RU2393231C1 - Method for determination of genetic relationship of comma bacilli strains by sequencing genes flanking cluster of o-antigen biosynthesis genes - Google Patents
Method for determination of genetic relationship of comma bacilli strains by sequencing genes flanking cluster of o-antigen biosynthesis genes Download PDFInfo
- Publication number
- RU2393231C1 RU2393231C1 RU2008152534/13A RU2008152534A RU2393231C1 RU 2393231 C1 RU2393231 C1 RU 2393231C1 RU 2008152534/13 A RU2008152534/13 A RU 2008152534/13A RU 2008152534 A RU2008152534 A RU 2008152534A RU 2393231 C1 RU2393231 C1 RU 2393231C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- genes
- gmhd
- rjg
- orf2
- comma
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 82
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 title claims abstract description 19
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims abstract description 8
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 title claims description 11
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 title abstract 6
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 claims abstract description 58
- 206010047400 Vibrio infections Diseases 0.000 claims abstract description 50
- 101100284517 Aneurinibacillus thermoaerophilus hddC gene Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 101150039741 hldD gene Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims abstract description 21
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 20
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 20
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 19
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims abstract description 18
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 claims description 45
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 17
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 3
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 claims description 3
- 101150009852 ORF2 gene Proteins 0.000 abstract description 10
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 description 24
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 description 10
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 6
- 101100121991 Chlamydia pneumoniae glmM gene Proteins 0.000 description 5
- 101150049837 PGM gene Proteins 0.000 description 5
- 101150084612 gpmA gene Proteins 0.000 description 5
- 101150104722 gpmI gene Proteins 0.000 description 5
- 229940118696 vibrio cholerae Drugs 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 101000666752 Theionarchaea archaeon (strain DG-70-1) NAD(+) hydrolase TcpA Proteins 0.000 description 4
- 101150028842 ctxA gene Proteins 0.000 description 4
- 101150087320 ctxB gene Proteins 0.000 description 4
- 101150013736 gyrB gene Proteins 0.000 description 4
- 101150012629 parE gene Proteins 0.000 description 4
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 3
- 101150006862 pyrH gene Proteins 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 2
- 101100456369 Aquifex aeolicus (strain VF5) mdh1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 101100038183 Dictyostelium discoideum polr2a gene Proteins 0.000 description 2
- 101000787195 Escherichia coli (strain K12) Aldose sugar dehydrogenase YliI Proteins 0.000 description 2
- 101150038414 LAP gene Proteins 0.000 description 2
- 101150058595 MDH gene Proteins 0.000 description 2
- 101100384788 Methanocaldococcus jannaschii (strain ATCC 43067 / DSM 2661 / JAL-1 / JCM 10045 / NBRC 100440) comC gene Proteins 0.000 description 2
- 101100020705 Mycoplasma gallisepticum (strain R(low / passage 15 / clone 2)) ldh gene Proteins 0.000 description 2
- 101000728677 Pseudomonas sp Bifunctional aspartate aminotransferase and L-aspartate beta-decarboxylase Proteins 0.000 description 2
- 101100290490 Rattus norvegicus Mdh1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100109098 Saccharolobus solfataricus (strain ATCC 35092 / DSM 1617 / JCM 11322 / P2) ape2 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100443856 Streptococcus pyogenes serotype M18 (strain MGAS8232) polC gene Proteins 0.000 description 2
- 101150008507 dnaE gene Proteins 0.000 description 2
- 101150035285 dnaE1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150003155 dnaG gene Proteins 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 2
- 101150093025 pepA gene Proteins 0.000 description 2
- 101150064613 pepN gene Proteins 0.000 description 2
- -1 rpo Proteins 0.000 description 2
- 101150047139 rpo1N gene Proteins 0.000 description 2
- 101150037064 rpoA gene Proteins 0.000 description 2
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 2
- 101100378273 Brachyspira hyodysenteriae acpP gene Proteins 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 101100425816 Dictyostelium discoideum top2mt gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 101150039774 GAPA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 description 1
- 101100098690 Listeria monocytogenes serovar 1/2a (strain ATCC BAA-679 / EGD-e) hly gene Proteins 0.000 description 1
- 101100276041 Mycolicibacterium smegmatis (strain ATCC 700084 / mc(2)155) ctpD gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 101100091878 Plasmodium falciparum (isolate 3D7) rpoC2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100282114 Pseudomonas aeruginosa (strain UCBPP-PA14) gap2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000602423 Vibrio cholerae O1 Species 0.000 description 1
- 241000194314 Vibrio cholerae O139 Species 0.000 description 1
- 101100041135 Vibrio cholerae rstR gene Proteins 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 101150008667 cadA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013505 freshwater Substances 0.000 description 1
- 101150073818 gap gene Proteins 0.000 description 1
- 101150091570 gapA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N guanidine;isothiocyanic acid Chemical compound N=C=S.NC(N)=N YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 101150021605 hlyA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 101150035917 mreB gene Proteins 0.000 description 1
- 238000003906 pulsed field gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 101150029016 rpo3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150102864 rpoD gene Proteins 0.000 description 1
- 101150033305 rtcB gene Proteins 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 101150117326 sigA gene Proteins 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 101150082896 topA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150021331 toxR gene Proteins 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области медицинской микробиологии, в частности, к определению филогенетического родства холерных вибрионов, выделенных из различных источников, и молекулярному типированию штаммов Vibrio cholerae.The invention relates to the field of medical microbiology, in particular, to the determination of the phylogenetic relationship of cholera vibrios isolated from various sources, and to the molecular typing of Vibrio cholerae strains.
Холерные вибрионы, относящиеся к виду V.cholerae, являются многочисленной и разнообразной группой бактерий, существующих в пресноводных и морских биоценозах. Среди них встречаются как высоковирулентные эпидемические штаммы V.cholerae O1 и O139 серогрупп, так и штаммы других серогрупп, которые способны вызывать лишь локальные вспышки холероподобных заболеваний или отдельные случаи гастроэнтеритов. Важной задачей является установление происхождения штамма и определение его родства с другими вибрионами, особенно с теми из них, которые имеют высокую вирулентность и высокий эпидемический потенциал.Vibrio cholerae belonging to the species V. cholerae are a large and diverse group of bacteria that exist in freshwater and marine biocenoses. Among them there are both highly virulent epidemic strains of V. cholerae O1 and O139 serogroups, as well as strains of other serogroups that can cause only local outbreaks of cholera-like diseases or isolated cases of gastroenteritis. An important task is to establish the origin of the strain and determine its relationship with other vibrios, especially those with high virulence and high epidemic potential.
Микробиологические, биохимические и другие методы идентификации являются не вполне надежными, поскольку фенотипические свойства холерных вибрионов могут меняться в зависимости от внешних условий. Высокую эффективность и воспроизводимость имеют различные генетические методы (риботипирование, пульс-гель-электрофорез, анализ вариабельных тандемных повторов и другие), среди которых первое место занимает метод мультилокусного секвенирования, связанный с определением нуклеотидных последовательностей нескольких фрагментов генома бактерий. Этот метод позволяет в достаточно короткие сроки получать достоверную информацию о штамме бактерий и проводить его сравнение с другими изучаемыми или представленными в генетических базах данных штаммами.Microbiological, biochemical and other identification methods are not entirely reliable, since the phenotypic properties of cholera vibrios can vary depending on external conditions. Various genetic methods (ribotyping, pulse gel electrophoresis, analysis of variable tandem repeats, and others) have high efficiency and reproducibility, among which the multilocus sequencing method, which is associated with the determination of the nucleotide sequences of several fragments of the bacterial genome, occupies the first place. This method allows in a fairly short time to obtain reliable information about the strain of bacteria and to compare it with other strains studied or presented in the genetic databases.
В настоящее время для генотипирования холерных вибрионов методом мультилокусного секвенирования используют такие гены холерных вибрионов, как: asd, mdh, hlyA, recA, dnaE (Byun et al., 1999); asd, cadA, idh, lap, mdh, epd (Farfan et al., 2002); dnaE, lap, recA, pgm, gyrB, cat, chi, rstR, gmd (Garg et al., 2002); gyrB, recA, pgm, ctxA, ctxB, tcpA (Kotetishili et al., 2003); recA, rpo, 16S rRNA (Thompson, Gevers, 2005); atp, pyrH, recA, rpoA (Thompson, et al., 2007); recA, pyrH, rpoD, rtcB, gyrB, toxR и 16S rRNA (Pascual et al., 2007); pyrH, recA, rpoA, ftysZ, gapA, gyrB, mreB и topA (Sawabe, Kita-Tsukamoto, Thompson, 2007). Использование этих генов позволяет хорошо дифференцировать различные виды рода Vibrio, а также филогенетически удаленные группы внутри вида V.cholerae, но оно является мало эффективным для разделения близкородственных холерных вибрионов.Currently, for the genotyping of cholera vibrios by multilocus sequencing, genes of cholera vibrios are used as: asd, mdh, hlyA, recA, dnaE (Byun et al., 1999); asd, cadA, idh, lap, mdh, epd (Farfan et al., 2002); dnaE, lap, recA, pgm, gyrB, cat, chi, rstR, gmd (Garg et al., 2002); gyrB, recA, pgm, ctxA, ctxB, tcpA (Kotetishili et al., 2003); recA, rpo, 16S rRNA (Thompson, Gevers, 2005); atp, pyrH, recA, rpoA (Thompson, et al., 2007); recA, pyrH, rpoD, rtcB, gyrB, toxR and 16S rRNA (Pascual et al., 2007); pyrH, recA, rpoA, ftysZ, gapA, gyrB, mreB and topA (Sawabe, Kita-Tsukamoto, Thompson, 2007). The use of these genes makes it possible to differentiate well different species of the genus Vibrio, as well as phylogenetically removed groups within the species V. cholerae, but it is not very effective for the separation of closely related cholera vibrios.
Известен способ определения генетического родства холерных вибрионов, включающий выделение ДНК холерных вибрионов, проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) с помощью олигонуклеотидных праймеров на гены gyrH, pgm, recA, tcpA, ctxA, ctxB, определение нуклеотидных последовательностей полученных в ПЦР генов, сравнение этих последовательностей с последовательностями аналогичных генов у других холерных вибрионов или с данными GenBank, дифференциацию вибрионов различных филогенетических групп (Kotetishvili M., Stine O.C., Chen Y. et al. Multilocus sequence typing has better discriminatory ability for typing Vibrio cholerae than does pulsed-field gel electrophoresis and provides a measure of phylogenrtic relatedness // J. Clinical Microbiology. - 2003. - Vol.41. - P.2191-2196). Использование генов gyrH, pgm, recA в описанном способе позволяет дифференцировать филогенетически удаленные между собой вибрионы, а также устанавливать родство изучаемых штаммов с эпидемически значимыми вибрионами O1 и O139 серогрупп. Однако этот способ является недостаточно эффективным для разделения близко родственных холерных вибрионов. Применение трех других генов tcpA, ctxA, ctxB, предложенных в этом способе, имеет еще меньшую разрешающую способность по сравнению с вышеуказанными генами gyrH, pgm, recA. Кроме того, способ в первую очередь предназначен для анализа вирулентных холерных вибрионов, у которых в геноме присутствуют гены вирулентности tcpA, ctxA, ctxB.A known method for determining the genetic affinity of cholera vibrios, including the isolation of DNA of cholera vibrios, polymerase chain reaction (PCR) using oligonucleotide primers for the genes gyrH, pgm, recA, tcpA, ctxA, ctxB, the determination of the nucleotide sequences obtained in PCR genes, comparison of these sequences with sequences of similar genes in other cholera vibrios or with GenBank data, differentiation of vibrios of various phylogenetic groups (Kotetishvili M., Stine OC, Chen Y. et al. Multilocus sequence typing has better discriminatory ability fo r typing Vibrio cholerae than does pulsed-field gel electrophoresis and provides a measure of phylogenrtic relatedness // J. Clinical Microbiology. - 2003. - Vol.41. - P.2191-2196). Using the genes gyrH, pgm, recA in the described method allows us to differentiate vibrioes phylogenetically removed from each other, as well as to establish the relationship of the studied strains with epidemiologically significant vibrios of O1 and O139 serogroups. However, this method is not effective enough to separate closely related cholera vibrios. The use of three other genes tcpA, ctxA, ctxB proposed in this method has even lower resolution compared to the above genes gyrH, pgm, recA. In addition, the method is primarily intended for the analysis of virulent cholera vibrios, in which the virulence genes tcpA, ctxA, ctxB are present in the genome.
Задачей изобретения является поиск в геноме холерных вибрионов менее консервативных генов, отличающихся большей вариабельностью их нуклеотидных последовательностей, использование которых позволяет более эффективно оценивать родственные связи холерных вибрионов, выделяемых из различных источников.The objective of the invention is to search for less conservative genes in the genome of cholera vibrios, which are characterized by greater variability of their nucleotide sequences, the use of which allows us to more efficiently evaluate the family ties of cholera vibrios isolated from various sources.
Впервые авторами предложен способ определения генетического родства штаммов холерных вибрионов, основанный на использовании в качестве ДНК мишеней для мультилокусного секвенирования генов rjg, gmhD и orf2, фланкирующих кластер генов биосинтеза O-антигена. Кластер генов O-антигена имеет у всех холерных вибрионов одинаковую организацию и ограничен генами rjg справа и gmhD, orf2 слева. Гены rjg, gmhD и orf2 выявлены у всех исследованных к данному моменту вибрионов. Фланкирующие кластер O-антигена гены являются сайтами для рекомбинационных событий, по которым у холерных вибрионов проходит замена кластеров генов O-антигена одной серогруппы на другую. Эти данные позволяют предположить определенную вариабельность нуклеотидной последовательности генов rjg, gmhD и orf2 и указывают на возможность использования фланкирующих кластер O-антигена участков генома для определения филогенетических связей различных штаммов холерных вибрионов.For the first time, the authors proposed a method for determining the genetic affinity of strains of cholera vibrios, based on the use of rjg, gmhD and orf2 genes flanking a cluster of O-antigen biosynthesis genes as DNA targets for multilocus sequencing. The cluster of O-antigen genes in all cholera vibrios has the same organization and is limited to the rjg genes on the right and gmhD, orf2 on the left. The rjg, gmhD, and orf2 genes were detected in all vibrios studied so far. O-antigen cluster flanking genes are sites for recombination events by which the replacement of O-antigen gene clusters from one serogroup to another occurs in cholera vibrios. These data suggest a certain variability of the nucleotide sequence of the rjg, gmhD, and orf2 genes and indicate the possibility of using flanking O-antigen clusters of genome regions to determine phylogenetic relationships of various strains of cholera vibrios.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение эффективности определения генетического родства холерных вибрионов, выделенных из различных источников.The technical result of the invention is to increase the efficiency of determining the genetic relationship of cholera vibrios isolated from various sources.
Технический результат достигается способом определения родства холерных вибрионов, основанном на методе секвенирования, который предусматривает выделение хромосомной ДНК исследуемого штамма, проведение полимеразной цепной реакции, амплификацию фрагментов генов rjg, gmhD, orf2, фланкирующих кластер генов биосинтеза O-антигена, при этом олигонуклеотидные праймеры на гены rjg, gmhD и orf2 имеют следующие последовательности:The technical result is achieved by a method for determining the affinity of cholera vibrios, based on the sequencing method, which involves the isolation of the chromosomal DNA of the studied strain, polymerase chain reaction, amplification of rjg, gmhD, orf2 gene fragments flanking the cluster of O-antigen biosynthesis genes, with oligonucleotide primers rjg, gmhD and orf2 have the following sequences:
RJG-1 5'- -3' CCCGTTGGCTGTGGAGTTTRJG-1 5'- -3 'CCCGTTGGCTGTGGAGTTT
RJG-2 5'- -3' TAATCTGCCCGCTCTGGCRJG-2 5'- -3 'TAATCTGCCCGCTCTGGC
GMHD-1 5'- -3' TGAAGAGGCATACAGGAAGGGMHD-1 5'- -3 'TGAAGAGGCATACAGGAAGG
GMHD-2 5'- -3' GGCAGCAACATTATCAAAGCGMHD-2 5'- -3 'GGCAGCAACATTATCAAAGC
ORF2-1 5'- -3' GCTGCGCTGCGTTTAAAGAORF2-1 5'- -3 'GCTGCGCTGCGTTTAAAGA
ORF2-2 5'- -3' CCAAAGCTCACGATGGCCT,ORF2-2 5'- -3 'CCAAAGCTCACGATGGCCT,
определение нуклеотидной последовательности фрагментов генов rjg, gmhD, orf2, установление родства штаммов путем сравнения нуклеотидных последовательностей генов rjg, gmhD, orf2 по количеству единичных нуклеотидных замен с данными GenBank или с последовательностями аналогичных генов у других холерных вибрионов.determination of the nucleotide sequence of fragments of rjg, gmhD, orf2 genes, establishing the relationship of strains by comparing the nucleotide sequences of the rjg, gmhD, orf2 genes by the number of single nucleotide substitutions with GenBank data or with sequences of similar genes in other cholera vibrios.
Способ осуществляют следующим образом.The method is as follows.
Выделение хромосомной ДНК исследуемого штамма холерного вибриона проводят по стандартной методике в соответствии с МУ 1.3.1794-03 «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами 1-11 групп патогенности».Isolation of chromosomal DNA of the studied strain of cholera vibrio is carried out according to the standard method in accordance with MU 1.3.1794-03 "Organization of work during PCR studies of material infected with microorganisms of 1-11 pathogenicity groups".
Полимеразную цепную реакцию осуществляют по стандартной методике (МУ 1.3.1794-03) с применением вышеуказанных праймеров на гены rjg, gmhD и orf2.The polymerase chain reaction is carried out according to the standard method (MU 1.3.1794-03) using the above primers for the rjg, gmhD and orf2 genes.
Олигонуклеотидные праймеры, используемые для амплификации в ПЦР фрагментов генов rjg, gmhD, orf2, рассчитаны на основе нуклеотидных последовательностей этих генов у штамма холерного вибриона N16961, представленных в базе данных GenBank. С помощью рассчитанных праймеров проводят в ПЦР амплификацию фрагментов генов rjg, gmhD и orf2 и определяют нуклеотидные последовательности полученных фрагментов генов (таблица 1). Олигонуклеотидные праймеры на rjg, gmhD и orf2 имеют следующий состав:Oligonucleotide primers used for PCR amplification of fragments of the rjg, gmhD, orf2 genes were calculated based on the nucleotide sequences of these genes in the V16961 cholera vibrio strain presented in the GenBank database. Using the calculated primers, amplification of rjg, gmhD and orf2 gene fragments is carried out in PCR and the nucleotide sequences of the obtained gene fragments are determined (Table 1). Oligonucleotide primers for rjg, gmhD and orf2 have the following composition:
RJG-1 5'- -3' CCCGTTGGCTGTGGAGTTTRJG-1 5'- -3 'CCCGTTGGCTGTGGAGTTT
RJG-2 5'- -3' TAATCTGCCCGCTCTGGCRJG-2 5'- -3 'TAATCTGCCCGCTCTGGC
GMHD-1 5'- -3' TGAAGAGGCATACAGGAAGGGMHD-1 5'- -3 'TGAAGAGGCATACAGGAAGG
GMHD-2 5'- -3' GGCAGCAACATTATCAAAGCGMHD-2 5'- -3 'GGCAGCAACATTATCAAAGC
ORF2-1 5'- -3' GCTGCGCTGCGTTTAAAGAORF2-1 5'- -3 'GCTGCGCTGCGTTTAAAGA
ORF2-2 5'- -3' CCAAAGCTCACGATGGCCTORF2-2 5'- -3 'CCAAAGCTCACGATGGCCT
Полимеразную цепную реакцию с амплификацией фрагментов генов на rjg, gmhD и orf2 с применением праймеров RJG-1/RJG-2, GMHD-1/GMHD-2 и ORF2-1/ORF2-2 осуществляют по следующей программе: 1-й цикл - 95°С, 5 мин; 2-35-й циклы - 95°С, 30 сек; 61°С, 40 сек; 72°С, 30 сек.A polymerase chain reaction with amplification of gene fragments on rjg, gmhD and orf2 using primers RJG-1 / RJG-2, GMHD-1 / GMHD-2 and ORF2-1 / ORF2-2 is carried out according to the following program: 1st cycle - 95 ° C, 5 min; 2-35th cycles - 95 ° С, 30 sec; 61 ° C, 40 sec; 72 ° C, 30 sec.
Определение нуклеотидных последовательностей ПЦР - фрагментов генов rjg, gmhD и orf2 - проводят на автоматическом секвенаторе по методу F. Sanger et al. (1977) с использованием прямых и обратных праймеров. Амплифицированные в ПЦР фрагменты генов rjg, gmhD и orf2 имеют размеры 447 п.н., 315 п.н., и 373 п.н. соответственно.The determination of the nucleotide sequences of PCR - fragments of the rjg, gmhD and orf2 genes - is carried out on an automatic sequencer according to the method of F. Sanger et al. (1977) using forward and reverse primers. PCR amplified fragments of the rjg, gmhD and orf2 genes are 447 bp, 315 bp, and 373 bp respectively.
Полученные в результате секвенирования нуклеотидные последовательности генов rjg, gmhD и orf2 у изучаемых штаммов сравнивают с последовательностью аналогичных генов штамма O1 серогруппы биовара эльтор V.cholerae N16961 (базы данных GenBank) с помощью программ BLAST и MEGA4, со штаммом O1 серогруппы классического биовара V.cholerae O395 (GenBank), референтным штаммом МO45 или между собой. Результаты сравнения нуклеотидных последовательностей фрагментов генов rjg, gmhD и orf2 у штаммов холерных вибрионов различных серогрупп со штаммом V.cholerae N16961 серогруппы O1 биовара эльтор (GenBank) представлены в таблице 1. Интерпретацию полученных результатов осуществляют в соответствии с таблицей 2.The nucleotide sequences of the rjg, gmhD, and orf2 genes obtained as a result of sequencing in the studied strains are compared with the sequence of similar genes of the O1 strain of the serogroup biovar Eltor V. cholerae N16961 (GenBank database) using BLAST and MEGA4 programs, with the O1 strain of the serogroup of the classical V.cholera biovar O395 (GenBank), reference strain MO45 or between each other. The results of comparing the nucleotide sequences of fragments of the rjg, gmhD, and orf2 genes in cholera vibrio strains of various serogroups with V. cholerae N16961 strain of serogroup O1 biovar eltor (GenBank) are presented in Table 1. The results are interpreted in accordance with table 2.
Определение генетического родства штаммов холерных вибрионов проводят по количеству единичных замен нуклеотидов в генах rjg, gmhD и orf, выявленных относительно штамма Vibrio cholerae N16961 серогруппы O1 биовара эльтор, полная нуклеотидная последовательность которого представлена в базе данных NCBI GenBank. Совпадение нуклеотидной последовательности этих генов с аналогичными генами у штамма N16961 свидетельствует о принадлежности изучаемого штамма к генотипу 1, к которому относятся холерные вибрионы O1 серогруппы биовара эльтор, вирулентные (см. таблицу 2). Присутствие замен трех нуклеотидов в гене orf2 (на фрагменте гена размером 373 п.н) и наличие одной или ее отсутствие в генах rjg (447 п.н.) и gmhD (315 п.н.) свидетельствует о принадлежности штамма к генотипу 3 (3-1, 3-2, 3-3), к которому относятся вибрионы O1 серогруппы классического биовара (см. таблицу 2). Наоборот отсутствие различий в гене orf2, но наличие 7 или 8 замен в гене gmhD (315 п.н.) и 13 замен в гене rjg (447 п.н.) относительно аналогичных генов штамма N16961 является доказательством принадлежности изучаемого штамма к генотипу 4 (4-1, 4-2), к которому принадлежат холерные вибрионы O139 серогруппы, вирулентные. Большое количество различий во всех трех генах rjg, gmhD и orf2 по сравнению со штаммом N16961 свидетельствует о принадлежности изучаемого штамма к другим филогенетическим линиям и соответствующим им генотипам - 2, 5, 6, 7 и т.д. (см. табл.2). Если исследуемые штаммы холерных вибрионов имеют множественные замены нуклеотидов в генах rjg, gmhD и orf2 по сравнению со штаммом N16961, но их количество у них идентично или отличается несущественно (одна или две единичные замены в трех генах) между собой, то эти штаммы относятся к одной филогенетической группе вибрионов (см. таблицу 2).The genetic affinity of strains of cholera vibrios is determined by the number of single nucleotide replacements in the rjg, gmhD and orf genes identified relative to the Vibrio cholerae N16961 strain of serogroup O1 biovar eltor, the complete nucleotide sequence of which is presented in the NCBI GenBank database. The coincidence of the nucleotide sequence of these genes with similar genes in strain N16961 indicates that the studied strain belongs to genotype 1, which includes O1 cholera vibrios of serogroup Biovar Eltor, virulent (see table 2). The presence of three nucleotide substitutions in the orf2 gene (on a 373 bp gene fragment) and the presence of one or its absence in the rjg (447 bp) and gmhD (315 bp) genes indicates that the strain belongs to genotype 3 ( 3-1, 3-2, 3-3), to which the vibrios O1 of the serogroup of the classical biovar belong (see table 2). On the contrary, the absence of differences in the orf2 gene, but the presence of 7 or 8 substitutions in the gmhD gene (315 bp) and 13 substitutions in the rjg gene (447 bp) relative to similar genes of strain N16961 is evidence of the belonging of the studied strain to genotype 4 ( 4-1, 4-2), to which the O139 serogroup cholera vibrios belong, virulent. A large number of differences in all three rjg, gmhD, and orf2 genes compared to strain N16961 indicates that the studied strain belongs to other phylogenetic lines and their corresponding genotypes - 2, 5, 6, 7, etc. (see table 2). If the studied strains of cholera vibrios have multiple nucleotide substitutions in the rjg, gmhD, and orf2 genes compared to strain N16961, but their number is identical or insignificant (one or two single substitutions in three genes) among themselves, then these strains belong to one phylogenetic group of vibrios (see table 2).
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.The invention is illustrated by the following examples.
Пример 1. Определение генетического родства штамма Vibrio cholerae T4 с другими холерными вибрионами (модельный эксперимент)Example 1. Determination of the genetic relationship of the strain Vibrio cholerae T4 with other cholera vibrios (model experiment)
Выделение ДНК штамма V.cholerae T4 проводят стандартным методом (с помощью лизирующего раствора на основе 6М гуанидинизотиоцианата с предварительным обеззараживанием культуры вибриона путем добавления мертиолята натрия до концентрации 1:10000 с последующим прогреванием при температуре 56°С в течение 30 мин (организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности (МУ 1.3.1794-03)).DNA isolation of strain V. cholerae T4 is carried out by the standard method (using a lysing solution based on 6M guanidine isothiocyanate with preliminary disinfection of the vibrio culture by adding sodium merthiolate to a concentration of 1: 10000, followed by heating at 56 ° C for 30 min (organization of work during research by PCR method of material infected with microorganisms of I-II pathogenicity groups (MU 1.3.1794-03).
Полимеразную цепную реакцию проводят в объеме 25 мкл; реакционная смесь содержит: 1х буфер (10х ПЦР-буфер - 2,5 мкл), MgCl2 - 2,0 мМ, смесь dNTP - 0,3 мМ, олигонуклеотидные праймеры - 2 пмол, Taq DNA полимераза - 0,1 ед., исследуемой ДНК - 10 мкл. Продукты амплификации анализируют в 1-2% агарозном геле с добавлением этидиум бромида и просматриваются в УФ-свете.The polymerase chain reaction is carried out in a volume of 25 μl; the reaction mixture contains: 1x buffer (10x PCR buffer - 2.5 μl), MgCl 2 - 2.0 mm, dNTP mixture - 0.3 mm, oligonucleotide primers - 2 pmol, Taq DNA polymerase - 0.1 units, test DNA - 10 μl. Amplification products are analyzed on a 1-2% agarose gel with the addition of ethidium bromide and viewed under UV light.
Нуклеотидные последовательности образованных в ПЦР фрагментов генов rjg, gmhD и orf2 определяют на автоматическом секвенаторе по методу F.Sanger et al. (1977) с использованием прямых и обратных праймеров. Амплифицированные в ПЦР фрагменты генов rjg, gmhD и orf2 имеют размеры 447 п.н., 315 п.н., и 373 п.н. соответственно.The nucleotide sequences of the rjg, gmhD and orf2 gene fragments generated in PCR are determined on an automated sequencer according to the method of F. Sanger et al. (1977) using forward and reverse primers. PCR amplified fragments of the rjg, gmhD and orf2 genes are 447 bp, 315 bp, and 373 bp respectively.
Определенные с помощью вышеуказанных манипуляций нуклеотидные последовательности генов rjg, gmhD и orf2 штамма V.cholerae T4 сравнивают с последовательностями этих генов у штамма N16961 серогруппы O1 биовара эльтор (GenBank). Последовательности генов rjg, gmhD и orf2 у штаммов T4 и N16961 идентичны. Делают заключение о том, что штамм T4 относится к генотипу 1, к которому принадлежат вибрионы O1 серогруппы биовара эльтор, вирулентные (см. таблицы 1, 2).The nucleotide sequences of the rjg, gmhD and orf2 genes of the V. cholerae T4 strain determined using the above manipulations are compared with the sequences of these genes in strain N16961 of serogroup O1 biovar eltor (GenBank). The sequences of the rjg, gmhD and orf2 genes in strains T4 and N16961 are identical. The conclusion is made that strain T4 belongs to genotype 1, to which vibrioes O1 of the serogroup of the biovar eltor belong, virulent (see tables 1, 2).
Пример 2. Определение генетического родства штамма V.cholerae P17815 проводится аналогично примеру 1. Полученные нуклеотидные последовательности генов rjg, gmhD и orf2 сравнивают с последовательностью этих генов у штамма N16961 серогруппы O1 биовара эльтор (GenBank). Они имеют существенные различия. В гене rjg имеется 1 нуклеотидная замена, в гене gmhD - 12, в orf2 - 12 замен по сравнению с N16961. Делается вывод о том, что штамм Р 17815 не относится к генотипу 1, но принадлежит к генотипу 2 (2-1), к которому относятся холерные вибрионы O1 серогруппы биовара эльтор, авирулентные (см. таблицы 1, 2).Example 2. Determination of the genetic affinity of strain V. cholerae P17815 is carried out analogously to example 1. The obtained nucleotide sequences of the rjg, gmhD and orf2 genes are compared with the sequence of these genes in strain N16961 of serogroup O1 biovar eltor (GenBank). They have significant differences. There is 1 nucleotide substitution in the rjg gene, 12 in the gmhD gene, and 12 substitutions in orf2 compared to N16961. It is concluded that strain P 17815 does not belong to genotype 1, but belongs to genotype 2 (2-1), to which cholera vibrios O1 of serogroup biovar eltor are avirulent (see tables 1, 2).
Пример 3. Определение родственных связей штамма V.cholerae В53-2 осуществляют аналогично примеру 1. Полученные нуклеотидные последовательности генов rjg, gmhD и orf2 сравнивают с последовательностью этих генов у штамма N16961 серогруппы O1 биовара эльтор (GenBank). Наличие трех замен нуклеотидов в гене orf2 и наличие одной в гене rjg, а также отсутствие замен в гене gmhD свидетельствует о принадлежности штамма к генотипу 3 (3-2), к которому также относятся вибрионы O1 серогруппы классического биовара (см. таблицы 1, 2).Example 3. The determination of the relatives of strain V. cholerae B53-2 is carried out analogously to example 1. The obtained nucleotide sequences of the rjg, gmhD and orf2 genes are compared with the sequence of these genes in strain N16961 of serogroup O1 biovar eltor (GenBank). The presence of three nucleotide substitutions in the orf2 gene and the presence of one in the rjg gene, as well as the absence of substitutions in the gmhD gene indicate that the strain belongs to genotype 3 (3-2), which also includes O1 vibrios of the serogroup of the classical biovar (see tables 1, 2 )
Пример 4. Определение родственных связей штамма V.cholerae AP1 осуществляют аналогично примеру 1. На основании отсутствия нуклеотидных замен в последовательности гена orf2, наличия 7 замен в гене gmhD и 13 замен в гене rjg штамм АР-1 относят к генотипу 4 (4-1), к которому принадлежат холерные вибрионы O139 серогруппы, вирулентные.Example 4. The determination of the relatives of strain V. cholerae AP1 is carried out analogously to example 1. Based on the lack of nucleotide substitutions in the sequence of the orf2 gene, the presence of 7 substitutions in the gmhD gene and 13 substitutions in the rjg gene, strain AP-1 is assigned to genotype 4 (4-1 ), to which cholera vibrios O139 serogroups belong, virulent.
Пример 5. Определение генетического родства штамма V.cholerae M420 осуществляют аналогично примеру 1. Наличие 16 замен в гене rjg, 11 - в gmhD и 22 - в orf2 относительно штамма N16961 свидетельствуют о том, что изучаемый штамм M420 относится к генотипу 5 (5-1), к которому относятся холерные вибрионы O139 серогруппы, авирулентные.Example 5. Determination of the genetic relationship of strain V. cholerae M420 is carried out analogously to example 1. The presence of 16 substitutions in the rjg gene, 11 in gmhD and 22 in orf2 relative to strain N16961 indicate that the studied strain M420 belongs to genotype 5 (5- 1), to which cholera vibrios of O139 serogroup, avirulent belong.
Пример 6. Определение генетического родства штаммов V.cholerae Р16134, Р16140, P16146 осуществляют аналогично примеру 1. В гене rjg присутствуют 14, gmhD - 12 и orf2 - 24 нуклеотидные замены относительно N16961. Штаммы относят к генотипу 6 (6-2), к которому принадлежат также холерные вибрионы не O1 /не O139 серогруппы, вирулентные. По последовательностям генов rjg, gmhD и orf2 штаммы идентичны. Делается вывод о том, что штаммы Р 16134, Р 16140, Р 16146 относятся к одной филогенетической линии.Example 6. Determination of the genetic relationship of strains of V. cholerae P16134, P16140, P16146 is carried out analogously to example 1. In the rjg gene there are 14, gmhD - 12 and orf2 - 24 nucleotide substitutions relative to N16961. The strains belong to genotype 6 (6-2), which also includes non-O1 / non O139 serogroup cholera vibrios, virulent. The strains are identical in the rjg, gmhD, and orf2 gene sequences. It is concluded that the strains P 16134, P 16140, P 16146 belong to the same phylogenetic line.
Пример 7. Определение генетического родства штамма V.cholerae P4107 осуществляют аналогично примеру 1. Полученные нуклеотидные последовательности генов rjg, gmhD и orf2 сравнивают с последовательностями этих генов у штаммов V.cholerae N16961. В гене rjg содержится 17 замен нуклеотидов, в gmhD - 15 и в orf2 - 14. Делают вывод о принадлежности штамма к генотипу 7 (7-1), к которому относятся также холерные вибрионы не O1 / не O139 серогруппы, авирулентные.Example 7. Determination of the genetic affinity of strain V. cholerae P4107 is carried out analogously to example 1. The obtained nucleotide sequences of the rjg, gmhD and orf2 genes are compared with the sequences of these genes in strains of V. cholerae N16961. The rjg gene contains 17 nucleotide substitutions, 15 in gmhD and 14 in orf2. It is concluded that the strain belongs to genotype 7 (7-1), which also includes non-O1 / non O139 serogroup cholera vibrios, avirulent.
Пример 8. Определение генетического родства штамма V.cholerae P-8845 осуществляют аналогично примеру 1. Полученные нуклеотидные последовательности генов rjg, gmhD и orf2 сравнивают с последовательностями этих генов у штаммов V.cholerae N16961 серогруппы O1 биовара эльтор (GenBank). В гене rjg присутствует 15 замен нуклеотидов, в гене gmhD - 15 и в гене orf2 - 10. Делают вывод о принадлежности штамма V.cholerae Р-8845 к генотипу 7 (7-2), к которому относятся холерные вибрионы не O1 / не O139 серогруппы, авирулентные.Example 8. Determination of the genetic affinity of strain V. cholerae P-8845 is carried out analogously to example 1. The obtained nucleotide sequences of the rjg, gmhD and orf2 genes are compared with the sequences of these genes in V. cholerae N16961 strains of serogroup O1 biovar eltor (GenBank). There are 15 nucleotide substitutions in the rjg gene, 15 in the gmhD gene, and 10 in the orf2 gene. It is concluded that the V. cholerae P-8845 strain belongs to genotype 7 (7-2), which includes non-O1 / non-O139 cholera vibrios serogroups, avirulent.
Отличительной особенностью заявляемого способа является использование в качестве ДНК мишеней для мультилокусного секвенирования последовательностей - генов rjg, gmhD и orf2, ранее никогда не применявшихся для определения генетического родства холерных вибрионов. Преимущество использования этих генов заключается в том, что они позволяют разделять не только филогенетически удаленные группы холерных вибрионов, но и проводить дифференциацию между близкородственными вибрионами O1 серогруппы классического и эльтор биоваров и O139 серогруппы. Использование генов в заявляемом способе, имеющих большую вариабельность нуклеотидных последовательностей по сравнению с другими применяемыми в настоящее время генами холерных вибрионов, значительно повышает эффективность определения родственных связей холерных вибрионов различного происхождения. Применение рассчитанных нами праймеров на гены rjg, gmhD, orf2 позволяет проводить секвенирование небольших (соответственно 447, 315 и 373 п.н.), но наиболее вариабельных фрагментов этих генов. Заявленный способ успешно апробирован на шестидесяти двух штаммах холерных вибрионов. Сорок три штамма представлены в таблице 1.A distinctive feature of the proposed method is the use of DNA targets for multilocus sequencing of the genes rjg, gmhD and orf2, previously never used to determine the genetic relationship of cholera vibrios. The advantage of using these genes is that they allow us to separate not only phylogenetically distant groups of cholera vibrios, but also to differentiate between closely related vibrios O1 of the classical serogroup and the eltor biovars and O139 serogroups. The use of genes in the claimed method, having greater variability of the nucleotide sequences compared to other currently used genes of cholera vibrios, significantly increases the efficiency of determining the relationship of cholera vibrios of various origin. The use of primers calculated by us for the rjg, gmhD, orf2 genes allows sequencing of small (447, 315, and 373 bp, respectively), but the most variable fragments of these genes. The claimed method has been successfully tested on sixty-two strains of cholera vibrios. Forty-three strains are presented in table 1.
Таким образом заявленный способ, основанный на определении нуклеотидной последовательности фрагментов генов rjg, gmhD и orf2, фланкирующих кластер генов биосинтеза O-антигена, позволяет эффективно и надежно устанавливать родственные связи штаммов холерных вибрионов различного происхождения и определять наличие возможного родства выделяемых изолятов с вирулентными и эпидемически значимыми вибрионами O1 и O139 серогрупп.Thus, the claimed method, based on the determination of the nucleotide sequence of fragments of the rjg, gmhD and orf2 genes flanking the cluster of O-antigen biosynthesis genes, allows one to efficiently and reliably establish family ties of cholera vibrio strains of various origin and to determine the possible relationship of isolates with virulent and epidemiologically significant vibrios of O1 and O139 serogroups.
Способ определения генетического родства штаммов холерных вибрионов методом секвенирования генов, фланкирующих кластер генов биосинтеза O-антигенаA method for determining the genetic affinity of strains of cholera vibrios by sequencing genes flanking a cluster of O-antigen biosynthesis genes
Способ определения генетического родства штаммов холерных вибрионов методом секвенирования генов, фланкирующих кластер генов биосинтеза O-антигенаA method for determining the genetic affinity of strains of cholera vibrios by sequencing genes flanking a cluster of O-antigen biosynthesis genes
Claims (1)
RJG-1 5'- -3' CCCGTTGGCTGTGGAGTTT;
RJG-2 5'- -3' TAATCTGCCCGCTCTGGC;
GMHD-1 5'- -3' TGAAGAGGCATACAGGAAGG;
GMHD-2 5'- -3' GGCAGCAACATTATCAAAGC;
ORF2-1 5'- -3' GCTGCGCTGCGTTTAAAGA;
ORF2-2 5'- -3' CCAAAGCTCACGATGGCCT,
определение родственных связей холерных вибрионов осуществляют путем сравнения нуклеотидных последовательностей генов rjg, gmhD, orf2 исследуемого штамма по количеству единичных нуклеотидных замен с данными, представленными в GenBank, или с последовательностями аналогичных генов у других холерных вибрионов. A method for determining the genetic affinity of strains of cholera vibrios by sequencing, including isolation of the chromosomal DNA of the studied strain, polymerase chain reaction, amplification of gene fragments, determination of the nucleotide sequence of gene fragments, analysis of the results, characterized in that primers for rjg, gmhD genes are used in PCR orf2 flanking a cluster of O-antigen biosynthesis genes, with the primers having the following sequences:
RJG-1 5'- -3 'CCCGTTGGCTGTGGAGTTT;
RJG-2 5'- -3 'TAATCTGCCCGCTCTGGC;
GMHD-1 5'- -3 'TGAAGAGGCATACAGGAAGG;
GMHD-2 5'- -3 'GGCAGCAACATTATCAAAGC;
ORF2-1 5'- -3 'GCTGCGCTGCGTTTAAAGA;
ORF2-2 5'- -3 'CCAAAGCTCACGATGGCCT,
Determination of the kinship relationships of cholera vibrios is carried out by comparing the nucleotide sequences of the rjg, gmhD, orf2 genes of the studied strain by the number of single nucleotide substitutions with the data presented in GenBank, or with sequences of similar genes in other cholera vibrios.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2008152534/13A RU2393231C1 (en) | 2008-12-29 | 2008-12-29 | Method for determination of genetic relationship of comma bacilli strains by sequencing genes flanking cluster of o-antigen biosynthesis genes |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2008152534/13A RU2393231C1 (en) | 2008-12-29 | 2008-12-29 | Method for determination of genetic relationship of comma bacilli strains by sequencing genes flanking cluster of o-antigen biosynthesis genes |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2393231C1 true RU2393231C1 (en) | 2010-06-27 |
Family
ID=42683614
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2008152534/13A RU2393231C1 (en) | 2008-12-29 | 2008-12-29 | Method for determination of genetic relationship of comma bacilli strains by sequencing genes flanking cluster of o-antigen biosynthesis genes |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2393231C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2587606C2 (en) * | 2010-06-30 | 2016-06-20 | БиДжиАй Дженомикс Ко., Лтд | Novel method for pcr-sequencing and use thereof for hla genotyping |
| CN112575041A (en) * | 2019-09-30 | 2021-03-30 | 江南大学 | Engineering bacterium for producing PHB (polyhydroxybutyrate) by high-efficiency fermentation of mixed carbon source and application of engineering bacterium |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2257415C1 (en) * | 2003-12-08 | 2005-07-27 | Ростовский-на-Дону государственный научно-исследовательский противочумый институт | Method for differentiating atoxigenic strains of cholera vibrio from toxigenic strains |
| RU2268942C1 (en) * | 2004-07-13 | 2006-01-27 | Ростовский-На-Дону Государственный Научно-Исследовательский Противочумный Институт | METHOD FOR INTRASPECIES DIFFERENTIATION OF Vibrio cholerae O139 |
| CN1967234A (en) * | 2006-08-26 | 2007-05-23 | 福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | PCR detection method for vibrio cholerae, vibrio parahaemolyticus, and vibrio mimicus in food |
-
2008
- 2008-12-29 RU RU2008152534/13A patent/RU2393231C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2257415C1 (en) * | 2003-12-08 | 2005-07-27 | Ростовский-на-Дону государственный научно-исследовательский противочумый институт | Method for differentiating atoxigenic strains of cholera vibrio from toxigenic strains |
| RU2268942C1 (en) * | 2004-07-13 | 2006-01-27 | Ростовский-На-Дону Государственный Научно-Исследовательский Противочумный Институт | METHOD FOR INTRASPECIES DIFFERENTIATION OF Vibrio cholerae O139 |
| CN1967234A (en) * | 2006-08-26 | 2007-05-23 | 福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | PCR detection method for vibrio cholerae, vibrio parahaemolyticus, and vibrio mimicus in food |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2587606C2 (en) * | 2010-06-30 | 2016-06-20 | БиДжиАй Дженомикс Ко., Лтд | Novel method for pcr-sequencing and use thereof for hla genotyping |
| CN112575041A (en) * | 2019-09-30 | 2021-03-30 | 江南大学 | Engineering bacterium for producing PHB (polyhydroxybutyrate) by high-efficiency fermentation of mixed carbon source and application of engineering bacterium |
| CN112575041B (en) * | 2019-09-30 | 2022-12-13 | 江南大学 | A kind of engineering bacteria and its application of mixed carbon source efficient fermentation to produce PHB |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Douidah et al. | Identification of five human and mammal associated Arcobacter species by a novel multiplex-PCR assay | |
| Linton et al. | Rapid identification by PCR of the genus Campylobacter and of five Campylobacter species enteropathogenic for man and animals | |
| Cloeckaert et al. | Classification of Brucella strains isolated from marine mammals by infrequent restriction site-PCR and development of specific PCR identification tests | |
| Vickery et al. | A real-time PCR assay for the rapid determination of 16S rRNA genotype in Vibrio vulnificus | |
| Stäuble et al. | Molecular genetic analysis of Dichelobacter nodosus proteases AprV2/B2, AprV5/B5 and BprV/B in clinical material from European sheep flocks | |
| Hellberg et al. | 16S rRNA partial gene sequencing for the differentiation and molecular subtyping of Listeria species | |
| RU2458141C1 (en) | Method for identifying toxigenic v cholerae o1 strains, determining its biovar and differentiating biovar eltor strains by typical and changed by multiplex polymerase chain reaction, and test system for implementation thereof | |
| Dyet et al. | Clonal analysis of the serogroup B meningococci causing New Zealand's epidemic | |
| Olsen et al. | Analysis of the genetic distribution among members of Clostridium botulinum group I using a novel multilocus sequence typing (MLST) assay | |
| Volokhov et al. | Identification of Bacillus anthracis by multiprobe microarray hybridization | |
| Liu et al. | Use of the dnaJ gene for the detection and identification of all Legionella pneumophila serogroups and description of the primers used to detect 16S rDNA gene sequences of major members of the genus Legionella | |
| LeJeune et al. | Polymerase chain reaction for definitive identification of Yersinia ruckeri | |
| Husmann et al. | Helicobacter sp. strain Mainz isolated from an AIDS patient with septic arthritis: case report and nonradioactive analysis of 16S rRNA sequence | |
| Rusak et al. | Rapid detection of Yersinia enterocolitica serotype O: 3 using a duplex PCR assay | |
| KR101373756B1 (en) | Primers for molecular identification of Staphylococcus aureus and method for identifying Staphylococcus aureus using the same | |
| RU2393231C1 (en) | Method for determination of genetic relationship of comma bacilli strains by sequencing genes flanking cluster of o-antigen biosynthesis genes | |
| Pohl et al. | Associations among Listeria monocytogenes genotypes and distinct clinical manifestations of listeriosis in cattle | |
| Ahmadi et al. | Molecular detection of Campylobacter species: comparision of 16SrRNA with slyD, cadF, rpoA, and dnaJ sequencing | |
| EP3115466A1 (en) | Listeria monocytogenes clonogrouping and assessment of infectivity | |
| Matucci et al. | Isolation and characterization of an atypical Mycoplasma gallisepticum strain showing a new mgc2 variant | |
| Garofolo et al. | Development of a real time PCR taqman assay based on the TPI gene for simultaneous identification of Clostridium chauvoei and Clostridium septicum | |
| Moser et al. | Arcanobacterium pluranimalium leading to a bovine mastitis: species identification by a newly developed pla gene based PCR | |
| RU2665542C1 (en) | Method of identification of non-oxygenic stamps of chiller vibrions of o1 serogrupp by pcr for obtaining the genetic determinants | |
| Merza | Prevalence and molecular characterization of Fim H gene in Escherichia coli isolates recovered from patients with utis | |
| Singh et al. | Multilocus sequence typing of Salmonella strains by high-throughput sequencing of selectively amplified target genes |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20101230 |