RU2380421C2 - Method of qualitative and quantitative estimation of fixation of membrane protein and ligand - Google Patents
Method of qualitative and quantitative estimation of fixation of membrane protein and ligand Download PDFInfo
- Publication number
- RU2380421C2 RU2380421C2 RU2007139290/13A RU2007139290A RU2380421C2 RU 2380421 C2 RU2380421 C2 RU 2380421C2 RU 2007139290/13 A RU2007139290/13 A RU 2007139290/13A RU 2007139290 A RU2007139290 A RU 2007139290A RU 2380421 C2 RU2380421 C2 RU 2380421C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- ligand
- membrane protein
- cells
- membrane
- spheroplasts
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к клеточной биоинженерии, а именно к клеточным технологиям скрининга молекулярных мишеней. Может быть использовано при разработке и фармакологическом контроле новых лекарственных средств.The invention relates to biotechnology, in particular to cellular bioengineering, in particular to cellular technologies for screening molecular targets. It can be used in the development and pharmacological control of new drugs.
Мембранные белки представляют собой обширный класс клеточных белков; наиболее биологически значимыми мембранными белками являются белки-рецепторы (например, GPCR, тирозин-киназные рецепторы), ионные каналы, белки-транспортеры, белки дыхательной цепи и др. Мембранные белки участвуют в регуляции клеточной активности путем связывания различных лигандов на поверхности клетки и проведения сигнала внутрь клетки. Возникновение множества заболеваний и патологий, таких как рак, диабет, сердечная аритмия, гипертония, иммунодефицитные состояния, связано с нарушением уровня экспрессии и/или нормальной функциональной активности мембранных белков. Различные мембранные белки, в первую очередь рецепторы и ионные каналы, являются молекулярными мишенями многих лекарств.Membrane proteins represent an extensive class of cellular proteins; the most biologically significant membrane proteins are receptor proteins (for example, GPCR, tyrosine kinase receptors), ion channels, transporter proteins, respiratory chain proteins, etc. Membrane proteins are involved in the regulation of cellular activity by binding various ligands on the cell surface and signal inside the cell. The emergence of many diseases and pathologies, such as cancer, diabetes, cardiac arrhythmia, hypertension, immunodeficiency, is associated with a violation of the level of expression and / or normal functional activity of membrane proteins. Various membrane proteins, primarily receptors and ion channels, are the molecular targets of many drugs.
Поиск и отбор лигандов, способных корректировать аномальную активность мембранных белков, является ключевым этапом при разработке лекарственных препаратов нового поколения. Создание новых экспериментальных методов для доклинического скрининга прототипов лекарственных препаратов по их способности взаимодействовать с белками-мишенями направлено на повышение эффективности выявления наиболее перспективных лигандов с потенциально высоким лекарственным действием. В основе этих методов лежит определение лигандсвязывающей активности мембранных белков, позволяющее оценивать характер взаимодействия мембранного белка с лигандом (специфичность, константа диссоциации комплекса и др.), исследовать влияние различных модуляторов на взаимодействие с лигандом и пр.The search and selection of ligands capable of correcting the abnormal activity of membrane proteins is a key step in the development of new generation drugs. The creation of new experimental methods for preclinical screening of drug prototypes by their ability to interact with target proteins is aimed at increasing the efficiency of identifying the most promising ligands with potentially high drug effects. The basis of these methods is the determination of the ligand-binding activity of membrane proteins, which allows one to evaluate the nature of the interaction of a membrane protein with a ligand (specificity, complex dissociation constant, etc.), to study the effect of various modulators on the interaction with a ligand, etc.
Основная трудность тестирования лигандсвязывающей активности мембранных белков в растворах заключается в необходимости применения различных детергентов для выделения белка и связанной с этим высокой вероятности денатурации белка в процессе выделения. Кроме того, проведение биохимических тестов в присутствии детергентов затруднено или вообще невозможно.The main difficulty in testing the ligand binding activity of membrane proteins in solutions is the need to use various detergents to isolate the protein and the associated high probability of protein denaturation during the isolation process. In addition, carrying out biochemical tests in the presence of detergents is difficult or even impossible.
Для определения тестирования связывания лигандов с мембранными белками, такими как ионные каналы, белки-рецепторы, в том числе GPCR, получение которых в функционально-активном состоянии представляет определенные трудности, используются клеточные тест-системы на основе эукариотических клеточных линий, экспрессирующих заданный рецептор. Методы тестирования основаны на функциональной экспрессии рекомбинантных белков в составе клеточной мембраны и на возможности проводить связывание мембранного белка с лигандом на поверхности клеток. Клеточные технологии позволяют исключить процедуру выделения мембранного белка, следствием чего является: упрощение, ускорение и удешевление технологии связывания; сохранение мембранным белком конформации, определяемой липидным окружением бактериальной мембраны. Связывание мембранного белка в составе клеточной мембраны дает возможность проводить тестирование в физиологических условиях (солевой состав, рН буфера) в отсутствие детергентов, используемых традиционно при выделении мембранных белков из состава мембран.To determine the testing of ligand binding to membrane proteins, such as ion channels, receptor proteins, including GPCR, the preparation of which in a functional-active state presents certain difficulties, cell test systems based on eukaryotic cell lines expressing a given receptor are used. Testing methods are based on the functional expression of recombinant proteins in the composition of the cell membrane and on the possibility of binding the membrane protein to a ligand on the surface of the cells. Cellular technologies make it possible to exclude the procedure for isolating a membrane protein, the consequence of which is: simplification, acceleration and cheapening of the binding technology; preservation by the membrane protein of the conformation determined by the lipid environment of the bacterial membrane. The binding of the membrane protein in the composition of the cell membrane makes it possible to test under physiological conditions (salt composition, pH of the buffer) in the absence of detergents used traditionally in the isolation of membrane proteins from the composition of the membranes.
Известен способ тестирования связывания с лигандом одного из GPCR-рецепторов - hNMUR (рецептор нейромедина U человека), экспрессированного в эукариотических линиях клеток (СНО, НЕК 293), путем измерения уровня биосинтеза репортерного гена люциферазы. [Li X. et.al. Functional characterization of cell lines for high-throughput screening of human neuromedin U receptor subtype 2 specific agonists using a luciferase reporter gene assay. Eur. J. Pharm. Biopharm., 2007, doi:10.1016/j.ejpb.2007.01.004]. Репортерные клеточные линии получают путем со-трансфекции клеток плазмидами, содержащими а) ген целевого белка hNMUR - рецептора нейромедина U и б) ген репортерного белка люциферазы. Активация рецептора hNMUR пептидом природного происхождения нейромедином U инициирует каскад внутриклеточных реакций, связанных с активностью аденилатциклазы и метаболизмом кальция. Изменения уровня внутриклеточного кальция и/или цАТФ, в свою очередь, влияют на уровень транскрипции репортерного белка. Тестирование проводят по определению уровня экспрессии репортерного белка люциферазы, являющегося конечным звеном в цепи клеточных реакций.A known method for testing ligand binding of one of the GPCR receptors, hNMUR (human neuromedin U receptor), expressed in eukaryotic cell lines (CHO, HEK 293), by measuring the level of biosynthesis of the luciferase reporter gene. [Li X. et.al. Functional characterization of cell lines for high-throughput screening of human neuromedin
Недостатком этого способа, основанного на непрямом определении связывания целевого белка с лигандом, является необходимость тщательной стандартизации условий с целью исключения влияния множества неспецифических факторов на уровень биосинтеза репортерного белка и связанная с этим сложность оценки полученных данных.The disadvantage of this method, based on the indirect determination of the binding of the target protein to the ligand, is the need for careful standardization of conditions in order to exclude the influence of many non-specific factors on the level of biosynthesis of the reporter protein and the associated complexity of evaluating the obtained data.
Известен наиболее близкий к заявленному способ тестирования связывания мембранного белка с лигандом, основанный на флуоресцентной детекции образования комплекса лиганда с мембранным белком-рецептором (GPCR), экспрессирующимся в эукариотической линии клеток [Mellentin-Michelotti J. ef al. Determination of ligand-binding affinities for endogenous seven-transmembrane receptors using flourometric microvolume assay technology. Analytical Biochemistry, 1999, 272:182-190]. В анализе используют клеточные линии астроцитомы UC11 и нейробластомы, продуцирующие соответственно человеческие рецепторы NK1 и GalR1, а также рекомбинантную клеточную линию NPY-Y2 с высоким уровнем экспрессии рецептора NPY-Y2. Эту линию получают путем трансфекции клеток СНО-К1 плазмидой sr-alpha-NPY-Y2R, содержащей ген рецептора NPY-Y2.Known closest to the claimed method for testing the binding of a membrane protein to a ligand, based on fluorescence detection of the formation of a complex of a ligand with a membrane protein receptor (GPCR) expressed in a eukaryotic cell line [Mellentin-Michelotti J. ef al. Determination of ligand-binding affinities for endogenous seven-transmembrane receptors using flourometric microvolume assay technology. Analytical Biochemistry, 1999, 272: 182-190]. The assay uses UC11 astrocytoma and neuroblastoma cell lines producing human NK1 and GalR1 receptors, respectively, as well as a recombinant NPY-Y2 cell line with a high expression level of NPY-Y2 receptor. This line is obtained by transfection of CHO-K1 cells with the sr-alpha-NPY-Y2R plasmid containing the NPY-Y2 receptor gene.
Клетки для анализа готовят двумя способами: в первом способе клетки культивируют в монослое, затем для отделения клеток от подложки проводят трипсинолиз и готовят клеточную суспензию для анализа связывания с лигандом. Во втором варианте клетки засевают в планшеты за сутки до проведения измерений и анализируют связывание лиганда с прикрепленными клетками в монослое.Cells for analysis are prepared in two ways: in the first method, cells are cultured in a monolayer, then trypsinolysis is performed to separate cells from the substrate and a cell suspension is prepared for analysis of ligand binding. In the second embodiment, the cells are seeded on the plates one day before the measurements and the binding of the ligand to the attached cells in a monolayer is analyzed.
Лиганды - нейропептиды (SP, нейрокинин А, галанин и др.) - метят флуоресцентным красителем Су5, при этом способность связываться с рецептором у меченых аналогов сравнима с исходными лигандами.Ligands - neuropeptides (SP, neurokinin A, galanin, etc.) - are labeled with Cy5 fluorescent dye, while the ability to bind to the receptor in labeled analogues is comparable to the original ligands.
Процедуру связывания флуоресцентно-меченого лиганда с мембранным белком выполняют двумя способами. В первом способе суспензию, содержащую 10000 клеток, смешивают с меченым лигандом в объеме 100 мкл, выдерживают в течение часа, затем вносят в лунки планшета и через 15 мин после оседания клеток на дно проводят измерение флуоресценции связавшегося на клеточной мембране лиганда с помощью лазерного сканирующего микроскопа.The procedure for binding a fluorescently labeled ligand to a membrane protein is performed in two ways. In the first method, a suspension containing 10,000 cells is mixed with a labeled ligand in a volume of 100 μl, incubated for an hour, then added to the wells of the plate and 15 minutes after the cells have settled to the bottom, the fluorescence of the ligand bound to the cell membrane is measured using a laser scanning microscope .
Во втором варианте проводят анализ клеток, выращенных в монослое в лунках планшета. Для этого из лунок отбирают культуральную жидкость, а к адсорбированным на дне клеткам прибавляют раствор меченого лиганда, инкубируют в течение часа и проводят измерения.In the second embodiment, the analysis of cells grown in a monolayer in the wells of the tablet. To do this, culture fluid is taken from the wells, and a solution of labeled ligand is added to the adsorbed cells at the bottom, incubated for an hour and measurements are taken.
Характеризуя исследуемое соединение как возможный лиганд целевого мембранного белка, тестируют способность этого соединения конкурировать с меченым лигандом за образование комплексов с мембранным белком. Способность конкурировать за связывание характеризуют константой IC50, которая численно равна концентрации исследуемого соединения, вытесняющего 50% флуоресцентно-меченого лиганда из комплексов с мембранным белком.By characterizing the test compound as a possible ligand of the target membrane protein, the ability of this compound to compete with the labeled ligand for the formation of complexes with the membrane protein is tested. The ability to compete for binding is characterized by the constant IC 50 , which is numerically equal to the concentration of the test compound, displacing 50% of the fluorescently labeled ligand from complexes with a membrane protein.
Для этого составляют смеси, содержащие фиксированную концентрацию меченого лиганда и возрастающие концентрации немеченого исследуемого соединения, тестируемого в качестве возможного лиганда. После инкубации клеток со смесями в каждой лунке планшета измеряют интегральную интенсивность флуоресценции по сканируемой области. Для каждой концентрации исследуемого соединения вычисляют среднее значение интенсивности флуоресценции по 16-ти лункам и данные концентрационной зависимости связывания меченого лиганда в условиях конкуренции с исследуемым соединением анализируют в программе Sigmaplot. Измеряемая интенсивность флуоресценции соответствует флуоресценции лиганда, связавшегося на поверхности клеток (флуоресценция меченого лиганда в растворе не детектируется), а интенсивность флуоресценции прямо пропорциональна количеству связанного лиганда. В результате сканирования получают также флуоресцентные изображения клеток и определяют, таким образом, локализацию лиганда на клеточной поверхности.To this end, mixtures are made containing a fixed concentration of labeled ligand and increasing concentrations of unlabeled test compound tested as a possible ligand. After incubation of the cells with mixtures in each well of the plate, the integrated fluorescence intensity of the scanned area is measured. For each concentration of the test compound, the average value of the fluorescence intensity for 16 wells is calculated and the concentration dependence of the binding of the labeled ligand under competition with the test compound is analyzed in the Sigmaplot program. The measured fluorescence intensity corresponds to the fluorescence of the ligand bound on the cell surface (fluorescence of the labeled ligand is not detected in the solution), and the fluorescence intensity is directly proportional to the amount of bound ligand. As a result of the scan, fluorescence images of the cells are also obtained and thus the localization of the ligand on the cell surface is determined.
С помощью описанного метода тестирования определяют, например, значение 1С50 для нейропептида SP (проводят конкурентное вытеснение меченого пептида Cy5-SP немеченым SP пептидом), связывающегося с рецептором NK1 на клетках UC11, которое составляет 0.7 нМ. Это значение соответствует данным, получаемым с помощью радиоизотопного метода анализа. В случае конкурентного вытеснения меченого пептида Cy5-SP пептидом NKA, имеющим слабое сродство к рецепторам NK1 на UC11 клетках, константа IС50 составляет 75 нМ.Using the described test method, for example, the value of 1C 50 for the SP neuropeptide is determined (competitively displacing the labeled Cy5-SP peptide with an unlabeled SP peptide), which binds to the NK1 receptor on UC11 cells, which is 0.7 nM. This value corresponds to the data obtained using the radioisotope analysis method. In the case of competitive displacement of the labeled peptide Cy5-SP by an NKA peptide having a weak affinity for NK1 receptors on UC11 cells, the IC 50 constant is 75 nM.
В описанных выше клеточных тест-системах используются для анализа клеточные линии с относительно высоким уровнем экспрессии природного мембранного рецептора или стабильные эукариотические клеточные линии, полученные путем трансфекции клеток плазмидой, содержащей ген целевого рекомбинантного белка. Процесс создания таких клеточных линий является длительным, трудозатратным и дорогим; не всегда уровень экспрессии целевого белка оказывается достаточен для надежной регистрации.The cell test systems described above use cell lines with a relatively high expression level of the natural membrane receptor or stable eukaryotic cell lines obtained by transfecting cells with a plasmid containing the target recombinant protein gene for analysis. The process of creating such cell lines is time-consuming, time-consuming and expensive; not always the level of expression of the target protein is sufficient for reliable registration.
Изобретение решает задачу создания простого и эффективного способа качественного и количественного определения связывания мембранного белка с исследуемым соединением - предполагаемым лигандом.The invention solves the problem of creating a simple and effective method for the qualitative and quantitative determination of the binding of a membrane protein to the test compound — the putative ligand.
Поставленная задача решается за счет того, что способ тестирования связывания мембранного белка с лигандом включает экспрессию рекомбинантного мембранного белка в клетках E.coli в составе цитоплазматической мембраны, приготовление препарата сферопластов из клеток E.coli путем пермеабилизации клеточной стенки, приготовление меченого лиганда, внесение сферопластов в лунки планшета, инкубацию сферопластов с меченым лигандом, детекцию на поверхности сферопластов комплекса мембранного белка с лигандом и измерение уровня флуоресценции на поверхности сферопластов методом флуоресцентной оптической микроскопии, определение константы диссоциации Kd для комплекса мембранного белка с лигандом, проведение конкурентного вытеснения флуоресцентно-меченного лиганда немеченым лигандом из комплекса с мембранным белком, определение константы IС50 для немеченого лиганда и расчет константы диссоциации Ki для немеченого лиганда.The problem is solved due to the fact that the method of testing the binding of a membrane protein to a ligand involves the expression of a recombinant membrane protein in E. coli cells as part of the cytoplasmic membrane, preparation of spheroplast preparation from E. coli cells by permeabilization of the cell wall, preparation of labeled ligand, introduction of spheroplasts into plate wells, incubation of labeled ligand spheroplasts, detection of a membrane protein complex with a ligand on the surface of spheroplasts, and measurement of fluorescence at erhnosti spheroplasts by fluorescence optical microscopy, determination of the dissociation constant Kd for the complex of membrane protein with a ligand carrying the competitive displacement of fluorescently-labeled ligand unlabeled ligand from the complex with membrane protein, determination of constants for the IC 50 of unlabelled ligand and calculate Ki the dissociation constants for unlabelled ligand.
Способ осуществляют следующим образом.The method is as follows.
В составе цитоплазматической мембраны Е. coli осуществляют функциональную экспрессию мембранного белка KcsA-Kv1.3. Этот белок представляет собой гибрид, в котором участок поровой петли калиевого канала KcsA из бактерии Streptomyces lividans заменен на гомологичный участок эукариотического вольтзависимого калиевого канала Kv1.3. Ген KcsA получают путем амплификации на матрице хромосомной ДНК Streptomyces lividans и клонируют в плазмиду рЕТ28а фирмы Novagen, США. Полученную плазмиду pETKcsA используют в ПЦР для синтеза гибридного гена KcsA-Kv1.3. Клетки E.coli BL21(DE3) трансформируют полученной плазмидой pETKcsA-Kv1.3 и проводят культивирование. Биосинтез целевого мембранного белка KcsA-Kv1.3 в клетках E.coli определяют с помощью электрофоретического анализа суммарного клеточного белка.As part of the cytoplasmic membrane of E. coli, the functional expression of the membrane protein KcsA-Kv1.3 is carried out. This protein is a hybrid in which the portion of the pore loop of the KcsA potassium channel from the bacterium Streptomyces lividans is replaced by a homologous portion of the eukaryotic voltage-dependent potassium channel Kv1.3. The KcsA gene is obtained by amplification on a Streptomyces lividans chromosomal DNA matrix and cloned into the pET28a plasmid from Novagen, USA. The resulting plasmid pETKcsA is used in PCR for the synthesis of the hybrid gene KcsA-Kv1.3. E. coli BL21 (DE3) cells were transformed with the obtained plasmid pETKcsA-Kv1.3 and cultured. The biosynthesis of the target membrane protein KcsA-Kv1.3 in E. coli cells is determined by electrophoretic analysis of the total cell protein.
Аналогичным образом проводят конструирование гена гибридного белка KcsA-Kν1.1 в составе плазмиды pETKcsA-Kν1.1 и последующее культивирование клеток E.coli BL21(DE3) для наработки белка KcsA-Kv1.1. Этот белок содержит участок поровой петли эукариотического вольтзависимого калиевого канала Kv1.1.Similarly, the construction of the gene for the hybrid protein KcsA-Kν1.1 in the plasmid pETKcsA-Kν1.1 and the subsequent cultivation of E. coli BL21 (DE3) cells to produce the protein KcsA-Kv1.1 are carried out. This protein contains a portion of the pore loop of the eukaryotic voltage-dependent potassium channel Kv1.1.
Подготовка клеток для анализа заключается в приготовлении сферопластов из клеток E.coli, экспрессирующих мембранный белок KcsA-Kv1.3 (или KcsA-Kv1.1) в составе цитоплазматической мембраны. Пермеабилизацию и последующее удаление наружной клеточной стенки осуществляют путем обработки клеток E.coli раствором, содержащим лизоцим, Трис-НСl и ЭДТА, и последующей стабилизации цитоплазматической мембраны добавлением MgCl2. В результате такой обработки флуоресцентно-меченый лиганд связывается с мембранным белком на поверхности сферопластов E.coli.The preparation of cells for analysis consists in the preparation of spheroplasts from E. coli cells expressing the membrane protein KcsA-Kv1.3 (or KcsA-Kv1.1) as part of the cytoplasmic membrane. Permeabilization and subsequent removal of the outer cell wall is carried out by treating E. coli cells with a solution containing lysozyme, Tris-Hcl and EDTA, and then stabilizing the cytoplasmic membrane by adding MgCl 2 . As a result of this treatment, the fluorescently-labeled ligand binds to the membrane protein on the surface of E. coli spheroplasts.
Флуоресцентно-меченый лиганд, обладающий сродством к участку поровой петли эукариотического калиевого канала Kv1.3 (а также канала Kv1.1), получают путем мечения пептидного токсина (агитоксина, AgTx2) флуоресцентным красителем TAMRA.A fluorescently labeled ligand, which has an affinity for the pore loop region of the eukaryotic potassium channel Kv1.3 (as well as channel Kv1.1), is obtained by labeling the peptide toxin (agitoxin, AgTx2) with TAMRA fluorescent dye.
Процедуру связывания флуоресцентно-меченого лиганда AgTx2-TAMRA с мембранным белком KcsA-Kv1.3 (или KcsA-Kv1.1), локализованным в цитоплазматической мембране клеток E.coli, проводят одним из двух вариантов. В обоих случаях используют лунки планшета, дно которых предварительно обрабатывают раствором полилизина для иммобилизации клеток. В первом варианте суспензию сферопластов инкубируют в лунках планшета в солевом буфере с флуоресцентно-меченым лигандом заданной концентрации, а затем проводят регистрацию флуоресцирующих клеток, осевших на дно лунки, или планшет подвергают центрифугированию для более полного осаждения клеток и проводят регистрацию флуоресцирующих клеток. Во втором варианте суспензию сферопластов вносят в лунки планшета, выдерживают в течение 30 мин для оседания сферопластов на дно лунки или подвергают центрифугированию для более полного осаждения клеток, затем неосевшие сферопласты удаляют, проводят инкубацию иммобилизованных сферопластов в солевом буфере с флуоресцентно-меченым лигандом и регистрируют флуоресцирующие клетки.The binding of the fluorescently labeled AgTx2-TAMRA ligand to the membrane protein KcsA-Kv1.3 (or KcsA-Kv1.1) located in the cytoplasmic membrane of E. coli cells is carried out in one of two ways. In both cases, use the wells of the tablet, the bottom of which is pre-treated with a solution of polylysine to immobilize cells. In the first embodiment, the suspension of spheroplasts is incubated in the wells of the tablet in saline buffer with a fluorescently-labeled ligand of a given concentration, and then the fluorescent cells deposited on the bottom of the well are registered, or the tablet is centrifuged to completely precipitate the cells and register the fluorescent cells. In the second embodiment, a suspension of spheroplasts is introduced into the wells of the plate, kept for 30 minutes to settle the spheroplasts to the bottom of the well, or centrifuged to completely precipitate cells, then the non-settled spheroplasts are removed, and the immobilized spheroplasts are incubated in a saline buffer with fluorescent-labeled fluorescent cells.
Регистрацию флуоресцирующих клеток (то есть комплексов флуоресцентно-меченого лиганда с мембранным белком на поверхности сферопластов) проводят с помощью флуоресцентной оптической микроскопии с применением одного из следующих методов: метода лазерной сканирующей конфокальной микроскопии, эпифлуоресцентной микроскопии или многофотонной сканирующей микроскопии. Результатом применения любого из этих методов являются цифровые микрофотографии, описывающие распределение флуоресцентно-меченого лиганда на мембране сферопластов.The registration of fluorescent cells (i.e., complexes of a fluorescently labeled ligand with a membrane protein on the surface of spheroplasts) is carried out using fluorescence optical microscopy using one of the following methods: laser scanning confocal microscopy, epifluorescence microscopy or multiphoton scanning microscopy. The result of using any of these methods is digital micrographs describing the distribution of a fluorescently labeled ligand on the membrane of spheroplasts.
Среднее количество связавшегося флуоресцентно-меченого лиганда в расчете на клетку оценивается по цифровой фотографии путем измерения средней яркости свечения меченого лиганда на поверхности отдельных клеток и усреднения этих данных по выборке клеток.The average amount of bound fluorescence-labeled ligand per cell is estimated from a digital photograph by measuring the average luminosity of the labeled ligand on the surface of individual cells and averaging these data on a sample of cells.
Для определения константы Kd диссоциации комплекса меченого лиганда и мембранного белка проводят: инкубацию клеток в лунках планшета с возрастающей концентрацией меченого лиганда; регистрацию флуоресцирующих клеток для каждой концентрации меченого лиганда; оценку среднего количества связавшегося флуоресцентно-меченого лиганда в расчете на клетку; построение зависимости среднего количества связавшегося лиганда от концентрации внесенного в среду лиганда; аппроксимацию построенной зависимости функциейTo determine the constant K d of dissociation of the complex of labeled ligand and membrane protein, the following is performed: incubation of cells in the wells of a plate with an increasing concentration of labeled ligand; registration of fluorescent cells for each concentration of labeled ligand; estimating the average amount of bound fluorescently labeled ligand per cell; plotting the average amount of bound ligand on the concentration of ligand introduced into the medium; approximation of the constructed dependence by the function
I=IмC/(Kd+C),I = I m C / (K d + C),
где Iм - максимальное количество связавшегося лиганда, соответствующее выходу функции на плато, С - концентрация внесенного в среду лиганда, Кd - искомая константа диссоциации комплекса меченого лиганда и мембранного белка.where I m is the maximum amount of bound ligand corresponding to the output of the function on a plateau, C is the concentration of the ligand introduced into the medium, K d is the desired dissociation constant of the complex of labeled ligand and membrane protein.
Проведение конкурентного вытеснения меченого лиганда исследуемым соединением (немеченым потенциальным лигандом) из комплексов с целевым мембранным белком проводят путем инкубации клеток со смесью, содержащей фиксированную концентрацию меченого лиганда и возрастающую концентрацию исследуемого соединения. Если соединение вытесняет меченый лиганд, то оно само является лигандом. В этом случае для исследуемого соединения определяют константу IС50. Проводят: регистрацию флуоресцирующих клеток для каждой концентрации исследуемого соединения; оценку среднего количества связавшегося флуоресцентно-меченого лиганда в расчете на клетку; построение зависимости среднего количества связавшегося меченого лиганда от концентрации внесенного в среду исследуемого соединения; определение по построенной зависимости константы IC50, которая численно равна концентрации исследуемого соединения, вытесняющего 50% флуоресцентно-меченого лиганда из комплексов с мембранным белком.Competitive displacement of the labeled ligand by the test compound (unlabeled potential ligand) from complexes with the target membrane protein is carried out by incubating cells with a mixture containing a fixed concentration of the labeled ligand and an increasing concentration of the test compound. If a compound displaces a labeled ligand, then it is itself a ligand. In this case, the constant IC 50 is determined for the test compound. Spend: registration of fluorescent cells for each concentration of the test compound; estimating the average amount of bound fluorescently labeled ligand per cell; plotting the average amount of bound labeled ligand on the concentration of the test compound introduced into the medium; determination according to the constructed dependence of the constant IC 50 , which is numerically equal to the concentration of the test compound, displacing 50% of the fluorescently labeled ligand from complexes with a membrane protein.
Расчет константы диссоциации Кi для исследуемого соединения, являющегося лигандом, проводят в соответствии с уравнением Ченга-Прусоффа [Cheng Y., Prusoff W.H. Relationship between the inhibition constant (K.1) and the concentration of inhibitor which causes 50 per cent inhibition (150) of an enzymatic reaction Biochem. Pharmacol. 1973, 22:3099-3108] по формуле:The calculation of the dissociation constant K i for the ligand test compound is carried out in accordance with the Cheng-Prussoff equation [Cheng Y., Prusoff WH Relationship between the inhibition constant (K.1) and the concentration of inhibitor which causes 50 per cent inhibition (150 ) of an enzymatic reaction Biochem. Pharmacol 1973, 22: 3099-3108] by the formula:
IC50=Ki(1+[L*]/Kd),IC 50 = K i (1+ [L * ] / K d ),
где [L*] - концентрация свободного меченого лиганда AgTx2-TAMRA (принимается равной общему количеству меченого лиганда).where [L * ] is the concentration of free labeled ligand AgTx2-TAMRA (taken equal to the total number of labeled ligand).
Заявляемый способ позволяет осуществлять эффективный и простой способ качественного и количественного определения связывания мембранного белка с лигандом, расширяет возможности тестирования связывания мембранного белка с лигандом, повышает чувствительность и точность измерений, облегчает детекцию и обсчет данных, полученных с помощью флуоресцентных методов анализа, позволяет получать точные количественные оценки всех параметров связывания.The inventive method allows for an effective and simple method for the qualitative and quantitative determination of the binding of a membrane protein to a ligand, expands the possibilities of testing the binding of a membrane protein to a ligand, increases the sensitivity and accuracy of measurements, facilitates the detection and calculation of data obtained using fluorescence methods of analysis, allows to obtain accurate quantitative Estimates of all binding parameters.
Эффективность и простота способа обеспечивается тем, что для анализа связывания мембранного белка с лигандом используют клетки E.coli, экспрессирующие целевой мембранный белок в составе цитоплазматической мембраны. Все стадии получения этих клеток (клонирование генов целевых белков в прокариотические плазмидные векторы, трансформация этими векторами клеток E.coli, поддержание и культивирование штаммов, содержащих плазмидные векторы, проведение индукции целевого мембранного белка) отличаются простотой и эффективностью технологических операций, дешевизной питательных сред и реактивов, не требуют дорогостоящего оборудования для культивирования.The efficiency and simplicity of the method is ensured by the fact that E. coli cells expressing the target membrane protein in the cytoplasmic membrane are used to analyze the binding of the membrane protein to the ligand. All stages of the production of these cells (cloning of the target protein genes into prokaryotic plasmid vectors, transformation of E. coli cells with these vectors, maintenance and cultivation of strains containing plasmid vectors, induction of the target membrane protein) are simple and efficient in technological operations, and low cost of nutrient media and reagents do not require expensive equipment for cultivation.
Эффективность метода определяется также тем, что его можно отнести к технологии флуориметрического тестирования в микрообъеме (FMAT): анализ проводят в микрообъемах (50 мкл) с использованием планшетов; процедура анализа представляет собой «гомогенный» способ тестирования, т.е. не требует удаления несвязавшегося меченого лиганда и исследуемого соединения из анализируемого образца; регистрацию лиганда, связавшегося с клетками, осуществляют одним из методов флуоресцентной микроскопии.The effectiveness of the method is also determined by the fact that it can be attributed to the technology of fluorimetric testing in microvolume (FMAT): the analysis is carried out in microvolume (50 μl) using tablets; the analysis procedure is a “homogeneous” test method, i.e. does not require the removal of unbound labeled ligand and the test compound from the analyzed sample; registration of the ligand bound to the cells is carried out using one of the methods of fluorescence microscopy.
Эффективность и простота этого способа как клеточной технологии тестирования обеспечивается тем, что исключается процедура выделения мембранного белка из состава бактериальной мембраны.The effectiveness and simplicity of this method as a cellular testing technology is ensured by the fact that the procedure for isolating a membrane protein from the composition of a bacterial membrane is excluded.
Детекция связывания флуоресцентно-меченного лиганда с мембранным белком на поверхности бактериальной цитоплазматической мембраны представляет собой новую систему тестирования связывания мембранного белка с лигандом и, таким образом, расширяет возможности тестирования лигандсвязывающей активности мембранных белков.The detection of binding of a fluorescently-labeled ligand to a membrane protein on the surface of a bacterial cytoplasmic membrane is a new system for testing the binding of a membrane protein to a ligand and, thus, expands the possibilities of testing the ligand-binding activity of membrane proteins.
Получение качественных и количественных параметров связывания обеспечивается тем, что в заявленном способе для детекции комплекса мембранного белка с лигандом используют лазерный сканирующий микроскоп, в результате чего исследователь получает флуоресцентные изображения клеток. Эти изображения позволяют, во-первых, локализовать комплекс мембранного белка с лигандом в составе клеточной мембраны и, во-вторых, произвести измерения средней яркости свечения флуоресцентного лиганда на поверхности отдельных клеток (для последующих расчетов констант связывания).Obtaining qualitative and quantitative binding parameters is ensured by the fact that in the inventive method for detecting a complex of a membrane protein with a ligand, a laser scanning microscope is used, as a result of which the researcher obtains fluorescence images of cells. These images allow, firstly, to localize the complex of the membrane protein with the ligand in the composition of the cell membrane and, secondly, to measure the average brightness of the fluorescence ligand on the surface of individual cells (for subsequent calculations of the binding constants).
Повышение чувствительности и точности измерений в значительной мере определяется высоким уровнем флуоресцентного сигнала, детектируемого на поверхности единичной клетки. Высокий уровень флуоресцентного сигнала, в свою очередь, является следствием, во-первых, высокого уровня экспрессии ряда мембранных белков в составе бактериальной мембраны (до 1000000 молекул рецептора на клетку и выше), что значительно превосходит уровень экспрессии мембранных белков в эукариотических клетках (10-100000 молекул на клетку), и, во-вторых, высокой плотности молекул мембранного белка в составе бактериальной мембраны (площадь поверхности бактериальной мембраны в 2000 раз меньше поверхности эукариотической клетки). Кроме того, неспецифическое (фоновое) связывание флуоресценто-меченного лиганда на поверхности бактериальной цитоплазматической мембраны практически отсутствует. Таким образом, высокий уровень флуоресцентного сигнала и значительное превышение уровня этого сигнала по отношению к фоновой флуоресценции позволяет повысить чувствительность метода, способствует упрощению обработки данных и получению более достоверных количественных характеристик.The increase in the sensitivity and accuracy of measurements is largely determined by the high level of the fluorescent signal detected on the surface of a single cell. The high level of the fluorescent signal, in turn, is the result, firstly, of the high level of expression of a number of membrane proteins in the bacterial membrane (up to 1,000,000 receptor molecules per cell and higher), which significantly exceeds the level of expression of membrane proteins in eukaryotic cells (10- 100,000 molecules per cell), and, secondly, a high density of membrane protein molecules in the bacterial membrane (the surface area of the bacterial membrane is 2,000 times smaller than the surface of a eukaryotic cell). In addition, nonspecific (background) binding of the fluorescently labeled ligand on the surface of the bacterial cytoplasmic membrane is practically absent. Thus, a high level of the fluorescent signal and a significant excess of the level of this signal with respect to the background fluorescence can increase the sensitivity of the method, helps to simplify data processing and obtain more reliable quantitative characteristics.
Облегчение детекции и обсчета данных обеспечивается, во-первых, применением нерадиоактивного, а именно флуоресцентного метода анализа; во-вторых, однородностью популяции клеток бактерий, несущих мембранный белок (в отличие от эукариотеских клеток); в-третьих, специальными процедурами приготовления сферопластов и тестирования. Процедура приготовления сферопластов, разработанная специально для визуализации флуоресцентно-окрашенных клеток в лазерном сканирующем микроскопе, основана на простых приемах (измерении оптической плотности клеточной суспензии, низкоскоростном центрифугировании, смешивании реагентов) и не требует для выполнения больших временных затрат (не более одного часа). Процедура приводит к получению четких изображений отдельных сферопластов, равномерному распределению флуоресцентного окрашивания на мембране отдельной клетки, а также соседних клеток, что является необходимым условием анализа связывания и проведения точных количественных расчетов. В результате этой процедуры происходит полное удаление внешней клеточной стенки, отсутствует слипание сферопластов, а также происходит количественное образование сферопластов из исходных клеток. Процедура позволяет хранить полученные сферопласты в течение, по крайней мере, 10 дней с сохранением их способности к связыванию с флуоресцентным токсином. Указанные эффекты достигаются соблюдением соотношений концентрации исходных клеток в суспензии и концентраций реагентов, таких как лизоцим, ЭДТА, MgCl2, а также последовательности смешивания реагентов и соблюдения температурного режима. Получению четких изображений отдельных сферопластов способствует и разработанная процедура тестирования, в которой для иммобилизации сферопластов на дне лунки планшета используют обработку лунок раствором полилизина.Facilitation of the detection and calculation of data is provided, firstly, by the use of a non-radioactive, namely fluorescence analysis method; secondly, the uniformity of the population of bacterial cells carrying a membrane protein (in contrast to eukaryotic cells); thirdly, special procedures for the preparation of spheroplasts and testing. The procedure for the preparation of spheroplasts, designed specifically for imaging fluorescence-stained cells in a laser scanning microscope, is based on simple techniques (measuring the optical density of a cell suspension, low-speed centrifugation, mixing reagents) and does not require large time expenditures (no more than one hour). The procedure leads to clear images of individual spheroplasts, a uniform distribution of fluorescence staining on the membrane of an individual cell, as well as neighboring cells, which is a necessary condition for binding analysis and accurate quantitative calculations. As a result of this procedure, the external cell wall is completely removed, spheroplasts stick together, and spheroplasts are quantitatively formed from the original cells. The procedure allows you to store the resulting spheroplasts for at least 10 days while maintaining their ability to bind to a fluorescent toxin. These effects are achieved by observing the ratios of the concentration of the starting cells in the suspension and the concentrations of the reagents, such as lysozyme, EDTA, MgCl 2 , as well as the sequence of mixing the reagents and observing the temperature regime. Obtaining clear images of individual spheroplasts is also facilitated by the developed testing procedure, in which, to immobilize spheroplasts at the bottom of the plate, the wells are treated with a polylysine solution.
Получение точных количественных оценок всех параметров связывания обеспечивается возможностью определения константы диссоциации комплекса мембранного белка с меченым лигандом (Kd), проведения теста по конкурентному ингибированию и определения величины IС50, а также расчета константы диссоциации комплекса мембранного белка с немеченым лигандом (Ki). Расчет констант диссоциации Kd и Ki позволяет количественно сопоставить аффинность используемых лигандов к мембранному белку.Obtaining accurate quantitative estimates of all binding parameters is provided by the ability to determine the dissociation constant of the membrane protein complex with a labeled ligand (Kd), conduct a competitive inhibition test and determine the IC 50 value, as well as calculate the dissociation constant of the membrane protein complex with unlabeled ligand (Ki). Calculation of the Kd and Ki dissociation constants allows a quantitative comparison of the affinity of the ligands used for the membrane protein.
Для иллюстрации изобретения представлены следующие графические материалы: схема конструирования гибридых генов KcsA-Kν1.3 и KcsA-Kν1.1 (фиг.1, а,б); схемы плазмид pETKcsA-Kv1.3 и pETKcsA-Kv1.1 с генами KcsA-Kv1.3 и KcsA-Kv1.1, соответственно (фиг.2, а,б); фотография электрофоретического разделения суммарного белка клеток BL21(DE3) с плазмидами pETKcsA-Kv1.3 и pETK.csA-Kv1.1 в 13.5%-ном SDS-ПААГ (фиг.3); хроматографический профиль (ВЭЖХ) разделения продуктов реакции токсина AgTx2 с флюоресцентной меткой TAMRA (5(6)-карбокситетраметилродамин-N-сукцинимидный эфир) (фиг.4); цифровые микрофотографии клеток E.coli BL21(DE3) с белками KcsA-Kv1.3 и KcsA-Kv1.1, связывающих на своей поверхности флуоресцентно-меченый лиганд AgTx2-TAMRA (фиг.5); графики зависимости количества меченого лиганда AgTx2-TAMRA, связавшегося на поверхности клеток E.coli BL21(DE3), от концентрации этого лиганда в инкубационной среде для белков KcsA-Kv1.3 и KcsA-Kv1.1 (фиг.6); графики зависимости количества связавшегося меченого лиганда AgTx2-TAMRA от концентрации внесенного в среду немеченого лиганда AgTx2 для белков KcsA-Kv1.3 и KcsA-Kv1.1 (фиг.7).To illustrate the invention, the following graphic materials are presented: design scheme for the hybrid genes KcsA-Kν1.3 and KcsA-Kν1.1 (Fig. 1, a, b); plasmid schemes pETKcsA-Kv1.3 and pETKcsA-Kv1.1 with the genes KcsA-Kv1.3 and KcsA-Kv1.1, respectively (Fig.2, a, b); photo electrophoretic separation of the total protein of cells BL21 (DE3) with plasmids pETKcsA-Kv1.3 and pETK.csA-Kv1.1 in 13.5% SDS-PAGE (figure 3); chromatographic profile (HPLC) of separation of reaction products of AgTx2 toxin with a fluorescent label TAMRA (5 (6) -carboxytetramethylrodamine-N-succinimide ether) (Fig. 4); digital micrographs of E. coli BL21 (DE3) cells with the KcsA-Kv1.3 and KcsA-Kv1.1 proteins binding on their surface the fluorescently-labeled AgTx2-TAMRA ligand (Fig. 5); graphs of the dependence of the number of labeled AgTx2-TAMRA ligand bound on the surface of E. coli BL21 (DE3) cells on the concentration of this ligand in the incubation medium for KcsA-Kv1.3 and KcsA-Kv1.1 proteins (Fig.6); graphs of the dependence of the amount of labeled AgTx2-TAMRA labeled ligand on the concentration of unlabeled AgTx2 ligand introduced onto the medium for KcsA-Kv1.3 and KcsA-Kv1.1 proteins (Fig. 7).
Изобретение иллюстрируют примеры.The invention is illustrated by examples.
Пример 1.Example 1
Получение клеток E.coli, экспрессирующих мембранный белок KcsA-Kv1.3: Хромосомную ДНК Streptomyces lividans выделяют из мицеллия Streptomyces lividans 66 [Rascher, A. et al. 2003. Cloning and characterization of a gene cluster for geldanamycin production in Streptomyces hygroscopicus. FEMS Microbiology Lett.218:223-230]. Ген KcsA (EMBL GenBank, accession number Z37969) амплифицируют методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) на матрице хромосомной ДНК Streptomyces lividans [Legros, С.et al. 2000. Generating a High Affinity Scorpion Toxin Receptor in KcsA-Kv1.3 Chimeric Potassium Channels. J. Biol. Chem.275: 16918-16924], а затем клонируют в плазмиду рЕТ28а (фирмы Novagen, США) по сайтам рестриктаз Ncol и Xhol. Полученная плазмида pETKcsA кодирует рекомбинантный белок KcsA-6xHis, содержащий гексагистидиновый таг на С-конце.Obtaining E. coli cells expressing KcsA-Kv1.3 membrane protein: Streptomyces lividans chromosomal DNA is isolated from Streptomyces lividans 66 micelles [Rascher, A. et al. 2003. Cloning and characterization of a gene cluster for geldanamycin production in Streptomyces hygroscopicus. FEMS Microbiology Lett. 218: 223-230]. The KcsA gene (EMBL GenBank, accession number Z37969) is amplified by polymerase chain reaction (PCR) on a chromosomal DNA template of Streptomyces lividans [Legros, C. et al. 2000. Generating a High Affinity Scorpion Toxin Receptor in KcsA-Kv1.3 Chimeric Potassium Channels. J. Biol. Chem. 275: 16918-16924], and then cloned into the pET28a plasmid (Novagen, USA) at the Ncol and Xhol restriction sites. The resulting plasmid pETKcsA encodes a recombinant KcsA-6xHis protein containing C-terminal hexahistidine tag.
Для конструирования гена KcsA-Kvl.3, кодирующего гибридный белок, в котором последовательность аминокислотных остатков (а.о.) 52-64 белка KcsA (EMBL accession Р0А334) заменена на последовательность а.о. 371-383 белка Kv1.3 (EMBL accession P2201), проводят ПЦР, в которой в качестве матрицы используют плазмиду pETKcsA. Схема конструирования гибридного гена представлена на фиг.1а. Для получения фрагментов ДНК, содержащих нуклеотидную последовательность соответствующих участков гена Kv1.3, используют синтетические олигонуклеотидные праймеры KV1 и KV2. Амплификацию 5'-концевой части гена KcsA проводят в присутствии праймеров Т7 direct (прямого) и KV1; 3'-концевую часть - KV2 и Т7 reverse (обратного):To construct the KcsA-Kvl.3 gene encoding a fusion protein in which the sequence of amino acid residues (a.o.) of 52-64 KcsA protein (EMBL accession P0A334) is replaced by the a.o. 371-383 of the Kv1.3 protein (EMBL accession P2201), PCR is performed in which the plasmid pETKcsA is used as the template. The design scheme of the hybrid gene is presented in figa. To obtain DNA fragments containing the nucleotide sequence of the corresponding regions of the Kv1.3 gene, synthetic oligonucleotide primers KV1 and KV2 are used. Amplification of the 5'-terminal part of the KcsA gene is carried out in the presence of T7 direct (direct) primers and KV1; 3'-end part - KV2 and T7 reverse (reverse):
Т7 direct: 5' - TAATACGACTCACTATAGGGT7 direct: 5 '- TAATACGACTCACTATAGGG
Т7 reverse: 5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGGT7 reverse: 5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG
KV1: 5'-GCTGAAACCGCTGGTCGGATCATCTGCCTCAGCCAGGACGGCKV1: 5'-GCTGAAACCGCTGGTCGGATCATCTGCCTCAGCCAGGACGGC
KV2: 5'- ACCAGCGGTTTCAGCAGCATCCCGGATGCGCTGTGGTGGTCCKV2: 5'- ACCAGCGGTTTCAGCAGCATCCCGGATGCGCTGTGGTGGTCC
После выделения из реакционной смеси полученные фрагменты ДНК, содержащие перекрывающиеся последовательности в области праймеров KV1 и KV2, используют для конструирования полноразмерного гена KcsA-Kv1.3 с помощью пары праймеров Т7 direct и Т7 reverse. Полученный фрагмент ДНК гидролизуют рестриктазами Ncol и Xhol и клонируют по соответсвующим сайтам в вектор рЕТ28а. Структуру полученной плазмиды pETKcsA-Kv1.3 подтверждают секвенированием. Схема плазмиды pETKcsA-Kv 1.3 с геном KcsA-Kv1.3 представлена на фиг.2а. Гибридный ген KcsA-Kv1.3 имеет следующую нуклеотидную последовательность и кодирует соответствующую аминокислотную последовательность (последовательность гена Ку1.3 подчеркнута):After isolation from the reaction mixture, the obtained DNA fragments containing overlapping sequences in the region of primers KV1 and KV2 are used to construct the full-length KcsA-Kv1.3 gene using a pair of T7 direct and T7 reverse primers. The resulting DNA fragment is hydrolyzed with restriction enzymes Ncol and Xhol and cloned at appropriate sites into the pET28a vector. The structure of the obtained plasmid pETKcsA-Kv1.3 is confirmed by sequencing. The scheme of the plasmid pETKcsA-Kv 1.3 with the KcsA-Kv1.3 gene is presented in figa. The KcsA-Kv1.3 hybrid gene has the following nucleotide sequence and encodes the corresponding amino acid sequence (Ku1.3 gene sequence is underlined):
Клетки E.coli BL21(DE3) трансформируют плазмидой pETKcsA-Kv1.3; ночную культуру засевают в жидкую питательную среду LB (среда Luria Bertani), содержащую 40 мкг/мл канамицина, до начальной мутности OD560=0.2 и культивируют при 37°С и качании 200 об/мин. При OD560=0.8 проводят индукцию культуры добавлением ИПТГ до концентрации 50 мкМ и продолжают выращивание в течение 18 час.E. coli BL21 (DE3) cells were transformed with the plasmid pETKcsA-Kv1.3; overnight culture is seeded in LB liquid medium (Luria Bertani medium) containing 40 μg / ml kanamycin to an initial turbidity of OD 560 = 0.2 and cultured at 37 ° C and swing at 200 rpm. At OD 560 = 0.8, culture is induced by adding IPTG to a concentration of 50 μM and cultivation is continued for 18 hours.
Экспрессию белка KcsA-Kv1.3 оценивают с помощью разделения суммарного клетотчного лизата электрофорезом в SDS-ПААГ [Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227:680-685]. Биосинтез белка KcsA-Kv1.3 в клетках E.coli показан на фиг.3а.The expression of KcsA-Kv1.3 protein is evaluated by separating the total cell lysate by electrophoresis in SDS-PAGE [Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685]. Protein biosynthesis of KcsA-Kv1.3 in E. coli cells is shown in figa.
Приготовление сферопластов:Spheroplast preparation:
Суспензию клеток E.coli BL21(DE3) объемом 0.1 мл с оптической плотностью OD560=3.0 о.е., содержащих мембранный белок KcsA-Kv1.3, охлаждают до 4°С, и клетки осаждают центрифугированием при 4000 g в течение 3 мин. Клетки промывают охлажденным буфером, содержащим 20 мМ Трис-HCl, рН 7.5, 50 мМ NaCl, центрифугируют и суспендируют в 1 мл буфера А (50 мМ Трис-HCl, рН 7.5, 0.3 М сахароза, 0.3 мМ ЭДТА). К клеточной суспензии добавляют раствор лизоцима до конечной концентрации 20 мкг/мл, смесь инкубируют при слабом качании в течение 30 мин при 4°С, а затем добавляют раствор MgCl2 до конечной концентрации 10 мМ и через 10 мин растворы NaCl и КСl до конечной концентрации соответственно 100 и 20 мМ. Полученную суспензию сферопластов (около 10(6) клеток/мл) хранят при 4°С в течение 10 дней.A suspension of 0.1 ml E. coli BL21 (DE3) cells with an optical density of OD 560 = 3.0 pu, containing the KcsA-Kv1.3 membrane protein, was cooled to 4 ° C, and the cells were pelleted by centrifugation at 4000 g for 3 min . Cells were washed with chilled buffer containing 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 50 mM NaCl, centrifuged and suspended in 1 ml of buffer A (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.3 M sucrose, 0.3 mM EDTA). Lysozyme solution is added to the cell suspension to a final concentration of 20 μg / ml, the mixture is incubated with gentle swinging for 30 min at 4 ° C, and then MgCl 2 solution is added to a final concentration of 10 mM and after 10 min NaCl and KCl solutions to a final concentration respectively 100 and 20 mm. The resulting suspension of spheroplasts (about 10 (6) cells / ml) was stored at 4 ° C for 10 days.
Получение флуоресцентно-меченого лиганда:Obtaining a fluorescently labeled ligand:
AgTx2 из яда скорпиона Leirus quinquestriatus - один из наиболее изученных классических ингибиторов калиевых каналов. AgTx2 широко применяется в изучении бактериального канала KcsA и его гибридов с потенциал-зависимыми каналами млекопитающих. Токсин AgTx2 представляет собой полипептид длиной 38 а.о. со следующей первичной структурой:AgTx2 from Leirus quinquestriatus scorpion venom is one of the most studied classical potassium channel inhibitors. AgTx2 is widely used to study the bacterial channel of KcsA and its hybrids with voltage-dependent mammalian channels. AgTx2 toxin is a 38 aa polypeptide. with the following primary structure:
GVPINVSCTGSPQCIKPCKDAGMRFGKCMNRKCHCTPKGVPINVSCTGSPQCIKPCKDAGMRFGKCMNRKCHCTPK
Кодирующую последовательность гена AgTx2 клонируют в вектор рЕТ32b по сайтам Kpn1/BamH1. При индукции 0.1-0.4 мМ IPTG и инкубации при 25°С в линиях клеток BL21(DE3) и Origami В, содержащих плазмиду pETAgTx2, образуются растворимые продукты экспрессии. Эффективную очистку гибридных белков проводят из суммарного растворимого клеточного лизата в одну стадию с использованием металлоаффинной хроматографии на сорбенте Talon (Clontech). Выход гибридного белка после металлоаффинной хроматографии составляет 80 мг/л для Trx-AgTx2 на богатой среде.The coding sequence of the AgTx2 gene is cloned into the pET32b vector at the Kpn1 / BamH1 sites. Upon induction of 0.1-0.4 mM IPTG and incubation at 25 ° C, soluble expression products are formed in BL21 (DE3) and Origami B cell lines containing the pETAgTx2 plasmid. Efficient purification of fusion proteins is carried out from the total soluble cell lysate in one step using metal affinity chromatography on Talon sorbent (Clontech). The yield of the hybrid protein after metal affinity chromatography is 80 mg / L for Trx-AgTx2 in a rich medium.
Для выделения целевых пептидов из состава гибридных белков используют гидролиз энтерокиназой по сайту DDDDK, предварительно введенному при создании экспрессирующей конструкции, с последующей очисткой пептидов методом ВЭЖХ на обращенной фазе. Состав рекомбинантных пептидов подтверждают MALDI- масс-спектрометрией. Общий выход продуктов после расщепления энтерокиназой составляет 50% для AgTx2.To isolate the target peptides from the composition of the hybrid proteins, enterokinase hydrolysis is used at the DDDDK site, previously introduced when creating the expression construct, followed by purification of the peptides by reverse phase HPLC. The composition of the recombinant peptides is confirmed by MALDI mass spectrometry. The total yield after digestion with enterokinase is 50% for AgTx2.
Для получения необходимого количества флуоресцентно-меченого токсина AgTx2 к 10 наномолям токсина AgTx2, растворенного в 100 мкл 50 мМ фосфата натрия рН 8.5, добавляют 30 наномолей метки TAMRA (5(6)-карбокситетраметилродамин-N-сукцинимидный эфир) в ДМСО (3 мкл), реакционную смесь инкубируют при 25°С 4 часа, продукты реакции разделяют ВЭЖХ в следующих условиях: колонка Supelko RP-Amid (4.6×150 мм), элюция в линейном градиенте концентрации ацетонитрила в присутствии 0.1% ТФУ при скорости 0.8 мл/мин. Моно-меченые производные определяют масс-спектрометрически.To obtain the required amount of fluorescently labeled AgTx2 toxin, to 10 nanomoles of AgTx2 toxin dissolved in 100 μl of 50 mM sodium phosphate pH 8.5, add 30 nanomolar TAMRA labels (5 (6) -carboxytetramethylrodamine-N-succinimide ether) in DMSO (3 μl) , the reaction mixture was incubated at 25 ° С for 4 hours, the reaction products were separated by HPLC under the following conditions: Supelko RP-Amid column (4.6 × 150 mm), elution in a linear gradient of acetonitrile concentration in the presence of 0.1% TFA at a rate of 0.8 ml / min. Mono-labeled derivatives are determined by mass spectrometry.
Наибольшей активностью обладает моно-производное 3 (фиг.4), которое содержит флуоресцентную метку, связанную с С-концевым остатком Lys38.The most active is mono-derivative 3 (Fig. 4), which contains a fluorescent label associated with the C-terminal residue of Lys38.
Проведение процедуры связывания мембранного белка с лигандом и детекции связавшегося лиганда:The procedure for binding a membrane protein to a ligand and detection of bound ligand:
В лунки планшета вносят по 50 мкл раствора 0,1%-ного полилизина, выдерживают около часа при 37°С для адсорбции полимера на дно планшета, затем остатки раствора удаляют, планшет высушивают и используют для проведения анализа.50 μl of a solution of 0.1% polylysine are added to the wells of the tablet, kept for about an hour at 37 ° C to adsorb the polymer to the bottom of the tablet, then the remaining solution is removed, the tablet is dried and used for analysis.
В лунки планшета вносят по 50 мкл суспензии сферопластов, затем добавляют 2 мкл флуоресцентно-меченого AgTx2 до конечной концентрации 30 нМ и выдерживают в течение 40 мин при 20°С.50 μl of a suspension of spheroplasts are added to the wells of a tablet, then 2 μl of fluorescently-labeled AgTx2 is added to a final concentration of 30 nM and incubated for 40 min at 20 ° C.
Детекцию образования комплекса мембранного белка KcsA-Kv1.3 с флуоресцентно-меченым лигандом AgTx2 осуществляют методом лазерной сканирующей конфокальной микроскопии с помощью установки LSM510 МЕТА. Цифровая микрофотография, описывающая распределение флуоресцентно-меченого лиганда на мембране сферопластов, представлена на фиг.5а и 5б.The formation of the complex of the membrane protein KcsA-Kv1.3 with the fluorescently labeled AgTx2 ligand is detected by laser scanning confocal microscopy using the LSM510 META setup. A digital micrograph describing the distribution of a fluorescently labeled ligand on the membrane of spheroplasts is shown in FIGS. 5a and 5b.
Параллельно проводят процедуру связывания мембранного белка KcsA-Kv1.3 с флуоресцентно-меченым лигандом следующим образом: в лунки планшета вносят по 50 мкл суспензии сферопластов, выдерживают 30 мин при 4°С, затем суспензию неосевших клеток отбирают, а в лунки, содержащие адсорбированные на дне сферопласты, вносят по 50 мкл буфера В (50 мМ Трис-HCl, 0.3 М сахароза, 0.3 мМ ЭДТА, 10 мМ MgCl2, 20 мМ КСl, 100 мМ NaCl, 0.1 % BSA), содержащего 30 нМ лиганда. Смесь выдерживают в течение 1 час при 20°С. Детекцию связавшегося лиганда проводят, как описано выше.In parallel, the procedure of binding the membrane protein KcsA-Kv1.3 with a fluorescently-labeled ligand is carried out as follows: 50 μl of a suspension of spheroplasts are introduced into the wells, incubated for 30 min at 4 ° C, then the suspension of unoccupied cells is removed, and the wells containing adsorbed At the bottom of the spheroplasts, add 50 μl of buffer B (50 mM Tris-HCl, 0.3 M sucrose, 0.3 mM EDTA, 10 mM MgCl 2 , 20 mM KCl, 100 mM NaCl, 0.1% BSA) containing 30 nM ligand. The mixture was incubated for 1 hour at 20 ° C. The detection of the bound ligand is carried out as described above.
Определение константы Kd диссоциации комплекса флуоресцентно-меченого лиганда и мембранного белка KcsA-Kv1.3:Determination of the Kd constant of dissociation of a complex of fluorescently labeled ligand and membrane protein KcsA-Kv1.3:
Константа Kd характеризует аффинность меченого токсина к мембранному белку KcsA-Kv1.3, экспонированному на поверхности сферопластов. Для определения Kd сферопласты инкубируют с увеличивающимися концентрациями меченого токсина AgTx2-TAMRA. Для этого в лунки планшета вносят по 50 мкл суспензии сферопластов, выдерживают 30 мин при 4°С, затем суспензию неосевших клеток отбирают, а в лунки вносят по 50 мкл буфера В, содержащего последовательно увеличивающиеся концентрации меченого токсина AgTx2-TAMRA. Смесь выдерживают в течение 1 ч при 20°С, затем проводят детекцию комплексов, как описано выше.The constant Kd characterizes the affinity of the labeled toxin to the membrane protein KcsA-Kv1.3 exposed on the surface of spheroplasts. To determine Kd, spheroplasts are incubated with increasing concentrations of labeled AgTx2-TAMRA toxin. For this, 50 μl of a suspension of spheroplasts are introduced into the wells of the tablet, incubated for 30 min at 4 ° С, then the suspension of unoccupied cells is taken, and 50 μl of buffer B containing successively increasing concentrations of labeled AgTx2-TAMRA toxin is added to the wells. The mixture was incubated for 1 h at 20 ° C, then the complexes were detected as described above.
Для каждой концентрации AgTx2-TAMRA получают по 5 цифровых микрофотографий размером 120×120 мкм, на каждой из которых присутствует 100-150 клеток. Все изображения получают в идентичных условиях при одинаковом напряжении на детекторе и размере зоны сканирования.For each concentration of AgTx2-TAMRA, 5 digital microphotographs of 120 × 120 μm in size are obtained, each of which contains 100-150 cells. All images are obtained under identical conditions with the same voltage at the detector and the size of the scan zone.
Полученные цифровые микрофотографии обрабатывают при помощи программы Image J: убирают шумы, используя функцию Порог (Threshold), применяют функцию Анализ частиц (Analyze Particles) для определения измерения средней яркости свечения AgTx2-TAMRA на поверхности отдельных клеток и общего количества клеток. Средняя яркость свечения AgTx2-TAMRA на клетке пропорциональна количеству токсина, связавшегося на поверхности сферопласта. С использованием полученного массива цифровых данных для каждой концентрации AgTx2-TAMRA рассчитывают усредненное по выборке клеток количество связавшегося AgTx2-TAMRA в расчете на клетку (в единицах средней яркости свечения) и стандартное отклонение этого значения. Строят график зависимости среднего количества связавшегося лиганда от концентрации внесенного в среду лиганда (фиг.6а) и аппроксимируют эту зависимость функциейThe obtained digital microphotographs are processed using the Image J program: noise is removed using the Threshold function, the Analyze Particles function is used to determine the average brightness of AgTx2-TAMRA luminescence on the surface of individual cells and the total number of cells. The average brightness of the AgTx2-TAMRA luminescence on the cell is proportional to the amount of toxin bound on the surface of the spheroplast. Using the obtained digital data array for each concentration of AgTx2-TAMRA, the number of bound AgTx2-TAMRA bound per cell sample calculated in a cell (in units of average brightness) and the standard deviation of this value are calculated. A graph is constructed of the dependence of the average amount of bound ligand on the concentration of the ligand introduced into the medium (Fig. 6a) and this function is approximated
I=IмC/(Kd+C),I = I m C / (K d + C),
определяя методом наименьших квадратов величину Кd. Для приведенной на фиг.6а зависимости значение Kd составляет Kd=29,6±1,6 нМ.determining by the least squares the value of K d . For the dependence shown in FIG. 6a, the Kd value is Kd = 29.6 ± 1.6 nM.
Проведение конкурентного вытеснения меченого лиганда исследуемым соединением из комплексов с целевым мембранным белком; определение константы IC50 и расчет константы диссоциации Кi для немеченого токсина AgTx2.Carrying out competitive displacement of the labeled ligand by the test compound from complexes with the target membrane protein; determination of the constant IC 50 and calculation of the dissociation constant K i for unlabeled toxin AgTx2.
Для определения константы IC50 для немеченого AgTx2 сферопласты инкубируют в присутствии фиксированной концентрации меченого токсина AgTx2-TAMRA и увеличивающихся концентраций немеченого токсина AgTx2. Для этого в лунки планшета вносят по 50 мкл суспензии сферопластов, выдерживают 30 мин при 4°С, затем суспензию неосевших клеток отбирают, а в лунки вносят по 50 мкл буфера В, содержащего AgTx2-TAMRA в концентрации 30 нМ, и последовательно увеличивающиеся концентрации немеченого токсина AgTx2 (60, 90, 180, 300 и 900 нМ). Смесь выдерживают в течение 1 ч при 20°С, затем проводят регистрацию флуоресцирующих клеток для каждой концентрации AgTx2, как описано выше. Оценку среднего количества связавшегося флуоресцентно-меченого лиганда в расчете на клетку проводят, как описано выше. На фиг.7а представлена зависимость среднего количества связавшегося AgTx2-TAMRA от концентрации внесенного в среду немеченого лиганда AgTx2. Значение константы IC50, соответствующей концентрации AgTx2, при которой происходит вытеснение 50% AgTx2-TAMRA из комплексов с KcsA-Kv1.3, равно IC50=55,8±1,0 нМ, а расчетная константа диссоциации для немеченого токсина AgTx2 равна Ki=55,8/(1+29,6/30)=28,1±1,0 нМ.To determine the IC 50 constant for unlabeled AgTx2, spheroplasts are incubated in the presence of a fixed concentration of labeled AgTx2-TAMRA toxin and increasing concentrations of unlabeled AgTx2 toxin. For this, 50 μl of a suspension of spheroplasts are introduced into the wells of the tablet, incubated for 30 min at 4 ° C, then the suspension of non-settled cells is taken, and 50 μl of buffer B containing AgTx2-TAMRA at a concentration of 30 nM and successively increasing concentrations of unlabeled AgTx2 toxin (60, 90, 180, 300, and 900 nM). The mixture was incubated for 1 h at 20 ° C, then fluorescent cells were recorded for each concentration of AgTx2, as described above. Assessment of the average amount of bound fluorescently-labeled ligand per cell is carried out as described above. Fig. 7a shows the dependence of the average amount of bound AgTx2-TAMRA on the concentration of unlabeled AgTx2 ligand introduced into the medium. The value of the constant IC 50 corresponding to the concentration of AgTx2, at which 50% AgTx2-TAMRA is displaced from complexes with KcsA-Kv1.3, is IC 50 = 55.8 ± 1.0 nM, and the calculated dissociation constant for unlabeled toxin AgTx2 is Ki = 55.8 / (1 + 29.6 / 30) = 28.1 ± 1.0 nM.
Пример 2.Example 2
Пример 2 проводят, как пример 1, но конструирование гена KcsA-Kv1.1, кодирующего гибридный белок, в котором последовательность аминокислотных остатков (а.о.) 52-64 белка KcsA (EMBL accession POA334) заменена на последовательность а.о. 347-363 белка Kv1.1 (EMBL accession NP000208), проводят следующим образом: для получения в реакции ПЦР фрагментов ДНК, содержащих нуклеотидную последовательность соответствующих участков гена Kv1.1, используют синтетические олигонуклеотидные праймеры Т7 direct и Т7 reverse, а также KV3 и KV4:Example 2 is carried out as example 1, but the construction of the KcsA-Kv1.1 gene encoding a hybrid protein in which the amino acid residue sequence (a.o.) 52-64 of the KcsA protein (EMBL accession POA334) is replaced by the a.o. sequence. 347-363 of the Kv1.1 protein (EMBL accession NP000208) is carried out as follows: in order to obtain DNA fragments containing the nucleotide sequence of the corresponding regions of the Kv1.1 gene in the PCR reaction, synthetic oligonucleotide primers T7 direct and T7 reverse, as well as KV3 and KV4, are used :
KV3: 5'- GCTGAAACCGCTGGTCGGATCATCTGCCTCAGCCAGGACGGCKV3: 5'- GCTGAAACCGCTGGTCGGATCATCTGCCTCAGCCAGGACGGC
KV4: 5'- ACCAGCGGTTTCAGCAGCATCCCGGATGCGCTGTGGTGGTCCKV4: 5'- ACCAGCGGTTTCAGCAGCATCCCGGATGCGCTGTGGTGGTCC
Схема конструирования гибридного гена KcsA-Kv1.1 представлена на фиг.1б, а схема плазмиды pETKcsA-Kv1.1 с геном KcsA-Kv1.1 представлена на фиг.2б. Гибридный ген KcsA-Kv1.1 имеет следующую нуклеотидную последовательность и кодирует соответствующую аминокислотную последовательность (последовательность гена Kv1.1 подчеркнута):The design scheme of the hybrid gene KcsA-Kv1.1 is shown in Fig.1b, and the scheme of the plasmid pETKcsA-Kv1.1 with the KcsA-Kv1.1 gene is shown in Fig.2b. The KcsA-Kv1.1 hybrid gene has the following nucleotide sequence and encodes the corresponding amino acid sequence (Kv1.1 gene sequence is underlined):
Трансформацию клеток BL21(DE3) плазмидой pETKcsA-Kv1.1, индукцию культуры и разделение суммарного клетотчного лизата электрофорезом в SDS-ПААГ проводят, как в примере 1; биосинтез белка KcsA-Kv1.1 в клетках E.coli показан на фиг.3б.The transformation of BL21 (DE3) cells with the plasmid pETKcsA-Kv1.1, the induction of culture and the separation of the total cell lysate by electrophoresis in SDS-PAGE are carried out as in example 1; KcsA-Kv1.1 protein biosynthesis in E. coli cells is shown in Fig. 3b.
Проведение процедуры связывания мембранного белка KcsA-Kv1.1 с лигандом и детекции связавшегося лиганда проводят, как в примере 1; цифровая микрофотография, описывающая распределение флуоресцентно-меченого лиганда на мембране сферопластов, содержащих KcsA-Kv1.1, представлена на фиг.5в и 5г.The procedure for binding the membrane protein KcsA-Kv1.1 to the ligand and the detection of the bound ligand is carried out, as in example 1; A digital micrograph describing the distribution of a fluorescently labeled ligand on the membrane of spheroplasts containing KcsA-Kv1.1 is shown in FIGS. 5c and 5d.
Определение константы Kd мембранного белка KcsA-Kv1.1, экспонированному на поверхности сферопластов, в отношении меченого токсина проводили, как в примере 1. Зависимость количества меченого лиганда AgTx2-TAMRA, связавшегося на поверхности клеток E.coli BL21(DE3) с белком KcsA-Kv1.1, от концентрации лиганда в инкубационной среде представлена на фиг.6б. Для приведенной на фиг.6б зависимости значение Kd составляет Kd=42±2 нМ.Determination of the Kd constant of the KcsA-Kv1.1 membrane protein exposed on the surface of spheroplasts with respect to the labeled toxin was carried out as in Example 1. The dependence of the amount of labeled AgTx2-TAMRA ligand bound on the surface of E. coli BL21 (DE3) cells with KcsA- protein Kv1.1, from the concentration of the ligand in the incubation medium is presented in figb. For the dependence shown in FIG. 6b, the Kd value is Kd = 42 ± 2 nM.
Проведение конкурентного вытеснения меченого лиганда исследуемым соединением из комплексов с целевым мембранным белком KcsA-Kv1.1; определение константы IС50 и расчет константы диссоциации Кi для немеченого токсина AgTx2 проводили, как в примере 1. На фиг.7б представлена зависимость среднего количества связавшегося AgTx2-TAMRA от концентрации внесенного в среду немеченого лиганда AgTx2. Значение константы IC50, соответствующей концентрации AgTx2, при которой происходит вытеснение 50% AgTx2-TAMRA из комплексов с KcsA-Kv1.1, равно IC50=80±2 нМ нМ, а расчетная константа диссоциации для немеченого токсина AgTx2 равна Ki=80/(1+40/42)=41±2 нМ.Carrying out competitive displacement of the labeled ligand with the test compound from complexes with the target membrane protein KcsA-Kv1.1; the determination of the IC 50 constant and the calculation of the dissociation constant K i for the unlabeled AgTx2 toxin were performed as in Example 1. Fig. 7b shows the dependence of the average amount of bound AgTx2-TAMRA on the concentration of unlabeled AgTx2 ligand introduced into the medium. The value of the constant IC 50 corresponding to the concentration of AgTx2, at which 50% AgTx2-TAMRA is displaced from complexes with KcsA-Kv1.1, is IC 50 = 80 ± 2 nM nM, and the calculated dissociation constant for unlabeled toxin AgTx2 is Ki = 80 / (1 + 40/42) = 41 ± 2 nM.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2007139290/13A RU2380421C2 (en) | 2007-10-24 | 2007-10-24 | Method of qualitative and quantitative estimation of fixation of membrane protein and ligand |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2007139290/13A RU2380421C2 (en) | 2007-10-24 | 2007-10-24 | Method of qualitative and quantitative estimation of fixation of membrane protein and ligand |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2007139290A RU2007139290A (en) | 2009-04-27 |
| RU2380421C2 true RU2380421C2 (en) | 2010-01-27 |
Family
ID=41018590
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2007139290/13A RU2380421C2 (en) | 2007-10-24 | 2007-10-24 | Method of qualitative and quantitative estimation of fixation of membrane protein and ligand |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2380421C2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2822761C2 (en) * | 2021-10-25 | 2024-07-12 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) | METHOD OF PRODUCING AND PURIFYING FUNCTIONALLY ACTIVE RECOMBINANT NSP1 SARS-CoV-2 PROTEIN AND METHOD OF IDENTIFYING POTENTIAL ANTI-COVID-19 DRUG COMPOUNDS AIMED AT INHIBITING NSP1 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2022550940A (en) * | 2019-10-01 | 2022-12-06 | エーシー イミューン ソシエテ アノニム | Microradioactive binding assay for ligand screening |
-
2007
- 2007-10-24 RU RU2007139290/13A patent/RU2380421C2/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| MAGGIONI A et al., Targeting the expression of functional murine CMP-sialic acid transporter to the E.coli inner membrane., Biochem Biophys Res Commun. Epub 2007. CHEN G et al., Isolation of high-affinity ligand-binding proteins by periplasmic expression with cytometric screening (PECS), Nat Biotechnol. 2001, v.19, №6, p.537-42. ROMANOV GA et al., A live cell hormone-binding assay on transgenic bacteria expressing a eukaryotic receptor protein., Anal Biochem. 2005, v.347, №1, p.129-34. HARVEY BR et al., Anchored periplasmic expression, a versatile technology for the isolation of high-affinity antibodies from Escherichia coli-expressed libraries, Proc Nat1 Acad Sci USA. 2004, v.101, №25, p.9193-8. JUNG ST et al., Binding and enrichment of Escherichia coli spheroplasts expressing inner membrane tethered scFv antibodies on surface immobilized antigens, Biotechnol Bioeng. 2007, v.98, №1, p.39-47. LEGROS С et al., Generating a high affinity scorpion toxin receptor in KcsA-Kvl.3 chimeric pot * |
| MELLENTIN-MICHELOTTI J et al., Determination of ligand binding affinities for endogenous seven-transmembrane receptors using fluorometric microvolume assay technology, Anal Biochem. 1999, v.272, n.2, p.182-90. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2822761C2 (en) * | 2021-10-25 | 2024-07-12 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) | METHOD OF PRODUCING AND PURIFYING FUNCTIONALLY ACTIVE RECOMBINANT NSP1 SARS-CoV-2 PROTEIN AND METHOD OF IDENTIFYING POTENTIAL ANTI-COVID-19 DRUG COMPOUNDS AIMED AT INHIBITING NSP1 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2007139290A (en) | 2009-04-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP2044219B1 (en) | Detectable nucleic acid tag | |
| AU2014322867B2 (en) | Method | |
| EP2585487B1 (en) | Coincidence detection | |
| Zhang et al. | Ribosome-bound Get4/5 facilitates the capture of tail-anchored proteins by Sgt2 in yeast | |
| Duart et al. | Methodological approaches for the analysis of transmembrane domain interactions: A systematic review | |
| Daggett et al. | Site-specific in vitro and in vivo incorporation of molecular probes to study G-protein-coupled receptors | |
| Izquierdo-Martinez et al. | DipM controls multiple autolysins and mediates a regulatory feedback loop promoting cell constriction in Caulobacter crescentus | |
| Hattori et al. | Split luciferase complementation for analysis of intracellular signaling | |
| RU2380421C2 (en) | Method of qualitative and quantitative estimation of fixation of membrane protein and ligand | |
| JP2002508515A (en) | Capillary electrophoresis for detecting novel biologically active compounds in complex biological materials | |
| He et al. | High-throughput selection of transmembrane sequences that enhance receptor tyrosine kinase activation | |
| AU2018265070B2 (en) | Genetically encoded potassium ion indicators | |
| CN104568861A (en) | Method for detecting protein interaction based on bimolecularly complemented covalent modification mark | |
| US20060046277A1 (en) | Protein kinase and phosphatase substrates and multiplex assays for identifying their activities | |
| Gübeli et al. | In vitro-evolved peptides mimic a binding motif of the G-actin-binding protein thymosin-B4 and serve as research tools | |
| JP2022529592A (en) | Complementary system of split photoactive yellow protein and its use | |
| Izquierdo-Martinez et al. | DipM controls multiple autolysins and mediates two regulatory feedback loops promoting cell constriction in C. crescentus | |
| Winkelaar | The Structural and Functional Characterization of the Periplakin Linker Domain | |
| CN120842429A (en) | A fusion protein and its application in preparing phosphatidic acid biosensor | |
| Umezawa | Detecting mitochondrial RNA and other cellular events in living cells | |
| Ding | Analysis of SecA structure and conformational dynamics | |
| HK40017877A (en) | Genetically encoded potassium ion indicators | |
| HK40017877B (en) | Genetically encoded potassium ion indicators | |
| Deeng | Functional and structural studies on the ribosome associated factors Trigger Factor and NAC | |
| Glickman et al. | Literature Search and Review |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FA92 | Acknowledgement of application withdrawn (lack of supplementary materials submitted) |
Effective date: 20090708 |
|
| FZ9A | Application not withdrawn (correction of the notice of withdrawal) |
Effective date: 20090817 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20161025 |