RU2393863C2 - Лекарственные формы - Google Patents

Abstract

Группа изобретений относится к медицине и может быть использована для лечения или предупреждения у пациента инфекции, вызванной вирусом гепатита С. Для этого вводят VX-950 или его фармацевтически приемлемую соль. Каждое из изобретений характеризует определенные режимы введения VX-950 для обеспечения эффективного лечения заболевания. Заявленные способы обеспечивают поддержание минимально низкого уровня VX-950 в плазме в течение 24-часового периода, снижение уровня ALT, существенное уменьшение уровня РНК вируса гепатита С в плазме и достижение устойчивого ответа на вирус. 5 н. и 24 з.п.ф-лы, 17 ил.

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение связано со способами лечения инфекций, вызываемых вирусом гепатита С.

ОСНОВЫ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Инфекция, вызываемая вирусом гепатита С ("HCV"), представляет собой медицинскую проблему, привлекающую особое внимание человечества. HCV считается агентом, вызывающим болезнь в большинстве случаев заболевания не-A, не-B-гепатитом, при этом, согласно оценкам, количество серопозитивных индивидов в целом составляет порядка 3% [A. Alberti и др., "Natural History of Hepatitis C," J. Hepatology, 31., (Suppl.1), pp.17-24 (1999)]. Около четырех миллионов индивидов может быть инфицировано только в Соединенных Штатах [M.J.Alter и др., "The Epidemiology of Viral Hepatitis in the United States, Gastroenterol. Clin. North Am., 23, pp.437-455 (1994); M.J.Alter "Hepatitis C Virus Infection in the United States," J. Hepatology, 31., (Suppl.1), pp.88-91 (1999)].

Из лиц, которые становились инфицированными HCV, 20-25% способны освобождаться от вируса после острой фазы инфекции, но у 75-80% будет развиваться хроническая форма инфекции гепатита C [вводная часть, Frontiers in Viral Hepatitis. Ed. RF Schinazi, J-P Sommadossi, and CM Rice. p. xi. Elsevier (2003)]. Это обычно приводит к рецидивам и постепенному ухудшению воспаления печени, которое часто приводит к более тяжелым формам заболевания, таким как цирроз и злокачественная гепатома [M.C.Kew, "Hepatitis C and Hepatocellular Carcinoma", FEMS Microbiology Reviews, 14, pp.211-220 (1994); I. Saito et. al., "Hepatitis C Virus Infection is Associated with the Development of Hepatocellular Carcinoma," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, pp.6547-6549 (1990)]. К сожалению, не существует достаточно эффективных курсов лечения для ослабления прогрессирования хронической HCV.

Геном HCV кодирует полипротеин из 3010-3033 аминокислот [Q.L.Choo, и др., "Genetic Organization and Diversity of the Hepatitis C Virus." Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, pp.2451-2455 (1991); N. Kato и др., "Molecular Cloning of the Human Hepatitis C Virus Genome From Japanese Patients with Non-A, Non-B Hepatitis," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, pp.9524-9528 (1990); A. Takamizawa и др., "Structure and Organization of the Hepatitis C Virus Genome Isolated From Human Carriers," J. Virol., 65, pp.1105-1113 (1991)]. Предполагается, что неструктурные (NS) белки HCV обеспечивают основной каталитический механизм вирусной репликации. NS-белки образуются посредством протеолитического расщепления полипротеина [R. Bartenschlager и др., "Nonstructural Protein 3 of the Hepatitis C Virus Encodes a Serine-Туре Proteinase Required for Cleavage at the NS3/4 and NS4/5 Junctions," J. Virol., 67, pp. 3835-3844 (1993); A. Grakoui и др., Characterization of the Hepatitis C Virus-Encoded Serine Proteinase: Determination of Proteinase-Dependent Polyprotein Cleavage Sites," J. Virol., 67, pp.2832-2843 (1993); A. Grakoui и др., "Expression and Identification of Hepatitis C Virus Polyprotein Cleavage Products," J. Virol., 67, pp.1385-1395 (1993); L. Tomei и др., "NS3 is a serine protease required for processing of hepatitis C virus polyprotein", J. Virol., 67, pp.4017-4026 (1993)].

NS3-белок HCV (NS3) обладает активностью сериновой протеиназы, которая содействует процессу жизнедеятельности большинства вирусных ферментов и является, таким образом, существенной для вирусной репликации и инфекционности. Известно, что мутации в NS3-протеиназе вируса желтой лихорадки снижают инфекционность вируса [Chambers, T.J. и др., "Evidence that the N-terminal Domain of Nonstructural Protein NS3 From Yellow Fever Virus is a Serine Protease Responsible for Site-Specific Cleavages in the Viral Polyprotein", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, pp.8898-8902 (1990)]. Обнаружено, что первые 181 аминокислот NS3 (остатки 1027-1207 вирусного полипротеина) содержат домен сериновой протеиназы NS3, который влияет на все четыре располагающихся ниже сайта полипротеина HCV [C. Lin и др., "Hepatitis C Virus NS3 Serine Proteinase: Trans-Cleavage Requirements and Processing Kinetics", J. Virol., 68, pp.8147-8157 (1994)].

Сериновая протеиназа NS3 HCV и связанный с ней кофактор NS4A содействуют процессу жизнедеятельности всех вирусных ферментов и являются, таким образом, существенными для вирусной репликации. Такой процессинг, по-видимому, аналогичен таковому, происходящему при действии аспартильной протеиназы вируса иммунодефицита человека, которая также вовлечена в процессинг вирусного фермента. Ингибиторы протеиназы ВИЧ, которые подавляют процессинг вирусного белка, представляют собой действенные противовирусные агенты для человеческого организма, что свидетельствует о том, что прерывание данной стадии жизненного цикла вируса приводит к терапевтически активным веществам. Следовательно, данное направление представляется привлекательным для усовершенствования лекарственных средств.

В настоящее время не существует удовлетворительных анти-HCV-агентов или способов лечения. До недавнего времени общепризнанной терапией заболевания, вызваемого HCV, было только лечение интерфероном. Сначала одобренной терапией HCV-инфекции было лечение стандартным (неПЭГилированным) интерфероном альфа. Однако интерфероны имеют значительный побочный эффект [M.A.Wlaker и др., "Hepatitis C Virus: An Overview of Current Approaches and Progress," DDT, 4, pp.518-29 (1999); D. Moradpour и др., "Current and Evolving Therapies for Hepatitis C," Eur. J. Gastroenterol. Hepatol., 11, pp.1199-1202 (1999); H.L.A. Janssen и др. "Suicide Associated with Alfa-Interferon Therapy for Chronic Viral Hepatitis," J. Hepatol., 21, pp.241-243 (1994); P.F. Renault и др., "Side Effects of Alpha Interferon," Seminars in Liver Disease, 9, pp.273-277. (1989)], и монотерапия интерфероном альфа вызывает длительную ремиссию только в некоторой части (~25%) случаев заболевания [O. Weiland, "Interferon Therapy in Chronic Hepatitis C Virus Infection", FEMS Microbiol. Rev., 14, pp.279-288 (1994)]. Добавление рибавирина в схему лечения незначительно улучшает степень ответной реакции. Недавнее введение ПЭГилированных форм интерферона (PEG-INTRON® и PEGASYS®), которые также комбинировали с рибавирином, дало в результате только умеренное улучшение степени ремиссии и только частичное уменьшение побочных эффектов. Текущий стандарт медицинского ухода представляет собой лечебную схему, продолжающуюся 24-48 недель, в зависимости от прогностических факторов, таких как генотип HCV и проявление первого ответа на лечение. Более того, перспективы в отношении эффективных анти-HCV-вакцин остаются неопределенными.

Таким образом, существует потребность в анти-HCV-терапии и подходящих режимах лекарственных доз для анти-HCV-соединений.

HCV и другие заболевания и нарушения связаны с повреждением печени. Существует также необходимость в терапии и подходящем режиме лекарственных доз для лечения повреждения печени.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение связано с лечением инфекций, вызываемых вирусом гепатита C. Изобретение, следовательно, связано с предупреждением клинического осложнения заболевания, вызванного вирусной инфекцией гепатита C.

Настоящее изобретение связано также с лечением повреждений печени и воспаления печени.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На Фиг.1A и Фиг.1B показаны профили временнόй зависимости средней концентрации для различных уровней лекарственной дозы (Пример 3).

На Фиг.2A-2D приведены полученные фармакокинетические параметры. Линия внутри рамки соответствует среднему значению, а границы рамки соответствуют разбросу средних значений (Пример 3).

На Фиг.3 показана концентрация (МЕд./мл) РНК HCV в плазме в течение 14-дневного исследования (Пример 5).

На Фиг.4 показано изменение концентрации (МЕд./мл) РНК HCV относительно исходного уровня в течение 14-дневного исследования (Пример 5 ).

На Фиг.5 показано изменение концентрации (МЕд./мл) РНК HCV относительно исходного уровня за период 14-дневного исследования для отдельных субъектов в группе лекарственной дозы 750 мг q8h (Пример 5).

На Фиг.6 показаны средние значения неоптерина, ALT (аланинаминотрансфераза) и РНК HCV +/- SEM во всех группах лекарственных доз. На Фиг.6 использованы следующие обозначения: изменения от исходного уровня средних уровней ALT ± SEM (самые верхние 4 линии с полыми символами), средние значения уровней неоптерина плазмы ± SEM (средние 4 линии с полыми символами) и средние значения нагрузки РНК HCV ± SEM (нижние 4 линии, с заполненными символами) показаны для всех 3 групп лекарственных доз и плацебо. Пациентов лечили в течение 14 дней с помощью VX-950. *Кратковременное увеличение среднего значения уровня ALT на 12 день в группе 450 мг q8h является артефактом (5 из 10 образцов отсутствуют, среднее значение 38 Ед./л, область 25-125 Ед./л) (Пример 5).

На Фиг.7 показаны средние значения неоптерина +/- SEM во всех группах. Показаны средние уровни неоптерина в плазме ± SEM до лечения и на 7 и 14 день для всех 3 групп лекарственных доз и плацебо. Отметим, что уменьшение среднего значения неоптерина максимально в группе лекарственной дозы 750 мг q8h, с высокими значениями до лечения и затем с самыми низкими значениями на 14 день. В группе лекарственной дозы 750 мг q8h уменьшение неоптерина по сравнению с исходным уровнем и плацебо становилось значимым на 14 день (*непарный двухсторонний T-тест, **критерий Манна-Уитни). Пунктирная горизонтальная линия при Y=7,7 нмол/л соответствует ULN (Пример 5).

На Фиг.8, 9 и 10 показано, что расщепление TRIF (адапторный белок TLR3) in vitro под действием протеиназы NS3/4A HCV ингибируется посредством VX-950.

На Фиг.8 (домен toll-Il1-рецептора, содержащий адаптор, индуцирующий IFN-Я TRIF

или TICAM-1) показана схематическая иллюстрация TRIF, выявляющая различные протеин-связывающие домены. TRIF расщепляется под действием протеиназы NS3 HCV у Cys 372, что приводит к образованию двух фрагментов - ∆С340 и ∆N372 (модификация Li и др. 2005, PNAS, 102, p 2992-2997).

На Фиг.9 показана кинетика расщепления TRIF под действием протеиназы NS3 HCV. Меченный по 35S-метионину in vitro продукт транскрипции/трансляции белка TRIF (в качестве субстрата) инкубировали с 6 мкМ протеиназы tNS3 в различных временных точках в диапазоне 0-240 минут, с последующим SDS-PAGE. Гель подвергали анализу на аппарате для визуализации фосфорной метки для количественной оценки продуктов расщепления. Количественная оценка продукта расщепления ∆N372 показана на чертеже как функция от времени.

На Фиг.10 показано NS3-протеиназо-зависимое расщепление TRIF и ингибирование расщепления TRIF посредством VX-950. Меченый 35S-метионин, связанный in vitro с продуктом транскрипции/трансляции белка TRIF (в качестве субстрата) инкубировали с увеличенной концентрацией фермента протеиназы tNS3 в диапазоне 0-4 мкМ либо в присутствии (кружочки), либо в отсутствие (квадратики) 10 мкМ VX-950, с последующим SDS-PAGE и анализом на аппарате для визуализации фосфорной метки. Количественный анализ продукта расщепления ∆N372 показан на чертеже.

На Фиг.11, 12, и 13 показано уменьшение соответствия вирусных вариантов.

На Фиг.11 показаны фенотипические характеристики VX-950 резистентных мутантов in vitro. Увеличивающаяся резистентность к VX-950 при ферментативных реакциях in vitro (Ki) связана с мутациями A156V/T, и показан анализ репликона на 2-день (IC₅₀) по сравнению с протеиназой дикого типа. Отношение Kcat/Km у мутантов по сравнению с ферментами дикого типа показано в таблице (модификация Lin и др. 2005, JBC, 280, p.36784-36791).

На Фиг.12 показано расщепление субстрата HCV 4A/B мутантами A156V/T по сравнению с расщеплением протеиназой NS3 дикого типа (WT): меченый 35S-метионин, связанный in vitro с продуктом транскрипции/трансляции инактивированного мутанта протеиназы HCV, слитого с белком SEAP с областью контакта 4A/B (в качестве субстрата) между ними, инкубировали с различными количествами протеиназы tNS3 либо дикого типа (WT) (квадратики), либо A156V/T (тругольники и кружочки), в диапазоне от 0,008 до 6 мкМ, с последующим SDS-PAGE и анализом на аппарате для визуализации фосфорной метки. Количественный анализ продукта расщепления ∆N372 показан на чертеже.

На Фиг.13 показано расщепление субстрата TRIF мутантами A156V/T по сравнению с расщеплением протеиназой NS3 дикого типа (WT). Меченный по 35S-метионину in vitro продукт транскрипции/трансляции TRIF (в качестве субстрата) инкубировали с различными количествами протеиназы tNS3 либо дикого типа (WT) (квадратики), либо A156V/T (треугольники и кружочки), в диапазоне от 0,008 до 6 мкМ, с последующим SDS-PAGE и анализом на аппарате для визуализации фосфорной метки. Количественный анализ продукта расщепления ∆N372 показан на чертеже.

На Фиг.14 показаны средние значения РНК HCV, неоптерина и ALT в исходный момент, на 7 день и на 14 день (Пример 5).

На Фиг.15 и 16 показаны данные, подтверждающие, что VX-950 восстанавливает IFNЯ-зависимую экспрессию гена в клетках Huh7, инфицированных вирусом Sendai.

На Фиг.15 показана супрессия активности промотора IFN-Я под действием протеиназы HCV в клетках Huh7, стимулированных вирусом Sendai. Клетки Huh7 совместно трансфицировали плазмидами, экспрессирующими ген люциферазы под контролем промотора IFN-β и либо протеиназой дикого типа (WT), либо инактивированной мутантной протеиназой (MT), с последующей стимуляцией вирусом Sendai (SeV). Кратное увеличение активности гена люциферазы в сравнении с неиндуцированным вирусом Sendai контролем показаны на данном чертеже.

На Фиг.16 показано, что обработка VX-950 способствует преодолению супрессивного эффекта протеиназы HCV в отношении стимуляции вирусом Sendai активности промотора IFN-Я. Клетки Huh7 совместно трансфицировали плазмидами, экспрессирующими ген люциферазы под контролем промотора IFN-β, и либо протеиназой дикого типа (WT), либо инактивированной мутантной протеиназой (MT). Клетки обрабатывали либо DMSO (контроль), либо 10 мкМ VX-950. Клетки стимулировали вирусом Sendai (SeV) и измеряли активность люциферазы через 16 часов после инфицирования. Кратная активация в сравнении с неактивируемым вирусом Sendai контролем показана на данном чертеже.

На Фиг.17 показаны данные, подтверждающие, что обработка VX-950 приводит к уменьшению РНК HCV у ранее не отвечающих на терапию HCV (Фиг.17A) и у леченых обычным способом пациентов (Фиг.17B). Показаны средние значения уровней РНК HCV пациентов в каждой из терапевтических схем. Концентрации РНК HCV в плазме определяли, используя анализ Roche COBAS TaqMan HCV/HPS.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение связано со специфическими дозами и режимами лекарственной дозы для введения VX-950. VX-950 представляет собой конкурентный, реверсивный пептидомиметик, ингибитор протеиназы NS3/4A с константой связывания в устойчивом состоянии (ki*) 7nM [Международная заявка на патент 02/018369].

VX-950 был протестирован в однократных дозах на человеческом организме, и была обнаружена высокая степень толерантности (Пример 3). Возникновение или увеличение степени тяжести неблагоприятных явлений не учащалась с дозой VX-950. Наблюдаемые неблагоприятные явления не рассматриваются как тяжелые (стадия 3 или стадия 4). Не наблюдалось клинически значимых изменений от исходного уровня лабораторных показателей в гематологии или клинических химических параметрах. Не наблюдалось клинически значимых изменений при физическом осмотре, на уровне жизненных показателей или электрокардиограмм ни у одного из тестируемых субъектов.

Исследования проводили для определения фармакокинетического профиля VX-950. Данные показаны на Фиг.1 и Фиг.2.

Воздействие VX-950 на печень прогнозировали, основываясь на комплексных доклинических и клинических данных. Прогнозируемое воздействие на печень человека сочетали с результатами исследования репликона VX-950 и анализом инфицирующего вируса (см. ниже) для определения лекарственных доз, которые предположительно будут в значительной степени толерантными и будут оказывать благоприятное терапевтическое воздействие. Прогнозируемые средние величины концентрации для печени составляют до 57-кратных анализируемого репликона IC₉₀ и до 113-кратных анализируемого репликона IC₅₀ в области исследуемых лекарственных доз.

Данные результаты означают, что режим лекарственной дозы претендента на изобретение будет достигнут при концентрации VX-950 в печени главным образом при превышении IC₅₀ и IC₉₀, определенных в неклинических опытах.

Согласно одному из воплощений данного изобретения предложены фармацевтические композиции, включающие в себя:

а) VX-950 или его фармацевтически приемлемую соль

в количестве приблизительно от 100 до приблизительно 1500 мг;

в количестве приблизительно от 300 до приблизительно 1500 мг;

в количестве приблизительно от 300 до приблизительно 1250 мг;

в количестве приблизительно 450 мг;

в количестве приблизительно 750 мг; или

в количестве приблизительно 1250 мг; и

b) и фармацевтически приемлемый носитель.

В данном изобретении предложена также терапевтическая схема, предусматривающая введение VX-950 или его фармацевтически приемлемой соли

в количестве приблизительно от 100 до приблизительно 1500 мг;

в количестве приблизительно от 300 до приблизительно 1500 мг,

в количестве приблизительно от 300 до приблизительно 1250 мг;

в количестве приблизительно 450 мг;

в количестве приблизительно 750 мг; или

в количестве приблизительно 1250 мг; где введение указанного количества происходит один раз, два раза или три раза в день. Терапевтическая схема согласно изобретению предусматривает введение VX-950 в составе одной или более лекарственных форм.

Другое воплощение данного изобретения представляет собой способ лечения или предупреждения инфекции HCV у пациента, включающий в себя введение пациенту VX-950 или его фармацевтически приемлемой соли в количестве приблизительно от 300 мг до приблизительно 1500 мг.

В определенных воплощениях доза VX-950 составляет по меньшей мере приблизительно 300 мг. В других воплощениях доза VX-950 составляет по меньшей мере приблизительно 450 мг. В других воплощениях доза VX-950 составляет по меньшей мере приблизительно 500 мг. В других воплощениях доза VX-950 составляет по меньшей мере приблизительно 750 мг. В других воплощениях доза VX-950 составляет по меньшей мере приблизительно 1250 мг. В других воплощениях доза VX-950 составляет по меньшей мере приблизительно 1500 мг.

В следующих воплощениях доза VX-950 составляет не более чем приблизительно 1500 мг. В других воплощениях доза VX-950 составляет не более чем приблизительно 1250 мг. В других воплощениях доза VX-950 составляет не более чем приблизительно 750 мг. В других воплощениях доза VX-950 составляет не более чем приблизительно 450 мг. В других воплощениях доза VX-950 составляет не более чем приблизительно 500 мг. В других воплощениях доза VX-950 составляет не более чем приблизительно 300 мг.

Должно быть понятно, что данные низкие и высокие уровни доз можно комбинировать для получения предпочтительных уровней доз для введения VX-950. Например, в одном из воплощений VX-950 или его фармацевтически приемлемую соль вводят в количестве приблизительно от 300 до 1250 мг.

В определенных воплощениях VX-950 вводят в количестве приблизительно 450 мг. VX-950 вводят в количестве приблизительно 500 мг. В других воплощениях VX-950 вводят в количестве приблизительно 600 мг. В других воплощениях VX-950 вводят в количестве приблизительно 750 мг. В других воплощениях VX-950 вводят в количестве приблизительно 1000 мг. Кроме того, в других воплощениях VX-950 вводят в количестве приблизительно 1250 мг.

В любом из этих воплощений количество VX-950 вводят один раз в день. Альтернативно, количество VX-950 вводят два раза в день (например, BID; q12h). Альтернативно, количество VX-950 вводят три раза в день (например, TID; q8h). VX-950 можно вводить во время еды или вне зависимости от приема пищи.

VX-950 также тестировали на человеке и обнаружили его эффективность в качестве ингибитора репликации HCV. Авторы изобретения продемонстрировали, что введение VX-950 существенно снижает уровни РНК HCV. Важно то, что авторы изобретения продемонстрировали, что введение VX-950 инфицированным HCV субъектам может ингибировать вирус, так что вирусная РНК становится необнаруживаемой путем анализа HCV/HPS Roche COBAS TaqMan™ (производства Roche Molecular Diagnostics). Из 8 субъектов, получавших 750 мг VX-950 каждые 8 часов (q8h), 4 имели уровни РНК HCV ниже предела чувствительности количественного анализа (LLQ 30 МЕд./мл), и 2 из этих 4 субъектов имели уровни РНК HCV ниже детектируемого порога (LLD 10 МЕд./мл).

У субъектов, получавших 750 мг VX-950 каждые восемь часов, достигнуто в среднем более чем в 4 log₁₀ снижениие (т.e. 10 000-кратное уменьшение) уровня HCV-РНК к концу 14-го дня лечения. Среднее более чем в 2 log₁₀ снижение HCV-РНК наблюдали в каждой из двух других групп лекарственных доз VX-950 к концу 14-го дня лечения. У каждого субъекта, получавшего VX-950, достигнуто более чем 2 log₁₀ снижение уровней HCV-РНК в течение первых трех дней лечения, а у 26 из 28 субъектов, получавших VX-950, наблюдалось 3 log₁₀ снижение уровней HCV-РНК в течение первых трех дней лечения. См. Пример 5 и Фиг.3-5.

Было показано, что вирусная нагрузка плазмы быстрее уменьшается у пациентов, которых лечили VX-950. Кроме того, было показано, что после завершения приема лекарства происходит незначительный возврат РНК HCV к исходным уровням. В частности, скорость возврата к исходным уровням РНК HCV после завершения лечения была ниже, чем скорость снижения уровней РНК HCV во время лечения. Указанные результаты, совместно с достижением невыявляемых уровней РНК HCV, свидетельствуют об эффективности VX-950 в качестве монотерапии.

Таким образом, данное изобретение связано со способом лечения пациента, инфицированного HCV, включающим в себя введение пациенту VX-950 или его фармацевтически приемлемой соли в количестве a) приблизительно 450 мг 3 раза в день каждые 8 часов; b) приблизительно 750 мг 3 раза в день каждые 8 часов; c) приблизительно 1250 мг 2 раза в день каждые 12 часов; или d) приблизительно 1250 мг 3 раза в день каждые 8 часов.

В других воплощениях данного изобретения предусмотрен способ введения VX-950 инфицированному HCV пациенту так, чтобы уровень РНК HCV у пациента составлял по меньшей мере приблизительно менее 2 log (предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 4 log) после лечения, чем перед лечением. В другом воплощении данное изобретение связано со способом введения VX-950 пациенту, инфицированному HCV, таким, чтобы уровень вирусной РНК у пациента уменьшался до неопределяемых величин и оставался на неопределямых уровнях до достижения "устойчивой реакции на вирус". Как определено в настоящем документе, "устойчивая реакция на вирус" означает, что в течение 24 недель после того, как введение лекарственной дозы завершилось, уровни вирусной РНК остаются неопределяемыми.

Не желая связывать себя какой-либо определенной теорией, авторы изобретения считают, что способ согласно настоящему изобретению, при котором используют 750 мг VX-950 каждые 8 часов, является предпочтительным, потому что данный способ приводит к наиболее значительному падению уровней. Наинизший уровень представляет собой такую концентрацию в плазме, которая обнаруживается непосредственно перед введением следующей дозы (т.e. минимальную концентрацию между дозами). Важно удерживать, в частности при вирусных заболеваниях, уровни лекарственного средства выше определенной концентрации для поддержания соответствующего ингибирования вирусной репликации. Авторы изобретения обнаружили, что преимущественно один из тестируемых режимов введения, 750 мг VX-950 каждые 8 часов, приводит к значительному падению уровней.

Следовательно, в предпочтительном воплощении данное изобретение связано со способом, включающим в себя введение пациенту VX-950 или его фармацевтически приемлемой соли в количестве приблизительно 750 мг 3 раза в день каждые 8 часов.

Нужно признать, что полезно пользоваться гибкими графиками введения доз. Следовательно, в другом воплощении данного изобретения дозу вводят 3 раза на день, но не каждые 8 часов, необязательно с приемом пищи. В определенных воплощениях VX-950 вводится вместе с пищей.

Данное изобретение предусматривает также способ предоставления VX-950 человеку, в случае необходимости, включающий в себя пероральное введение человеку дозы композиции, содержащей VX-950, где указанная доза предоставляется указанному человеку по средней концентрации VX-950 в плазме (C_avg), составляющей по меньшей мере приблизительно 750 нг/мл после введения. В определенных воплощениях (C_avg) составляет приблизительно 1000 нг/мл или приблизительно 1250 нг/мл. В определенных воплощениях указанная доза, по-существу, содержит 750 мг VX-950. В данных воплощениях дозу (C_avg) получают/она достигается в течение 3 часов после введения, предпочтительно в течение 2 часов, более предпочтительно в течение 1 часа после введения. В предпочтительных вариантах данных воплощений доза (C_avg) поддерживается более чем приблизительно в течение 24 часов и предпочтительно более 12 недель.

В определенных воплощениях данное изобретение связано со способом лечения инфекции HCV у пациента посредством введения по меньшей мере одной лекарственной формы, содержащей VX-950, в течение 24-часового периода, где лекарственная форма вводится для поддержания минимального уровня VX-950 в плазме, приблизительно 750 нг/мл, в течение 24-часового периода.

В определенных вариантах данного воплощения лекарственную форму вводят для поддержания минимального уровня VX-950 в плазме, составляющего приблизительно 800 нг/мл, предпочтительно приблизительно 900 нг/мл в течение 24-часового периода и более предпочтительно приблизительно 1000 нг/мл в течение 24-часового периода.

В определенных предпочтительных воплощениях добиваются установления терапевтически эффективной концентрации в плазме и поддерживают ее на определенном минимальном уровне. Данные способы, в частности, применимы для лечения человека, страдающего от инфекции HCV, посредством введения композиции VX-950, когда наинизший уровень VX-950 в плазме поддерживается как минимум на уровне приблизительно 750, 800, 900, или 1000 нг/мл в течение 24-часового периода. Не желая связывать себя какой-либо определенной теорией, авторы изобретения считают, что наинизшие уровни, превосходящие приблизительно 1500 нг/мл, не потребуются в данном изобретении. Соответственно, наинизшие уровни, составляющие приблизительно 750, 800, 900, 1000 нг/мл и приблизительно до 1500 нг/мл (конкретно, от 1000 до приблизительно 1500), входят в объем данного изобретения.

Предоставляется также лекарственная форма для доставки VX-950 в человеческий организм, где лекарственная форма содержит VX-950, указанная лекарственная форма при введении по меньшей мере один раз в течение 24-часового периода поддерживает наинизший уровень VX-950 в плазме, составляющий по меньшей мере приблизительно 750, 800, 900 или 1000 нг/мл в течение 24-часового периода приблизительно до 1500 нг/мл (конкретно, от 1000 до приблизительно 1500 нг/мл) в течение 24-часового периода.

Идеально, когда способ согласно настоящему изобретению включает в себя лечение пациента, инфицированного HCV, относительно быстрое достижение терапевтически эффективной концентрации VX-950 в плазме и затем поддержание наинизшего уровня, при котором достигается эффективный терапевтический ответ. Эффективный терапевтический ответ предпочтительно представляет собой один или оба из следующих: a) достижения устойчивой реакции на вирус; и b) достижения неопределяемого уровня РНК HCV в плазме по меньшей мере в течение 12 недель (12 недель или более). Используемый в данном документе термин "неопределяемый" уровень РНК HCV означает, что РНК HCV присутствует в концентрации менее чем 10 МЕд./мл, что определяется анализом, в настоящее время коммерчески доступным, и, предпочтительно, как определяется с помощью Roche COBAS TaqMan™ - анализа HCV/HPS.

Относительно быстрое падение концентрации в плазме можно получить путем введения пациенту ударной дозы. В одном воплощении ударная доза составляет приблизительно 1250 мг VX-950.

В определенных лекарственных формах согласно изобретению (отличных от лекарственной формы, используемой для введения ударной дозы) содержится приблизительно 750 мг VX-950, и лекарственную форму вводят три раза за каждый 24-часовой период.

В определенных воплощениях продолжительность лечения с помощью VX-950 короче, чем с помощью стандартного, современного лечения.

В определенных воплощениях способ согласно настоящему изобретению включает в себя лечение пациента, инфицированного вирусом гепатита С генотипа 1. Генотип 1 HCV-инфекции является наиболее сложным для лечения штаммом HCV и наиболее распространенным штаммом в Соединенных Штатах.

Авторы изобретения показали также, что введение VX-950 снижает уровни неоптерина и ALT in vivo (Фиг.6, Фиг.7 и Фиг.14). Уровни AST (аспартатаминотрансфераза) также уменьшались после введения VX-950. ALT представляет собой фермент, присутствующий в клетках печени; когда клетки печени разрушаются или воспаляются, ALT просачивается из клетки в кровь. Уровни ALT в крови используют как маркер повреждения или воспаления печени. См. Tatyana Yashina

и J. Sanders Sevall, "Hepatitis C Virus" в Use and Interpretation of Laboratory Tests in Gastroenterology, James B. Peter, ed., р. 127, (1998); и Andres T. Blei, "Liver and Biliary Tract" в Laboratory Medicine, D.A. Noe and Robert C. Rock, eds., ch. 19, р. 363 (1994).

Неоптерин (6-d-эритро-три-гидроксипропилптеридин) представляет собой производное птеридина, которое продуцируется в процессе метаболизма гуанозинтрифосфата (GTP). Неоптерин продуцируется главным образом моноцитами и макрофагами при активации интерфероном гамма или интерфероном альфа и является маркером воспаления. Уровни неоптерина часто повышаются при хронической HCV-инфекции (Quiroga, и др. Dig Dis Sci 1994; 39 (11): 2485-96). Ожидаемый уровень неоптерина в плазме здоровых индивидуумов составляет от 3,1 до 7,7 нмоль/л.

Таким образом, авторы изобретения определяли изменения концентрации неоптерина в сыворотке как маркера активности моноцитов/макрофагов во время введения ингибитора протеиназы NS3·4A (HCV). Как описано в данном документе, VX-950 вводили в течение 14 дней в случайном порядке, двойным слепым методом, контроллируемым плацебо, анализировали разнообразные дозы у 34 пациентов, инфицированных генотипом 1 HCV (Таблица 1). Пациенты получали VX-950 450 мг q8h (n=10), 750 мг q8h (n=8), 1250 мг q12h (n=10), или плацебо (n=6). Концентрации неоптерина в сыворотке измеряли с помощью количественного конкурентного метода ELISA (ELItest® Neopterin, Brahms, Hennigsdorf, Germany) до лечения, на 7 и на 14 день, и в последующие 10 дней. Самый низкий зарегистрированный предел (LLD) составлял 2 нмол/л. РНК HCV определяли через повторяющиеся интервалы в течение исследования ПЦР в реальном масштабе времени (COBAS® TaqMan HCV Test; в линейной динамичной области значений РНК HCV от 3,0 × 10¹ до 2,0 × 10⁸ МЕд./мл; LLD РНК HCV 10 МЕд./мл; Roche Diagnostics, Branchburg, NJ).

Во время введения VX-950 у каждого пациента наблюдали падение вирусной нагрузки >2-log₁₀ во всех группах лекарственных доз (Таблица 2). В группе лекарственной дозы 750 мг q8h среднее значение РНК HCV падало до 3,6 log₁₀ на 3 день и до 4,3 log₁₀ на 14 день. В группах лекарственных доз 450 мг q8h и 1250 мг q12h максимальный эффект наблюдали с 3 дня по 7 день с последующим увеличением значения вирусной нагрузки между 7 и 14 днями. Средняя вирусная нагрузка увеличивалась во всех группах лекарственных доз в течение последующего наблюдения. В основном в обоих случаях лечения HCV - и при лечении первичных больных HCV, и при лечении пациентов, ранее получавших лечение лечение против HCV, способы согласно изобретению оказывают благоприятное действие. Как показано на Фиг.17A и Фиг.17B, и предварительно леченые пациенты, и первичные пациенты реагировали на VX-950. Во избежание недоразумений следует отметить, что пациенты, которых можно лечить способами согласно настоящему изобретению, включают в себя тех пациентов, у которых HCV не пытались лечить или же попытка лечения HCV оказалась неудачной, включая неотвечающих на лечение пациентов, пациентов с возобновлением симптомов, пациентов с рецидивом и успешно леченых пациентов.

Исходный уровень неоптерина повышался у 23/34 пациентов (среднее значение 9,33 нмол/л; верхний предел нормы (ULN) 7,7 нмол/л). В группе лекарственной дозы 750 мг уменьшение неоптерина по сравнению с исходным уровнем и плацебо становится значительным на 14 день (группа лекарственной дозы 750 мг q8h против исходного уровня на 14 день 10,48±0,84 нмол/л против 7,32±0,48 нмол/л P=0,0104, тест Mann Whitney; группа лекарственной дозы 750 мг q8h против плацебо на 14 день 7,32±0,48 нмол/л против 9,81±1,36 нмол/л P=0,0036, непарный Т-критерий на основе двойной выборки). Средние уровни неоптерина принимают нормальные значения только на 14 день в группе лекарственной дозы 750 мг q8h (Фиг.7 и Фиг.14). В группе лекарственной дозы 450 мг q8h и группе лекарственной дозы 1250 мг q12h уменьшение средних уровней неоптерина было меньше (Фиг.6, 7, и 14). Средние уровни неоптерина не менялись в группе плацебо (Фиг.6 и Фиг.7). Средние уровни неоптерина увеличивались во всех группах лекарственных доз в течение последующего наблюдения.

Средние уровни ALT, повышенные на исходном уровне, уменьшались во время введения дозы во всех группах (Фиг.6). Повышенные средние уровни ALT возвращались к исходному уровню во всех группах лекарственных доз в течение последующего наблюдения.

Хотя РНК HCV увеличивалась в группе лекарственной дозы 450 мг и в группе лекарственной дозы 1250 мг после 7 дня, неоптерин, и особенно ALT, продолжали уменьшаться. Изменения средней концентрации неоптерина коррелируют с падением уровней РНК HCV и ALT в течение введения дозы VX-950. Максимальное падение средней концентрации неоптерина происходило в группе лекарственной дозы 750 мг q8h на 14 день. Данная группа лекарственной дозы также имела максимальное снижение РНК HCV на 14 день. После 7-го дня в группах лекарственных доз 450 мг q8h и 1250 мг q12h уровни ALT и неоптерина уменьшались, в то время как уровни РНК HCV увеличивались. Эти данные наводят на мысль, что ингибирование репликации HCV посредством VX-950 приводит к заметному падению общей воспалительной активности, связанной с вирусной инфекцией.

VX-950 улучшает также повышенные уровни ALT у животных моделей (см. Международную заявку на патент 2005/025517). В частности, экспрессия протеиназы-SEAP WT-HCV у мышей SCID приводит к увеличению уровней ALT, которое может быть улучшено посредством обработки посредством VX-950. Экспрессия одной только протеиназы WT-HCV у мышей SCID приводит также к зависящему от времени и дозы увеличению уровней ALT.

Согласно другому воплощению, данное изобретение предоставляет способ лечения или предотвращения одного или более повреждений печени, воспаления печени, жировой дегенерации, жировой инфильтрации печени, NAFLD, NASH, алкогольной дегенерации и синдрома Рейе у пациента либо с HCV-положительной реакцией, либо с HCV-отрицательной реакцией. Данное изобретение предоставляет также способы предотвращения гепатита у пациента либо с HCV-положительной реакцией, либо с HCV-отрицательной реакцией.

Авторы изобретения продемонстрировали также, что VX-950 блокирует уклонение от механизмов иммунологического надзора in vitro.

VX-950 восстанавливает IFNЯ-зависимую экспрессию генов в инфицированных вирусом Sendai клетках Huh7. Активность промотора IFNЯ уменьшается в ответ на стимуляцию вируса Sendai в присутствии WT HCVpro. VX-950 позволяет обойти опосредованное HCVpro WT подавление промоторной активности IFNЯ (Фиг.15 и Фиг.16).

Более того, известно, что NS3/4A участвует в уклонении от механизмов врожденной иммунной защиты посредством, например, TRIF-зависимого механизма (так же как и вирусного процессинга полипротеинов). Указанное уклонение от иммунологического надзора приводит к вирусной персистенции. Таким образом, соединение, которое ингибирует и полипротеиновый процессинг вируса, и уклонение от механизмов врожденной иммунной защиты, является желательным. Выявлено, что VX-950 преимущественно этому способствует. В частности, VX-950 ингибирует in vitro расщепление TRIF, который представляет собой адапторный белок TLR3 (Фиг.8-10).

Не желая связывать себя какой-либо определенной теорией, авторы изобретения считают, что моделирование позволяет предположить, что VX-950 ингибирует расщепление TRIF с помощью протеиназы NS3. TRIF связывается с активным сайтом протеиназы NS3 на участке, который не является расщепляющим. VX-950 связывается с тем же самым нерасщепляющим участком активного сайта, что и TRIF, и блокирует расщепление TRIF.

Кроме того, авторы изобретения показали, что два вирусных варианта VX-950, A156T и A156V, проявляют пониженную способность расщеплять и TRIF, и 4A/4B (C. Lin и др. "In Vitro Studies of Cross-resistance Mutations Against two Hepatitis C Virus Serine Protease Inhibitors VX-950 and BILN 2061", J. Biol. Chem., (August 8, 2005). Поскольку данные вирусные варианты менее пригодны, они неэффективны и для вирусного полипротеинового процессинга, и для вирусной персистенции. Не желая связывать себя какой-либо определенной теорией, авторы изобретения считают, что это связано с пространственным барьером A156V, затрагивающим связывание с субстратами 4A/4B и TRIF (Фиг.11-13).

Это означает, что VX-950 действует и как прямая противовирусная композиция, и как ингибитор механизма уклонения от иммунологического надзора. Следовательно, данное изобретение также связано со способами ингибирования опосредованного протеиназой HCV механизма уклонения от иммунологического надзора у хозяина.

Эти результаты, совместно с данными in vivo, описанными в настоящем документе, указывают на эффективность VX-950 в качестве монотерапии.

Количество VX-950 согласно изобретению вводят в виде однократной лекарственной дозы или в виде более чем однократной лекарственной дозы. Если вводят раздельные лекарственные формы, каждую лекарственную форму вводят приблизительно в одно и то же время. Во избежание недоразумений следует отметить, что для схем приема лекарственных доз, предусматривающих введение более чем одной лекарственной дозы в день, можно принимать по одной или более таблеток, или каждый раз в течение дня можно принимать по одной или более таблеток (например, по 1 таблетке три раза в день или по 3 таблетки три раза в день). В большей части воплощений данного изобретения будут использованы по меньшей мере 2 таблетки на лекарственную дозу [на прием].

VX-950 может содержать один или более асимметрических атомов углерода и, таким образом, может встречаться в виде рацематов и смесей рацематов, единичных энантиомеров, смесей диастереоизомеров, а также в виде отдельных диастереомеров. Все такие формы изомеров данных соединений определенно входят в объем настоящего изобретения. Каждый стереогенный углерод может иметь или R-, или S-конфигурацию. D- и L-изомеры у N-пропилового участка цепи VX-950 определенно входят в объем настоящего изобретения. В предпочтительных воплощениях данного изобретения используется VX-950.

Как должно быть понятно специалистам в данной области, если способ согласно изобретению применялся ранее для профилактического лечения пациента, то и в том случае, если пациент станет инфицированным вирусом гепатита С, способ согласно изобретению может быть использован для лечения инфекции. Следовательно, одно воплощение данного изобретения связано со способами лечения или профилактики инфекции гепатита С у пациента.

В дополнение к лечению пациентов, инфицированных гепатитом C, способы согласно изобретению могут быть использованы для предупреждения инфицирования пациента гепатитом C. Таким образом, одно воплощение данного изобретения связано со способом предотвращения инфекции вирусом гепатита С у пациента, включающим в себя введение пациенту композиции или лекарственной формы согласно изобретению.

Способы согласно изобретению могут также включать в себя введение другого компонента, содержащего дополнительный агент, выбранный из иммуномодулирующего агента, противовирусного агента, ингибитора протеиназы HCV (отличного от VX-950); ингибитора другой мишени в жизненном цикле HCV (отличной от протеиназы NS3/4A); ингибитора входа в рибосому, широкого спектра вирусных ингибиторов или ингибитора цитохрома P-450; или их комбинаций. Дополнительный агент может быть выбран также из ингибитора входа в клетку вируса.

Согласно другому воплощению данное изобретение предоставляет способ, включающий в себя введение VX-950 и другого противовирусного агента, предпочтительно анти-HCV-агента. Такие противовирусные агенты включают в себя, без ограничения, следующие агенты: иммуномодуляторные агенты, такие как α-, Я- и γ-интерфероны или тимозин, ПЭГилированные производные соединения интерферона-α, и тимозин; другие противовирусные агенты, такие как рибавирин, амантадин и телбивудин; другие ингибиторы протеиназ гепатита C (ингибиторы NS2-NS3 и ингибиторы NS3-NS4A); ингибиторы других мишеней в жизненном цикле HCV, включая ингибиторы геликазы, полимеразы и металлопротеиназы; ингибиторы входа в рибосому; широкий спектр вирусных ингибиторов, таких как IMPDH-ингибиторы (например, соединения, описанные в Патентах Соединенных Штатов №№5807876, 6498178, 6344465, 6054472, Международной заявке 97/40028, Международной заявке 98/40381, Международной заявке 00/56331, и микофенольная кислота и ее производные, и включая, без ограничения, VX-497, VX-148, и/или VX-944); или комбинации любых из вышеперечисленных веществ.

Другие агенты (например, соединения неиммуномодуляторов или иммуномодуляторов) могут быть использованы в комбинации с соединением согласно изобретению, включая, без ограничения, те, которые подробно описаны в Международной заявке на патент 02/18369, которая включена в настоящее описание посредством ссылки (см., например, страницу 273, строки 9-22, и со строки 4 на странице 274 до строки 11 на странице 276, это сообщение специально включено сюда посредством ссылки).

Кроме того, другие агенты включают в себя таковые, описанные в различных опубликованных заявках на патент США. Данные публикации представляют дополнительные исследования соединений и способов, которые могут быть использованы в комбинации с VX-950 в способах согласно изобретению, в частности, для лечения гепатита. Предполагается, что любые такие способы и композиции могут быть использованы в сочетании со способами и композициями согласно настоящему изобретению. Для краткости описания этих публикаций они включены в описание настоящей заявки в виде ссылки на номер публикации, однако следует отметить, в частности, что описание соединений специально включено здесь посредством ссылки. Примеры таких публикаций включают в себя публикацию заявки на патент США №20040058982; публикацию заявки на патент США №20050192212; публикацию заявки на патент США №20050080005; публикацию заявки на патент США №20050062522; публикацию заявки на патент США №20050020503; публикацию заявки на патент США №20040229818; публикацию заявки на патент США №20040229817; публикацию заявки на патент США №20040224900; публикацию заявки на патент США №20040186125; публикацию заявки на патент США №20040171626; публикацию заявки на патент США №20040110747; публикацию заявки на патент США №20040072788; публикацию заявки на патент США №20040067901; публикацию заявки на патент США №20030191067; публикацию заявки на патент США №20030187018; публикацию заявки на патент США №20030186895; публикацию заявки на патент США №20030181363; публикацию заявки на патент США №20020147160; публикацию заявки на патент США №20040082574; публикацию заявки на патент США №20050192212; публикацию заявки на патент США №20050187192; публикацию заявки на патент США №20050187165; публикацию заявки на патент США №20050049220; и публикацию заявки на патент США №US2005/0222236.

Кроме того, другие агенты включают в себя, без ограничения, Albuferon™ (альбумин-интерферон альфа), имеющийся в распоряжении от Human Genome Sciences; PEG-INTRON® (регинтерферон альфа-2b, имеющийся в распоряжении от Schering Corporation, Kenilworth, NJ); INTRON-A® (VIRAFERON®, интерферон альфа-2b, имеющийся в распоряжении от Schering Corporation, Kenilworth, NJ); рибавирин (1-бета-D-рибофуранозил-1H-1,2,4-триазол-3-карбоксамид), имеющийся в распоряжении от ICN Pharmaceuticals, Inc., Costa Mesa, CA; описанный в Merck Index, статья 8365, Twelfth Edition); REBETROL® (Schering Corporation, Kenilworth, NJ); COPEGUS® (Hoffmann-La Roche, Nutley, NJ); PEGASYS® (ПЭГинтерферон альфа-2а, имеющийся в распоряжении от Hoffmann-La Roche, Nutley, NJ); ROFERON® (рекомбинантный интерферон альфа-2a, имеющийся в распоряжении от Hoffmann-La Roche, Nutley, NJ); BEREFOR® (интерферон альфа-2, производства Boehringer Ingelheim Pharmaceutical, Inc., Ridgefield, CT); SUMIFERON® (очищенная смесь природных альфа-интерферонов, таких как Sumiferon, производства Sumitomo, Japan); WELLFERON® (интерферон альфа-n1 производства Glaxo Wellcome Ltd., Great Britain); ALFERON® (смесь природных альфа-интерферонов, изготовленных компанией Interferon Sciences, и производства Purdue Frederick Co., CT); a-интерферон; природный альфа-интерферон 2a; природный альфа-интерферон 2b; ПЭГилированный альфа-интерферон 2a или 2b; консенсусный альфа-интерферон (Amgen, Inc., Newbury Park, CA); REBETRON® (Schering Plough, интерферон-альфа 2B + рибавирин); ПЭГилированный интерферон альфа (Reddy, K.R. и др. "Эффективность и безопасность ПЭГилированного (40-kd) интерферона альфа-2a, по сравнению с интерфероном альфа-2a, у пациентов с хроническим гепатитом С без цирроза (Hepatology, 33, pp.433-438 (2001); консенсус-интерферон (INFERGEN®) (Kao, J.H., и др., "Эффективность консенсус-интерферона в лечении хронического гепатита" J. Gastroenterol. Hepatol. 15, pp.1418-1423 (2000); Лимфобластный или "природный" интерферон; интерферон-тау (Clayette, P. и др., "IFN-тау, новый интерферон типа I с антиретровирусной активностью" Pathol. Biol. (Paris) 47, pp.553-559 (1999); интерлейкин-2 (Davis, G.L. и др., "Future Options for the Management of Hepatitis C." Seminars in Liver Disease, 19, pp.103-112 (1999); интерлейкин-6 (Davis и др. "Future Options for the Management of Hepatitis C." Seminars in Liver Disease 19, pp.103-112 (1999); интерлейкин-12 (Davis, G.L. и др., "Future Options for the Management of Hepatitis C." Seminars in Liver Disease, 19, pp.103-112 (1999); и соединения, которые усиливают проявление ответа Т-клетки вспомогательного типа 1 (Davis et al., "Future Options for the Management of Hepatitis C." Seminars in Liver Disease, 19, pp.103-112 (1999)). Включены в состав агентов также соединения, которые стимулируют синтез интерферона в клетках (Tazulakhova, E.B. и др., "Русский опыт в скрининге, исследовании и клиническом применении новых индукторов интерферона " J. Interferon Cytokine Res., 21 pp.65-73), включая, без ограничения, РНК с двойной молекулярной цепочкой, отдельно или в сочетании с тобрамицином и имиквимодом (3M Pharmaceuticals; Sauder, D.N. "Иммуномодуляторы и фармакологические свойства имиквимода" J. Am. Acad. Dermatol., 43 pp.S6-11 (2000)). См. также Международную заявку на патент 02/18369, в частности, со страницы 272, строки 15, до страницы 273, строки 8, описание этой публикации специально включено в настоящее описание посредством ссылки.

Как признано специалистами-практиками в данной области, VX-950 предпочтительно вводить перорально. Интерферон обычно не вводят перорально, хотя формы перорального введения и усовершенствуются. Тем не менее, ничто в данном документе не ограничивает способы или комбинации согласно изобретению какими бы то ни было специфическими лекарственными формами или схемами. Таким образом, каждый компонент комбинации согласно изобретению может быть введен по отдельности, вместе или в любом их сочетании. Как известно специалистам в данной области, лекарственные формы интерферона обычно измеряются в МЕд. (например, приблизительно от 4 миллионов МЕд. до приблизительно 12 миллионов МЕд.). Интерферон может также быть дозирован в микрограммах. Например, стандартная доза ПЭГ-интрона составляет 1,0-1,5 мкг/кг/нед. и пэгасиса - составляет 180 мкг/нед.

Ингибитор цитохром P450-монооксигеназы ("CYP"), используемый в связи с данным изобретением, является вероятным ингибитором метаболизма VX-950. Следовательно, ингибитор цитохром P450 монооксигеназы будет в итоге эффективно ингибировать метаболизм VX-950. Таким образом, ингибитор CYP вводят в таком количестве, чтобы биологическая доступность или воздействие на VX-950 увеличивалась по сравнению с VX-950 в отсутствие ингибитора CYP. Ингибиторы CYP включают в себя, без ограничения, ритонавир (Международная заявка на патент 94/14436), кетосоназол, тролеандомицин, 4-метилпиразол, циклоспорин, клометиазол, циметидин, итраконазол, флюконазол, миконазол, флювоксамин, флюоксетин, нефазодон, сертралин, индинавир, нелфинавир, ампренавир, фосампренавир, сакьюинавир, лопинавир, делавирдин, эритромицин, VX-944 и VX-497. Предпочтительно ингибиторы CYP включают в себя ритонавир, кетосоназол, тролеандомицин, 4-метилпиразол, циклоспорин и клометиазол.

Способы измерения способности соединения ингибировать цитохром P50 монооксидазную активность известны (см. патент США №6037157 и Yun, и др. Drug Metabolism & Disposition, vol. 21, pp.403-407 (1993)). Способы оценки влияния сопутствующих агентов при введении VX-950 и ингибитора CYP на субъекта также известны (Заявка на патент США 2004/0028755). Любые такие способы могут быть использованы в сочетании со способом согласно изобретению для определения фармакокинетического воздействия комбинации.

Одно воплощение данного изобретения связано со способом введения ингибитора CYP3A4 и VX-950.

Способы согласно изобретению могут включать в себя введение или сочетанное введение a) комбинаций VX-950 и другого агента; или b) VX-950 в более чем одной лекарственной форме. Введение сопутствующих агентов включает в себя введение каждого ингибитора в одной и той же лекарственной форме или в различных лекарственных формах. При введении ингибитора в различных лекарственных формах ингибиторы могут быть введены в разное время, включая приблизительно одновременное введение или введение в любой период вблизи момента введения других лекарственных форм. Отдельные лекарственные формы могут быть введены в любом порядке. То есть любые лекарственные формы могут быть введены до введения других лекарственных форм, одновременно с ними или после них.

VX-950 и любой дополнительный агент могут быть составлены в виде раздельных лекарственных форм. Альтернативно, для уменьшения количества лекарственных форм, вводимых пациенту, VX-950 с любым дополнительным агентом могут быть составлены в композицию вместе в любом сочетании. Любые раздельные лекарственные формы могут быть введены в одно и то же время или в разное время. Должно быть понятно, что лекарственные формы нужно вводить в такой период, чтобы биологический эффект был благоприятным.

В соответствии с режимами и лекарственными формами согласно изобретению, VX-950 присутствует в количестве для эффективного уменьшения вирусной нагрузки в образце или у пациента, где указанный вирус кодирует сериновую протеиназу NS3/4A, необходимую для жизненного цикла вируса (или в количестве, необходимом для эффективного осуществления способа согласно изобретению), и фармацевтически приемлемый носитель. С другой стороны, композиция согласно изобретению содержит дополнительный агент, как описано в данном документе. Каждый компонент может быть представлен в индивидуальных композициях, комбинациях композиций или в одиночной композиции.

Если фармацевтически приемлемые соли соединений применять в этих композициях, то соли предпочтительно получать из неорганических или органических кислот и оснований. В число таких солей кислот входят следующие: ацетат, адипат, альгинат, аспартат, бензоат, бензол сульфонат, бисульфат, бутират, цитрат, камфорат, сульфонат камфоры, циклопентан-пропионат, диглюконат, додецилсульфат, этансульфонат, фумарат, глюкогептаноат, глицерофосфат, гемисульфат, гептаноат, гексаноат, гидрохлорид, гидробромид, гидроиодид, 2-гидрокси этансульфонат, лактат, малеат, метансульфонат, 2-нафталенсульфонат, никотинат, оксалат, памоат, пектинат, персульфат, 3-фенил-пропионат, пикрат, пивалат, пропионат, сукцинат, тартрат, тиоцианат, тозилат и ундеканоат. Соли оснований включают в себя соли аммония, соли щелочных металлов, такие как соли натрия и калия, соли щелочноземельных металлов, такие как соли кальция и магния, соли органических оснований, такие как соли дициклогексиламина, N-метил-D-глюкамин и соли аминокислот, такие как аргинин, лизин и пр.

Кроме того, основные азот-содержащие группы могут быть кватернизованы с такими агентами, как низшие алкильные галогениды, такие как метил, этил, пропил и бутилхлорид, бромиды и йодиды; диалкилсульфаты, такие как диметил, диэтил, дибутил и диамилсульфаты, длинноцепочечные галогениды, такие как децил, лаурил, миристил и стеарилхлориды, бромиды и йодиды, аралкильные галогениды, такие как бензил и фенетилбромиды и пр. В силу этого получают водо- или жирорастворимые или диспергируемые продукты.

Соединения, применяемые в композициях и способах согласно настоящему изобретению, могут быть модифицированы также посредством добавления подходящих функций для усиления селективных биологических свойств. Такие модификации известны в данной области и включают в себя такие модификации, которые увеличивают биологическое проникновение в данную биологическую систему (например, кровь, лимфатическую систему, центральную нервную систему), увеличивают пероральную доступность, увеличивают растворимость, позволяющую введение посредством инъекции, видоизменяют метаболизм и изменяют скорость экскреции.

Фармацевтически приемлемые носители, которые могут быть использованы в данных композициях, включают в себя, без ограничения, ионообменники, оксид алюминия, стеарат алюминия, лецитин, белки сыворотки, такие как сывороточный альбумин человека, буферные субстанции, такие как фосфаты, глицин, сорбиновая кислота, сорбат калия, частичные глицеридовые смеси насыщенных растительных жирных кислот, вода, соли или электролиты, такие как протаминсульфат, двунатриевая кислая фосфорнокислая соль, калиевая фосфорнокислая соль, хлорид натрия, соли цинка, коллоидный кремнезем, трисиликат магния, поливинилпирролидон, вещества на основе целлюлозы, полиэтиленгликоль, натрий-карбоксиметилцеллюлоза, полиакрилаты, парафины, полиэтилен-полипропиленоксид-блок-сополимеры, полиэтиленгликоль и ланолин.

Согласно предпочтительному воплощению, композиции согласно изобретению составляют в композицию для фармацевтического введения млекопитающему, в частности человеку.

Такие фармацевтические композиции согласно изобретению (так же как и композиции для применения в способах, комбинациях, наборах и пакетах согласно изобретению) можно вводить перорально, парентерально, сублингвально, путем ингаляционного впрыскивания, местно, ректально, назально, буккально, вагинально или посредством имплантированного резервуара. Термин "парентеральный", используемый в данном документе, включает в себя способы подкожной, внутривенной, внутримышечной, внутрисуставной, внутрисиновиальной, надчревной, интратекальной, внутрипеченочной, вводимой внутрь пораженной ткани и внутричерепной инъекции или инфузии. Предпочтительно пероральное или внутривенное введение композиций. Более предпочтительно, чтобы композиции вводились перорально.

Стерильные инъекционные формы композиций согласно изобретению могут быть водными или маслянистыми суспензиями. Указанные суспензии могут быть составлены в композицию согласно техническим приемам, известным в данной области, с применением подходящих диспергирующих или смачивающих агентов и суспендирующих агентов. Стерильный инъекционный препарат может также быть стерильным инъекционным раствором или суспензией в нетоксическом приемлемом для парентерального введения разбавителе или растворителе, как, например, раствор в 1,3-бутандиоле. Среди подходящих сред и растворителей, которые могут быть использованы, можно отметить воду, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, стерильные нелетучие масла традиционно применяют в качестве растворителя или суспендирующей среды. Для этой цели можно использовать любое мягкое нелетучее масло, включая синтетические моно- или диглицериды. Жирные кислоты, такие как олеиновая кислота и ее глицеридные производные, применимы для приготовления инъецируемых композиций, так же как и природные фармацевтически приемлемые масла, такие как оливковое масло или касторовое масло, особенно в их полиоксиэтиленовых вариантах. Такие масляные растворы или суспензии могут содержать также длинноцепочечный спиртовой разбавитель, такой как карбоксиметилцеллюлоза или подобные диспергирующие агенты, которые обычно используются в композиции фармацевтически приемлемых лекарственных форм, включая эмульсии и суспензии. Другие обычно используемые поверхностно-активные вещества, такие как Tween, Span и другие эмульгирующие агенты или усилители биодоступности, обычно используемые в производстве фармацевтически приемлемых твердых, жидких или других лекарственных форм, также могут быть использованы для создания композиции согласно изобретению.

В композициях согласно изобретению, содержащих VX-950 и дополнительный агент, VX-950 и дополнительный агент должны присутствовать в количестве от уровня лекарственных доз приблизительно от 10 и до 100%, а более предпочтительно приблизительно от 10 до 80% от лекарственной дозы, вводимой обычно в режиме монотерапии.

Фармацевтические композиции согласно изобретению могут быть введены перорально в любой приемлемой для перорального введения лекарственной форме, включая, без ограничения, капсулы, таблетки, пилюли, порошки, гранулы, водные суспензии или растворы. В случае таблеток для перорального применения носители, которые обычно используют, включают в себя лактозу и кукурузный крахмал. Также обычно добавляют смазывающие агенты, такие как стеарат магния. Для перорального введения в виде капсул используют разбавители, включая лактозу и высушенный кукурузный крахмал. Если для перорального применения необходимы водные суспензии, активный ингредиент комбинируют с эмульгирующими и суспендирующими агентами. При необходимости, можно также добавлять определенные подсластители, ароматизаторы или красители. Приемлемые жидкие лекарственные формы включают в себя эмульсии, растворы, суспензии, сиропы и эликсиры.

С другой стороны, фармацевтические композиции согласно изобретению можно использовать в виде суппозиториев для ректального введения. Суппозитории можно приготовить, смешивая агент с подходящим нераздражающим наполнителем, который тверд при комнатной температуре, но становится жидким при ректальной температуре и, следовательно, будет растворяться в прямой кишке, высвобождая лекарственное средство. Такие материалы включают в себя масло какао, воск и полиэтиленгликоли.

Фармацевтические композиции согласно изобретению можно вводить также местно, особенно когда мишенью для лечения являются области или органы, легкодоступные для местной аппликации, включая заболевания глаз, кожи или нижний отдел кишечного тракта. Подходящие композиции лекарственных форм для местного применения легко приготовить для каждой из указанных областей или органов.

Как признано в данной области, фармацевтические композиции согласно изобретению могут быть введены также в виде липосом.

Авторы изобретения продемонстрировали, что VX-950 биологически доступен при пероральном введении. Следовательно, предпочтительными фармацевтическими композициями согласно изобретению являются композиции для перорального введения.

Для ингибитора CYP типичными будут уровни лекарственных доз приблизительно от 0,001 до 200 мг/кг веса тела в день. Более типичными будут уровни лекарственных доз приблизительно от 0,1 до 50 мг/кг или приблизительно от 1,1 до приблизительно 25 мг/кг в день.

Предпочтительные лекарственные формы ритонавира, см. патент Соединенных Штатов №6037157 и ссылки на указанные в нем документы: патент Соединенных Штатов №5484801, заявка на патент США 08/402,690, и Международные заявки на патент WO 95/07696 и WO 95/09614.

Введение лекарственных средств согласно изобретению может быть использовано в качестве постоянной или экстренной терапии. Количество активного ингредиента, которое можно комбинировать с материалами-носителями для получения разовой лекарственной формы, будет отличаться, в зависимости от конкретного организма, подвергаемого лечению, и, в частности, от способа введения. Типичный препарат будет содержать приблизительно от 5 до 95% активного соединения (w/w). Предпочтительно такие препараты содержат приблизительно от 20 до 80% активного компонента.

При улучшении состояния пациента можно вводить, если это необходимо, поддерживающую дозу соединения, композиции или комбинации согласно изобретению. Следовательно, лекарственные формы или частота введения, или оба этих фактора могут быть снижены, в зависимости от симптомов, до уровня, при котором у пациента сохраняется состояние улучшения, когда же симптомы снизятся до желаемого уровня, лечение будет приостановлено. Однако пациенты могут нуждаться в длительном периодическом лечении при возврате симптомов заболевания.

Также должно быть понятно, что специфическая дозировка и схема лечения в случае любого конкретного пациента будет зависеть от различных факторов, включая активность применяемого специфического соединения, возраст, вес тела, общее состояние здоровья, пол, диету, время введения, скорость экскреции, сочетание лекарственных средств, мнение лечащего врача и степень тяжести конкретного заболевания, которое предстоит подвергнуть лечению, предшествующую историю лечения, сопутствующие заболевания или сопутствующее медикаментозное лечение, исходный уровень вирусной нагрузки, расовое происхождение, продолжительность заболевания, состояние фунции печени и степень фиброза/цирроза печени и цель терапии (устранение циркулирующего вируса в трансплантате или ликвидация вируса). Количество активных ингредиентов также будет зависеть от конкретного описанного соединения и присутствия или отсутствия и природы дополнительного противовирусного агента в композиции.

Согласно другому воплощению настоящее изобретение связано со способом лечения пациента, инфицированного вирусом, отличающимся кодируемой вирусом сериновой протеиназой NS3/4A, которая необходима для жизненного цикла вируса, путем введения указанному пациенту фармацевтически приемлемой композиции согласно изобретению. Предпочтительно способы согласно изобретению применяют для лечения пациента, страдающего от инфекции HCV. Такое лечение может полностью уничтожить вирусную инфекцию или уменьшить ее тяжесть. Предпочтительно, если пациентом является млекопитающее. Более предпочтительно, когда пациентом является человек.

Лекарственные формы, описанные в данном документе, предпочтительны для применения in vivo. Тем не менее, подразумевается, что нет никаких ограничений для применения указанных количеств VX-950 для любых целей. Кроме того, в другом воплощении настоящего изобретения предоставляется способ предварительной обработки биологической субстанции, предназначенной для введения пациенту, включающий в себя стадию контактирования указанной биологической субстанции с фармацевтически приемлемой композицией, содержащей соединение согласно настоящему изобретению. Такие биологические субстанции включают в себя, без ограничения, кровь и ее компоненты, такие как плазма, тромбоциты, субпопуляции клеток крови и пр; органы, такие как почка, печень, сердце, легкое и пр.; сперма и яйцеклетка; костный мозг и его компоненты, и другие жидкости для вливания пациенту, такие как физиологический раствор, декстроза и пр.

Данное изобретение предоставляет также способ приготовления композиции, содержащей VX-950 или его фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически приемлемый носитель, адъювант или наполнитель, включающий в себя стадию комбинирования VX-950 или его фармацевтически приемлемой соли и фармацевтически приемлемого носителя, адьюванта или наполнителя, где дозировка VX-950 в композиции находится в соответствии с любым воплощением данного изобретения. Альтернативное воплощение данного изобретения связано со способом, согласно которому композиция содержит один или более дополнительных агентов, как описано в данном документе.

Данное изобретение предоставляет также терапевтические схемы, включающие в себя VX-950 или его фармацевтически приемлемую соль в дозировках, описанных в данном документе. В альтернативном воплощении данного изобретения терапевтическая схема, кроме того, включает в себя один или более дополнительных агентов, как описано в данном документе.

Фармацевтические композиции могут также быть прописаны пациенту в "упаковках для пациента", содержащих полный курс лечения в одной упаковочной таре, обычно в блистерной упаковке. Упаковки для пациента имеют преимущество перед традиционно прописываемыми лекарствами, когда фармацевт разделяет для пациента общее количество фармацевтической формы нерасфасованного лекарственного средства, причем пациент всегда имеет доступ к вкладышу в упаковочной таре, содержащемуся в упаковке для пациента, в норме отсутствующий в традиционных рецептах. Показано, что включение вкладыша в упаковочную тару повышает вероятность того, что пациент будет следовать инструкциям врача.

Нужно понимать, что введение комбинации согласно изобретению при наличии единой упаковки для пациента или упаковок для пациента каждой из композиций, содержащийся внутри упаковочной тары вкладыш с инструкциями для пациента, касающимися правильного применения согласно изобретению, являются желательной дополнительной особенностью данного изобретения.

Согласно следующему аспекту настоящего изобретения предоставляется упаковка, содержащая по меньшей мере VX-950 (в лекарственных дозах согласно изобретению), и информационный вкладыш, содержащий инструкции по применению комбинации согласно изобретению. Любая композиция, лекарственная форма, терапевтическая схема или другое воплощение данного изобретения могут быть представлены в фармацевтическом пакете. В альтернативном воплощении данного изобретения фармацевтический пакет дополнительно содержит один или более дополнительных агента, как описано в данном документе. Дополнительный агент или агенты могут быть представлены в том же самом пакете или в отдельных пакетах.

Другой аспект данного изобретения связан с упакованным набором для применения пациентом при лечении инфекции HCV или предупреждения инфекции HCV (или для применения в соответствии с другим способом согласно изобретению), содержащим одну или множество фармацевтических композиций каждого из фармацевтических компонентов; контейнер для хранения фармацевтической композиции до введения; и инструкции для выполнения пациентом введения лекарственного средства эффективным способом для лечения или предупреждения инфекции HCV.

Следовательно, данное изобретение связано с наборами для одновременного или последовательного введения лекарственной дозы VX-950 (и необязательно дополнительного агента). Обычно такой набор будет содержать, например, композицию каждого соединения и необязательно дополнительный агент(ы) в фармацевтически приемлемом носителе (и в составе одной или нескольких фармацевтических композиций) и написанных инструкциях для одновременного или последовательного введения.

В другом воплощении предоставляется набор в упаковке, который содержит одну или более лекарственных форм для самостоятельного введения; контейнер, предпочтительно герметичный, для вмещения лекарственных форм во время хранения и перед применением; и инструкции для осуществления пациентом введения лекарственного средства. Инструкции обычно должны быть написаны на вкладыше упаковочной тары, этикетке и/или на других компонентах набора и лекарственной форме или формах, как описано выше. Каждая лекарственная форма может индивидуально вставляться в контейнер, как, например, в лист металлической фольги слой пластика, отдельно от других, в индивидуальные ячейки или пузырьки, или же лекарственные формы могут быть вставлены в отдельный контейнер, например пластиковый баллон. Такие наборы обычно должны включать в себя также устройство для упаковки индивидуальных компонентов набора, т.е. лекарственных форм, контейнера и инструкции по применению. Такое устройство для упаковки может иметь форму картонной или бумажной коробки, пакета из пластика или фольги и пр.

Набор согласно изобретению может быть связан с любым воплощением данного изобретения, так же как и любой композицией, лекарственной формой, терапевтической схемой или фармацевтической упаковкой.

Упаковки и наборы согласно изобретению необязательно содержат множество композиций или лекарственных форм. Соответственно, упаковки и наборы, содержащие одну композицию или более чем одну композицию, должны входить в объем данного изобретения.

Хотя определенные примеры воплощений и описаны ниже, нужно принять во внимание, что соединения согласно изобретению могут быть получены согласно способам, описанным в основном выше, с применением подходящих стартовых материалов, как правило, доступных специалистам в данной области.

Все цитируемые документы включены здесь посредством ссылки.

Для того, чтобы более полно понять данное изобретение, далее приведены препаративные и тестирующие примеры. Данные примеры приведены только для иллюстрационной цели и не должны никоим образом истолковываться как ограничение объема изобретения.

Пример 1

Протокол исследования клеточного репликона HCV

Клетки, содержащие репликон вируса гепатита C (HCV), поддерживали в DMEM, содержащем 10% эмбриональную бычью сыворотку (FBS), 0,25 мг на мл G418, с соответствующими добавками (среда A).

В 1 день репликон-содержащий клеточный монослой обрабатывали смесью трипсин:EDTA, отделяли и затем разбавляли средой А до конечной концентрации 100000 на мл wit. 10000 клеток в 100 мкл вносили в каждую лунку 96-луночного планшета для культуры тканей и культивировали в течение ночи в инкубаторе для культуры тканей при 37^oC.

На 2 день осуществляли серийное разведение соединения (в 100% DMSO) в DMEM, содержащем 2% FBS, 0,5% DMSO, с соответствующими добавками (среда B). Конечную концентрацию DMSO поддерживали равной 0,5% в процессе серийного разведения.

Среду, покрывающую репликон-содержащий монослой клеток, удаляли и затем добавляли среду B, содержащую соединение в различных концентрациях. В другие лунки добаляли среду B без соединения в качестве контроля.

Клетки инкубировали с соединением или 0,5% DMSO в среде B в течение 48 часов в инкубаторе для культуры тканей при 37°C. По окончании 48-часовой инкубации среду удаляли и репликон-содержащий монослой клеток однократно промывали PBS и хранили при -80°C до экстракции РНК.

Культуральные планшеты с обработанными репликон-содержащими монослоями клеток размораживали и добавляли к клеткам в каждую лунку фиксированное количество РНК другого вируса, такого как вирус бычьей вирусной диареи (BVDV). Реагенты для экстракции РНК (такие как реагенты из наборов RNeasy) добавляли к клеткам незамедлительно, чтобы избежать деградации РНК. Суммарную РНК экстрагировали согласно инструкции изготовителя, с модификацией для улучшения эффективности и устойчивости экстракции. В заключение, суммарную клеточную РНК, включая РНК репликона HCV, элюировали и хранили при -80°C до следующей обработки.

Количественный анализ Taqman RT-ПЦР в реальном масштабе времени проводили, используя два набора специфических праймеров и зонд. Один набор предназначался для HCV, а другой - для BVDV. Суммарные экстракты РНК из обработанных HCV-репликон-содержащих клеток добавляли к реакциям ПЦР для определения количества обоих типов РНК - и HCV, и BVDV - в одной и той же лунке для проведения ПЦР. Экспериментальные сбои маркировали и отбраковывали, основываясь на уровне РНК BVDV в каждой лунке. Уровень РНК HCV в каждой лунке подсчитывали, сверяясь со стандартной кривой протекания реакции в том же ПЦР-планшете. Процент ингибирования или уменьшения уровня РНК HCV в результате обработки соединением подсчитывали, используя DMSO или контроль без соединения в качестве 0% ингибирования. IC₅₀ (концентрация, при которой наблюдали 50% ингибирования уровня РНК HCV) подсчитывали из титрационной кривой любого данного соединения.

VX-950 проявлял значительную активность при анализе репликона. Показано, что VX-950 имеет IC₅₀, равную 240 нг/мл, и IC₉₀, равную 476 нг/мл.

Пример 2

Протокол исследования Ki HCV

Микроколоночный метод HPLC для разделения продуктов и субстрата 5AB

Субстрат:

NH₂-Glu-Asp-Val-Val-(alpha)Abu-Cys-Ser-Met-Ser-Tyr-COOH

Стандартный раствор 20 мМ 5AB (или концентрацию, выбранную по усмотрению исполнителя) готовили в DMSO вес/0,2 M DTT. Данный раствор хранили в аликвотных количествах при -20^oC.

Буфер: 50 мМ HEPES, pH 7,8; 20% глицерин; 100 мМ NaCl

Полный анализируемый объем составлял 100 мкл

	X1 (мкл)	Концентр. в опыте
Буфер	86,5	См. выше
5 мМ KK4A	0,5	25 мкл
1 M DTT	0,5	5 мМ
DMSO или ингибитор	2,5	2,5% об./об.
50 мкМ tNS3	0,05	25 нМ
250 мкМ 5AB (инициация)	20	25 мкМ

Смешивали буфер, KK4A, DTT и tNS3; распределяли по 78 мкл в каждую лунку 96-луночного планшета. Инкубировали при 30°C в течение ~5-10 мин.

2,5 мкл соответствующей концентрации тестируемого соединения разбавляли DMSO (в контроле только DMSO) и добавляли в каждую лунку. Инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин.

Реакцию инициировали добавлением 20 мкл 250 мкМ субстрата 5AB (25 мкМ концентрация эквивалентна или немного ниже, чем Km для 5AB).

Инкубировали в течение 20 мин при 30°C.

Завершали реакцию добавлением 25 мкл 10% ТФУ.

Переносили 120 мкл аликвоты в колонки HPLC.

Отделяли SMSY продукт от субстрата и KK4A следующим образом:

Способ разделения посредством микроколоночной хроматографии:

Инструменты: Agilent 1100

Дегазатор G1322A

Бинарный насос G1312A

Автоматический дозатор G1313A

Термостатическая камера колонки G1316A

Детектор-диодная матрица G1315A

Колонка:

Phenomenex Jupiter; 5 микрон C18; 300 ангстрем, 150×2 мм; P/0 00F-4053-B0

Колоночный термостат: 40°C

Вливаемый объем: 100 мкл

Раствор A = вода с маркировкой «для HPLC» + 0,1% ТФУ

Раствор B = ацетонитрил с маркировкой «для HPLC» + 0,1% ТФУ

Время (мин)	%B	Поток (мл/мин)	Макс. давл.
0	5	0,2	400
12	60	0,2	400
13	100	0,2	400
16	100	0,2	400
17	5	0,2	400

Время остановки: 17 мин.

Время после прогона: 10 мин.

Пример 3

VX-950 изучали в рандомизированном исследовании в режиме повышения однократной дозы двойным слепым методом, с контролем плацебо. К исследованию привлекали 25 здоровых мужчин-добровольцев. Каждый субъект многократно получал одноразовые дозы VX-950 в отдельности в течение по меньшей мере 7 дней, 3 дозы VX-950 в режиме увеличения уровней доз и 1 дозу плацебо.

Оценивали дозы от 25 мг до 1250 мг. Применяли схему повышения доз, при которой комбинируют удвоение дозы и модифицированный ряд Фибоначчи, чтобы добиться активности в области низких доз и стабильности в области высоких доз.

VX-950 в высокой степени толерантен при всех уровнях доз, и о серьезных неблагоприятных случаях в течение исследования не сообщалось. Не наблюдалось увеличения неблагоприятных случаев при повышении уровней дозы.

Фармакокинетические анализы проводили, используя приближение статистического момента. На Фиг.1A и Фиг.1B показаны профили зависимости средних значений концентрации от времени. Селективные фармакокинетические параметры изображены на Фиг.2A-2D. Фармакокинетический анализ показал, что VX-950 абсорбировался со средним значением t_max, составляющим 3 часа. Менее чем 2% VX-950 выводилось в неизмененном виде с мочой, что указывает на то, что лекарственное средство выводится преимущественно путем метаболизма.

Пример 4

Исследование инфекционности вируса

При исследовании инфекционности вируса определили, что значение IC₅₀ для VX-950 составляет 196 нг/мл.

Пример 5

VX-950 изучали в рандомизированном исследовании в режиме повышения многогократной дозы слепым методом, с контролем плацебо, на 24 здоровых субъектах и на 34 субъектах с положительной реакцией на гепатит C.

Здоровые субъекты были разделены на 3 группы, по 8 субъектов в каждой. В каждой группе 6 субъектов получали VX-950, а 2 субъекта получали плацебо. Здоровые субъекты получали лекарственные дозы VX-950, равные 450 мг, 750 мг или 1250 мг q8h, в течение 5 дней подряд. Здоровые субъекты были в возрасте 18-65 лет (включительно) с отрицательной реакцией на гепатит B, гепатит C и ВИЧ. Мужчины имели индекс массы 18,5-29,0 кг/м² (включительно). Женщины имели индекс массы 18,5-32,5 кг/м² (включительно).

Субъекты с положительной реакцией на гепатит C (генотип 1) были разделены на 3 группы, по 12 субъектов в каждой. В каждой группе 10 субъектов получали VX-950, а 2 субъекта получали плацебо; в группе, получавшей 750 мг q8h, 2 субъекта вышли из эксперимента до начала лечения, поэтому 8 субъектов получали VX-950, а 2 получали плацебо. Субъектов с положительной реакцией на HCV лечили дозой VX-950 в 450 мг или 750 мг q8h или 1250 мг q12h в течение 14 дней подряд.

VX-950 в высокой степени толерантен при всех уровнях доз, и серьезных неблагоприятных случаев в течение исследования не было; были сообщения о легких и умеренных неблагоприятных явлениях. Все субъекты завершили исследование.

Среди субъектов с положительной реакцией на HCV следующее процентное соотношение субъектов было обработано просто плацебо, 450 мг q8h, 750 мг q8h и 1250 мг q12h: 33,2%, 10%, 12,5% и 30% соответственно.

Субъектов с положительной реакцией на HCV после обработки тестировали для мониторинга уровней РНК HCV по отношению к исходному уровню.

Таблица 1
Характеристики исходного уровня субъекта
		VX-950
	Плацебо (n=6)	450 мг q8h (n=10)	750 мг q8h (n=8)	1250 мг q12h (n=10)
Пол, n (%)
Женский	3 (50,0)	8 (80,0)	3 (37,5)	8 (80,0)
Мужской	3 (50,0)	2 (20,0)	5 (62,5)	2 (20,0)
Раса, n (%)
Белая европеоидная	6 (100)	10 (100)	8 (100)	10 (100)
Возраст, лет
Среднее	54,0	47,0	52,0	43,5
Интервал	31-64	33-64	46-64	25-62
BMI, кг/м2
Среднее	24,8	25,8	27,0	22,2
Интервал	21,0-29,0	22,6-28,4	21,1-29,4	21,2-24,3
РНК HCV, log10 МЕд./мл
Среднее±SD	6,28±0,47	6,54±0,50	6,18±0,47	6,46±0,41
Приблизительное количество лет инфициров. HCV,
Среднее±SD	7,3±7,6	9,2±11,5	7,2±7,6	6,9±6,7
HCV подтип, n (%)
1*	1 (16,7)	0	2 (25,0)	1 (10,0)
1a	2 (33,3)	3 (30,0)	1 (12,5)	5 (50,0)
1b	3 (50,0)	7 (70,0)	5 (62,5)	4 (40,0)
До лечения гепатита С, n (%)	4 (66,7)	9 (90,0)	7 (87,5)	7 (70,0)
*Образцы, взятые у 4 пациентов, были классифицированы как генотип 1, потому что исследование не установило, относятся ли они к генотипу 1a или 1b
BMI - индекс массы тела; HCV - вирус гепатита C; q8h -каждые 8 часов; q12h - каждые 12 часов; SD - стандартное отклонение. Изменение РНК HCV от исходного уровня, исследование VX04-950-101

Таблица 2
Максимальные изменения в РНК HCV по категориям
		VX-950
Изменение от исходного уровня РНК HCV (log10 МЕд./мл)	Плацебо (n=6)	450 мг q8h (n=10)	750 мг q8h (n=8)	1250 мг q12h (n=10)
>-1 до <0	6 (100,0)	0	0	0
>-2 до <-1	0	0	0	0
>-3 до <-2	0	1 (10,0)	0	1 (10,0)
>-4 до <-3	0	7 (70,0)	3 (37,5)	9 (90,0)
>-5 до <-4	0	0	3 (37,5)	0
≥-5	0	2 (20,0)	2 (25,0)	0
Значения n (%) часов. Каждые 8 часов (q8h); каждые 12 часов (q12h)

Пример 6

Композицию пероральной лекарственной формы готовили следующим образом. VX-950 и повидон K29/32 разводили в метиленхлориде, затем добавляли лаурилсульфат натрия и диспергировали в растворе до образования гомогенной суспензии. Суспензию сушили путем распыления при температуре входного канала 90°C и температуре выходного канала 56°C, и продукт собирали из области низкого давления. Высушенную путем распыления дисперсию сушили в псевдоожиженном слое при 75°C в течение 8 часов. Полученный порошок количественно распределяли по стеклянным пузырькам и только непосредственно перед применением ресуспендировали в воде (30 мл) для введения субъектам. При дозировании каждый пузырек промывали 3 отдельными порциями воды с суммарным объемом воды 90 мл.

Твердая дисперсия VX-950
% (w/w)	Ингредиент
49,5	VX-950	Сушка распылением CH2Cl2
49,5	PVP K29/32
1	SLS

Пример 7

РНК HCV обнаруживали, используя Roche COBAS TaqMan HCV/HPS анализ, доступный от Roche molecular Diagnostics. Имеются и другие виды анализа.

Пример 8

Концентрации сывороточного неоптерина измеряли, используя количественный конкурентный метод ELISA (ELItest® Neopterin, Brahms, Hennigsdorf, Germany), перед обработкой, на 7 и 14 дни, и в дни 7-10 - последующее наблюдение. Выявленный нижний предел (LLD) составлял 2 нмол/л.

Пример 9

Сывороточный ALT измеряли, используя коммерчески доступные способы.

Пример 10

Подтверждение наличия VX-950 в плазме человека

VX-950

Исходный раствор: 0,961 мг/мл VX-950 в 2-пропаноле (10,0 мл)

Исходный раствор для разбавления 1: 96,1 мкг/мл VX-950 в 2-пропаноле (5,00 мл)

Исходный раствор для разбавления 2: 9,61 мкг/мл VX-950 в 2-пропаноле (10,0 мл)

Исходный раствор для разбавления 3: 0,961 мкг/мл VX-950 в 2-пропаноле (10,0 мл)

Исходный раствор и исходный раствор для разбавления хранили в закрытых пробкой боросиликатных трубках (11,5 мл) при -20°C.

Внутренний стандарт (Соединение 1)

Исходный раствор: 1,00 мг/мл соединения 1 (закрытый структурный аналог VX-950) в 2-пропаноле (5,00 мл)

Рабочий раствор: 300 нг/мл соединения 1 в ацетонитриле (100 мл)

Исходный раствор хранили в закрытой пробкой боросиликатной трубке (11,5 мл); рабочий раствор хранили в закрытой пробкой боросиликатной бутылке (100 мл), все растворы хранили при -20°C.

Приготовление образца

Аликвоты плазмы по 100 мкл, 100 мкл внутреннего стандартного рабочего раствора (или ацетонитрила для пустых образцов) добавляли в трубку экстракционного аппарата. После перемешивания путем встряхивания в течение 30 секунд добавляли 500 мкл толуола и экстракцию проводили путем перемешивания встряхиванием в течение 30 секунд. После центрифугирования при 3000 об/мин при +4°C в течение 5 минут водный слой замораживали в смеси ацетона и сухого льда, а органический слой переносили в другую трубку экстракционного аппарата. Добавляли 50 мкл 2,2-диметоксипропана и образцы выпаривали до сухости в атмосфере азота при приблизительно +30°C. Осадок разбавляли в 300 мкл смеси гептан: ацетон (90:10, об./об.) [или гептан: THF (80:20, об./об.)] путем перемешивания посредством встряхивания в течение 60 секунд. Образец переносили в инъекционный пузырек и аликвоту в 60 мкл вводили в систему для хроматографии.

Режим хроматографии

Мобильная фаза: (изократическое элюирование) гептан:ацетон:метанол (80:19:1, об./об./об.)

Свежеприготовленный раствор: ацетонитрил: ацетон: метанол: муравьиная кислота (40:60:1:1, об./об./об./об.)

Температура в колонке: -1°C

Скорость потока: 1,00 мл/мин (в котором 0,750 мл/мин составляет мобильная фаза и 0,250 мл/мин - свежеприготовленный раствор) (полностью перемещенный на детектор)

Объем инъекционного раствора: 60 мкл

Температура автоматического дозатора: +3°C

Дополнительные ссылки

Wasley A, Alter MJ. Epidemiology of hepatitis C: geographic differences and temporal trends. Semin Liver Dis 2000; 20: 1-16.

Alter HJ, Seeff LB. Recovery, persistence, and sequelae in hepatitis C virus infection: a perspective on long-term outcome. Semin Liver Dis 2000; 20: 17-35.

Brown RS Jr, Gaglio PJ. Scope of worldwide hepatitis C problem. Liver Transpl 2003; 9: S10-S13.

DeFrancesco R, Migliaccio G. Challenges and successes in developing new therapies for hepatitis C. Nature 2005; 436(7053): 953-60.

Bowen DG, Walker CM. The origin of quasispecies: cause or consequence of chronic hepatitis C viral infection? J Hepatol 2005; 42: 408-17.

Hoofnagle JH. Course and outcome of hepatitis C. Hepatology 2002; 36: S21-S29.

Brown RS Jr. Hepatitis C and liver transplantation. Nature 2005; 436(7053): 973-8.

Chisari FV. Unscrambling hepatitis C virus-host interactions. Nature 2005; 436 (7053): 930-2.

Все цитируемые здесь документы включены в настоящее описание посредством ссылки.

Несмотря на то, что авторы изобретения описали ряд воплощений данного изобретения, очевидно, что основные модели могут быть изменены для получения других воплощений, в которых используются соединения и способы согласно настоящему изобретению. Следовательно, следует учитывать, что объем настоящего изобретения должен определяться прилагаемой формулой изобретения, а не специфическими воплощениями, которые представлены выше в виде примеров.

Claims (29)

1. Способ лечения или предупреждения у пациента инфекции, вызванной вирусом гепатита С, включающий введение пациенту VX-950 или его фармацевтически приемлемой соли в количестве приблизительно от 100 до 1500 мг.

2. Способ по п.1, где VX-950 или его фармацевтически приемлемая соль представлены в количестве приблизительно от 300 до 1500 мг.

3. Способ по п.2, где VX-950 или его фармацевтически приемлемая соль представлены в количестве приблизительно от 300 до 1250 мг.

4. Способ по п.3, где VX-950 или его фармацевтически приемлемая соль представлены в количестве приблизительно 450 мг.

5. Способ по п.3, где VX-950 или его фармацевтически приемлемая соль представлены в количестве приблизительно 750 мг.

6. Способ по п.3, где VX-950 или его фармацевтически приемлемая соль представлены в количестве приблизительно 1250 мг.

7. Способ по п.1, где указанное количество VX-950 вводят один раз в день.

8. Способ по п.1, где указанное количество VX-950 вводят два раза в день.

9. Способ по п.1, где указанное количество VX-950 вводят три раза в день.

10. Способ по любому из пп.1-9, включающий введение дополнительного агента, выбранного из иммуномодулирующего агента; противовирусного агента; другого ингибитора протеиназы NS3/4A HCV; другого ингибитора жизненного цикла HCV, отличного от ингибитора протеиназы NS3/4A; ингибитора входа в рибосому, вирусного ингибитора широкого спектра действия; другого ингибитора цитохрома Р-450; ингибитора внедрения вируса в клетку; или комбинации указанных агентов.

11. Способ по п.10, где указанным иммуномодулирующим агентом является α-, β- или γ-интерферон или тимозин; противовирусным агентом является рибавирин, амантадин или телбивудин; или другим ингибитором жизненного цикла HCV является ингибитор геликазы, полимеразы или металлопротеиназы HCV.

12. Способ по п.1, включающий введение пациенту VX-950 в количестве приблизительно 750 мг 3 раза в день каждые 8 ч.

13. Способ лечения пациента, инфицированного вирусом гепатита С, включающий введение пациенту VX-950 в количестве, эффективном для достижения уменьшения РНК вируса гепатита С в плазме по меньшей мере приблизительно в 4 раза по шкале log₁₀.

14. Способ по п.13, включающий введение пациенту VX-950 в количестве, эффективном для понижения РНК вируса гепатита С в плазме до невыявляемых уровней.

15. Способ лечения пациента, инфицированного вирусом гепатита С, предусматривающий введение пациенту VX-950 в количестве, эффективном для достижения устойчивого ответа на вирус.

16. Способ по любому из пп.1-14, где пациент инфицирован вирусом гепатита С генотипа 1.

17. Способ нормализации и/или снижения уровней ALT у пациента, включающий введение пациенту VX-950.

18. Способ по п.17, где VX-950 вводят пациенту в количестве приблизительно 1350 мг в день (например, приблизительно по 450 мг каждые 8 ч), приблизительно 2250 мг в день (например, приблизительно по 750 мг каждые 8 ч), или приблизительно 2500 мг в день (например, приблизительно по 1250 мг каждые 12 ч).

19. Способ по п.17, где пациент инфицирован вирусом гепатита С.

20. Способ по п.17, где пациент не инфицирован вирусом гепатита С.

21. Способ лечения человека, инфицированного вирусом гепатита С, включающий введение человеку, по меньшей мере, одной лекарственной формы, содержащей VX-950, в течение 24-часового периода, где лекарственную форму вводят для поддержания минимально низкого уровня VX-950 в плазме, составляющего, по меньшей мере, 750 нг/мл, в течение 24-часового периода.

22. Способ по п.21, где лекарственную форму вводят для поддержания низшего минимально низкого уровня VX-950 в плазме, составляющего приблизительно от 750 до 1500 нг/мл в течение 24-часового периода.

23. Способ по п.21, где лекарственную форму вводят для поддержания минимально низкого уровня VX-950 в плазме, составляющего приблизительно от 1000 до 1500 нг/мл в течение 24-часового периода.

24. Способ по п.21, где VX-950 присутствует в лекарственной форме в количестве приблизительно 750 мг.

25. Способ по любому из пп.21-24, где лекарственную форму вводят три раза в день.

26. Способ по любому из пп.21-24, где минимально низкий уровень VX-950 поддерживают приблизительно в течение 12 недель.

27. Способ по п.21, дополнительно включающий стадию введения интерферона.

28. Способ по п.27, где интерферон представляет собой ПЭГилированный интерферон.

29. Способ по п.27, дополнительно включающий стадию введения рибавирина.

Images