ингибиторы протеасом; белок А-основного иммуномодулятора; ингибитор протеинкиназы C; микроалгальные ингибиторы протеинкиназы C; ингибиторы белка тирозинфосфатаз; ингибиторы фосфорилазы пуриновых нуклеозидов; пурпурины; пиразолоакридин; конъюгат пиридоксилированного гемоглобина с полиоксиэтиленом; raf антагонисты; ралтитрексед; рамозетрон; ингибиторы ras farnesyl протеинтрансферазы; ингибиторы ras; ras-GAP ингибитор; деметилированный ретеллиптин; этидронат рения Re 186; ризоксин; рибозимы; RII ретинамид; роглетимид; рогитукин; ромуртид; рохинимекс; рубигинон В1; рубоксил; сафингол; саинтопин; SarCNU; саркофитол A; сарграмостим; миметики Sdi 1; семустин; ингибитор старения 1; чувствительные олигонуклеотиды; ингибиторы сигнальной передачи; модуляторы сигнальной передачи; белок, агрегирующий одиночные цепи антигенов; сизофиран; собузоксан; борокаптат натрия; фенилацетат натрия; солверол; соматомедин, агрегирующий белки; сонермин; спарфосовую кислоту; спикамицин D; спиромустин; спленопентин; спонгистатин 1; скваламин; ингибитор стволовой клетки; ингибиторы деления стволовой клетки; стипиамид; ингибиторы стромелизина; сульфинозин; суперактивный вазоактивный антагонист интестинального пептида; сурадиста; сурамин; сваинзонин; синтетические гликозаминогликаны; таллимустин; тамоксифена метиодид; тауромустин; тазаротен; текогалан натрия; тегафур; теллурапириллий; ингибиторы теломеразы; темопорфин; темозоломид; тенипосид; тетрахлородекаоксид; тетразомин; талибластин; тиокоралин; тромбопоэтин; тромбопоэтинмиметик; тималфазин; агонист рецептора тимопоэтина; тимотринан; гормон, стимулирующий щитовидную железу; олова этил этиопурпурин; тирапазамин; титаноцена дихлорид; топсентин; торемифен; фактор тотипотентной стволовой клетки; ингибиторы транслокации; третиноин; триацелилуридин; трицирибин; триметрексат; трипторелин; тропизетрон; туростерид; ингибиторы тирозинкиназы; тирфостины; ингибиторы UBC; убенимекс; фактор, ингибирующий рост мочеполового синуса; антагонисты рецептора урокиназы; вапреотид; вариолин B; векторную систему, эритроцитарную генную терапию; веларезол; верамин; вердины; вертепорфин; винорелбин; винксалтин; витаксин; ворозол; занотерон; зениплатин; зиласкорб; зиностатина стималамер.

Противоопухолевое средство может быть химиотерапевтическим и включает, без ограничения, следующие группы соединений: цитотоксические антибиотики, антиметаболиты, антимитотические средства, алкилирующие агенты, платиновые соединения, мышьяковые соединения, ингибиторы топоизомеразы ДНК, таксаны, аналоги нуклеозида, растительные алкалоиды и токсины; синтетические производные всего вышеперечисленного. В таблице 2 перечислены примеры соединений групп.

Таблица 2
Алкилирующие агенты
Азотистые иприты:	Циклофосфамид
	Ифосфамид
	Трофосфамид
	Хлорамбуцил
Нитрозоуреазы:	Кармустин (BCNU)
	Ломустин (CCNU)
Алкилсульфонаты:	Бусульфан
	Треосульфан
Триазены:	Дакарбазин
Соединения, содержащие платину:	Цисплатин
	Карбоплатин
	Ароплатин
	Оксалиплатин
Растительные алкалоиды
Алкалоиды барвинка:	Винкристин
	Винбластин
	Виндезин
	Винорелбин
Таксоиды:	Паклитаксел
	Доцетаксол

Ингибиторы ДНК-топоизомеразы
Эпиподофиллины:	Этопозид
	Тенипозид
	Топотекан
	9-аминокамптотецин
	Камптотецин
	Криснатол
Митомицины:	Митомицин C

Антифолаты:
DHFR ингибиторы:	Метотрексат
	Триметрексат
Ингибиторы IMP дегидрогеназы:	Микофеноловая кислота
	Тиазофурин
	Рибавирин
	EICAR
Ингибиторы рибонуклеотидредуктазы:	Гидроксимочевина
	Дефероксамин
Аналоги пиримидина:
Аналоги урацила:	5-Фторурацил
	Флоксуридин
	Доксифлуридин
	Ратитрексед
Аналоги цитозина:	Цитарабин (ara C)
	Цитозина арабинозид
	Флударабин
Аналоги пурина:	Меркаптопурин
	Тиогуанин
Антиметаболиты ДНК:	3-HP
	2'-дезокси-5-фторуридин
	5-HP
	Альфа-ТGDR
	Афидиколина глицинат
	Ara-C
	5-aзa-2'-дезоксицитидин
	бета-TGDR циклоцитидина гуаназол
	Инозина гликодиальдегид мацебецин II
	Пиразолоимидазол
Антимитотические агенты:	Аллоколхицин
	Галихондрин B
	Колхицин
	Производные колхицина
	Дольстатин 10
	Маитансин
	Ризоксин
	Тиоколхицин
	Тритил цистеин
Другие:
Ингибиторы изопрениляции:
Допаминергические нейротоксины:	Ион 1-метил-4-фенилпиридиния
Ингибиторы клеточного цикла:	Стауроспорин
Актиномицины:	Актиномицин D
	Дактиномицин
Блеомицины:	Блеомицин A2
	Блеомицин B2
	Пепломицин
Антрациклины:	Даунорубицин
	Доксорубицин (адриамицин)
	Идарубицин
	Эпирубицин
	Пирарубицин
	Зорубицин
	Митоксантрон
MDR ингибиторы:	Верапамил
Ингибиторы Ca²⁺ATФ-азы:	Тапсигаргин

Композиции, включающие одно или несколько химиотерапевтических средств (например, FLAG, CHOP) также рассмотрены настоящим изобретением. FLAG включает флударабин, цитозина арабинозид (Ara-C) и G-CSF. CHOP включает циклофосфамид, винкристин, доксорубицин и преднизолон. Каждый из перечисленных списков показателен, но не является полным.

В одном варианте осуществления рак молочной железы можно лечить фармацевтической композицией, которая включает комплексные соединения по изобретению в комбинации с 5-фторурацилом, цисплатином, доцетакселом, доксорубицином, Герцептином®, гемцитабином, IL-2, паклитакселом и/или VP-16 (этопозидом).

В другом варианте осуществления рак предстательной железы можно лечить фармацевтической композицией, включающей комплексные соединения по изобретению в комбинации с паклитакселом, доцетакселом, митоксантроном и/или антагонистом рецепторов андрогена (например, флутамидом).

В другом варианте осуществления лейкоз можно лечить фармацевтической композицией, включающей комплексные соединения по изобретению в комбинации с флударабином, цитозина арабинозидом, гемтузимабом (MYLOTARG), даунорубицином, метотрексатом, винкристином, 6-меркаптопурином, идарубицином, митоксантроном, этопозидом, аспарагиназой, преднизолоном и/или циклофосфамидом. Другой пример: миеломную болезнь можно лечить фармацевтической композицией, включающей комплексные соединения по изобретению в комбинации с дексаметазоном.

В другом варианте осуществления меланому можно лечить фармацевтической композицией, включающей комплексные соединения по изобретению в комбинации с дакарбазином.

В другом варианте осуществления колоректальный рак можно лечить фармацевтической композицией, включающей комплексные соединения по изобретению в комбинации с иринотеканом.

В другом варианте осуществления рак легкого можно лечить фармацевтической композицией, включающей комплексные соединения по изобретению в комбинации с паклитакселом, доцетакселом, этопозидом и/или цисплатином.

В другом варианте осуществления неходжкинскую лимфому можно лечить фармацевтической композицией, включающей комплексные соединения по изобретению в комбинации с циклофосфамидом, CHOP, этопозидом, блеомицином, митоксантроном и/или цисплатином.

В другом варианте осуществления рак желудка можно лечить фармацевтической композицией, включающей комплексные соединения по изобретению в комбинации с цисплатином.

В другом варианте осуществления рак поджелудочной железы можно лечить фармацевтической композицией, включающей комплексные соединения по изобретению в комбинации с гемцитабином.

Согласно изобретению комплексные соединения по изобретению могут применяться до, после или одновременно с противоопухолевым средством(ами) для профилактики или лечения опухолей. В зависимости от вида опухоли, наследственности, условий жизни человека и выбора противоопухолевого средства (средств) применение комплексных соединений по изобретению может координироваться дозировкой и временем применения химиотерапии.

Комплексные соединения по изобретению можно добавлять к химиотерапии. В одном варианте осуществления химиотерапевтическое средство представляет собой гемцитабин в дозе 100-1000 мг/м²/цикл. В одном варианте осуществления химиотерапевтическое средство представляет собой дакарбазин в дозе 200-4000 мг/м²/цикл. В предпочтительном варианте осуществления доза дакарбазина составляет от 700 до 1000 мг/м²/цикл. В другом варианте осуществления химиотерапевтическое средство представляет собой флударабин в дозе 25-50 мг/м²/цикл. В другом варианте осуществления химиотерапевтическое средство представляет собой цитозина арабинозид (Ara-C) в дозе 200-2000 мг/м²/цикл. В другом варианте осуществления химиотерапевтическое средство представляет собой доцетаксел в дозе 1,5-7,5 мг/кг/цикл. В другом варианте осуществления химиотерапевтическое средство представляет собой паклитаксел в дозе 5-15 мг/кг/цикл. В еще одном варианте осуществления химиотерапевтическое средство представляет собой цисплатин в дозе 5-20 мг/кг/цикл. В еще одном варианте осуществления химиотерапевтическое средство представляет собой 5-фторурацил в дозе 5-20 мг/кг/цикл. В еще одном варианте осуществления химиотерапевтическое средство представляет собой доксорубицин в дозе 2-8 мг/кг/цикл. В еще одном варианте осуществления химиотерапевтическое средство представляет собой эпиподофиллотоксин в дозе 40-160 мг/кг/цикл. В еще одном варианте осуществления химиотерапевтическое средство представляет собой циклофосфамид в дозе 50-200 мг/кг/цикл. В еще одном варианте осуществления химиотерапевтическое средство представляет собой иринотекан в дозе 50-75, 75-100, 100-125 или 125-150 мг/м²/цикл. В еще одном варианте осуществления химиотерапевтическое средство представляет собой винбластин в дозе 3,7-5,4, 5,5-7,4, 7,5-11 или 11-18,5 мг/м²/цикл. В еще одном варианте осуществления химиотерапевтическое средство представляет собой винкристин в дозе 0,7-1,4 или 1,5-2 мг/м²/цикл. В еще одном варианте осуществления химиотерапевтическое средство представляет собой метотрексат в дозе 3,3-5, 5-10, 10-100 или 100-1000 мг/м²/цикл.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение далее охватывает использование малых доз химиотерапевтических средств в составе комбинированной терапии. Например, первоначальное лечение комплексными соединениями по изобретению увеличивает чувствительность опухоли к последующему воздействию химиотерапевтического средства, доза которого находится около или ниже нижней границы диапазона доз химиотерапевтических средств, применяемых без комплексных соединений по изобретению.

В одном варианте осуществления комплексные соединения по изобретению и низкие дозы (например, 6-60 мг/м²/день или меньше) доцетаксела вводятся больным с опухолями. В другом варианте осуществления комплексные соединения по изобретению и низкие дозы (например, 10-135 мг/м²/день или меньше) паклитаксела вводятся больным с опухолями. В еще одном варианте осуществления комплексные соединения по изобретению и низкие дозы (например, 2,5-25 мг/м²/день или меньше) флударабина вводятся больным с опухолями. В еще одном варианте осуществления комплексные соединения по изобретению и низкие дозы (например, 0,5-1,5 г/м²/день или меньше) цитозина арабинозида (Ara-C) вводятся больным с опухолями.

В другом варианте осуществления химиотерапевтическое средство представляет собой гемцитабин в дозе 10-100 мг/м²/цикл. В другом варианте осуществления химиотерапевтическое средство представляет собой цисплатин, например ПЛАТИНОЛ или ПЛАТИНОЛ-AQ (Bristol Myers), в дозе 5-10, 10-20, 20-40 или 40-75 мг/м²/цикл. В еще одном варианте осуществления доза цисплатина 7,5-75 мг/м²/цикл вводится пациентам с раком яичника. В еще одном варианте осуществления доза цисплатина 5-50 мг/м²/цикл вводится пациентам с раком мочевого пузыря. В еще одном варианте осуществления химиотерапевтическое средство представляет собой карбоплатин, например ПАРАПЛАТИН (Bristol Myers), в дозе 2-4, 4-8, 8-16, 16-35 или 35-75 мг/м²/цикл. В еще одном варианте осуществления доза карбоплатина 7,5-75 мг/м²/цикл вводится пациентам с раком яичника. В другом варианте осуществления доза карбоплатина 5-50 мг/м²/цикл вводится пациентам с раком мочевого пузыря. В еще одном варианте осуществления доза карбоплатина 2-20 мг/м²/цикл вводится пациентам с раком яичка. В еще одном варианте осуществления химиотерапевтическое средство представляет собой доцетаксел, например ТАКСОТЕР (Rhone Poulenc Rorer), в дозе 6-10, 10-30 или 30-60 мг/м²/цикл. В еще одном варианте осуществления химиотерапевтическое средство представляет собой паклитаксел, например ТАКСОЛ (Bristol Myers Squibb), в дозе 10-20, 20-40, 40-70 или 70-135 мг/кг/цикл. В еще одном варианте осуществления химиотерапевтическое средство представляет собой 5-фторурацил в дозе 0,5-5 мг/кг/цикл. В еще одном варианте осуществления химиотерапевтическое средство представляет собой доксорубицин, например АДРИАМИЦИН (Pharmacia & Upjohn), ДОКСИЛ (Alza), РУБЕКС (Bristol Myers Squibb), в дозе 2-4, 4-8, 8-15, 15-30 или 30-60 мг/кг/цикл.

В другом варианте осуществления комплексные соединения по изобретению применяются в комбинации с одним или несколькими иммунотерапевтическими средствами, такими как антитела и вакцины. В предпочтительном варианте осуществления in vivo антитела имеют терапевтическое и/или профилактическое противоопухолевое применение. В некоторых вариантах осуществления антитела могут использоваться для лечения и/или профилактики инфекционных заболеваний. Примеры терапевтических и профилактических антител включают, без ограничения, MDX-010 (Medarex, NJ), который является гуманизированным анти-CTLA-4 антителом и применяется в настоящее время в клинике для лечения рака предстательной железы; СИНАГИС® (MedImmune, MD), который является гуманизированным антиреспираторно-синцитиальным вирусным (РСВ) моноклональным антителом для лечения пациентов с инфекцией РСВ; ГЕРЦЕПТИН® (Trastuzumab) (Genentech, СА), который является гуманизированным анти-HER2 моноклональным антителом для лечения пациентов с метастазами рака молочной железы и др. Другие примеры: гуманизированный анти-CD18 F(ab')2 (Genentech); CDP860, который является гуманизированным анти-CD18 F(ab')2 (Celltech, Великобритания); PRO542, который является анти-НIV gp120 антителами, объединенными с CD4 (Progenics/Genzyme Transgenics); Оставир, который является человеческим антителом против вируса гепатита B (Protein Design Lab/Novartis); ПРОТОВИР™, который является гуманизированным анти-CMV IgG1 антителом (Protein Design Lab/Novartis); MAK-195 (СЕГАРД), который является мышиным анти-TNF-α F(ab')2 (Knoll Pharma/BASF); IC14, который является антителом анти-CD14 (ICOS Pharm); гуманизированные анти-VEGF IgG1 антитела (Genentech); ОВАРЕКС™, который является мышиными анти-СА 125 антителами (Altarex); ПАНОРЕКС™, который является мышиным анти-17-IA антигена поверхности клетки антителом IgG2a (Glaxo Wellcome/Centocor); BEC2, который является мышиным антиидиотипичным (эпитоп GD3) IgG антителом (ImClone System); IМС-C225, который является химерным анти-EGFR IgG антителом (ImClone System); ВИТАКСИН™, который является гуманизированным анти-αVβ3 антителом интегрина (Applied Molecular Evolution/MedImmune); Campath 1H/LDP-03, который является гуманизированным анти-CD52 IgGl антителом (Leukosite); Smart M195, который является гуманизированным анти-CD33 IgG антителом (Protein Design Lab/Kanebo); РИТУКСАН™, который является химерным анти-CD20 IgG1 антителом (IDEC Pharm/Genentech, Roche/Zettyaku); ЛИМФОСИД™, который является гуманизированным анти-CD22 IgG антителом (Immunomedics); Smart ID10, которое является гуманизированным анти-HLA антителом (Protein Design Lab); ОНКОЛИМ™ (Lym-1) - меченные изотопом диагностические реактивные мышиные анти-HLA антитела (Techniclone); ABX-IL8 - человеческие aнти-IL8 антитела (Abgenix); анти-CD11a - гуманизированные IgG1 антитела (Genentech/Xoma); ICM3 - гуманизированные aнти-ICAM3 антитела (ICOS Pharm); IDEC-114 - анти-CD80 антитела приматов (IDEC Pharm/Mitsubishi); ЗЕВАЛИН™ - меченные изотопом мышиные aнти-CD20 антитела (IDEC/Schering AG); IDEC-131 - гуманизированные aнти-CD40L антитела (IDEC/Eisai); IDEC-151 - aнти-CD4 антитела приматов (IDEC); IDEC-152 - aнти-CD23 антитела приматов (IDEC/Seikagaku); СМАРТ aнти-CD3 - гуманизированные IgG aнти-CD3 (Protein Design Lab); 5G1.1 - гуманизированные антитела фактора 5 (C5) анти-комплемента (Alexion Pharm); D2E7 - гуманизированные антитела анти-TNF-α (CAT/BASF); CDP870 - гуманизированные фрагменты анти-TNF-αFab (Celltech); IDEC-151 - анти-CD4 IgG1 антитела приматов (IDEC Pharm/SmithKline Beecham); MDX-CD4 - человеческие IgG антитела анти-CD4 IgG антитело (Medarex/Eisai/Genmab); CDP571 - гуманизированные анти-TNF-αIgG4 IgG4антитела (Celltech); LDP-02 - гуманизированные aнти-α4β7 антитела (LeukoSite/Genentech); OrthoClone OKT4A - гуманизированные aнти-CD4 IgG антитела (Ortho Biotech); АНТОВА™ - гуманизированные aнти-CD40L IgG антитела (Biogen); АНТЕГРЕН™ - гуманизированные aнти-VLA-4 IgG антитела (Elan); MDX-33 - человеческие aнти-CD64 (FcyR) антитела (Medarex/Centeon); SCH55700 - гуманизированные aнти-IL-5 IgG4 антитела (Celltech/Schering); SB-240563 и SB-240683 - гуманизированные aнти-IL-5 и IL-4 антитела соответственно (SmithKline Beecham); rhuMab-E25 - гуманизированные aнти-IgE IgG1 антитела (Genentech/Norvartis/Tanox Biosystems); ABX-CBL - мышиные анти-CD-147 IgM антитела (Abgenix); BTI-322 - крысиные aнти-CD2 IgG антитела (Medimmune/Bio Transplant); Orthoclone/OKT3 - мышиные aнти-CD3 IgG2a антитела (ortho Biotech); СИМУЛЕКТ™ - химерные aнти-CD25 IgG1 антитела (Novartis Pharm); LDP-01 - гуманизированные aнти-β2-интегрин IgG антитела (LeukoSite); Aнти-LFA-1 - мышиный анти-CD18 F(ab')2 (Pasteur-Merieux/Immunotech); CAT-152 - человеческие aнти-TGF-β2 антитела (Cambridge Ab Tech); Корсевин М - химерный антифактор VII антитела (Centocor). Вышеуказанный список иммунореактивных реагентов, так же как и любые другие иммунореактивные реагенты, может применяться в соответствии с любым режимом, известным для них из разработанных технологий, включая режимы, рекомендованные поставщиками иммунореактивных реагентов. В предпочтительном варианте осуществления молекулярные комплексные соединения по изобретению применяются в комбинации с aнти-CTLA4 антителами или антителами aнти-41BB.

В другом варианте осуществления комплексные соединения по изобретению применяются в комбинации с одним или несколькими антиангиогенными средствами, включающими, без ограничения: ангиостатин, талидомид, крингл 5, эндостатин, Серпин (Сывороточный ингибитор протеаз) антитромбин, 29 кДа N-терминальный и 40 кДа C-терминальный протеолитические фрагменты фибронектина, 16 кДа протеолитические фрагменты пролактина, 7,8 кДа протеолитические фрагменты фактора-4 тромбоцитов, пептид из 13 аминокислот, соответствующий фрагменту фактора 4 тромбоцитов (Maione et al., 1990, Cancer Res. 51:2077-2083), пептид из 14 аминокислот, соответствующий фрагменту коллагена I (Tolma et al., 1993, J. Cell Biol 122:497-511), пептид из 19 аминокислот, соответствующий фрагменту тромбоспондина I (Tolsmа et al., 1993, J. Cell Biol. 122:497-511), пептид из 20 аминокислот, соответствующий фрагменту SPARC (Sage et al., 1995, J. Cell. Biochem. 57:1329-1334), или любые фрагменты, представители семейств или их варианты, включая их фармацевтически приемлемые соли.

Также были описаны другие пептиды, которые замедляют ангиогенез и соответствуют фрагментам ламинина, фибронектина, проколлагена и EGF (см., например, Cao, 1998, Prog Mol Subcell Biol. 20:161-176). Моноклональные антитела и циклические пентапептиды, которые блокируют определенные интегрины, связывающие белки RGD (то есть обладают фрагментом пептида Arg-Gly-Asp), показали свою активность против васкуляризации (Brooks et al., 1994, Science 264:569-571; Hammes et al., 1996, Nature Medicine 2:529-533). Кроме того, ингибирование рецептора активатора урокиназы плазминогена антагонистами рецептора замедляет ангиогенез, рост опухоли и метастазирование (Min et al., 1996, Cancer Res. 56: 2428-33; Crowley et al., 1993, Proc Natl Acad Sci. 90:5021-25). Использование таких антиангиогенных средств в комбинации с комплексными соединениями также рассмотрено настоящим изобретением.

В еще одном варианте осуществления комплексные соединения по изобретению используются в комбинации с гормональной терапией. Гормональная терапия включает применение агонистов гормонов и их антагонистов (например, флутамида, бикалютамида, тамоксифена, ралоксифена, лейпролида ацетата (LUPRON), антагонистов LH-RH), ингибиторов биосинтеза и распада гормонов и стероидов (например, дексаметазона, ретиноидов, дельтоидов, бетаметазона, кортизола, кортизона, преднизолона, дегидротестостерона, глюкокортикоидов, минералокортикоидов, эстрогенов, тестостеронов, прогестинов), производных витамина А (например, все-транс-ретиноевая кислота (ATRA)); аналогов витамина D3; антигестагенов (например, мифепристона, онапристона) и антиандрогенов (например, ципротерона ацетата).

В еще одном варианте осуществления комплексные соединения по изобретению используются в комбинации с программой генотерапии опухолей. В одном варианте осуществления генотерапия рекомбинантными клетками, секретирующими интерлейкин-2, применяется в комбинации с комплексными соединениями по изобретению для предотвращения или лечения опухолей, особенно рака молочной железы (см., например, Deshmukh et al., 2001, J. Neurosurg. 94:287-92). В других вариантах осуществления генотерапия проводится с использованием полинуклеотидных соединений, таких как, без ограничения: антисенсорные полинуклеотиды, рибозимы, РНК интерференционные молекулы, тройные спиральные полинуклеотиды, где последовательность нуклеотидов связана с последовательностью нуклеотидов ДНК и/или РНК генов, отвечающих за инициирование, прогрессирование и/или патологию злокачественной или доброкачественной опухоли. Например, многие являются онкогенами, генами фактора роста, генами рецептора фактора роста, генами клеточного цикла, генами репарации ДНК и хорошо известны в уровне техники.

В другом варианте осуществления комплексные соединения по изобретению применяются в комбинации с лучевой терапией. Облучение может быть произведено гамма-лучами или рентгеновским излучением. Методы лечения опухолей включают лучевую терапию, такую как внешнюю лучевую терапию, интерстициальную имплантацию радиоизотопов (I-125, палладия, иридия), радиоизотопов, таких как стронций-89, торакальную лучевую терапию, внутрибрюшинную лучевую терапию P-32 и/или полную брюшную и тазовую лучевую терапию. Для общего краткого обзора лучевой терапии см. Hellman, Chapter 16: Principles of Cancer Management: Radiation Therapy, 6th edition, 2001, DeVita et al., eds., J.B. Lippencott Company, Philadelphia. В предпочтительных вариантах осуществления лучевая терапия применяется как внешняя, или телетерапия, когда излучение направлено из отдаленного источника. В различных предпочтительных вариантах осуществления лучевая терапия применяется как внутренняя, или брахитерапия, когда радиоактивный источник помещен в орган близко к опухолевым клеткам или опухолевой массе. Также охвачено комбинированное использование комплексных соединений по изобретению с фотодинамической терапией, включающей введение фотосенсибилизаторов, таких как гематопорфирин и его производные, Вертопорфин (BPD-MA), фталоцианин, фотосенсибилизатор Pc4, деметокси-гипокреллин A; и 2BA-2-DMHA.

В различных вариантах осуществления комплексные соединения по изобретению применяются в комбинации по крайней мере с одним химиотерапевтическим средством для укорочения цикла лечения опухолей. Продолжительность лечения химиотерапевтическим средством может меняться в зависимости от применения терапевтического средства для конкретной опухоли. Изобретение также рассматривает прерывистое воздействие или разделение суточной дозы на несколько приемов. Адекватное время лечения терапевтическим средством для конкретной опухоли будет определено квалифицированным специалистом, а изобретение рассматривает длительное исследование оптимальных программ лечения терапевтическими средствами для каждого типа опухоли. Настоящее изобретение рассматривает по крайней мере один цикл, в лучшем случае более одного цикла, в течение которого применяются одно терапевтическое средство или их последовательность. Адекватный период времени для одного цикла будет определен квалифицированным специалистом, так же как и общее количество циклов и интервалы между ними.

В другом варианте осуществления комплексные соединения по изобретению используются в комбинации с соединениями, которые улучшают симптоматику опухолей (такие, как боль и др.) и побочные эффекты комплексных соединений по изобретению (такие, как гриппоподобные симптомы, лихорадка и т.д.). Соответственно, много соединений, уменьшающих боль, гриппоподобные симптомы, лихорадку, могут использоваться в комбинации или в смеси с комплексными соединениями по изобретению. Такие соединения включают анальгетики (например, ацетаминофен), противозастойные средства (например, псевдоэфедрин), антигистамины (например, малеат хлорфенирамина) и противокашлевые средства (например, декстрометорфан).

5.8.2 Целевые инфекционные болезни

Инфекционные болезни, которые можно лечить или предотвращать методами настоящего изобретения, вызываются возбудителями, включающими, без ограничения, вирусы, бактерии, протозойные грибы, гельминты, паразиты. Изобретение не ограничивается лечением или предотвращением инфекционных болезней, вызванных внутриклеточными патогенами. Много значимых в медицине микроорганизмов были широко описаны в литературе, например, см. CGA Thomas, Medical Microbiology, Bailliere Tindall, Great Britain 1983, который включен здесь в виде ссылки в полном объеме.

Комбинированная терапия охватывает в дополнение к воздействию комплексных соединений по изобретению использование одной или нескольких методик, которые способствуют профилактике или лечению инфекционных болезней. Такие методики включают, без ограничения, применение антибиотиков, антивирусных препаратов, антипротозойных составов, противогрибковых составов и противоглистных средств. Другие методики, которые могут использоваться для лечения или предотвращения инфекционных болезней, включают иммунотерапевтические средства, полинуклеотиды, антитела, цитокины и гормоны, как описано выше.

Инфекционные вирусы человека и позвоночных включают ретровирусы, РНК вирусы и ДНК вирусы. Примеры вирусов, которые были найдены у людей: Ретровирусы (например, вирусы иммунодефицита человека, такие как ВИЧ-1 (также описанный как HTLV-III, LAV или HTLV-III/LAV, или ВИЧ-III; выделяют и другие, такие как ВИЧ-LP); Пикорнавирусы (например, вирус полиомиелита, вирус гепатита А; энтеровирусы, вирус Коксаки человека, риновирусы, ЕСНО-вирус); Кальцивирусы (например, штаммы, вызывающие гастроэнтерит); Тогавирусы (например, лошадиный вирус энцефалита, вирус краснухи); Флавирусы (например, вирусы лихорадки, вирус энцефалита, вирус желтой лихорадки); Коронавирусы (например, коронавирусы); Рабдовирусы (например, вирус везикулярного стоматита, вирус бешенства); Филовирусы (например, вирус Эбола); Парамиксовирусы (например, вирус парагриппа, вирус паротита, вирус кори, респираторно-синцитиальный вирус); Ортомиксовирусы (например, вирус гриппа); Бунгавирусы (например, хантавирус, бунгавирус, флебовирус и вирус Наиро); Аренавирусы (вирус геморрагической лихорадки); Реовирусы (например, реовирус, орбивирус и ротавирус); Бирнавирусы; Гепаднавирусы (вирус гепатита В); Парвовирусы (парвовирус); Паповавирусы (вирус папилломы, вирусы полиомы); Аденовирусы (большинство аденовирусов); Герпесвирусы (вирус простого герпеса (HSV) 1 и 2, вирус опоясывающего лишая и ветряной оспы, цитомегаловирус (ЦМВ), вирус герпеса); Поксвирусы (вирус оспы, вакцинавирусы, вирусы сыпи); и Иридовирусы (например, Африканский вирус свиной лихорадки); и неклассифицированные вирусы (например, возбудители губчатых энцефалопатий, возбудитель дельта-гепатита (предполагается, что он является дефектным сателлитом вируса гепатита В), возбудители ни-А, ни-В гепатита (класс 1 - передающиеся энтерально; класс 2 - парентерально (то есть Гепатит C); Норфолк и подобные вирусы, и астровирусы).

Рассмотренные ретровирусы включают простые и комплексные ретровирусы. Простые ретровирусы включают подгруппы B-типа, C-типа и D-типа. Пример ретровируса B-типа - мышиный вирус опухоли молочной железы (MMTV). C-тип ретровирусов состоит из группы А (включающей вирус саркомы Рауса (RSV), вирус птичьего лейкоза (ALV) и вирус птичьего миелобластоза (AMV)) и группы В (включающей вирус мышиного лейкоза (MLV), вирус кошачьего лейкоза (FeLV), вирус мышиной саркомы (MSV), вирус лейкоза обезьяны гиббона (GALV), вирус некроза селезенки (SNV), вирус ретикулоэндотелиоза (RV) и вирус саркомы обезьян (SSV)). D-тип ретровирусов включает вирус Масона-Пфайзера обезьян (MPMV) и ретровирус тип-1 обезьян (SRV-1). Комплексные ретровирусы включают подгруппы лентивирусов, вирусов Т-клеточного лейкоза и фоамивирусов. Лентивирусы включают ВИЧ-1, а также ВИЧ-2, SIV, вирус Вишна, вирус иммунодефицита кошки (FIV) и лошадиный вирус инфекционной анемии (EIAV). Вирусы Т-клеточного лейкоза включают HTLV-I, HTLV-II, вирус Т-клеточного лейкоза обезьян (STLV) и вирус бычьего лейкоза (BLV). Фоамивирусы включают человеческий фоамивирус (HFV), фоамивирус обезьян (SFV) и бычий фоамивирус (BFV).

РНК вирусы, которые являются антигенами позвоночных, включают: представителей семейства Реовирусов, включающих род Ортореовирусы (множество серотипов как млекопитающих, так и птичьих ретровирусов), род Орбивирусы (вирус Блютонга, вирус Еугенанге, Кемеровский вирус, африканский вирус лошадиной болезни и вирус Колорадской клещевой лихорадки), род Ротавирусы (человеческий ротавирус, вирус Штата Небраска, вызывающий диарею у телят, мышиный ротавирус, ротавирус обезьян, бычий или овечий ротавирус, птичий ротавирус); семейство Пикомавирусов, включающих род Энтеровирусы (полиовирус, вирус Коксаки A и B, энтероцитопатические сиротские вирусы (ЕСНО), вирус гепатита А, энтеровирусы обезьян, мышиные вирусы энцефаломиелита (МЕ), мышиный полиовирус, бычьи энтеровирусы, свиные энтеровирусы), род Кардиовирус (вирус энцефаломиокардита (EMC), Менговирус), род Риновирус (человеческие риновирусы, включающие как минимум 113 подтипов; другие риновирусы), род Аптовирус (болезнь ног и ротовой полости (FMDV); семейство Кальцивирусов, включающее вирус везикулярной экзантемы свиньи, вирус морского льва Сан-Мигель, кошачий пикорнавирус и Норфолкский вирус; семейство Тогавирусов, включающее род Альфавирус (восточный вирус лошадиного энцефалита, вирус леса Семлики, вирус Синдбис, вирус Чикунгунья, вирус O'Ньянг-Ньянг, вирус реки Росса, вирус венесуэльского энцефалита лошадей, вирус западного энцефалита лошадей), род Флавирус (вирус желтой лихорадки, переносимый москитами, вирус лихорадки, вирус японского энцефалита, вирус энцефалита Сант-Луи, вирус энцефалита долины Мюррей, вирус Западного Нила, вирус Куньин, Центральноевропейский клещевой вирус, дальневосточный клещевой вирус, вирус леса Киассианур, вирус Лупинг III, Повассанский вирус, вирус Омской геморрагической лихорадки), род Рубивирусы (вирус раснухи), род Пестивирусы (вирус болезни слизистой оболочки, вирус холеры свиней, вирус окопной болезни); семейство Буньявирусов, включающее род Буньявирусы (Bunyamwera и родственные вирусы, вирус группы Калифорнийских энцефалитов), род Флебовирусы (вирус сицилийской москитной лихорадки, вирус лихорадки долины Рифт), род Найровирусы (вирус Конго-крымской геморрагической лихорадки, вирус болезни овец Найроби), род Уукувирусов (уукиниеми и родственные вирусы); семейство Ортомиксовирусов, включающее род вирусов гриппа (вирус гриппа типа A, множество человеческих подтипов); свиной вирус гриппа, птичьи и лошадиные вирусы гриппа; вирусы гриппа типа B (множество человеческих подтипов), гриппа типа C (возможно, отдельный род); семейство Парамиксовирусов, включающее род парамиксовирусов (вирус парагриппа типа 1, вирус Сендай, вирус гемадсорбции, вирусы парагриппа типов 2-5, вирус Ньюкаслской болезни, вирус паротита), род Морбилливирусов (вирус кори, вирус подострого склерозирующего панэнцефалита, вирус чумы собак, вирус чумы рогатого скота), род Пневмовирусов (респираторно-синцитиальный вирус (РСВ), бычий респираторно-синцитиальный вирус и вирус пневмонии мышей); семейство Рабдовирусов, включающих род Везикуловирусов (VSV), вирус Чанбипура, вирус парковых оленей Фландрии), род Лиссавирусов (вирус бешенства), рабдовирусы рыб и два вероятных рабдовируса (вирус Марбурга и вирус Эбола); семейство Аренавирусов, включающее вирус лимфоцитарного хориоменингита (LCM), вирусный комплекс Такарибе и вирус Ласс; семейство Короновирусов, включающее вирус инфекционного бронхита (IBV), вирус мышиного гепатита, человеческий тонкокишечный коронавирус, вирус кошачьего инфекционного перитонита (кошачий коронавирус).

Показательные ДНК вирусы, которые являются антигенами позвоночных, включают: семейство Поксвирусов, включающее род Ортопоксвирусов (большая оспа, малая оспa, вакциния обезьян, коровья оспа, оспа, оспа кроликов, эктромелия), род Лепорипоксвирусов (миксома, фиброма), род Авипоксвирусов (оспа домашних птиц, другой птичий поксвирус), род Каприпоксвирусов (оспа овец, оспа коз), род Суипоксвирусов (оспа свиней), род Парапоксвирусов (вирус контагиозного постулярного дерматита, коровья псевдооспа, вирус бычьего папулезного стоматита); семейство Иридовирусов (вирус африканской свиной лихорадки, вирусы лягушки 2 и 3, лимфоцитарный вирус рыб); семейство Герпесвирусов, включающее альфа-герпесвирусы (простого герпеса типов 1 и 2, опоясывающего лишая и ветряной оспы, вирус, вызывающий аборт у лошадей, лошадиный вирус герпеса 2 и 3, вирус псевдобешенства, вирус инфекционного бычьего кератоконъюнктивита, вирус инфекционного бычьего ринотрахеита, вирус кошачьего ринотрахеита, вирус инфекционного ларинготрахеита), бета-герпесвирусы (цитомегаловирусы человека и цитомегаловирусы свиней, обезьян и грызунов); гамма-герпесвирусы (вирус Эпштейна-Барр (EBV), вирус болезни Мейрка, герпес саимири, герпесвирус ateles, герпесвирус sylvilagus, герпесвирус гвинейской свиньи, вирус опухоли Lucke); семейство Аденовирусов, включающее род Мастаденовирусов (человеческие подгруппы A, B, C, D, E и несгруппированные; аденовирусы обезьян (как минимум, 23 серотипа), собачий инфекционный гепатит, аденовирусы рогатого скота, свиней, овец, лягушек и многие другие виды, род Авиаденовирусов (птичьи аденовирусы); и некультивируемые аденовирусы; семейство Паповирусов, включающее род Папилломавирусов (вирусы человеческой папилломы, вирусы папилломы коров, вирус папилломы кроликов Shope и различные патогенные вирусы папилломы других видов), род Полиомавирусов (полиомавирус, обезьяний вакуолизирующий фактор (SV-40), кроличий вакуолизирующий фактор (RKV), K вирус, ВК вирус, вирус JC и другие полиомавирусы обезьян, такие как лимфотрофический вирус папилломы); семейство Парвовирусы, включающее род Аденоассоциированные вирусы, род Парвовирусов (вирус кошачьей панлейкопении, парвовирус коров, парвовирус собак, вирус болезни Алеутской норки и т.д.) и др. Наконец, ДНК вирусы могут включать вирусы, которые не относятся к вышеупомянутым семействам, такие как вирусы болезни Куру и Круцфелдта-Якоба и факторы хронической инфекционной нейропатии.

Примеры антивирусных соединений, которые могут применяться в комбинации с комплексными соединениями по изобретению, известны в уровне техники и включают, без ограничения: рифампицин, ингибиторы обратной нуклеозидтранскриптазы (например, AZT, ddl, ddC, 3TC, d4T), ингибиторы обратной ненуклеозидтранскриптазы (например, эфавиренз, невирапин), ингибиторы протеаз (например, апренавир, индинавир, ритонавир и сахинавир), идоксуридин, цидофовир, ацикловир, ганцикловир, занамивир, амантадин и паливизумаб. Другие примеры антивирусных средств включают, без ограничения: ацеманнан; ацикловир; ацикловир-натрий; адефовир; аловудин; алвирцепт судотокс; амантадина гидрохлорид; аранотин; арилдон; атевирдина месилат; авридин; цидофовир; ципамфиллин; цитарабина гидрохлорид; делавирдина месилат; десцикловир; диданозин; дизоксарил; эдоксудин; энвираден; энвироксим; фамцикловир; фамотина гидрохлорид; фиацитабин; фиалуридин; фосарилат; фоскамет-натрий; фосфонет-натрий; ганцикловир; ганцикловир-натрий; идоксуридин; кетоксал; ламивудин; лобукавир; мемотина гидрохлорид; метисазон; невирапин; пенцикловир; пиродавир; рибавирин; римантадина гидрохлорид; сахинавира месилат; сомантадина гидрохлорид; соривудин; статолон; ставудин; тилорона гидрохлорид; трифлуридин; валацикловира гидрохлорид; видарабин; видарабина фосфат; видарабина натрия фосфат; вироксим; залцитабин; зидовудин; зинвироксим.

Бактериальные инфекции или болезни, которые можно лечить или предотвращать способами настоящего изобретения, вызываются бактериями, которые включают, без ограничения: бактерии, которые имеют внутриклеточную стадию в своем жизненном цикле, такие как микобактерии (например, Mycobacteria tuberculosis, M. bovis, M. avium, M. leprae или M. africanum), риккетсии, микоплазмы, хламидии и легионеллы. Другие примеры рассмотренных бактериальных инфекций, без ограничения: инфекции, вызванные грамположительными бациллами (например, листерии, бациллы, такие как Bacillus anthracis, виды Erysipelothrix), грамотрицательными бациллами (например, бартонелла, бруцелла, кампилобактер, энтеробактер, эшерихия, франциселла, гемофилюс, клебсиелла, морганелла, протей, провиденсия, псевдомонада, сальмонелла, серрация, шигелла, вибрион и виды иерсиний), спирохетами (например, виды боррелий, включая Borrelia burgdorferii, которая вызывает болезнь Лайма), анаэробными бактериями (например, виды Actinomyces и Clostridium), грамположительными и грамотрицательными кокками, видами энтерококков, стрептококков, пневмококков, стафиллококков, нейссерий. Особые примеры инфекционных бактерий включают, без ограничения: Helicobacter pyloris, Borelia burgdorferi, Legionella pneumophilia, Mycobacteria tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansaii, М. gordonae, Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes (стрептококк группы А), Streptococcus agalactiae (стрептококк группы В), Streptococcus viridans, Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Bacillus antracis, Сorynebacterium biphtheriae, Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringers, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella multocida, Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidium, Treponema pertenue, Leptospira, Rickettsia и Actinomyces israelli.

Бактерицидные средства или антибиотики, которые могут применяться в комбинации с комплексными соединениями по изобретению, включают, без ограничения: аминогликозиды (например, апрамицин, арбекацин, бамбермицины, бутирозин, дибекацин, неомицин, неомицина ундециленат, нетилмицин, паромомицин, рибостамицин, сизомицин и спектиномицин), амфениколы (например, азидамфеникол, хлорамфеникол, флорфеникол и тиамфеникол), ансамицины (например, рифамид и рифампин), карбацефемы (например, лорацербеф), карбапенемы (например, биапенем и имипенем), цефалоспорины (например, цефаклор, цефадроксил, цефамандол, цефатризин, цефазедон, цефозопран, цефпимизол, цефпирамид и цефпиром), цефамицины (например, цефбуперазон, цефметазол и цефминокс), монобактамы (например, азтреонам, карумонам и тигемонам), оксацефемы (например, фломоксеф и моксалактам), пенициллины (например, амдиноциллин, амдиноциллинпивоксил, амоксициллин, бакампициллин, бензилпенициллиновая кислота, бензилпенициллин-натрий, эпициллин, фенбенициллин, флоксациллин, пенамоциллин, пенетамата гидроиодид, пенициллин o-бенетамин, пенициллин 0, пенициллин V, пенициллин V бензатин, пенициллин V гидрабамин, пенимепициклин и фенцинициллин-калий), линкозамиды (например, клиндамицин и линкомицин), макролиды (например, азитромицин, карбомицин, кларитромицин, диритромицин, эритромицин и эритромицина ацистрат), амфомицин, бацитрацин, капреомицин, колистин, эндурацидин, энвиомицин, тетрациклины (например, апициклин, хлортетрациклин, кломоциклин и демеклоциклин), 2,4-диаммопиримидины (например, бродимоприм), нитрофураны (например, флуралтадон и фуразолия хлорид), хинолоны и их аналоги (например, циноксацин, ципрофлоксацин, клинафлоксоцин, флумехин и грепаглоксацин), сульфамиды (например, ацетилсульфаметоксипиразин, бензилсульфамид, ноприлсульфамид, фталилсульфацетамид, сульфахризоидин и сульфацитин), сульфоны (например, диатимосульфон, глюкосульфон-натрий и соласульфон), циклосерин, мупироцин и туберин.

Дополнительные примеры бактерицидных средств включают, без ограничения: ацедапсон; ацетосульфон-натрий; аламецин; алексидин; амдиноциллин; амдиноциллина пивоксил; амициклин; амифлоксацин; амифлоксацина месилат; амикацин; амикацина сульфат; аминосалициловая кислота; натрия аминосалицилат; амиксициллин; амфомицин; ампициллин; ампициллин-натрий; апалциллин-натрий; апрамицин; аспартоцин; астромицина сульфат; авиламицин; авопарцин; азитромицин; азлоциллин; азлоциллин-натрий; бакампициллина гидрохлорид; бацитрацин; бацитрацина метилен дизалицилат; бацитрацин-цинк; бамбермицины; бензоилпас-кальций; беритромицин; бетамицина сульфат; биапенем; бинирамицин; бифенамина гидрохлорид; биспиритиона магсульфекс; бутикацин; бутирозина сульфат; капреомицина сульфат; карбадокс; двунатриевый карбенициллин; карбенициллин-инданилнатрий; карбенициллин-фенилнатрий; карбенициллин-калий; карумонам-натрий; цефаклор; цефадроксил; цефамандол; цефамандола нафат; цефамандол-натрий; цефапарол; цефатризин; цефазафлур-натрий; цефазолин; цефазолин-натрий; цефбуперазон; цефдинир; цефепим; цефепима гидрохлорид; цефетекол; цефиксим; цеминеноксима гидрохлорид; цефметазол; цефметазол-натрий; цефоницид-мононатрий; цефоницид-натрий; цефоперазон-натрий; цефоранид; цефотаксим-натрий; цефотетан; двунатриевый цефотетан; цефотиама гидрохлорид; цефокситин; цефокситин-натрий; цефпимизол; цефпимизол-натрий; цефпирамид; цефпирамид-натрий; цефпирома сульфат; цефподоксима проксетил; цефпрозил; цефроксадин; цефсулодин-натрий; цефтазидим; цефтибутен; цефтизоксим-натрий; цефтриаксон-натрий; цефуроксим; цефуроксим аксетил; цероксим пивоксетил; цефуроксим-натрий; цефацетрил-натрий; цефалексин; цефалексина гидрохлорид; цефалоглицин; цефалоридин; цефалотин-натрий; цефапирин-натрий; цефрадин; цетоциклина гидрохлорид; цетофеникол; хлорамфеникол; хлорамфеникола пальмитат; комплексное соединение хлорамфеникола пантотената; хлорамфеникол-натрийсукцинат; хлоргексидина фосфанилат; хлороксиленол; хлортетрациклина бисульфат; хлортетрациклина гидрохлорид; циноксацин; ципрофлоксацин; ципрофлоксацина гидрохлорид; циролемицин; кларитромицин; клинафлоксацина гидрохлорид; клиндамицин; клиндамицина гидрохлорид; клиндамицина пальмитат гидрохлорид; клиндамицина фосфат; клофазимин; клоксациллина бензатин; клоксациллин-натрий; клоксигвин; колистиметат натрия; колистина сульфат; коумермицин; коумермицин-натрий; циклациллин; циклосерин; дальфопристин; дапсон; даптомицин; демеклоциклин; демеклоциклина гидрохлорид; демециклин; денофунгин; диаверидин; диклоксациллин; диклоксациллин-натрий; дигидрострептомицина сульфат; бипиритион; диритромицин; доксициклин; доксициклин-кальций; доксициклина фосфатекс; доксициклина хиклат; дроксацин-натрий; эноксацин; эпициллин; эпитетрациклина гидрохлорид; эритромицин; эритромицина ацистрат; эритромицина эстолат; эритромицина этилсукцинат; эритромицина глюцептат; эритромицина лактобионат; эритромицина пропионат; эритромицина стеарат; этамбутола гидрохлорид; этионамид; флероксацин; флоксациллин; флудаланин; флумегвин; фосфомицин; фосфомицина трометамин; фумоксициллин; фуразолия хлорид; фуразолия тартрат; натрия фузидат; фузидевая кислота; гентамицина сульфат; глоксимонам; грамицидин; галопрогин; гетациллин; гетациллин-калий; гекседин; ибафлоксацин; имипенем; изоконазол; изепамицин; изониазид; иозамицин; канамицина сульфат; китазамицин; левофуралтадон; левопропилциллин-калий; лекситромицин; линкомицин; линкомицина гидрохлорид; ломефлоксацин; ломефлоксацина гидрохлорид; ломефлоксацина месилат; лоракарбеф; мафенид; меклоциклин; меклоциклина сульфосалицилат; мегаломицина калия фосфат; мегвидокс; меропенем; метациклин; метациклина гидрохлорид; метенамин; метенамина гиппурат; метенамина манделат; мемициллин-натрий; метиоприм; метронидазола гидрохлорид; метронидазола фосфат; мезлоциллин; мезлоциллин-натрий; миноциклин; миноциклина гидрохлорид; миринкамицина гидрохлорид; моненсин; моненсин-натрий; нафциллин-натрий; натрия налидиксат; налидиксовая кислота; натамицин; небрамицин; неомицина пальмитат; неомицина сульфат; неомицина ундециленат; нетилмицина сульфат; нейтрамицин; нифураден; нифуралдезон; нифурател; нифуратрон; нифурдазил; нифуримид; нифурпиринол; нифурхиназол; нифуртиазол; нитроциклин; нитрофурантоин; нитромид; норфлоксацин; новобиоцин-натрий; офлоксацин; орметоприм; оксациллин-натрий; оксимонам; оксимонам-натрий; оксолиновая кислота; окситетрациклин; окситетрациклин-кальций; окситетрациклина гидрохлорид; пальдимицин; парахлорофенол; пауломицин; пефлоксацин; пефлоксацина месилат; пенамециллин; пенициллина G бензатин; пенициллин G калий; пенициллина G прокаин; пенициллин G натрий; пенициллин V; пенициллина V бензатин; пенициллина V гидрабамин; пенициллин V калий; пентизидон-натрий; фенил аминосалицилат; пиперациллин-натрий; пирбенициллин-натрий; пиридициллин-натрий; пирлимицина гидрохлорид; пивампициллина гидрохлорид; пивампициллина памоат; пивампициллина пробенат; полимиксина B сульфат; порфиромицин; пропикацин; пиразинамид; пиритион-цинк; хиндекамин ацетат; хинупристин; рацефеникол; рамопланин; ранимицин; реломицин; репромицин; рифабутин; рифаметан; рифамексил; рифамид; рифампин; рифапентин; рифаксимин; ролитетрациклин; ролитетрациклина нитрат; розарамицин; розарамицина бутират; розарамицина пропионат; розарамицина натрия фосфат; розарамицина стеарат; розоксацин; роксарзон; роксатромицин; санциклин; санфетринем-натрий; сармоксициллин; сарпициллин; скопафингин; сизомицин; сизомицина сульфат; спарфлоксацин; спектиномицина гидрохлорид; спирамицин; сталлимицина гидрохлорид; стеффимицин; стрептомицина сульфат; стрептоникозид; сульфабенз; сульфабензамид; сульфацетамид; сульфацетамид-натрий; сульфацитин; сульфадиазин; сульфадиазин-натрий; сульфадоксин; сульфаден; сульфамеразин; сульфаметер; сульфаметазин; сульфаметизол; сульфаметоксазол; сульфамонометоксин; сульфамоксол; цинка сульфанилат; сульфанитран; сульфасалазин; сульфазомизол; сульфатиазол; сульфазамет; сульфизоксазол; сульфизоксазола ацетил; сульфизоксазола диоламин; сульфомиксин; сулопенем; сультамициллин; сунциллин-натрий; талампициллина гидрохлорид; тейкопланин; темафлоксацина гидрохлорид; темоциллин; тетрациклин; тетрациклина гидрохлорид; комплексное соединение тетрациклина фосфата; тетроксоприм; тиамфеникол; тифенциллин-калий; тикарциллин крезил натрий; двунатриевый тикарциллин; тикарциллин-мононатрий; тиклатон; тиодония хлорид; тобрамицин; тобрамицина сульфат; тосуфлоксацин; триметоприм; триметоприма сульфат; трисульфапиримидины; тролеандомицин; троспектомицина сульфат; тиротрицин; ванкомицин; ванкомицина гидрохлорид; виргиниамицин; зорбамицин.

Грибковые болезни, которые можно лечить или предотвращать методами настоящего изобретения, включают, без ограничения: аспергиллез, критококкоз, споротрихоз, сокцидиомикоз, паракокцидиомикоз, гистоплазмоз, бластомикоз, зигомикоз и кандидоз.

Противогрибковые соединения, которые могут применяться в комбинации с комплексными соединениями по изобретению, включают, без ограничения: полиены (например, амфотерицин В, кандицидин, мепартрицин, натамицин и нистатин), аллиламины (например, бутенафин и нафтифин), имидазолы (например, бифоназол, бутоконазол, хлордантоин, флутримазол, изоконазол, кетоконазол и ланоконазол), тиокарбаматы (например, толциклат, толиндат и толнафтат), триазолы (например, флуконазол, итраконазол, саперконазол и терконазол), бромосалицилхлоранилид, буклосамид, пропионат кальция, хлорфенесин, циклопирокс, азасерин, гризеофульвин, олигомицины, неомицина ундециленат, пирролнитрин, сикканин, туберцидин и виридин. Дополнительные примеры противогрибковых соединений включают, без ограничения: акризорцин; амбрутицин; амфотерицин B; азаконазол; азасерин; базифунгин; бифоназол; бифенамина гидрохлорид; биспиритиона магсулфекс; бутоконазола нитрат; ундециленат кальция; кандицидин; карбол-фуксин; хлордантоин; циклопирокс; циклопирокса оламин; цилофунгин; цисконазол; клотримазол; купримиксин; денофунгин; бипиритион; доконазол; эконазол; эконазола нитрат; энилконазол; этонама нитрат; фентиконазола нитрат; филипин; флуконазол; флуцитозин; фунгимицин; гризеофульвин; гамицин; изоконазол; итраконазол; калафунгин; кетоконазол; ломофингин; лидимицин; мепартрицин; миконазол; миконазола нитрат; моненсин; моненсин-натрий; нафтифина гидрохлорид; неомицина ундециленат; нифурател; нифурмерон; нитраламина гидрохлорид; нистатин; октановая кислота; орконазола нитрат; оксиконазола нитрат; оксифунгина гидрохлорид; парконазола гидрохлорид; партрицин; иодид калия; проклонол; пиритион-цинк; пирролнитрин; рутамицин; сангвинария хлорид; саперконазол; скопафунгин; селена сульфид; синефунгин; сульконазола нитрат; тербинафин; терконазол; тирам; тиклатон; тиоконазол; толциклат; толиндат; толнафтат; триацетин; триафунгин; ундециленовая кислота; виридофлилвин; цинка ундециленат и зиноконазола гидрохлорид.

Паразитарные болезни, которые можно лечить или предотвращать методами настоящего изобретения, включают, без ограничения: амебиаз, малярию, лейшманиоз, кокцидиоз, гиардиаз, криптоспоридиоз, токсоплазмоз, трипаносомоз. Также сюда входят поражения различными гельминтами, такие как, без ограничения: аскаридоз, анкилостомоз, трихоцефалез, стронгилоидоз, токсоккариаз, трихинеллез, онхоцерциаз, филяриоз и дирофиляриоз. Также к ним относятся инфекции различными трематодами, такие как, без ограничения: шистосомоз, парагонимоз и клонорхоз. Паразиты, вызывающие эти болезни, могут быть классифицированы на внутриклеточные и внеклеточные. "Внутриклеточный паразит" в данном случае проходит весь жизненный цикл внутри клетки. Примеры человеческих внутриклеточных паразитов: Leishmania spp., Plasmodium spp., Trypanosoma cruzi, Toxoplasma gondii, Babesia spp. и Trichinella spiralis. "Внеклеточный паразит" в данном случае проходит весь жизненный цикл вне клетки. Внеклеточные паразиты, способные инфицировать людей, включают: Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, Enterocytozoon bieneusi, Naegleria и Acanthamoeba, так же как и большинство гельминтов. Еще один класс паразитов выделен как являющийся главным образом внеклеточным, но с обязательной внутриклеточной стадией жизненного цикла. Такие паразиты здесь относят к "облигатным внутриклеточным паразитам". Эти паразиты могут существовать большую или только небольшую часть их жизни вне клетки, но все они имеют по крайней мере одну облигатную внутриклеточную стадию жизненного цикла. Эта последняя категория паразитов включает: Trypanosoma rhodesiense и Trypanosoma gambiense, Isospora spp., Cryptosporidium spp, Eimeria spp., Neospora spp., Sarcocystis spp. и Schistosoma spp.

Много примеров антипротозойных соединений, которые могут применяться в комбинации с комплексными соединениями по изобретению для лечения паразитарных болезней, известны в уровне техники и включают, без ограничения: хинины, хлорохин, мефлохин, прогванил, пириметамин, метронидазол, дилоксанида фуроат, тинидазол, амфотерицин, натрия стибоглюконат, тримоксазол, пентамидина изетионат. Много примеров антипаразитарных препаратов, которые могут применяться в комбинации с комплексными соединениями по изобретению для лечения паразитных болезней, известны в уровне техники и включают, без ограничения: мебендазол, левамизол, никлозамид, празиквантел, альбендазол, ивермектин, диэтилкарбамазин, тиабендазол. Еще примеры антипаразитарных средств включают, без ограничения: ацедапсон; амодиахина гидрохлорид; амхинат; артефлен; хлорохин; хлорохина гидрохлорид; хлорохина фосфат; циклогуанила памоат; энпиролина фосфат; галофантрина гидрохлорид; гидроксихлорохина сульфат; мефлохина гидрохлорид; меноктон; миринкамицина гидрохлорид; примахина фосфат; пириметамин; хинина сульфат, тебухин.

В менее предпочтительном варианте осуществления комплексные соединения по изобретению могут применяться в комбинации с non-HSP и non-α2M-основными вакцинными композициями. Примеры таких вакцин для людей описаны в Jordan Report 2000, Accelerated Development of Vaccines, National Institute of Health, включенного сюда в виде ссылки. Много вакцин для лечения позвоночных раскрыто в Bennett, K. Compendium of Veterinary Products, 3rd ed. North American Compendiums, Inc., 1995, включенном здесь в виде ссылки в полном объеме.

5.8.3 Другие болезни-мишени

Помимо опухолей и инфекционных болезней способами настоящего изобретения можно также лечить или предотвращать другие болезни, включающие, без ограничения: анемию, заболевания, связанные с недостаточностью гормона роста, ферментной недостаточности и иммунодефицитные состояния.

Анемия может развиваться из-за различных причин, например: дефицита железа, фолиевой кислоты, хронических заболеваний (например, хронической инфекции или воспаления, опухоли, заболевания печени, хронической почечной недостаточности), химиотерапии и т.д.

Гормон роста секретируется передней долей гипофиза. Недостаток гормона роста у взрослых приводит к умеренному ожирению, астении и ослаблению сердечных сокращений. Человеческий гормон роста может синтезироваться технологией рекомбинантных ДНК. Пациентов с гипопитуитаризмом и тяжелым дефицитом гормона роста можно лечить человеческим гормоном роста.

Есть много других болезней ферментной недостаточности, например, без ограничения: недостаток ферментов расщепления (также известный, как болезнь Кори или Форбса), гликогенозы (например, недостаток фермента, расщепляющего гликоген), недостаточность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (G6PD), недостаточность галактозилцереамидазы (болезнь Краббе).

Не ограничиваясь какой-либо теорией, одним из возможных объяснений терапевтических или профилактических эффектов молекулярных комплексных соединений по изобретению или фармацевтических композиций, включающих эти соединения, для лечения или предотвращения болезней, таких как анемия, заболеваний, связанных с недостаточностью гормона роста и ферментной недостаточностью, может быть то, что олигомеризация иммунологически и/или биологически активных гликопротеидов, которые имеют терапевтический или профилактический эффект при таких болезнях, может усилить их эффективность по сравнению с неолигомеризованными гликопротеидами. Например, олигомеризованный гликопротеид может легче проникать к целевому месту или типу клеток, например, путем агрегации лектином в комплекс с рецепторами гликопротеида на поверхности клетки. Таким образом, предпочтительно, чтобы лектин в комплексе находился в молярном избытке. Как вариант, олигомеризованный гликопротеид может легче захватываться клетками-мишенями, или рецептором, опосредованным действием, или неопосредованным рецептором действия.

Гормоны и ферменты, которые известны в уровне техники для лечения или профилактики болезней, таких как, без ограничения: анемия, гормональные или ферментные недостаточности, могут применяться совместно с настоящим изобретением. Гормоны и ферменты, которые являются гликопротеидами (например, эритропоэтин), могут образовывать олигомеры в присутствии лектина и могут применяться совместно с настоящим изобретением. К гормонам и ферментам, которые не являются гликопротеидами, можно добавить одну или несколько углеводных групп и применять совместно с настоящим изобретением. В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает метод лечения анемии путем введения субъекту, нуждающемуся в этом, композиции, включающей одно или несколько молекулярных комплексов, где каждый комплекс включает лектин и эритропоэтин (EPO). Предпочтительно, если субъектом является человек и применяемый EPO - человеческий. EPO - гликопротеидовый гормон, продуцируемый прежде всего клетками перитубулярного капиллярного эндотелия почки. Он отвечает за регуляцию эритропоэза. В другом варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способ лечения болезни ферментной недостаточности путем введения композиции, включающей лектин и глюкоцереброзидазу. Предпочтительно, если болезнью ферментной недостаточности, которая лечится, будет болезнь Гоше.

Иммунодефицитные состояния могут быть вызваны различными причинами, включая, без ограничения: опухоль (например, тимому, болезнь Ходжкина), синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), саркоидоз и химиотерапию. Белки, которые известны как стимуляторы иммунной системы, могут применяться совместно с настоящим изобретением для лечения или предотвращения иммунодефицитного состояния. В одном варианте осуществления настоящее изобретение представляет собой способ лечения или предотвращения иммунодефицитного состояния путем введения субъекту, нуждающемуся в этом, композиции, включающей один или несколько молекулярных комплексов, где каждый комплекс содержит лектин и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF). В другом варианте осуществления настоящее изобретение представляет способ лечения или предотвращения иммунодефицитного состояния путем введения субъекту, нуждающемуся в этом, композиции, включающей один или несколько молекулярных комплексов, где каждый комплекс состоит из лектина и гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF).

5.8.4 Аутологичный вариант осуществления

Специфическая иммуногенность HSP получена не от HSP per se, а от антигенных белков, связанных с ними. В предпочтительном варианте осуществления изобретения комплексные соединения в композициях по изобретению для применения в качестве опухолевых вакцин представляют собой аутогенные комплексы, которые таким образом помогают преодолеть два из наиболее трудных препятствия для иммунотерапии опухоли. Во-первых, опухоли человека, так же как и опухоли подопытных животных, могут быть антигенно различными. Чтобы обойти это препятствие, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения лектин-HSP образуют комплексы с антигенными белками и применяются для лечения опухолей у того же самого субъекта, от которого получены белки. Во-вторых, актуальнейшие подходы к иммунотерапии опухоли сосредотачиваются на том, чтобы определять CTL-распознающие эпитопы опухолевых клеточных линий. Этот подход требует наличия клеточных линий и CTL против опухолей. Эти реагенты недоступны для подавляющего большинства опухолей человека. В одном варианте осуществления настоящего изобретения, направленном на применение аутологичных антигенных белков, иммунотерапия опухолей не зависит от наличия клеточных линий или CTL и при этом не требует определения антигенных эпитопов опухолевых клеток. Эти преимущества делают комплексы лектин-HSP, связанные с аутологичными антигенными белками, перспективными иммуногенами против опухоли.

В некоторых вариантах осуществления антигенные белки в терапевтических или профилактических комплексах могут быть получены от злокачественной ткани того же самого вида опухоли от субъекта, аллогенного субъекту, которому вводят комплексы.

5.9. Фармацевтические препараты и способы введения

Молекулярные комплексные соединения и фармацевтические композиции по изобретению могут вводиться пациенту в терапевтически эффективных дозах для лечения или облегчения состояния или болезней (например, опухолей, инфекционных болезней, анемии, иммунодефицитных состояний, недостаточности ферментов или гормонов). Терапевтически эффективная доза - это то количество комплексов, которое достаточно для уменьшения симптомов заболевания. Эффективная доза комплексов может меняться при использовании в комбинации с другим методом лечения. Адекватные и рекомендованные дозировки, соединения и способы назначения методов лечения, таких как химиотерапевтические средства, лучевая терапия и биологические/иммунотерапевтические средства типа цитокинов, известны в уровне техники (например, как описано в литературе, такой как Physicians' Desk Reference (56^th ed., 2002, 57^th ed., 2003 и 58^th ed., 2004)) и могут применяться в соответствии с инструкциями или указаниями изготовителя.

5.9.1 Эффективная доза

Токсичность и терапевтическая эффективность молекулярных комплексных соединений по изобретению могут быть определены стандартными фармацевтическими методами на клеточных культурах или подопытных животных, например, для определения LD₅₀ (дозы, смертельной для 50% популяции) и ЕD₅₀(дозы, терапевтически эффективной для 50% популяции). Отношение доз токсических и терапевтических эффектов - это терапевтический индекс, он может быть выражен как отношение LD₅₀/ЕD₅₀. Предпочтительны комплексы, которые имеют большие терапевтические индексы. В то время как комплексы, имеющие токсические побочные эффекты, могут быть использованы, должна быть предпринята осторожность в виде разработки системы введения, при которой такие комплексы направляются непосредственно к пораженной ткани, для того чтобы минимизировать потенциальное повреждение неинфицированных клеток и, таким образом, уменьшить побочные эффекты.

В одном варианте осуществления данные, полученные в анализах на клеточных культурах и в исследованиях на животных, могут быть использованы при определении диапазона доз для людей. Дозировка комплексов находится предпочтительно в пределах диапазона циркулирующих концентраций, которые включают ED₅₀ с небольшой токсичностью или без нее. Дозировка может изменяться в пределах этого диапазона в зависимости от применяемых формы и пути введения. Для любых комплексных соединений, используемых в способе изобретения, терапевтически эффективная доза может быть оценена первоначально в анализах на клеточных культурах. Доза может быть определена на животных, чтобы получить диапазон циркулирующей в плазме концентрации, который включает IC₅₀ (то есть концентрацию тестируемого соединения, которая вызывает уменьшение максимальных симптомов наполовину), как определено в клеточной культуре. Такая информация может быть использована для более точного определения эффективных доз для людей. Уровни в плазме могут быть измерены, например, высокоэффективной жидкостной хроматографией.

В другом варианте осуществления количество молекулярных комплексных соединений по изобретению, включающих лектины и Hsp96-антигенные молекулярные комплексы, которые вводят субъекту, находится в диапазоне приблизительно от 1 нанограмма до 600 микрограммов для человека. Предпочтительная дозировка для человека та же, что применяется у 25-граммовых мышей, то есть в диапазоне приблизительно от 1 до 10 нг, около 20 нг, около 30 нг, около 40 нг, около 50 нг, около 70 нг, около 100 нг, около 200 нг, около 300 нг, около 400 нг, около 500 нг, около 600 нг, около 700 нг, около 800 нг, около 900 нг, около 1 мкг, около 10 мкг, около 25 мкг, около 50 мкг, около 100 мкг, около 200 мкг, около 300 мкг, около 400 мкг, около 500 мкг или около 600 мкг. Дозировка для молекулярных комплексных соединений по изобретению, включающих лектин, связанный с любыми другими комплексами HSP для человека, находится в диапазоне приблизительно от 5 до 5000 микрограммов, предпочтительная дозировка составляет 100 микрограммов. Эти дозы предпочтительно применяются внутрикожно, подкожно, внутримышечно, внутривенно или интраперитонеально. Эти дозы можно вводить за один или несколько раз, например ежедневно, через день, еженедельно, каждые две недели или ежемесячно. Предпочтительно комплексы вводить один раз в неделю приблизительно в течение 4-6 недель, и предпочтительно менять способ или место применения для каждого введения. Можно привести такой пример, без ограничения: первую инъекцию можно сделать подкожно на левой руке, вторую - на правой руке, третью - на животе слева, четвертую - на животе справа, пятую - на левом бедре, шестую - на правом бедре. Повторить место введения можно через одну или несколько инъекций. Кроме того, можно дробить инъекции. Например, половину дозы можно ввести в одном месте, а оставшуюся - в другом в этот же день. Также можно менять способ введения, например еженедельные инъекции делаются в последовательности: внутрикожно, внутримышечно, подкожно, внутривенно или интраперитонеально. Предпочтительно, чтобы еженедельная доза давалась в течение 4 недель. После 4-6 недель последующие инъекции предпочтительно вводятся с двухнедельными интервалами в течение одного или нескольких месяцев или пока не истощатся запасы комплексных соединений. Режим введения последующих инъекций может быть изменен в зависимости от клинического улучшения и чувствительности к иммунотерапии. В предпочтительном примере делают внутрикожные инъекции, меняя последовательно места ведения.

Изобретение предоставляет способы профилактики и лечения опухолей или инфекционных болезней, включающие введение композиции, которая стимулирует иммунную систему человека и вызывает специфический иммунитет против пренеопластических и/или неопластических клеток или инфицированных клеток.

В отдельном варианте осуществления в ходе комбинированной терапии молекулярные комплексные соединения по изобретению (например, молекулярные комплексные соединения, включающие лектин и HSP) вводятся в субоптимальном количестве, то есть в таком количестве, которое не вызывает выявляемые терапевтические эффекты, когда применяется в отсутствие других терапевтических методов, как определено методами, известными в уровне техники. В этих методах введение такого субоптимального количества молекулярного комплексного соединения по изобретению субъекту, получающему другое терапевтическое средство, приводит к полному выздоровлению. В другом отдельном варианте осуществления терапевтическое средство без применения молекулярных комплексных соединений по изобретению используется в субоптимальном количестве в ходе комбинированной терапии. В таких методах введение субоптимального количества терапевтического средства субъекту, получающему молекулярное комплексное соединение по изобретению, приводит к полному выздоровлению.

В одном варианте осуществления одно или несколько молекулярных комплексных соединений по изобретению вводятся в количестве, которое не приводит к регрессии доброкачественной опухоли или ремиссии злокачественной опухоли, или в количестве, которое не вызывает значительного уменьшения опухолевых клеток или вызывает их увеличение, если эти соединения назначаются в отсутствие другого лечебного воздействия. В другом варианте осуществления субоптимальное количество молекулярных комплексных соединений по изобретению вводят субъекту, получающему лечебное средство, посредством чего достигается полная эффективность лечения. Среди этих субъектов, получающих молекулярные комплексные соединения по изобретению, есть те, которые получают химиотерапию или лучевую терапию. Субоптимальное количество может быть определено адекватным экспериментальным исследованием. Такое субоптимальное количество для людей может быть определено экстраполяцией экспериментов на животных.

В одном варианте осуществления одно или несколько молекулярных комплексных соединений по изобретению включают лектин, связанный с гликопротеидом и антигенной молекулой, где гликопротеид не является белком теплового шока. Например, молекулярное комплексное соединение по изобретению может включать эритропоэтин (EPO). Когда EPO используется как отдельное лекарственное средство, обычная начальная доза составляет 25-30 Ед/кг на инъекцию, два или три раза в неделю. (В среднем 5000-6000 Ед в неделю.) Некоторых пациентов можно лечить еженедельно или даже каждые две недели подкожными инъекциями. Внутривенно EPO нужно вводить минимум 2 или 3 раза в неделю. Другие режимы дозирования можно найти в Physician's Desk References (56^th ed., 2002, 57^th ed., 2003 и 58^th ed., 2004).

В другом варианте осуществления молекулярное комплексное соединение по изобретению может включать тканевой активатор плазминогена (tPA) типа альтеплазы (Активаза®, Genentech). Альтеплаза - очищенный гликопротеид из 527 аминокислот. Альтеплаза применяется при остром инфаркте миокарда (ОИМ), острой ишемии и легочной эмболии. Активаза применяется внутривенно. Для лечения ОИМ есть два режима дозирования: ускоренная инфузия и 3-часовая инфузия. При ускоренной инфузии для пациентов, весящих >67 кг, 100 мг вводят: 15 мг внутривенно болюсно, 50 мг в течение следующих 30 минут и затем 35 мг в течение следующих 60 минут. Для пациентов, весящих меньше или 67 кг, рекомендованная доза вводится: 15 мг внутривенно болюсно, далее 0,75 мг/кг в течение следующих 30 минут, но не более 50 мг, и затем 0,5 мг/кг в течение следующих 60 минут, но не более 35 мг. При 3-часовой инфузии рекомендованная доза - 100 мг, вводится так: 60 мг за первый час, 20 мг за второй час и 20 мг за третий час. Режимы дозирования альтеплазы при лечении другой патологии могут также быть найдены в Physician's Desk Reference (56^th ed., 2002, 57^th ed., 2003 и 58^th ed., 2004), включенной здесь в виде ссылки.

В другом варианте осуществления молекулярное комплексное соединение по изобретению может включать гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), такой как Лейкин® (Berlex). Лейкин® может применяться, например, после индукционной химиотерапии при остром миелолейкозе, при мобилизации и после трансплантации аутогенных периферических кровяных клеток-предшественников, при восстановлении миелоидного ростка после аутогенной трансплантации костного мозга, при восстановлении миелоидного ростка после аллогенной пересадки костного мозга и при неудачной пересадке костного мозга или задержке приживления. Режимы дозирования для других патологий могут меняться. Например, когда Лейкин® применяется после трансплантации периферических кровяных клеток-предшественников, рекомендованная доза составляет 250 мкг/м²/день и вводится в/в через 24 часа или п/к один раз в день, начиная сразу после инфузии клеток-предшественников и продолжая до ANC >1500 клеток/мм³ в течение 3 последующих дней. Другие режимы дозирования могут также быть найдены в Physician's Desk References (56^th ed., 2002, 57^th ed., 2003 и 58^th ed., 2004).

В другом варианте осуществления молекулярное комплексное соединение по изобретению может включать гранулоциторный колониестимулирующий фактор (G-CSF), такой как Нейпоген®. Нейпоген® может применяться, например, у больных с опухолями, получающих миелосупрессивную химиотерапию, у пациентов с острым миелолейкозом, получающим индукционную или консолидационную химиотерапию, у больных с опухолями после трансплантации костного мозга, у пациентов, переносящих аккумуляцию или терапию периферическими кровяными клетками-предшественниками, и у пациентов с тяжелой хронической нейтропенией. Режимы дозирования различны при других патологиях. Например, больным с опухолями после трансплантации костного мозга можно назначать 10 мкг/кг/день, при в/в инфузии в течение 4 или 24 часов, или непрерывно в течение 24-часов при п/к инфузии. Другие режимы можно найти в Physician's Desk Reference (56^th ed., 2002, 57^th ed., 2003 и 58^th ed., 2004).

В другом варианте осуществления молекулярное комплексное соединение по изобретению может включать фермент, такой как глюкоцереброзидазу (Церезим®, от Genzyme), который применяется при болезнях ферментной недостаточности, например болезни Гоше. Церезим® вводится внутривенно в течение 1-2 часов. Доза должна быть индивидуальной для каждого пациента. Начальная доза составляет от 2,5 ЕД/кг веса 3 раза в неделю до 60 ЕД/кг один раз в 2 недели. Другие режимы можно найти в Physician's Desk Reference (56^th ed., 2002, 57^thed., 2003 и 58^th ed., 2004).

В различных вариантах осуществления олигомеризация с лектином в соответствии с существующим изобретением может уменьшить эффективную дозировку упомянутых лекарственных средств, например, в 1, 5, 10, 20, 50, 100 раз или больше. Когда доза лекарственного средства дается не в весовых единицах, она может быть преобразована согласно спецификации изготовителя или любым методом, известным в уровне техники, и тогда может быть соответственно рассчитано количество присутствующего лектина в молекулярном комплексном соединении.

5.9.2 Терапевтические режимы

Для любой из комбинированных терапий, описанных выше для лечения или профилактики болезней (например, опухолей, инфекционных болезней, анемии, иммунодефицитов, ферментной или гормональной недостаточностях), комплексные соединения по изобретению могут вводиться до, одновременно или после применения метода, основанного не на лектин-гликопротеиде. Метод, основанный не на лектин-гликопротеиде, может быть любым методом, описанным выше для лечения или профилактики опухолей или инфекционных болезней (или любым другим методом лечения, который является желательным для лечения или профилактики рассматриваемых болезней).

В одном варианте осуществления комплексные соединения по изобретению вводят субъекту в приемлемое время совместно с другим методом (средством). Этот метод предусматривает, что эти два воздействия применяются в пределах временного интервала от меньше одной минуты до приблизительно пяти минут, приблизительно одного часа, приблизительно 2 часов, приблизительно 3 часов, приблизительно 4 часов, приблизительно 6 часов, приблизительно 8 часов или до 12 часов друг от друга, например, в одно посещение врача.

В другом варианте осуществления комплексные соединения по изобретению и другой метод вводятся в одно и то же время. В еще одном варианте осуществления комплексные соединения по изобретению и другой метод вводятся последовательно и в пределах такого временного интервала, чтобы комплексные соединения по изобретению и другой метод могли действовать одновременно, чтобы увеличить эффект по сравнению с тем, если бы они применялись отдельно. В другом варианте осуществления комплексные соединения по изобретению и другой метод применяются через достаточно короткое время, чтобы обеспечить желательный терапевтический или профилактический результат. Каждое из них может применяться одновременно или отдельно, в любой адекватной форме и любым подходящим способом. В одном варианте осуществления комплексные соединения по изобретению и другой метод применяются разными способами. В дополнительном варианте осуществления каждое из них применяется одинаковым способом введения. Комплексные соединения по изобретению могут вводиться в одни и те же или другие места, например в руку и ногу. При одновременном применении комплексные соединения по изобретению и другой метод могут или не могут быть применены в смеси или в одном и том же месте одним и тем же способом введения.

В предпочтительном варианте осуществления комплексные соединения по изобретению применяются согласно режиму, описанному в разделе 5.9.1. В различных вариантах осуществления комплексные соединения по изобретению и другой метод применяются с интервалом времени меньше 1 часа, приблизительно в 1 час, от 1 до 2 часов, от 2 до 3 часов, от 3 до 4 часов, от 4 до 5 часов, от 5 до 6 часов, от 6 до 7 часов, от 7 до 8 часов, от 8 до 9 часов, от 9 до 10 часов, от 10 до 11 часов, от 11 до 12 часов, не более 24 часов или не более 48 часов. В других вариантах осуществления комплексные соединения по изобретению и другой метод применяются через 2-4 дня, 4-6 дней, 1 неделю, 1-2 недели, 2-4 недели, один месяц, 1-2 месяца или 2 и более месяца. В предпочтительных вариантах осуществления комплексные соединения по изобретению и другой метод применяются в таком временном интервале, когда оба активны одновременно. Такой временной интервал можно узнать определением полупериода выведения каждого применяемого компонента.

В одном варианте осуществления комплексные соединения по изобретению и другой метод применяются в течение одного посещения пациента, в отдельном предпочтительном варианте осуществления комплексные соединения по изобретению применяются до назначения другого метода. В дополнительном отдельном варианте осуществления комплексные соединения по изобретению применяются после назначения другого метода.

В определенных вариантах осуществления комплексные соединения по изобретению и один или несколько других методов (средств) применяются субъекту циклически. Циклическая терапия включает назначение комплексных соединений по изобретению на период времени, следующий за назначением другого метода, и повторение этого последовательного назначения. Циклическая терапия может уменьшить развитие устойчивости к одному или большему количеству методов, избежать или уменьшить побочные эффекты одного из методов и/или улучшить эффективность лечения. В таких вариантах осуществления изобретение рассматривает переменное назначение комплексных соединений по изобретению, сопровождаемое назначением другого метода 4-6 дней спустя, предпочтительно 2-4 дня спустя, более предпочтительно 1-2 дня спустя, где такой цикл может повторяться желательное количество раз. В определенных вариантах осуществления комплексные соединения по изобретению и один или несколько других методов поочередно применяются в цикле продолжительностью менее 3 недель, один раз в две недели, один раз каждые 10 дней или один раз в неделю. В отдельном варианте осуществления комплексные соединения по изобретению применяются субъекту в пределах временного интервала от одного часа до двадцати четырех часов после назначения другого метода (средства). Далее временной интервал может быть увеличен до нескольких дней или более, если используется медленный или непрерывный тип системы высвобождения средства.

5.9.3 Композиции и применение

Фармацевтические композиции для применения в соответствии с настоящим изобретением могут быть изготовлены обычным образом, используя один или несколько физиологически приемлемых носителей или эксципиентов.

Таким образом, комплексные соединения и их физиологически приемлемые соли и сольваты могут быть приготовлены для введения ингаляционно или вдуванием (или через рот или нос), энтерально, буккально, парентерально, внутрикожно, на слизистые оболочки, подкожно, внутривенно, ректально или трансдермально. Предусмотрены также неинвазивные способы назначения.

Для перорального приема фармацевтические композиции могут быть в виде, например, таблеток или капсул, полученных обычными средствами с фармацевтически приемлемыми эксципиентами, такими как связующие (например, предварительно желатинизированный кукурузный крахмал, поливинилпирролидон или гидроксипропилметилцеллюлоза); наполнители (например, лактоза, микрокристаллическая целлюлоза или гидрофосфат кальция); лубриканты (например, стеарат магния, тальк или кремнезем); дезинтегранты (например, картофельный крахмал или крахмалгликолят натрия); или смачивающие вещества (например, лаурилсульфат натрия). Таблетки могут быть покрыты известными в уровне техники методами. Жидкие препараты для перорального приема могут быть, например, растворами, сиропами или суспензиями, или они могут быть представлены сухим продуктом для смешивания с водой или другим подходящим носителем перед употреблением. Такие жидкие препараты могут быть приготовлены обычными средствами с фармацевтически приемлемыми добавками, такими как суспендирующие агенты (например, сироп сорбита, производные целлюлозы или гидрированные пищевые жиры); эмульгаторы (например, лецитин или акация); неводные носители (например, миндальное масло, масляные сложные эфиры, этиловый спирт или фракционированные растительные масла); и консерванты (например, метил- или пропил-п-гидроксибензоаты или сорбиновая кислота). При необходимости препараты могут также содержать буферные соли, флаворанты, красители и подсластители.

Препараты для перорального приема могут быть соответственно приготовлены для контролируемого высвобождения активных комплексных соединений.

Для буккального введения композиции могут иметь форму таблеток, приготовленных обычным способом.

Комплексные соединения для ингаляционного применения в соответствии с настоящим изобретением просто помещаются в аэрозоль-спрей с герметичными пакетами или небулайзером, с использованием подходящего пропеллента, например дихлордифторметана, дихлорфторметана, дихлортетрафторэтана, двуокиси углерода или др. В герметичном аэрозоле каждая доза может быть фиксирована за счет клапана, обеспечивающего отмеренное количество вещества. Капсулы и картриджи для использования в ингаляторе или инсуффляторе могут готовиться, например, из желатина и содержать комплексные соединения в виде порошка и подходящую порошковую основу, такую как лактоза или крахмал.

Комплексы могут быть приготовлены для парентерального введения, например, болюсной инъекцией или длительной инфузией. Инъекционные соединения могут быть представлены в форме дозированных единиц, например, в ампулах или в мультидозовых контейнерах с добавлением консерванта. Композиции могут иметь такие формы, как суспензии, растворы или эмульсии на масляных или водных основах, и могут содержать рецептурные средства, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие вещества. Как вариант активный ингредиент может быть в форме порошка для восстановления с подходящим носителем перед использованием, например стерильной апирогенной водой.

Комплексы могут также быть приготовлены в виде ректальных композиций, таких как свечи или лечебные клизмы, например, содержащих обычные основы свечей типа какао масла или других глицеридов.

В дополнение к композициям, описанным выше, комплексы могут также быть приготовлены как препараты-депо. Такие длительно действующие композиции могут имплантироваться (например, подкожно или внутримышечно) или вводиться инъекцией внутримышечно. Таким образом, например, комплексы могут быть приготовлены вместе с подходящими полимерными или гидрофобными материалами (например, такими как эмульсия в подходящем масле) или ионообменными смолами или приготовлены как умеренно растворимые производные, например умеренно растворимая соль.

При необходимости композиции могут быть помещены в пакет или распределительное устройство, которые могут содержать одну или несколько единичных дозированных форм, содержащих активный ингредиент. Пакет может быть, например, из металла или пластиковой пленки, такой как прозрачная упаковка. Пакет или распределительное устройство могут сопровождаться инструкциями по применению.

Также рассмотрено использование адъювантов в комбинации или в смеси с комплексными соединениями по изобретению. Рассмотренные адъюванты включают, без ограничения: адъюванты на основе минеральных солей или геля минеральных солей, корпускулярные, микрокорпускулярные, мукозальные и иммуностимулирующие адъюванты, такие как описанные в разделе 5.8. Адъюванты могут вводиться субъекту в смеси с комплексными соединениями по изобретению или использоваться в комбинации с комплексными соединениями, как описано в разделе 5.9.2.

Также рассмотрено использование аденозина бифосфата (АДФ) в комбинации или в смеси с комплексными соединениями по изобретению, предпочтительно gp96 комплексами.

5.9.4 Наборы

Изобретение также предоставляет наборы для осуществления терапевтических режимов по изобретению. Такие наборы включают в одной или нескольких емкостях терапевтически или профилактически эффективные количества молекулярных комплексных соединений по изобретению в фармацевтически приемлемой форме. Молекулярный комплекс во флаконе набора изобретения может быть в форме фармацевтически допустимого раствора, например, в комбинации со стерильным солевым раствором, раствором декстрозы, или буферным раствором, или другой фармацевтически приемлемой стерильной жидкостью. Как вариант, комплексное соединение может быть лиофилизировано или высушено; в этом случае набор дополнительно включает емкость с фармацевтически приемлемым раствором (например, солевым раствором, раствором декстрозы и т.д.), предпочтительно стерильным, чтобы восстановить раствор комплексного соединения для инъекции.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает наборы, состоящие из множества емкостей, каждая из которых содержит фармацевтическую композицию, включающую дозу молекулярных комплексных соединений по изобретению, достаточную для одного терапевтического или профилактического назначения. Изобретение также предусматривает наборы, состоящие из емкости, содержащей иммунологически и/или биологически активный гликопротеид или его комплексные соединения, и емкости, содержащей лектин. Дополнительно в наборы могут быть включены инструкции по приготовлению олигомеризованных комплексных соединений согласно способам изобретения.

В отдельном варианте осуществления набор состоит из первой емкости, содержащей очищенное молекулярное комплексное соединение; и второй емкости, содержащей другое лечебное средство в количестве, которое, когда применяется до, одновременно, или после назначения молекулярного комплексного соединения первой емкости, вызывает более выраженный эффект лечения или в большей степени уменьшает побочные эффекты (например, по сравнению с наблюдаемыми побочными эффектами) по сравнению с тем, если бы каждое из этих средств применялось раздельно. В предпочтительном отдельном варианте осуществления изобретение рассматривает набор, содержащий первую емкость с очищенным молекулярным комплексным соединением по изобретению, включающим совокупность нековалентных пептидных комплексов, полученных из ткани злокачественной опухоли млекопитающих и олигомеризованных в присутствии Con A; вторую емкость с композицией, включающей очищенное противоопухолевое химиотерапевтическое средство; и третью емкость с композицией, включающей очищенный цитокин.

5.10. Контроль эффектов в ходе лечения

Эффект лечения молекулярными комплексными соединениями по изобретению можно контролировать любыми известными в уровне техники методами. Например, улучшение или ухудшение состояния и/или лабораторных показателей, результатов дополнительных методов исследования или ухудшение различных биохимических проб можно использовать для контроля эффекта лечения.

Эффект лечения молекулярными комплексными соединениями по изобретению развития и прогрессирования пренеопластических заболеваний можно контролировать любыми известными в уровне техники методами, включая измерение: а) гиперчувствительности, как исследование клеточного иммунитета; b) активности цитолитических Т-лимфоцитов in vitro; c) уровней специфических опухолевых антигенов, например карциноэмбриональных (CEA) антигенов; d) изменений в морфологии опухолей, используя методики, такие как компьютерное томографическое (КТ) сканирование; e) изменений уровней предполагаемых биомаркеров риска для специфических опухолей у субъектов с высоким риском, и f) изменений в морфологии опухолей, используя сонограмму.

5.10.1 Кожная проба на повышенную чувствительность

Кожные пробы на повышенную чувствительность имеют большое значение для определения иммунокомпетенции и клеточного иммунитета к антигену. Неспособность реагировать на совокупность общих дермальных антигенов называют анергией (Sato, T., et al., 1995, Clin. Immunol. Pathol, 74:35-43).

Надлежащая методика кожной пробы требует, чтобы антигены были сохранены стерильными при 4°C, защищены от света и восстановлены непосредственно перед использованием. Игла 25 или 27 калибра гарантирует скорее внутрикожное, чем подкожное введение антигена. Через 24 и 48 часов после внутрикожного введения антигена линейкой измеряются наибольшие размеры эритемы и индурации. Гипореактивность к любому данному антигену или группе антигенов подтверждается пробой с более высокими концентрациями антигена или, при неоднозначных результатах, повторной пробой с промежуточной пробой.

5.10.2 Активация цитотоксических Т-клеток in vitro

8×10⁶ Т-лимфоцитов, полученных из периферической крови, изолированных центрифугированием в градиенте Ficoll-Hypaque, повторно стимулируются 4×10⁴ опухолевыми клетками, обработанными митомицином C, в 3 мл питательной среды RPMI, содержащей 10% сыворотки эмбриона теленка. В некоторых экспериментах 33%-ный вторично смешанный супернатант культуры лимфоцитов или IL-2 включен в питательную среду как источник факторов роста Т-лимфоцтов.

Чтобы измерить первичную реакцию цитолитических Т-лимфоцитов после иммунизации, Т-клетки культивируют без стимулятора опухолевых клеток. В других экспериментах Т-клетки повторно стимулируют антигенно различными клетками. Через шесть дней культуры проверяют на цитотоксичность в 4-часовом анализе по высвобождению ⁵¹Cr. Спонтанное высвобождение ⁵¹Cr должно достигнуть уровня менее 20%. Для анти-MHC класса I, блокирующего активность, десятикратно концентрированный супернатант гибридомы W6/32 добавляют к пробе в конечной концентрации 12,5% (Heike M., et al., J. Immunotherapy, 15:165-174).

5.10.3 Уровни специфических опухолевых антигенов

Хотя, возможно, не получится обнаружить уникальные опухолевые антигены во всех опухолях, многие опухоли имеют антигены, которые отличают их от нормальных клеток. Реактивы моноклональных антител позволили изолировать и биохимически исследовать антигены, и они неоценимы для диагностики трансформированных и нетрансформированных клеток и определения их происхождения. Лучше всех описаны человеческие ассоциированные с опухолью антигены - онкофетальные антигены. Эти антигены определяются на протяжении эмбриогенеза, но отсутствуют или их очень трудно обнаружить в нормальной зрелой ткани. Прототип антигена - карциноэмбриональный антиген (CEA), гликопротеид, найденный в кишке эмбриона и на раковых клетках ободочной кишки человека, но не на нормальных зрелых клетках ободочной кишки. Раньше предполагали, что после попадания и нахождения в сыворотке CEA раковых клеток ободочной кишки определение этого антигена в сыворотке можно использовать для скрининга пациентов на предмет рака ободочной кишки. Однако пациенты с другими опухолями, такими как рак поджелудочной железы и рак молочной железы, также имеют повышенные уровни CEA в сыворотке. Тем не менее, контроль уменьшения и повышения уровней CEA у больных с опухолями, получающих терапию, оказался полезным для предсказывания прогрессирования опухоли и реакции на лечение.

Несколько других онкофетальных антигенов были полезны для диагностики и контроля опухолей человека, например альфа-фетопротеин, альфа-глобулин, обычно секретируемый печенью эмбриона и клетками желточного мешка, найден в сыворотке пациентов с опухолями печени и половых клеток и может использоваться как маркер болезни.

5.10.4 Компьютерное томографическое (КТ) сканирование

КТ остается методом выбора для точного определения стадии опухоли. КТ оказалась более чувствительной и специфичной, чем любые другие методики по обнаружению метастазов.

5.10.5 Измерение предполагаемых биомаркеров

Для контроля эффекта молекулярного комплексного соединения по изобретению измеряют уровни предполагаемого биомаркера риска специфической опухоли. Например, у субъектов с повышенным риском развития рака предстательной железы измеряют серологический специфический антиген предстательной железы (PSA) в соответствии с процедурой, описанной Вrawer, M.K., et al., 1992, J. Urology, 147:841-845 и Catalona, W.J., et al., 1993, JAMA, 270:948-958; или у субъектов с риском развития колоректального рака измеряют CEA, как описано выше в разделе 5.10.3; и у субъектов с повышенным риском развития рака молочной железы измеряют 16-гидроксилированный эстрадиол в соответствии с процедурой, описанной Schneider, J. et al., 1982, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 79:3047-3051.

5.10.6 Сонограмма

Сонограмма остается альтернативным методом выбора для точного определения стадии опухолей.

6. ПРИМЕР 1: СТОЙКО ПОВЫШЕННЫЕ УРОВНИ CON A УЧАСТКОВ GP96-ПЕПТИДНОГО КОМПЛЕКСА У ЧЕЛОВЕКА

Гомогенаты тканей от четырех независимых образцов опухолей почек человека (от А до D) были приготовлены и пропущены через хроматографическую колонку Con A. Половина экстракта из Con A была отложена. Оставшаяся половина была подвергнута обмену буфера PBS (колонка PD-10), и затем оба образца были очищены в отдельных колонках DEAE, таким образом было получено два гомогенат-соответственных конечных продукта: один - полученный без буферного обмена (не Bx) между Con A и DEAE колонками и один - полученный через стадию буферного обмена (Вх) между этими двумя колонками. Затем использовался чувствительный ELISA для обнаружения Con А, чтобы определить концентрацию Con А в этих отдельных образцах gp96-пептида.

Конканавалин А-специфичный ELISA

Материалы: Конканавалин A был от Sigma, Каталог # C7275. Иммобилизованное антитело: мышиный анти-Con А Cat# MAB 158 Maine Biotechnology, первичное антитело: кроличий анти-Con A Cat# C7401 Sigma; антитело обнаружения: козий антикроличий IgG-HRP Cat# 111-035-144 Jackson ImmunoResearch. 0,1M NaHCO₃, pH 9,6. Моющий буфер PBST PBS+0,05% твин 20. Блокирующий буфер: 2%-ное обезжиренное сухое молоко в буфере для промывания (PBST). Метил a-D-маннопиранозид (ММ), USB Cat# 19115. Типовой растворитель: PBS плюс 1% BSA и 10% MMP. TMB субстрат для микроячейки, Cat# 50-76-05 KPL. Стоп раствор, Cat#50-85-05 KPL.

Методы: чашки были покрыты 2 мкг/мл мышиным анти-Con A в 0,1M NaHCO₃, рН 9,6, и культивированы в течение ночи при 4°C. Чашка была промыта (PBS-Tween) и впоследствии блокирована (1% BSA/PBS) при 37°C в течение 1 часа и затем промыта. Образцы и стандарты были приготовлены в типовом растворителе и помещены в ячейки в двойной повторности по 100 мкл на ячейку, культивированы (при 37°C в течение 1 часа), и планшеты были промыты. Кроличьи анти-Con A в 1% BSA+10%, а-ММ были добавлены, и планшеты культивированы при 37°C в течение 1 часа и затем промыты. Козьи антитела обнаружения антикроличьей пероксидазы IgG-хрена 1:5000 были добавлены в блокирующий буфер, и планшета культивирована в течение получаса при комнатной температуре и затем вымыта. Затем субстрат TMB был добавлен к каждой ячейке, планшета культивирована (комнатная температура, 10 минут), добавлен стоп раствор, и планшеты были подсчитаны при 450 нм.

Результаты: очищенный от общего гомогената gp96 в процессе, включающем этап буферного обмена, имел более высокие уровни Con A, чем полученный соответственно образец гомогената gp96 без буферного обмена (фиг.1).

7. ПРИМЕР 2: CON A ПРИСУТСТВУЕТ В ОЛИГОМЕРИЗОВАННОМ МОЛЕКУЛЯРНОМ КОМПЛЕКСЕ

Общий гомогенат от ткани химически индуцированной мышиной фибросаркомы (Meth A) был приготовлен и пропущен через хроматографическую колонку Con A. Половина экстракта из Con A была отложена. Оставшаяся половина была обработана буфером обмена PBS, и затем оба образца очищены в отдельных колонках DEAE, получено два гомогенат-соответствующих конечных продукта - один, полученный без буферного обмена (не Bx), и один, полученный с этапом буферного обмена (Bx) между Con А и DEAE колонками. Оба образца, наряду с образцом свободного Con A (5 мкг, 50 мкг/мл), были SEC фракционированы на колонке Superdex 200 (верхний, средний, нижний соответственно). Собранные фракции были проанализированы SDS-PAGE на gp96 (фракции 1-8; вставка), и содержание Con A в индивидуальных фракциях оценено прямой ELISA против Con A (фракции 1-14; наложение) (для прямой ELISA против Con A, см. пример 1). Немного Con А было найдено в препарате не Вх-gp96, в то время как было показано, gp96, полученный с Вх, имеет Con A во фракциях 1-5. Свободный Con A, элюированный намного позже предложенного Con A, присутствующего в образце Вх-gp96, был не свободным, а связанным с частицами с более высоким молекулярным весом.

Чтобы подтвердить, что gp96 был олигомеризован Con А, общий гомогенат ткани Meth А-индуцированной мышиной фибросаркомы был приготовлен и обработан процессом, включающим хроматографию через колонки Con А и DEAE. Окончательно очищенный gp96 препарат был разделен на две части. К одной половине материала был добавлен экзогенный Con A в конечной концентрации 50 мкг/мл; ко второй половине был добавлен только буфер для контроля, оба образца культивировались при 37°C в течение 2 часов и затем подвергнуты SEC фракционированию (Superdex 200). Индивидуальные фракции были проанализированы с помощью SDS-PAGE и gp96- и con А-специфичной ELISA. Аналитические данные для материала, полученного без этапа буферного обмена показаны на левой панели; то, к чему был добавлен con А - направо. На левой панели пик gp96 находится во фракции 5, а уровни con А, как определено специфическим ELISA, расположены ниже. На правой панели (con А добавлен) очевидны два пика gp96, как показано SDS-PAGE (вставка; пиковые фракции 3 (стрелка) и 5), и gp96 ELISA (фракции 3 и 5) так же, как явный пик Con A в центре фракции 3. Con A вызывает сдвиг в позиции элюирования gp96.

8. ПРИМЕР 3: ОЛИГОМЕРИЗАЦИЯ КОРРЕЛИРУЕТ С АКТИВНОСТЬЮ IN VITRO И IN VIVO

8.1. Содержание Con A коррелирует с активностью in vitro для образцов человеческого gp96

Образцы gp96 от четырех независимых образцов опухоли почек человека (от А до D) были приготовлены, как описано выше (см. фиг.1), получены четыре парные пробы, отличающиеся только по включению или отсутствию этапа буферного обмена между Con А и DEAE колонками. Все восемь образцов были исследованы на предмет содержания Con A (панель A; также см. фиг.1) наряду с представлением антигена in vitro, используя систему CD71 (панель B). В каждом случае материал, приготовленный в процессе, включающем этап буферного обмена (и содержащий повышенные уровни Con A), имел более высокую представительную активность in vitro, чем образец, полученный от соответствующего гомогената опухоли и приготовленный без этапа буферного обмена.

Анализ представления CD71 in vitro

Материалы: в этих экспериментах использовалась линия антиген-представляющих клеток, RAW264.7 (ATCC #TIB-71). Это вирус лейкоза мышей Abelson, трансформировавший линию макрофагальных клеток, которая происходит от штамма BALB/c (H-2^d). Т-клеточная гибридома была получена слиянием Т-клеток BALB/c, специфичных для человеческого CD71 9-мера с BWαβ-клетками тимомы. Т-клетки были слиты с BWαβ-клетками PEG и были собраны в питательной среде HAT. Клетки T-T гибридомы были затем отобраны по специфичности к 9-мерам CD71 измерением продукции IL-2 пролиферирующими клетками HT-2 после стимуляции антигеном. Используемая питательная среда была RPMI 1640 (Gibco-BRL). Человеческий gp96 был очищен от опухолей почек человека, используя как Вх-, так и не-ВХ-процессы, а также метод scFv-столбца, как описано (Arnold-Schild et al., выше). Мышиные gp96-CT26, очищенные от опухоли CT26, используя тот же самый протокол очистки как пробный образец, и мышиный CD71 9-мерный пептид (TYEALTQKV) использовались как негативные антигенные контроли. Человеческий 9-мер CD71 (TYKELIERI) использовался как позитивный антигенный контроль.

Препарат gp96, полученный из опухоли человека: человеческий gp96 был очищен от опухолей почек человека. Опухоли были гомогенизированы и очищены центрифугированием. Бесклеточный супернатант был подвергнут преципитации 50%-ным сульфатом аммония. Окончательный супернатант был далее очищен, используя ConA и DEAE хроматографию. Белок был стерилизован фильтрованием (0,22 мкм), и определенное количество сохранено при -80±20°C до использования.

Представительное исследование: в 96-луночном планшете с плоским дном были культивированы человеческие CD71-специфичные Т-клеточные гибридомы (5×10⁴) совместно с клетками RAW264.7 (5×10⁴). Желаемые концентрации человеческого gp96, титрованные, начиная от 150 мкг/мл и ниже, были добавлены в трех повторностях. Соответственно, были добавлены позитивные и негативные контроли, и объем питательной среды был отрегулирован для достижения окончательного объема 200 мкл. В дополнение к испытательной чашке, содержащей как Т-клеточные гибридомы, так и APC, чашки, содержащие только Т-клеточные гибридомы или только APC, были добавлены как контроли. Содержимое чашек было немного перемешано постукиванием перед помещением в термостат с 5% CО₂ при 37°C на 20 часов. После инкубации клетки были осаждены при 1000 оборотов/мин в течение 5 минут при 4°C. Супернатанты были перемещены в 96-луночный планшет с круглым дном и проверены на продукцию IL-2 ELISA (R&D).

8.2. Содержание Con A коррелирует с активностью in vivo в мышиной системе СТ26

Образцы gp96 от двух независимых образцов мышиной опухоли CT26 (препараты A и B) были приготовлены, как описано выше для образцов, полученных из человеческой опухоли (см. фиг.1). Все четыре образца были исследованы на содержание con A (панель A) и на представление антигена in vitro, используя систему CT26 (панель В). В каждом случае материал, приготовленный в процессе, включающем этап буферного обмена (и имеющий повышенное количество con A), имел более высокую представительную активность in vitro, чем образец, полученный от гомогената соответствующей опухоли и приготовленный в процессе без этапа буферного обмена.

In vitro анализ представления антигена CT26

Материалы: в этих экспериментах использовалась антиген-представляющая клеточная линия, RAW264.7 (ATCC #TIB-71). Это трансформированная вирусом мышиного лейкоза Abelson макрофагальная клеточная линия, происходящая от штамма BALB/c (H-2d). Цитотоксические Т-лимфоциты (CTL): Т-клетки, специфичные для пептида опухоли CT26 были получены из Университета медицинского центра штата Коннектикут. Эти Т-клетки специфичны для эпитопа AH1, последовательности аминокислот SPSYVYHQF. Эти CTL рестимулированы на недельной основе с 9-мерным пептидом AH1 плюс облученными спленоцитами BALB/c. Использовалась AIM V (Gibco-BRL) тканевая питательная среда. Это питательная среда, очищенная от сыворотки, не содержит протеаз. Протеазы в ней нежелательны из-за того, что они могут разложить длинные пептиды до меньшего размера, тем самым способствуя отложению их на поверхности молекул MHC, стимулируя реакцию CTL, независимую от антигенного представления. gp96, полученный от CT26, был очищен от опухолей мыши, используя процессы как с буферным обменом, так и без него. Только 19-мер AH1 (RVTYHSPSYVYHQFERRAK) был добавлен как негативный контроль, так же как gp96, полученный из нормальных органов мыши. 9-мер AH1 (SPSYVYHQF), который может адсорбироваться на поверхности и активизировать для распознавания CTL, использовался как позитивный контроль. Дополнительный позитивный контроль включал полученный от мыши комплекс gp96 с 19-мерным пептидом АН1.

Методы

Приготовление gp96, полученного из CT26: gp96, полученный из CT26, был очищен от солидных опухолей. Опухоль мыши была гомогенизирована и очищена центрифугированием. Бесклеточный супернатант был подвергнут преципитации 50%-ным сульфатом аммония. Окончательный супернатант был дополнительно очищен, используя Con A и DEAE хроматографию. Белок был стерилизован фильтрованием (0,22 мкм), и определенное количество сохранено при -80±20°C до использования.

Приготовление 19-мерных комплексов gp96-AH1 (комплексных позитивных контролей): 19-мерный пептид AH1, растворенный в H₂O, был добавлен к gp96 в мольном отношении 50:1. Образцы были смешаны в 15 мл конической пробирке в объеме приблизительно от 1 до 2 мл в зависимости от того, из какого количества белка был образован комплекс, и помещены при 37°C на полчаса. После инкубации образцы были промыты 4X по 5 мл PBS, используя фильтр 30К MWCO Centricon (Millipore), и проанализированы на концентрацию белка анализом по Бредфорду.

Подготовка 9-мера AH1 (испытательных позитивных контролей): 9-мер AH1 может быть нагружен непосредственно на молекулы MHCI, поэтому использовался как позитивный контроль, чтобы непосредственно стимулировать Т-клетки, не обрабатывая их APC.

Негативные контроли включали не связанный в комплекс gp96 или чистый 19-мерный пептид, растворенный в PBS в той же молярной концентрации.

Анализ представления: AH1-пептид-специфичные Т-клетки (через 8 дней после стимуляции) были промыты 3X, чтобы удалить APC, и ресуспендированы в среде AIM V при 2×10⁵ клетки/мл. Клетки RAW 264.7 использовались как APC и были промыты один раз в DMEM плюс 10% PCS, перед ресуспендированием при 2×10⁵ клеток/мл в AIM V. В 96-ячеечном планшете с круглым дном образцы gp96, полученного из CT26, были добавлены в четырех повторностях, и были сделаны два закрытых серийных разведения (200 мкг/мл-6,25 мкг/мл). Соответствующие позитивные и негативние контроли были добавлены для достижения итогового объема AIM V 250 мкл. В каждой ячейке 1×10⁴ Т-клетки культивировались совместно с равным числом APC. Чашки, содержащие только Т-клетки, использовались как контроли. Чашки были культивированы при 37°C в 5% CO₂ в течение 18 часов.

После инкубации клетки были осаждены центрифугированием при 1000 об/мин в течение 5 минут при 4°C. Супернатанты были перемещены в 96-ячеечные планшеты с плоским дном для ELISA и сохранены при -20°C. Уровни IFN-γ были измерены ELISA (R&D системы).

8.3. Содержание Con A коррелирует как с представительным анализом Meth А in vitro, так и с активностью в модели защиты мышиной опухоли Meth А in vivo

Два отдельных препарата Meth А gp96 были приготовлены из общего гомогената опухоли (описано выше), из них произведена пара образцов, отличающихся только по включению или отсутствию этапа буферного обмена между Con А и DEAE колонками. Эти образцы были испытаны Con A ELISA на содержание Con A (панель A), in vitro активность в Meth А представительного анализа (панель B) и in vivo в Meth А анализа защиты опухоли в дозе 10 мкг (панель C). Meth А gp96, приготовленный в процессе с этапом буферного обмена между Con А и DEAE колонками, имел повышенное содержание Con А, выше в in vitro антигенном представлении и выше in vivo активности по защите опухоли, чем приготовленный в процессе без этапа буферного обмена.

Meth А представление антигена in vitro

Материалы: облученные спленоциты BALB/c использовались как антиген-представляющие клетки (APC). Использовался Meth А специфичный клон CD4+ Т-клеток, 24D3. Они ограничиваются молекулой MHCII I-Ed и специфичны для антигенного пептида, содержащегося в последовательности EYELRKHNFSDTG. Питательная среда, используемая для этого анализа, была RPMI1640 (Gibco-BRL). gp96 был очищен от Meth А мышиных опухолей, используя как Вх, так и не-Вх процессы. Первоначальная форма L11 пептида (EYELRKNNFSDTG) использовалась как негативный контроль, и видоизмененная форма L11 пептида (EYELRKHNFSDTG) использовалась как позитивный контроль.

Методы

Подготовка gp96, полученного из Meth А: gp96, полученный из Meth А, был очищен от солидных опухолей. Опухоль мыши была гомогенизирована и очищена центрифугированием. Бесклеточный супернатант был подвергнут преципитации 50% сульфатом аммония. Окончательный супернатант был дополнительно очищен, используя Con А и DEAE хроматографию. Белок был стерилизован фильтрованием (0,22 мкм), и определенное количество сохранено при -80±20°C до использования.

Анализ представления: 2×10⁴ Meth А специфичные клоны CD4+ Т-клеток (24D3) были культивированы с 5×10⁵облученными BALB/c селезеночными APC в присутствии различных концентраций gp96, полученного из Meth A или других источников (100, 50, 25, 12,5, 6,25 мкг/мл конечные концентрации), в течение 48-72 часов в 96-ячеечных планшетах с плоским дном в конечном объеме 200 мкл. Первоначальный тип рибосомального белка L11 и видоизмененный рибосомальный белок L11 были добавлены в репликационные ячейки и использовались как негативные контроли или позитивные контроли соответственно. После 48-72 часов инкубации при 37°C, при 5% CO₂ были взяты 100 мкл супернатанта, и измерена продукция IL-5 ELISA.

In vivo анализ ингибирования опухоли Meth А

In vivo анализ ингибирования роста Meth А: мыши BALB/c (n=30/группа) были иммунизированы в 0 и 7 день 10 или 50 мкг gp96 внутрикожно. В 14 день исследования мышам было введено 1×10⁵ клеток Meth А внутрикожно в полном объеме 100 мкл. Контроль растущих опухолей производился в течение последующих четырех недель. Все животные были умерщвлены на 41 день исследования после заключительного измерения опухоли. Полученные данные - это процент животных, не имеющих опухоль на 41 день исследования. Контрольные группы включали неиммунизированных (растворитель - негативный контроль) и иммунизированных облученными клетками Meth А (позитивный контроль) животных.

9. ПРИМЕР 4: ЭКЗОГЕННЫЙ CON A УВЕЛИЧИВАЕТ АКТИВНОСТЬ GP96 В АНАЛИЗЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ CD71 IN VITRO

Ткань печени человека была гомогенизирована и центрифугирована, таким образом был получен 11К супернатант, который был разделен на 3 идентичных образца и обработан различными методами.

Два образца были пропущены через хроматографическую колонку Con A (см. раздел 5.13), половина экстракта из Con A была отложена. Оставшийся образец был обработан буфером обмена (см. раздел 5.13) PBS, и затем оба образца очищены в отдельных колонках DEAE, таким образом произведено два гомогенат-соответственных конечных продукта: один, произведенный без буферного обмена (не-Вх - образец A) и один, произведенный с этапом буферного обмена (Вх - образец B) между Con A и DEAE столбцами (фиг.7).

Оставшийся 11К супернатант использовался, чтобы очистить gp96, используя gp96-специфичную scFv колонку, как описано в “Cancer research” Arnold-Schild et al., 2000, 60 (15):4175-4178 (далее как " Arnold-Schild"), включена здесь в виде ссылки в полном объеме. Очистка была сделана следующим образом: пять мг scFv анти-gp96 были соединены с 0,5 мг CNBr-активизированной Сефарозы (Pharmacia) (Для продукции scFv анти-gp96, см. Arnold-Schild, или это может быть сделано любым известным в уровне техники методом.). 11К супернатанты были нанесены на scFv анти-gp96 колонку. После тщательного промывания в PBS gp96 элюировался с PBS, 1,3М NaCl, 10 мМ натрия ацетата (рН 7,2).

Все образцы были проанализированы на концентрацию con A при помощи con A специфичной ELISA. Экзогенный con A (7,5 нг con A/мкг общего количества белка) был добавлен к обоим образцам A и D до уровней, эквивалентных им в образце B) и для in vitro представления антигена в системе CD71 в концентрации белка 75 мкг/мл. Для соответствующих пар образцов материал, полученный в процессе с этапом буферного обмена (образец #1; содержание con A 7,5 нг/мкг общего количества белка) был более активным in vitro, чем материал, полученный в процессе без этапа буферного обмена (образец A; содержание con A 0,43 нг/мкг общего количества белка) (фиг.7). Материал, полученный одномоментным методом без этапа очистки на колонке con A (scFv gp96; 0 нг/мкг), имел низкую in vitro активность, подобно образцу А (фиг.7). Добавление экзогенного con A к образцам A и C до уровней, эквивалентных им в образце B (7,5 нг con A/мкг общего количества белка), увеличило специфичную in vitro активность представления антигена до уровня, подобного ему в образце B (фиг.7). Этот уровень con A сам по себе не имел никакого влияния на Т-клетки.

10. ПРИМЕР 5: ОЛИГОМЕРНЫЕ РАЗНОВИДНОСТИ - ЧУВСТВИТЕЛЬНЫЙ МЕТИЛ АЛЬФА-D-МАННОПИРАНОЗИД (АЛЬФА-ММ)

Meth А gp96 образец был очищен стандартным процессом очистки, включающем Con А и DEAE хроматографию, и белок был проанализирован аналитическим SEC, используя колонку Superose 6 (Pharmacia), который показал препарат белка, содержащий первично димерный gp96 (gp96 T=0). Con А был добавлен (50 мкг/мл в итоге) к кратному ему gp96 образцу (концентрация 500 мкг/мл), образец культивирован, и почасовые образцы были взяты (от T=1 до T=5) и проанализированы SEC. Также использовался образец, включающий только con A. Добавление Con A опосредовало сдвиг в позиции элюирования пика димера gp96, который изменился только немного после первого пункта. gp96 один не менял в большую сторону этот интервал времени (gp96 T=5). После заключительной точки времени два отдельных определенных количества итогового пятичасового образца были взяты, и к ним добавлен равный объем PBS или PBS, содержащего 10% α-ММ. Каждый образец был затем повторно проанализирован SEC. Никаких изменений не было замечено в образце, к которому был добавлен PBS (не показано). Добавление α-ММ диссоциировало высокомолекулярные комплексы (gp96+con А T=5+α-MM), что привело к тому, что профиль SEC стал сходен с оригинальным gp96 образцом (gp96 T=0 или T=5).

11. ПРИМЕР 6: НИЗКИЕ СТЕХИОМЕТРИИ CON A:GP96 ОПОСРЕДУЮТ SEC-ЧУВСТВИТЕЛЬНЫЙ СДВИГ В ПОЗИЦИИ ЭЛЮЦИИ GP96

Gp96 опухоли почки человека был очищен стандартным процессом очистки, включая Con А и DEAE хроматографию, и белок был проанализирован аналитическим SEC, используя колонку Superose 6 (Pharmacia). Con А был добавлен к конечной концентрации 0,005-50 мкг/мл к gp96 (180 мкг/мл), образец культивирован при комнатной температуре в течение 1 часа и проанализирован SEC. Стехиометрии приблизительно 1Con A: 10 gp96 в состоянии произвести SEC чувствительный сдвиг в позиции элюирования gp96.

12. ПРИМЕР 7: ДОБАВЛЕНИЕ МЕТИЛ АЛЬФА-D-МАННОПИРАНОЗИДА ВЫЗЫВАЕТ КОНЦЕНТРАЦИОННО ЗАВИСИМОЕ УМЕНЬШЕНИЕ АКТИВНОСТИ АНТИГЕННОГО ПРЕДСТАВЛЕНИЯ CT26 IN VITRO

Образец gp96, полученного из CT26 (приготовленного Вх процессом), наряду с позитивным контролем 9-мерного пептида (SPSYVYHQF), был культивирован в течение 30 минут в присутствии 50, 100 или 400 мM α-ММ до разбавления (1 к 5) в ячейках планшета микротитратора, содержащих RAW264.7 APC клетки и АН1 специфичные Т-клетки. Образцы были культивированы в течение ночи и окончательные супернатанты проанализированы INF-γ специфичным ELISA. α-ММ вызвал дозозависимое уменьшение представления антигена CT26 и не оказывал эффект на Т-клеточное распознавание позитивного контроля 9-мерного пептида. Этот уровень α-ММ не действует на жизнеспособность APC или Т-клеток.

13. ПРИМЕР 8: CON A УСИЛИВАЕТ ОТТОРЖЕНИЕ ОПУХОЛИ HSPPC-96

13.1. Con A, добавленный в процессе очистки gp96, увеличивает активность очищенного конечного продукта

Gp96, полученный из Meth А, был приготовлен с различными уровнями Con A в конечном продукте путем добавления Con A в процессе очистки. Все образцы были исследованы Con A ELISA на содержание Con A (измеренная концентрация Con A в нг, Con A/мкг для каждого образца обозначен на фигуре) и на отторжение опухоли in vivo. Фиг.11 показывает результаты исследования противоопухолевого действия Meth А in vivo. Добавление Con A в процесс вызывает титруемое увеличение противоопухолевой активности HSPPC-96.

Методы

Приготовление gp96, полученного из Meth А, и добавление в процесс Con A: образец опухоли Meth А был гомогенизирован (30 мM буфера фосфата натрия, рН 7,2, содержащий 2 мM MgCl₂ и 2 мM AEBSF), очищен центрифугированием, добавлен твердый сульфат аммония до 50%, образец центрифугирован снова, и супернатант помещен непосредственно в Con A колонку. На данном этапе экстракт из Con A был пропущен через фосфатный буфер обмена ("PBS") и разделен на 6 идентичных образцов. Один образец был обработан немедленно помещением на ("DEAE") колонку, промыванием этого образца с 10 мM фосфата натрия, 260 мM NaCl и элюированием с 10 мM фосфата натрия, 700 мM NaCl (Стандартная процедура). К оставшимся пяти был добавлен экзогенный Con A (уровни от первого до пятого: 3 мкг/мл, 10 мкг/мл, 30 мкг/мл, 100 мкг/мл и 300 мкг/мл соответственно). Затем все образцы были очищены на колонке DEAE, как описано выше. Все экстракты из DEAE были впоследствии пропущены через буфер обмена 9% сахарозы - фосфат калия, рН 7,4.

Исследование ингибирования роста Meth А in vivo: мыши BALB/c (n=10/группа) были иммунизированы в 0 и 7 день по 10 мкг gp96 внутрикожно. В 14 день исследования мышам было введено 1×10⁵ клеток Meth А внутрикожно в полном объеме 100 мл. Контроль растущих опухолей производился в течение последующих четырех недель. Все животные были умерщвлены на 41 день исследования после заключительного измерения опухоли. Полученные данные - это процент животных без опухоли на 41 день исследования. Контрольные группы включали неиммунизированных (растворитель - негативный контроль) и иммунизированных облученными клетками Meth А (позитивный контроль) животных.

13.2. Добавление Con A в течение очистки gp96 или после очистки gp96 увеличивает активность очищенного конечного продукта

gp96, полученный из Meth А, был приготовлен с различными уровнями Con A в конечном продукте путем добавления Con A как в течение процесса очистки (на уровнях 30 мкг/мл и 300 мкг/мл), так и после очистки (на уровне 30 мкг/мл). Все образцы были исследованы Con A ELISА на содержание Con A (измеренная концентрация Con A в нг Con A/мкг для каждого образца обозначена на фигуре) и отторжение опухоли in vivo. Фиг.12 (A) показывает результаты исследования противоопухолевого действия in vivo метанола А для добавленного Con A в процессе, и фиг.12 (B) показывает результаты для добавления Con A к конечному продукту. Добавление Con A в процессе или после очистки gp96 привело к увеличению противоопухолевого действия HSPPC-96.

Методы

Приготовление gр96, полученного из Meth А, и добавление Con А: образец опухоли Meth А был гомогенизирован (30 мМ буфера фосфата натрия, рН 7,2, содержащего 2 мМ МgСl₂ и 2 мМ AEBSF), очищен центрифугированием, твердый сульфат аммония добавлен до 50%, образец центрифугирован снова, и супернатант нанесен непосредственно на Con А колонку. На данном этапе экстракт из Con А был пропущен через буфер обмена PBS и разделен на 3 образца. Один образец был обработан немедленно через колонку DEAE, чтобы получить gр96 (Стандартная процедура). К оставшимся двум был добавлен экзогенный Con A (30 и 300 мкг/мг соответственно), и затем образцы были очищены в колонке DEAE. Все DEAE элюированные образцы были подвергнуты заключительному буферному обмену в буфере 9% сахарозы-фосфат калия, рН 7,4. Con A был добавлен (30 мкг/мл) к определенному количеству gр96, очищенного стандартной процедурой. Образцы были проанализированы на содержание Con А и отторжение опухоли in vivo. Con А вызвал увеличение противоопухолевой активности gр96, когда был добавлен в процессе (фиг.12 (А)) или к окончательно очищенному gp96 белку (фиг.12 (В)).

Исследование ингибирования роста Meth A in vivo: мыши BALB/c (n=10/группа) были иммунизированы в 0 и 7 день по 10 мкг gр96 внутрикожно. На 14 день исследования мышам было введено 1×10⁵ клеток Meth А внутрикожно в полном объеме 100 мл. Контроль растущих опухолей производился в течение последующих четырех недель. Все животные были умерщвлены на 41 день исследования после заключительного измерения опухоли. Полученные данные - это процент животных без опухоли на 41 день исследования. Контрольные группы включали неиммунизированных (растворитель - негативный контроль) и иммунизированных облученными клетками Meth А (позитивный контроль) животных.

В другом эксперименте gp96, полученный из Meth А, был приготовлен, используя анти-gp96 scFv иммуноаффинную колонку. Очищенный gp96 был обработан буфером обмена PBS и разделен на несколько образцов. К одному определенному количеству был добавлен Con A. Образцы были проанализированы Con A ELISA (измеренная концентрация Con A в нг Con А/мкг для каждого образца обозначена на фигуре) и на отторжение опухоли in vivo. Результаты показаны на фиг.13. В каждом случае добавление Con A увеличивало активность отторжения опухоли gp96.

Метод

Приготовление gp96, полученного из Meth А, и добавление Con A: образец опухоли Meth А был гомогенизирован (30 мM буфера фосфата натрия, рН 7,2, содержащего 2 мM MgCl₂ и 2 мM AEBSF), очищен центрифугированием и фильтрованием (0,45 мкM). Окончательно очищенный гомогенат затем был помещен в 1 мл анти-gp96 scFv иммунаффинный столбец. Столбец был промыт 10 объемами колонки PBS, и gp96 впоследствии элюирован с 5 объемами колонки PBS, содержащими 1,3M NaCl. Экстракт из колонки был пропущен через буфер обмена PBS.

Исследование ингибирования роста Meth А in vivo: мыши BALB/c (n=10/группа) были иммунизированы в 0 и 7 день по 0,3 или 3 мкг только gp96 или в комбинации с Con A внутрикожно. На 41 день исследования мышам было введено 1×10⁵ клеток Meth А внутрикожно в полном объеме 100 мл. Контроль растущих опухолей производился в течение последующих четырех недель. Все животные были умерщвлены на 41 день исследования после заключительного измерения опухоли. Полученные данные - это процент животных без опухоли на 41 день исследования. Контрольные группы включали неиммунизированных (растворитель - негативный контроль) и иммунизированных облученными клетками Meth А (позитивный контроль) животных.

14. ПРИМЕР 9: ИММУНОТЕРАПИЯ ИНФЕКЦИИ HSV-2

Вирус простого герпеса типа 2 ("HSV-2") был выращен, и вирусные частицы выделены любым известным в уровне техники методом (см., например, Principles of Virology, Molecular Biology, Pathgenesis, and Control, Flint et al., ed., ASM Press, (2000)). Вирусные частицы были извлечены одним из нескольких общих методов, и окончательный образец был центрифугирован и профильтрован для получения фракции, обогащенной вирусным белком. Начальный пул растворенных вирусных белков может быть определен количественно, и может быть добавлен стехиометрический излишек Con A (или другого лектина). Как вариант растворимый экстракт белка может также быть далее обогащен вирус-специфичным гликопротеидом хроматографией на колонке Concacavalin А (или другого иммобилизованного лектина). Гликопротеиды специфично элюируются из колонки путем использования лектин-специфичного ингибитора (такого, как метил альфа-маннопиранозид для Con A). Ингибитор может быть удален, используя множество методов буферного обмена. Обогащенный гликопротеидом образец затем может быть определен количественно, и может быть добавлен стехиометрический излишек Con A. Как вариант обогащенный гликопротеидом образец может быть дополнительно обработан, используя ферментные или химические методы, чтобы получить меньшие фрагменты пептида гликопротеидов. Эти меньшие фрагменты могут быть смешаны непосредственно со стехиометрическим излишком Con A (или другого лектина) или далее очищены хроматографией и элюированием из Con A колонки (или другой колонки с иммобилизированным лектином). Обогащенная гликопептидом фракция может быть определена количественно, и может быть добавлен стехиометрический излишек Con A (или другого лектина). Образцы и соответствующие контрольные группы оценены на биологическую активность, используя профилактическую (мышиный HSV-2) или терапевтическую (HSV-2 морской свинки) модели.

Подобные методологии могут быть использованы для получения исследуемого материала для оценки в иммунотерапии опухолей.

Упомянутые эквиваленты и ссылки

Все упомянутые здесь ссылки включены в виде ссылки в их полном объеме и для всех целей в той же степени, как если бы каждая индивидуальная публикация, или патент, или патентная заявка были бы специфично и индивидуально обозначены, чтобы быть включенными во всей своей полноте для всех целей.

Различные модификации и вариации этого изобретения могут быть сделаны без значительного отступления от сути изобретения, как это может быть осуществлено специалистами. Отдельные варианты осуществления, описанные здесь, предлагаются для целей примера.

Claims

1. Композиция, включающая один или несколько нековалентных комплексов, вызывающая иммунный ответ у пациента, где каждый комплекс содержит белок теплового шока, антигенную молекулу и лектин, где указанный белок теплового шока гликозилирован, и где количество лектина, присутствующего в указанных комплексах, относительно количества белка теплового шока больше или равно 50 нанограммам лектина на микрограмм белка теплового шока, или меньше или равно 5 нанограммам лектина на микрограмм белка теплового шока, и где указанный белок теплового шока и указанная антигенная молекула происходят из опухолевой ткани, и где указанная антигенная молекула проявляет антигенные свойства указанной опухолевой ткани.

2. Композиция по п.1, где содержание лектина в указанных комплексах относительно количества белка теплового шока составляет от 50 до 1000 нанограммов лектина на микрограмм белка теплового шока.

3. Композиция по п.1, где содержание лектина в указанных комплексах относительно количества белка теплового шока составляет от 100 до 500 нанограммов лектина на микрограмм белка теплового шока.

4. Композиция по п.1, где содержание лектина в указанных комплексах относительно количества белка теплового шока составляет от 0,1 до 1 нанограмма лектина на микрограмм белка теплового шока.

5. Композиция по п.1, где содержание лектина в указанных комплексах относительно количества белка теплового шока составляет от 0,5 до 1 нанограмма лектина на микрограмм белка теплового шока.

6. Композиция по п. , где молярное отношение между белком теплового шока и лектином составляет 3:1,2:1 или 1:1.

7. Композиция по п.1, где указанный лектин присутствует в форме олигомера.

8. Композиция по любому из пп.1-7, где указанный лектин представляет собой связанный с маннозой лектин.

9. Композиция по п.8, где указанный связанный с маннозой лектин представляет собой конканавалин A (Con A).

10. Композиция по любому из пп.1-7, где указанный белок теплового шока выбран из группы, состоящей из gp96, кальретикулина и GRP170.

11. Композиция п.1, где указанный белок теплового шока представляет собой gp96.

12. Композиция по п.8, где указанный связанный с маннозой лектин представляет собой конканавалин A (Con А), и где указанный белок теплового шока представляет собой gp96.

13. Композиция по любому из пп.1-7, где указанные комплексы очищены.

14. Композиция по п.9, где указанные комплексы очищены.

15. Композиция по п.11, где указанные комплексы очищены.

16. Композиция по п.12, где указанные комплексы очищены.

17. Способ получения композиции по любому из пп.1-7, где указанный метод включает (а) получение комплексов, содержащих указанный белок теплового шока и указанную антигенную молекулу, и (b) связывание указанного лектина с указанными комплексами, полученными на стадии (а), где указанный лектин не связан с твердой фазой.

18. Способ получения композиции по п.12, где указанный метод включает (а) получение комплексов, содержащих указанный белок теплового шока и указанную антигенную молекулу, и (b) связывание указанного лектина с указанными комплексами, полученными на стадии (а), где указанный лектин не связан с твердой фазой.

19. Способ по п.17, дополнительно включающий выделение указанных комплексов, получаемых на стадии (а), путем аффинной хроматографии, основанной на лектине, до связывания указанных комплексов с указанным лектином.

20. Способ по п.17, дополнительно включающий выделение указанных комплексов, получаемых на стадии (а), путем хроматографии, не основанной на лектине, до связывания указанного комплекса с указанным лектином.

21. Способ по п.20, где указанная хроматография, не основанная на лектине, представляет собой аффинную хроматографию, основанную на антителах.

22. Способ по п.17, где указанный способ включает добавление лектина в форме порошка или жидкого раствора в ходе процесса очистки комплексов, получаемых на стадии (а), и где белок теплового шока в комплексах, получаемых на стадии (а), представляет собой гликозилированный белок теплового шока.

23. Способ по п.18, где указанный способ включает добавление лектина в форме порошка или жидкого раствора в ходе процесса очистки комплексов, получаемых на стадии (а), и где белок теплового шока в комплексах, получаемых на стадии (а), представляет собой гликозилированный белок теплового шока.

24. Способ по п.19, где указанный способ дополнительно включает очистку комплексов, содержащих указанный белок теплового шока и указанную антигенную молекулу, с использованием gp96-специфичной scFv колонки, и добавление лектина в форме порошка или жидкого раствора в ходе указанного процесса очистки комплексов, получаемых на стадии (а), и где белок теплового шока в комплексах, получаемых на стадии (а), представляет собой gp96.

25. Фармацевтическая композиция, вызывающая иммунный ответ у пациента, включающая фармацевтически приемлемый носитель и композицию по любому из пп.1-7.

26. Фармацевтическая композиция, вызывающая иммунный ответ у пациента, включающая фармацевтически приемлемый носитель и композицию по п.11.

27. Фармацевтическая композиция, вызывающая иммунный ответ у пациента, включающая фармацевтически приемлемый носитель и композицию по п.2.

28. Фармацевтическая композиция по п.25, где композиция по любому из пп.1-7 присутствует в количестве, эффективном для применения при лечении или профилактики опухолей у пациента.

29. Способ профилактики или лечения опухоли, включающий введение субъекту, имеющему опухоль, терапевтически эффективного количества композиции по любому из пп.1-7.

30. Способ профилактики или лечения опухоли, включающий введение субъекту, имеющему опухоль, терапевтически эффективного количества композиции по п.12.

31. Способ по п.29, где указанный субъект является млекопитающим.

32. Способ по п.31, где указанное млекопитающее является человеком.

33. Способ по п.30, где указанный субъект является млекопитающим.

34. Способ по п.33, где указанное млекопитающее является человеком.