RU2385872C1 - SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDE PRIMERS USED FOR DETECTING DNA OF HUMAN Varicella-Zoster Herpes VIRUS - Google Patents
SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDE PRIMERS USED FOR DETECTING DNA OF HUMAN Varicella-Zoster Herpes VIRUS Download PDFInfo
- Publication number
- RU2385872C1 RU2385872C1 RU2008138768/13A RU2008138768A RU2385872C1 RU 2385872 C1 RU2385872 C1 RU 2385872C1 RU 2008138768/13 A RU2008138768/13 A RU 2008138768/13A RU 2008138768 A RU2008138768 A RU 2008138768A RU 2385872 C1 RU2385872 C1 RU 2385872C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dna
- oligonucleotide primers
- synthetic oligonucleotide
- vzv
- zoster
- Prior art date
Links
- 208000007514 Herpes zoster Diseases 0.000 title claims abstract description 7
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 title abstract 4
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 title description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 20
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 8
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 4
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 12
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 19
- 241000701085 Human alphaherpesvirus 3 Species 0.000 description 19
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 4
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 3
- 241000701074 Human alphaherpesvirus 2 Species 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 201000006082 Chickenpox Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 101150026402 DBP gene Proteins 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000124033 Salix Species 0.000 description 1
- 108010090851 Simplexvirus DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101150048584 TRM3 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 101150072074 UL28 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150008036 UL29 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150085237 UL36 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150099321 UL42 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010046980 Varicella Diseases 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000012568 clinical material Substances 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- -1 lauryl sarcosyl Chemical group 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 101150046896 trm1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012108 two-stage analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к генетической инженерии и может быть использовано для диагностических целей выявления вируса Varicella-Zoster (VZV), относящегося к сем. Herpesviridaea, а также для решения научно-исследовательских задач по изучению инфекции, вызываемых этим вирусом и называемых ветрянкой (характерной для детского возраста или опоясывающий лишай, как правило, встречающийся у взрослых людей).The invention relates to biotechnology, in particular, to genetic engineering and can be used for diagnostic purposes to detect the Varicella-Zoster virus (VZV), related to this. Herpesviridaea, as well as for solving research tasks to study the infection caused by this virus and called chickenpox (typical for childhood or shingles, usually found in adults).
Экспресс-диагностика инфекций, вызываемых этим вирусом, имеет важное значение в клинической практике, в особенности, у людей с ослабленным иммунитетом и когда требуется быстрый метод для подтверждения диагноза. В таких случаях лучше всего использовать метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), который позволяет непосредственно с высокой степенью чувствительности и достаточно быстро определить наличие вирусной ДНК в образце, позволяя решать задачи диагностики инфекционных заболеваний более эффективно. В основе ПЦР лежит многократное копирование с помощью фермента ДНК-полимеразы определенного фрагмента ДНК, являющегося маркерным для данного вида возбудителя инфекционного заболевания. ПЦР является прямым методом выявления вируса и имеет высокую степень чувствительности.Rapid diagnosis of infections caused by this virus is important in clinical practice, especially in people with weakened immune systems and when a quick method is needed to confirm the diagnosis. In such cases, it is best to use the method of polymerase chain reaction (PCR), which allows you to directly determine the presence of viral DNA in the sample with a high degree of sensitivity and quickly enough to solve the problem of diagnosing infectious diseases more effectively. PCR is based on multiple copying of a specific DNA fragment using the DNA polymerase enzyme, which is a marker for this type of infectious agent. PCR is a direct method for detecting the virus and has a high degree of sensitivity.
Для эффективного проведения ПЦР необходимы праймеры - синтетические олигонуклеотиды определенного размера, специфичные для каждого вида и типа вируса. Ограниченность использования праймеров обусловлена их видоспецифичностью. Праймеры должны быть комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, чтобы синтез ДНК, осуществляемый ДНК-полимеразой, протекал только между ними. В результате происходит экспоненциальное увеличение количества копий специфического фрагмента. От правильно выбранных праймеров, определяющих специфичность ПЦР, зависит определение строгой видоспецифичности; с их помощью можно выявить целые роды или семейства микроорганизмов.For effective PCR, primers are needed - synthetic oligonucleotides of a certain size, specific for each type and type of virus. The limited use of primers is due to their species specificity. Primers should be complementary to the DNA sequences on the left and right borders of a specific fragment and oriented so that DNA synthesis by DNA polymerase proceeds only between them. As a result, an exponential increase in the number of copies of a specific fragment occurs. The selection of strict species specificity depends on correctly selected primers that determine the specificity of PCR; with their help, whole genera or families of microorganisms can be identified.
Известны синтетические олигонуклеотиды-праймеры, используемые для выявления с помощью полимеразной цепной реакции ДНК вируса Varicella-Zoster Herpes человека (патент США №6849407, МПК С12Q 1/68, опубл. 01.02.2005; Заявка США №2002182634, МПК G01N 33/53, опубл. 05.12.2002; Заявка США №2004259078, МПК С12Q 1/68, опубл. 23.12.2004; Заявка США №2007207453, МПК С12Q 1/70, опубл. 06.09.2007).Known synthetic oligonucleotides primers used to detect DNA of the human Varicella-Zoster Herpes virus using polymerase chain reaction (US patent No. 6849407, IPC
Однако во всех приведенных ссылках используют уникальные области генов: UL28 и UL29. В предлагаемой заявке на изобретение используют другой район: ген UL36, кодирующий тимидинкиназу, для которого было найдено в мировых базах данных максимальное количество нуклеотидных последовательностей из известных штаммов и клинических изолятов. Анализ максимального количества последовательностей позволяет надеяться, что выявленная нуклеотидная изменчивость этого гена близка к реальной ситуации изменчивости этого вируса. А, следовательно, выбранные праймеры будут выявлять максимальное количество изолятов VZV. Кроме того, фермент VZV-тимидинкиназа является одним из основных компонентов для реализации жизненной программы этого вируса и поэтому его последовательность является крайне консервативной.However, all of the cited references use unique gene regions: UL28 and UL29. In the proposed application for the invention, another region is used: the UL36 gene encoding thymidine kinase, for which the maximum number of nucleotide sequences from known strains and clinical isolates was found in world databases. Analysis of the maximum number of sequences allows us to hope that the detected nucleotide variability of this gene is close to the real situation of variability of this virus. And, therefore, the selected primers will reveal the maximum number of VZV isolates. In addition, the enzyme VZV-thymidine kinase is one of the main components for the implementation of the life program of this virus and therefore its sequence is extremely conservative.
Известны также синтетические олигонуклеотиды-праймеры, используемые для выявления с помощью полимеразной цепной реакции ДНК Herpes Simplex Virus.Also known are synthetic primer oligonucleotides used to detect Herpes Simplex Virus DNA polymerase chain reaction.
Однако высокая степень специфичности ПЦР была достигнута за счет применения внутренних праймеров, т.н. «nested» ПЦР (P.Cassinotti et al., - Suitability and Clinical Application of a Multiplex Nested PCR Assey for the Diagnosis of Herpes Simplex Virus Infections. - J. Med. Virology, 50:75-81 (1996).However, a high degree of PCR specificity was achieved through the use of internal primers, the so-called "Nested" PCR (P. Cassinotti et al., Suitability and Clinical Application of a Multiplex Nested PCR Assey for the Diagnosis of Herpes Simplex Virus Infections. - J. Med. Virology, 50: 75-81 (1996).
В качестве ближайшего аналога (прототипа) был взят аналогичный способ специфического определения ВПГ-1, ВПГ-2 и VZV, предусматривающий амплификацию ДНК в жидкой смеси, содержащей ДНК-полимеразу, водную жидкую пробу и комбинацию праймеров, соответствующих району генов UL15 генома ВПГ и UL42 генома VZV (J.M.Baron, A.Rubben, E-Ingrid Grussendorf-Conen. Evaluation of a new general primer pair for rapid detection and differentiation of HSV-1, HSV-2, VZV by Polimerase Chain Reaction. - J. of Medical Virology, 49, 279-282 (1996).As the closest analogue (prototype), a similar method was used for specific determination of HSV-1, HSV-2 and VZV, which involves amplification of DNA in a liquid mixture containing DNA polymerase, an aqueous liquid sample, and a combination of primers corresponding to the region of the UL15 genes of the HSV and UL42 genome VZV genome (JMBaron, A.Rubben, E-Ingrid Grussendorf-Conen. Evaluation of a new general primer pair for rapid detection and differentiation of HSV-1, HSV-2, VZV by Polimerase Chain Reaction. - J. of Medical Virology 49, 279-282 (1996).
Однако выбранные праймеры не давали перекрестных реакций в ПЦР, если в качестве матрицы дополнительно использовали ДНК родственного генома, т.е. при определении ВПГ-1 вносили еще ДНК ВПГ-2, либо генетическую вариабельность амплифицированных нуклеотидных последовательностей из клинических образцов анализировали рестрикционным анализом.However, the selected primers did not cross-react in PCR if DNA of a related genome was additionally used as a template, i.e. when determining HSV-1, HSV-2 DNA was also added, or the genetic variability of amplified nucleotide sequences from clinical samples was analyzed by restriction analysis.
Таким образом, общими недостатками известных аналогов и прототипа является дороговизна и недоступность предлагаемых различными зарубежными фирмами праймеров, а также трудоемкость проведения процедуры двухступенчатого анализа клинических образцов.Thus, the common disadvantages of the known analogues and prototype are the high cost and inaccessibility of the primers offered by various foreign companies, as well as the complexity of the two-stage analysis of clinical samples.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является выявление ДНК VZV с высокой степенью специфичности в клинических образцах посредством таких олигонуклеотидов-праймеров, которые позволяют определять ДНК, ограничиваясь одноступенчатой процедурой проведения ПЦР.The technical result of the invention is the identification of VZV DNA with a high degree of specificity in clinical samples by means of primer oligonucleotides that allow DNA to be detected, limited to a single-step PCR procedure.
Технический результат достигается подбором синтетических олигонуклеотидов-праймеров, используемых для выявления с помощью полимеразной цепной реакции ДНК вируса Varicella-Zoster Herpes человека и имеющих следующий нуклеотидный состав:The technical result is achieved by the selection of synthetic oligonucleotides primers used to detect DNA of the human Varicella-Zoster Herpes virus using the polymerase chain reaction and having the following nucleotide composition:
P1: 5' GCGAAAATCTCGGCATTGATGG 3'P1: 5 'GCGAAAATCTCGGCATTGATGG 3'
Р2: 3' GCCCGACCTTGTGTGACAGTA 5'P2: 3 'GCCCGACCTTGTGTGACAGTA 5'
Подбор уникальных праймеров для амплификации фрагмента гена UL-36 генома VZV, кодирующего тимидинкиназу, для которого было найдено наибольшее количество нуклеотидных последовательностей из известных штаммов и клинических изолятов. С этой целью были проанализированы области последовательностей генома VZV из имеющихся банков данных на предмет выявления консервативных районов ДНК, не имеющих гомологии у других герпесвирусов с тем, чтобы исключить возможность перекрестного реагирования близких видов и типов. Для выявления гомологии ДНК VZV были проанализированы консервативные участки генов, кодирующих основные белки-VZV, и из большого массива базы данных был выбран участок гена UL-36 (по наибольшему числу сопоставимых гомологии) и к нему подобраны праймеры следующего состава:Selection of unique primers for amplification of a fragment of the UL-36 gene of the VZV genome encoding thymidine kinase for which the largest number of nucleotide sequences from known strains and clinical isolates was found. To this end, regions of the VZV genome sequences from existing data banks were analyzed to identify conserved DNA regions that were not homologous to other herpes viruses in order to exclude the possibility of cross-reacting of similar species and types. To identify the VZV DNA homology, the conserved regions of the genes encoding the main VZV proteins were analyzed, and the UL-36 gene region was selected from a large database array (by the largest number of homology comparable) and primers of the following composition were selected:
P1: 5' GCGAAAATCTCGGCATTGATGG 3'P1: 5 'GCGAAAATCTCGGCATTGATGG 3'
Р2: 3' GCCCGACCTTGTGTGACAGTA 5'P2: 3 'GCCCGACCTTGTGTGACAGTA 5'
специфичные к консервативному участку вариабельной части данного гена, кодирующего фермент тимидинкиназу. Компьютерный анализ вирусных пептидных последовательностей проводился с помощью программы SALIX, а с помощью компьютерной программы «OLIGO» были подобраны условия проведения полимеразной цепной реакции с данными праймерами.specific to the conserved region of the variable part of the gene encoding the thymidine kinase enzyme. Computer analysis of viral peptide sequences was carried out using the SALIX program, and the conditions for the polymerase chain reaction with these primers were selected using the OLIGO computer program.
Полимеразную цепную реакцию проводили на амплификаторе марки Термоцик МС 16, производитель «ДНК-технология», г.Москва.The polymerase chain reaction was carried out on a thermocyclic brand MS 16, manufacturer DNA-technology, Moscow.
ПЦР-продукт был подвергнут электрофорезу в агарозном геле, и о положительной реакции судили по полосе амплификата, соответствующей размеру 394 пар нуклеотидных оснований.The PCR product was subjected to agarose gel electrophoresis, and a positive reaction was judged by the amplification band corresponding to a size of 394 base pairs.
Перечень графических материалов:The list of graphic materials:
- фиг.1 - нуклеотидная последовательность гена UL-36, амплифицируемая патентуемыми олигонуклеотидами-праймерами.- figure 1 - nucleotide sequence of the UL-36 gene, amplified by patented primer oligonucleotides.
- фиг.2 - электрофореграмма амплифицируемого фрагмента генома VZV.- figure 2 is an electrophoregram of an amplified fragment of the VZV genome.
Идентификация ДНК VZV показана на следующих примерах.VZV DNA identification is shown in the following examples.
Пример 1. Амплификация участка ДНК гена UL-36, кодирующего фермент тимидинкиназуExample 1. Amplification of a DNA region of the UL-36 gene encoding the thymidine kinase enzyme
Инкубационная смесь конечным объемом 50 мкл содержит: 10 мМ Mg - буфер «Unipol», 10 мМ d NTP, 2 мкл праймеров, 5 мкл ДНК - матрицы, 0,5 ед. ДНК-полимеразы Tag, оставшийся объем занимает вода. Поверх смеси наслаивают 25 мкл минерального масла.The incubation mixture with a final volume of 50 μl contains: 10 mM Mg - Unipol buffer, 10 mM d NTP, 2 μl of primers, 5 μl of DNA template, 0.5 units. Tag DNA polymerase, the remaining volume is water. Over the mixture layered 25 μl of mineral oil.
Реакцию проводят в следующем режиме: денатурация - 94°С - 1 мин, отжиг - 58° - 1 мин, синтез - 72° - 1 мин, далее 30 циклов по схеме: денатурация при 94°С в течение 0,5 мин, отжиг при 58°С - 0,5 мин, синтез при 72°С - 0,5 мин. Синтез на конечной стадии, т.е. в последнем цикле, проводят при 72°С в течение 2,5 мин.The reaction is carried out in the following mode: denaturation - 94 ° C - 1 min, annealing - 58 ° - 1 min, synthesis - 72 ° - 1 min, then 30 cycles according to the scheme: denaturation at 94 ° C for 0.5 min, annealing at 58 ° С - 0.5 min; synthesis at 72 ° С - 0.5 min. Synthesis at the final stage, i.e. in the last cycle, carried out at 72 ° C for 2.5 minutes
Продукт амплификации соответствует отрезку нуклеотидной последовательности генома VZV длиной 394 bp (фиг.1).The amplification product corresponds to a segment of the nucleotide sequence of the VZV genome with a length of 394 bp (figure 1).
Пример 2. Определение ДНК VZV в клинических образцахExample 2. Determination of VZV DNA in clinical samples
Для апробации полученных праймеров использовали образцы клинического материала от больных в ПЦР. Клинические образцы представляли собой либо кровь (цельную или сыворотку), но чаще всего содержимое пузырьков на кожных покровах больного. Материал образцов ставили на переваривание с использованием протеиназы "К" (100 мкг\мл) в ТЕ-буфере с добавлением 1% лаурилсаркозила при 50°С в течение 1 ч. ДНК выделяли фенольной экстракцией. Протокол проведения ПЦР, идентичный приводимому в примере 1. На фиг.2 приведена электрофореграмма амплифицируемого фрагмента генома VZV. Дорожка 10 - ДНК, выделенного от больного в культуре клеток VZV; дорожки 1-9 - ДНК из клинических образцов.To test the obtained primers used samples of clinical material from patients in PCR. Clinical samples were either blood (whole or serum), but most often the contents of the vesicles on the skin of the patient. The sample material was digested using proteinase K (100 μg / ml) in TE buffer with 1% lauryl sarcosyl added at 50 ° C for 1 h. DNA was isolated by phenol extraction. The PCR protocol identical to that given in example 1. Figure 2 shows the electrophoregram of the amplified fragment of the VZV genome.
Таким образом, заявленный технический результат получения высоко специфичных праймеров, позволяющих выявлять ДНК VZV для проведения ПЦР из различных клинических образцов, успешно достигается. Выбранные уникальные олигонуклеотиды не дают перекрестных реакций с родственными видами, позволяют, ограничиваясь одноступенчатой процедурой проведения реакции, быстро и надежно определять наличие или отсутствие ДНК VZV.Thus, the claimed technical result of obtaining highly specific primers that allow the detection of VZV DNA for PCR from various clinical samples is successfully achieved. The selected unique oligonucleotides do not cross-react with related species; they allow, confining themselves to a single-step reaction procedure, to quickly and reliably determine the presence or absence of VZV DNA.
Claims (1)
P1: 5' GCGAAAATCTCGGCATTGATGG 3'
Р2: 3' GCCCGACCTTGTGTGACAGTA 5'. Synthetic oligonucleotides are primers used to detect human Varicella-Zoster Herpes DNA using the polymerase chain reaction and having the following nucleotide composition:
P1: 5 'GCGAAAATCTCGGCATTGATGG 3'
P2: 3 'GCCCGACCTTGTGTGACAGTA 5'.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2008138768/13A RU2385872C1 (en) | 2008-09-29 | 2008-09-29 | SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDE PRIMERS USED FOR DETECTING DNA OF HUMAN Varicella-Zoster Herpes VIRUS |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2008138768/13A RU2385872C1 (en) | 2008-09-29 | 2008-09-29 | SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDE PRIMERS USED FOR DETECTING DNA OF HUMAN Varicella-Zoster Herpes VIRUS |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2385872C1 true RU2385872C1 (en) | 2010-04-10 |
Family
ID=42671139
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2008138768/13A RU2385872C1 (en) | 2008-09-29 | 2008-09-29 | SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDE PRIMERS USED FOR DETECTING DNA OF HUMAN Varicella-Zoster Herpes VIRUS |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2385872C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2629335C1 (en) * | 2016-04-18 | 2017-08-28 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Детский научно-клинический центр инфекционных болезней Федерального медико-биологического агентства" (ФГБУ ДНКЦИБ ФМБА РОССИИ) | Method for diagnostics of infectious disease period caused by varicella zoster virus in children |
| CN109913589A (en) * | 2019-04-09 | 2019-06-21 | 深圳市儿童医院 | A kind of primer-probe composition, kit and method for detecting herpes zoster virus |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6849407B2 (en) * | 2000-08-31 | 2005-02-01 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Detection of varicella-zoster virus |
-
2008
- 2008-09-29 RU RU2008138768/13A patent/RU2385872C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6849407B2 (en) * | 2000-08-31 | 2005-02-01 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Detection of varicella-zoster virus |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| BARON J.M. et al. Evaluation of a new general primer pair for rapid detection and differentiation of HSV-1, HSV-2, and VZV by polymerase chain reaction. J. Med. Virol. 1996, n. 49(4), p.279-82. * |
| STN on the Web. База данных Chemical Abstract (CA), AN=111:127792, MORI H. et al. Molecular analysis of the thymidine kinase gene of thymidine kinase-deficient mutants of varicella-zoster virus. Intervirology. 1988, n. 29(6), p.301-10. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2629335C1 (en) * | 2016-04-18 | 2017-08-28 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Детский научно-клинический центр инфекционных болезней Федерального медико-биологического агентства" (ФГБУ ДНКЦИБ ФМБА РОССИИ) | Method for diagnostics of infectious disease period caused by varicella zoster virus in children |
| CN109913589A (en) * | 2019-04-09 | 2019-06-21 | 深圳市儿童医院 | A kind of primer-probe composition, kit and method for detecting herpes zoster virus |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zhou et al. | Advancements in detection of SARS-CoV-2 infection for confronting COVID-19 pandemics | |
| Ryschkewitsch et al. | Multiplex qPCR assay for ultra sensitive detection of JCV DNA with simultaneous identification of genotypes that discriminates non-virulent from virulent variants | |
| ES2608952T3 (en) | Method and microarray to detect herpesvirus | |
| Mancuso et al. | Increased prevalence of varicella zoster virus DNA in cerebrospinal fluid from patients with multiple sclerosis | |
| Mach* et al. | Human cytomegalovirus: recent aspects from molecular biology | |
| Mozzi et al. | Past and ongoing adaptation of human cytomegalovirus to its host | |
| CN104619858B (en) | Non-invasive detection of fetal health status | |
| US6410704B1 (en) | Methods and compositions for the preparation and use of a herpes protease | |
| CN105779644A (en) | Realtime fluorescent nucleic acid constant temperature amplification detection kit of human cytomegalovirus (HCMV) | |
| RU2385872C1 (en) | SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDE PRIMERS USED FOR DETECTING DNA OF HUMAN Varicella-Zoster Herpes VIRUS | |
| Ben Fredj et al. | Identification of human herpesviruses 1 to 8 in Tunisian multiple sclerosis patients and healthy blood donors | |
| Fickel et al. | Comparison of glycoprotein B (gB) variants of the elephant endotheliotropic herpesvirus (EEHV) isolated from Asian elephants (Elephas maximus) | |
| LING et al. | Elephant endotheliotropic herpesvirus update | |
| Bar et al. | Differentiation of human cytomegalovirus genotypes in immunocompromised patients on the basis of UL4 gene polymorphisms | |
| WO2017060912A1 (en) | METHODS AND KITS FOR PREDICTION AND DIAGNOSIS OF HUMAN CYTOMEGALOVIRUS CONGENITAL (hCMV) TRANSMISSION | |
| Ihira et al. | Loop-mediated isothermal amplification for discriminating between human herpesvirus 6 A and B | |
| CN103003694A (en) | Method for detection of infection with human cytomegalovirus | |
| RU2165977C1 (en) | Synthetic oligonucleotide-primers used for detection of human herpes simplex type-1 virus dna | |
| JP2018536429A (en) | Compositions and methods for diagnosing Lyme disease and for predicting Lyme disease spirochete removal after treatment | |
| WO2000066774A3 (en) | Improved assay and reagents therefor | |
| RU2241751C2 (en) | Synthetic oligonucleotide-primers used for detection of dna of cattle infectious rhinotracheitis and pustular vulvovaginitis herpes virus type 1 | |
| Vankova et al. | NGS Technology in Monitoring the Genetic Diversity of Cytomegalovirus Strains | |
| RU2164945C1 (en) | Synthetic oligonucleotide-primers for detection of human cytomegalovirus dna | |
| CN104080477A (en) | Methods and compositions of protein antigens for the diagnosis and treatment of herpes simplex viruses type 1 and 2 | |
| BR0110756A (en) | Detection method for detecting a variation in gh1 effective to act as an indicator of gh dysfunction in an individual, gh1 variant, protein or amino acid sequence, human gh variant, screening method for screening an individual suspected of having gh1 dysfunction. gh, kit, isolated, purified or recombinant nucleic acid sequence, vector, host cell, process for preparing a gh variant, amino acid sequence, composition, and use of gh1 variant or gh variant |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20140930 |