RU2378374C2 - Recombinant dna ensuring production of recombinant protein pbi expressing protective properties in relation to streptococcus pyogenes and streptococcus agalactiae - Google Patents
Recombinant dna ensuring production of recombinant protein pbi expressing protective properties in relation to streptococcus pyogenes and streptococcus agalactiae Download PDFInfo
- Publication number
- RU2378374C2 RU2378374C2 RU2008111000/13A RU2008111000A RU2378374C2 RU 2378374 C2 RU2378374 C2 RU 2378374C2 RU 2008111000/13 A RU2008111000/13 A RU 2008111000/13A RU 2008111000 A RU2008111000 A RU 2008111000A RU 2378374 C2 RU2378374 C2 RU 2378374C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- recombinant
- dna
- pqe
- protein
- streptococcus
- Prior art date
Links
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 39
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 39
- 241000193985 Streptococcus agalactiae Species 0.000 title claims abstract description 14
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 title claims abstract description 14
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 title claims abstract description 13
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 title claims abstract description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 33
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract 6
- 108010059574 C5a peptidase Proteins 0.000 claims description 12
- 241001596967 Escherichia coli M15 Species 0.000 claims description 11
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 11
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 8
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 5
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 claims description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 4
- 230000004154 complement system Effects 0.000 claims 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 abstract description 12
- 238000010367 cloning Methods 0.000 abstract description 12
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 abstract description 8
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 8
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 abstract description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 27
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 25
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 22
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 14
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 11
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 10
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 10
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 8
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 6
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 5
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 5
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 5
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 5
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 5
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 5
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 4
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 4
- 101800004967 Small cardioactive peptide B Proteins 0.000 description 4
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 4
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- 230000000625 opsonophagocytic effect Effects 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 4
- 101150024466 scpB gene Proteins 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 3
- 101150088541 SCPA gene Proteins 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 101150033155 sspP gene Proteins 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- IDATZUYVZKJKRE-SXMXEBDWSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-n-[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[(2s)-2-[[(2s)-1-[[(2s)-1-amino-4-methylsulfanyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]carbamoyl]pyrrolidin-1-yl]-1-oxo-3-phenylpropan Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(N)=O)C1=CC=C(O)C=C1 IDATZUYVZKJKRE-SXMXEBDWSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 2
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 2
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 2
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000003571 opsonizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 235000019371 penicillin G benzathine Nutrition 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- FKENQMMABCRJMK-RITPCOANSA-N sulbactam Chemical compound O=S1(=O)C(C)(C)[C@H](C(O)=O)N2C(=O)C[C@H]21 FKENQMMABCRJMK-RITPCOANSA-N 0.000 description 2
- 229960005256 sulbactam Drugs 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- RXZBMPWDPOLZGW-XMRMVWPWSA-N (E)-roxithromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=N/OCOCCOC)/[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 RXZBMPWDPOLZGW-XMRMVWPWSA-N 0.000 description 1
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 206010009152 Chronic tonsillitis Diseases 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108010005054 Deoxyribonuclease BamHI Proteins 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 201000000297 Erysipelas Diseases 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 206010016228 Fasciitis Diseases 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 206010018364 Glomerulonephritis Diseases 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 206010021531 Impetigo Diseases 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241001420836 Ophthalmitis Species 0.000 description 1
- 206010031252 Osteomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 206010033078 Otitis media Diseases 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 201000007100 Pharyngitis Diseases 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 206010037596 Pyelonephritis Diseases 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 206010039587 Scarlet Fever Diseases 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 206010061372 Streptococcal infection Diseases 0.000 description 1
- 206010048960 Streptococcal sepsis Diseases 0.000 description 1
- 208000017757 Streptococcal toxic-shock syndrome Diseases 0.000 description 1
- 231100000650 Toxic shock syndrome Toxicity 0.000 description 1
- 206010044251 Toxic shock syndrome streptococcal Diseases 0.000 description 1
- 108010059993 Vancomycin Proteins 0.000 description 1
- 206010047115 Vasculitis Diseases 0.000 description 1
- 206010001093 acute tonsillitis Diseases 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 1
- 229960004099 azithromycin Drugs 0.000 description 1
- MQTOSJVFKKJCRP-BICOPXKESA-N azithromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)N(C)C[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 MQTOSJVFKKJCRP-BICOPXKESA-N 0.000 description 1
- 229960002536 benzathine benzylpenicillin Drugs 0.000 description 1
- BVGLIYRKPOITBQ-ANPZCEIESA-N benzylpenicillin benzathine Chemical compound C=1C=CC=CC=1C[NH2+]CC[NH2+]CC1=CC=CC=C1.N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C([O-])=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1.N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C([O-])=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 BVGLIYRKPOITBQ-ANPZCEIESA-N 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000006161 blood agar Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000748 cardiovascular system Anatomy 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 230000035606 childbirth Effects 0.000 description 1
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N chloroform Substances ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002626 clarithromycin Drugs 0.000 description 1
- AGOYDEPGAOXOCK-KCBOHYOISA-N clarithromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@](C)([C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)OC)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 AGOYDEPGAOXOCK-KCBOHYOISA-N 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- -1 deoxyribonucleotide triphosphates Chemical class 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 206010014665 endocarditis Diseases 0.000 description 1
- 108010002480 endodeoxyribonuclease SacI Proteins 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000224 granular leucocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003120 macrolide antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041033 macrolides Drugs 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003973 paint Substances 0.000 description 1
- 208000010403 panophthalmitis Diseases 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 230000009984 peri-natal effect Effects 0.000 description 1
- 210000003024 peritoneal macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 239000007981 phosphate-citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 230000009979 protective mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229960005224 roxithromycin Drugs 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 208000013223 septicemia Diseases 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid Substances OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 206010044008 tonsillitis Diseases 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 229940124856 vaccine component Drugs 0.000 description 1
- 229960003165 vancomycin Drugs 0.000 description 1
- MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N vancomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=C2C=C3C=C1OC1=CC=C(C=C1Cl)[C@@H](O)[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]3C(=O)N[C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](C3=CC(O)=CC(O)=C3C=3C(O)=CC=C1C=3)C(O)=O)=O)[C@H](O)C1=CC=C(C(=C1)Cl)O2)=O)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC)[C@H]1C[C@](C)(N)[C@H](O)[C@H](C)O1 MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N 0.000 description 1
- MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N vancomycin Natural products O1C(C(=C2)Cl)=CC=C2C(O)C(C(NC(C2=CC(O)=CC(O)=C2C=2C(O)=CC=C3C=2)C(O)=O)=O)NC(=O)C3NC(=O)C2NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CC(C)C)NC)C(O)C(C=C3Cl)=CC=C3OC3=CC2=CC1=C3OC1OC(CO)C(O)C(O)C1OC1CC(C)(N)C(O)C(C)O1 MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 150000003952 β-lactams Chemical class 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области микробиологии и молекулярной генетики и может быть использовано в медицинской промышленности при производстве вакцин против Streptococcus pyogenes, стрептококков группы А (СГА), и Streptococcus agalactiae, стрептококков группы В (СГВ).The invention relates to the field of microbiology and molecular genetics and can be used in the medical industry in the production of vaccines against Streptococcus pyogenes, Streptococcus group A (SGA), and Streptococcus agalactiae, Streptococcus group B (SGB).
Streptococcus pyogenes (СГА) являются широко распространенным патогеном для человека и приматов, инфицируя, главным образом, назофарингеальную слизистую и кожу. Стрептококки, инфицирующие слизистую человека, вызывают острую ангину, скарлатину, хронический тонзилит и фарингит, которые часто сопровождаются серьезными осложнениями, такими как отит, ревматизм и гломерулонефрит. К кожным заболеваниям, вызываемым СГА, относятся импетиго, васкулиты, гнойные посттравматические и постожоговые поражения тканей, рожистое воспаление. В ряде случаев инфекции, вызванные СГА, переходят в более генерализованные формы: некротический фасцит, стрептококковый сепсис и токсический шоковый синдром. Эти заболевания характеризуются высоким процентом летальных исходов вследствие быстрого развития шока на фоне общей недостаточности работы органов человеческого организма.Streptococcus pyogenes (GHA) are a common pathogen for humans and primates, mainly infecting the nasopharyngeal mucosa and skin. Streptococci that infect the human mucosa cause acute tonsillitis, scarlet fever, chronic tonsillitis and pharyngitis, which are often accompanied by serious complications, such as otitis media, rheumatism and glomerulonephritis. Skin diseases caused by SGA include impetigo, vasculitis, purulent post-traumatic and post-burn tissue damage, erysipelas. In a number of cases, infections caused by SGA turn into more generalized forms: necrotic fasciitis, streptococcal sepsis and toxic shock syndrome. These diseases are characterized by a high percentage of deaths due to the rapid development of shock against the background of a general insufficiency of the organs of the human body.
Streptococcus agalactiae (СГВ) является основной причиной серьезных перинатальных инфекций, чаще всего протекающих в виде пневмоний, сепсиса и менингита. Заражение ребенка происходит во время родов от матери с носительством СГВ или еще антинатально в случае бессимптомного носительства СГВ у матери. У детей старшего возраста стрептококковая инфекция проявляется в форме остеомиелита, артрита, поражения глаз, кожи и мочевого пузыря. У взрослых стрептококки группы В также могут вызывать ряд тяжелых заболеваний, таких как пиелонефрит, артрит, офтальмит, эндокардит, септицемия и др.Streptococcus agalactiae (HBV) is the main cause of serious perinatal infections, most often occurring in the form of pneumonia, sepsis and meningitis. Infection of the child occurs during childbirth from the mother with carrier of GBS or even antinatally in case of asymptomatic carrier of GBV in the mother. In older children, streptococcal infection manifests itself in the form of osteomyelitis, arthritis, damage to the eyes, skin and bladder. In adults, group B streptococci can also cause a number of serious diseases, such as pyelonephritis, arthritis, ophthalmitis, endocarditis, septicemia, etc.
В настоящее время заболевания, вызываемые стрептококками группы А и В, рассматриваются как важная социально-экономическая и медицинская проблема во всех странах мира. Заболевания, вызываемые стрептококками группы А и В, лечат с помощью антибиотиков (Страчунский Л.С., Козлов С.Н., Соврем. Антимикроб. Химиотер., М.: Боргес, 1-432 (2002), Поляк М.С. Основы антибиотикотерапии, СПб: НИЦФ, 1-53 (2003)). Препаратами выбора при лечении СГА и СГВ инфекций являются бета-лактамы: бензилпенициллин, ампициллин (Семина Н.А., Сидоренко С.В. и др., Клин. Микробиол. Антимикроб. Химиотер.6 (4): 306-359 (2004)), ампициллин + сульбактам (Бурбелло А.Т. и др., Соврем. Лекар. Средства, СПб: Нева, 332 (2003)); макролиды: эритромицин, кларитромицин, рокситромицин, азитромицин; ванкомицин (Зуева Л.П., Поляк М.С. и др., Микробиологический мониторинг, СПб: Медицинский информационно-аналитический центр, 1-72 (2004)).Currently, diseases caused by group A and B streptococci are considered as an important socio-economic and medical problem in all countries of the world. Diseases caused by group A and B streptococci are treated with antibiotics (Strachunsky L.S., Kozlov S.N., Sovrem. Antimicrobial. Chemioter., M .: Borges, 1-432 (2002), Polyak M.S. Fundamentals of antibiotic therapy, St. Petersburg: NICF, 1-53 (2003)). Beta-lactams: benzylpenicillin, ampicillin (Semina N.A., Sidorenko S.V. et al., Klin. Mikrobiol. Antimikrob. Khimioter. 6 (4): 306-359 (2004 )), ampicillin + sulbactam (Burbello A.T. et al., Sovrem. Lekar. Means, St. Petersburg: Neva, 332 (2003)); macrolides: erythromycin, clarithromycin, roxithromycin, azithromycin; vancomycin (Zueva L.P., Polyak M.S. et al., Microbiological monitoring, St. Petersburg: Medical Information and Analytical Center, 1-72 (2004)).
В целях профилактики СГА и СГВ инфекций используют такие антибиотики, как бензатин бензилпенициллин (Бурбелло А.Т. и др., Соврем. Лекар. Средства, СПб: Нева, 323-324 (2003)), эритромицин (Бурбелло А.Т. и др., Соврем. Лекар. Средства, СПб: Нева, 352 (2003)), ампициллин + сульбактам (Бурбелло А.Т. и др., Соврем. Лекар. Средства, СПб: Нева, 332 (2003)).In order to prevent hepatitis A and hepatitis B infections, antibiotics such as benzathine benzylpenicillin (Burbello A.T. et al., Sovrem. Lekar. Means, St. Petersburg: Neva 323-324 (2003)), erythromycin (Burbello A.T. and et al., Sovrem. Lekar. Means, Saint Petersburg: Neva, 352 (2003)), ampicillin + sulbactam (Burbello A.T. et al., Sovrem. Lekar. Medicines, Saint Petersburg: Neva, 332 (2003)).
Антибиотикотерапия, широко применяемая в качестве мер профилактики и лечения, нередко оказывается неэффективной в силу увеличения числа антибиотикоустойчивых штаммов. Другим значительным недостатком антибиотикотерапии является возникновение побочных эффектов для здоровья людей. К ним относятся аллергические реакции, срыв иммунной системы организма, нарушение микробиоценоза организма и развитие сопутствующих заболеваний и осложнений на фоне иммунодефицита, негативное действие на центральную нервную и сердечно-сосудистую системы и на некоторые важные внутренние органы человека.Antibiotic therapy, widely used as a preventive and treatment measure, is often ineffective due to an increase in the number of antibiotic-resistant strains. Another significant drawback of antibiotic therapy is the occurrence of side effects for human health. These include allergic reactions, disruption of the body’s immune system, impaired microbiocenosis of the body and the development of concomitant diseases and complications due to immunodeficiency, a negative effect on the central nervous and cardiovascular systems and on some important internal organs of a person.
В этой связи необходимость создания вакцины против стрептококков групп А и В остается актуальной проблемой.In this regard, the need to create a vaccine against streptococcus groups A and B remains an urgent problem.
Практически все штаммы СГА и СГВ продуцируют на поверхности клетки С5а пептидазу - фермент, расщепляющий С5а компонент комплемента человека, обезьяны и коровы, который обладает свойствами анафилатоксина и участвует в привлечении полиморфноядерных лейкоцитов в очаг инфекции (Wexler D.E., and P.P.Cleary, Infect. Immun. 39:239-246 (1983); Wexler D.E., and P.P.Cleary, Infect. Immun. 50:757-764 (1985)). Кроме того, было продемонстрировано, что С5а пептидаза обладает способностью связывать фибронектин, а также участвует в инвазии эпителиальных клеток (Beckmann С. и др., Infect. Immun. 70: 2869-2876 (2002); Cheng Q. и др., Infect. Immun., 70: 2408-2413 (2002)).Almost all strains of CGA and CHB produce peptidase on the surface of C5a cells — an enzyme that breaks down the C5a component of the complement of humans, monkeys and cows, which has the properties of anaphylatoxin and is involved in attracting polymorphonuclear leukocytes to the infection site (Wexler DE, and PPCleary, Infect. Immun. 39: 239-246 (1983); Wexler DE, and PPCleary, Infect. Immun. 50: 757-764 (1985)). In addition, it has been demonstrated that C5a peptidase has the ability to bind fibronectin and is also involved in the invasion of epithelial cells (Beckmann C. et al., Infect. Immun. 70: 2869-2876 (2002); Cheng Q. et al., Infect . Immun., 70: 2408-2413 (2002)).
При сравнении генов scpA и scpB, кодирующих С5а пептидазу стрептококков групп А и В, была выявлена 95-98% гомология их нуклеотидных последовательностей (Chmouryguina I., Suvorov А. и др., Infect. Immun. Jul: 2387-2390, (1996)). Было также обнаружено, что единственной областью, отличающей scpA от scpB, является дополнительная область гена размером 51 п.н., локализованная близко к 3' концу scpA (Cleary Р.Р.и др.. Infect. Immun. 60: 4239-4244 (1992)).When comparing the scpA and scpB genes encoding the C5a peptidase of group A and B streptococci, a 95-98% homology of their nucleotide sequences was revealed (Chmouryguina I., Suvorov A. et al., Infect. Immun. Jul: 2387-2390, (1996 )). It was also found that the only region that distinguishes scpA from scpB is an additional 51 bp gene region located close to the 3 'end of scpA (Cleary P.R. et al. Infect. Immun. 60: 4239-4244 (1992)).
Впервые ген, кодирующий С5а пептидазу СГА (CS24) M12 серотипа был проклонирован с использованием экспрессионного вектора рТТ1 в Е. coli DH 5а в 1989 году американскими учеными Cleary P.P. и Chen С.С. (Chen C.C. and Cleary P. Infect. Immun, 57. 1740-1745 (1989)).For the first time, a gene encoding C5a peptidase SGA (CS24) M12 serotype was cloned using the expression vector pTT1 in E. coli DH 5a in 1989 by American scientists Cleary P.P. and Chen S.S. (Chen C. C. and Cleary P. Infect. Immun, 57. 1740-1745 (1989)).
В 2000 г. были проклонированы полноразмерные гены scpB из двух штаммов СГВ (125 и 130) III серотипа с использованием плазмидного вектора pGEX-2T и получены рекомбинантные белки SCPB (John F. Bohnsack J.F. и др. Infect. Immun. 68(9): 5018-5025 (2000)).In 2000, full-length scpB genes from two serotype SGV strains (125 and 130) of the III serotype were cloned using the plasmid vector pGEX-2T and recombinant SCPB proteins were obtained (John F. Bohnsack JF et al. Infect. Immun. 68 (9): 5018-5025 (2000)).
В 2002 г. из СГВ (СHI) III серотипа были проклонированы гены scpB, кодирующие полноразмерную С5а пептидазу (с 1-го по 1090-й аминокислотный остаток) и фрагмент С5а пептидазы (с 116-го по 227-й аминокислотный остаток) с использованием плазмидного вектора pGEX-4T3 в Е. coli BL21(DE3) (Beckmann С. и др., Infect. Immun. 70(6): 2869-2876 (2002)).In 2002, scpB genes encoding the full-length C5a peptidase (from the 1st to 1090th amino acid residue) and the C5a peptidase fragment (from the 116th to 227th amino acid residue) were cloned from the HBV (CHI) III serotype using pGEX-4T3 plasmid vector in E. coli BL21 (DE3) (Beckmann, C. et al., Infect. Immun. 70 (6): 2869-2876 (2002)).
Прототипом изобретения является ген, кодирующий С5а пептидазу СГВ штамма 78/471 II/c серотипа, который был проклонирован в Е. coli DH 5а с использованием экспрессионного плазмидного вектора pGEX-4T-l в 1996 г. российскими учеными Шмурыгиной И.И. и Суворовым А.Н. совместно с американскими учеными Ferrieri P. и Cleary P.P. В результате этой работы был экспрессирован и очищен рекомбинантный белок SCPB молекулярной массы 126 кДа. В тесте на подавление хемотаксиса клеток крови человека была продемонстрирована биологическая активность полученного белка SCPB (Chmouryguina I., Suvorov А. и др., Infect. Immun. Jul: 2387-2390, (1996)).The prototype of the invention is a gene encoding the C5 peptidase of the HBV strain 78/471 II / c serotype, which was cloned in E. coli DH 5a using the expression plasmid vector pGEX-4T-l in 1996 by Russian scientists I. Shmurygina I.I. and Suvorov A.N. together with American scientists Ferrieri P. and Cleary P.P. As a result of this work, a recombinant protein of 126 kDa molecular weight SCPB was expressed and purified. In the test for suppressing chemotaxis of human blood cells, the biological activity of the obtained SCPB protein was demonstrated (Chmouryguina I., Suvorov A. et al., Infect. Immun. Jul: 2387-2390, (1996)).
При рассмотрении возможного применения SCPB для создания вакцины недостатком этого белка являлось сохранение его ферментативной активности, что ставило под сомнение возможность его применения для человеческого организма.When considering the possible use of SCPB to create a vaccine, the disadvantage of this protein was the preservation of its enzymatic activity, which cast doubt on the possibility of its use for the human body.
Задачей данного изобретения стало получение рекомбинантного белка РВ1 с отсутствием ферментативной активности, обладающего иммуногенными и протективными свойствами, причем получение его на основе СГВ Ia серотипа С5а пептидазы, с целью использования его в качестве компонента вакцины против Streptococcus pyogenes и Streptococcus agalactiae. Задачей изобретения стало создание штамма-продуцента рекомбинантного белка РВ1.The objective of this invention was to obtain a recombinant protein PB1 with no enzymatic activity, having immunogenic and protective properties, and obtaining it on the basis of HBV Ia serotype C5a peptidase, in order to use it as a component of the vaccine against Streptococcus pyogenes and Streptococcus agalactiae. The objective of the invention was the creation of a strain producing a recombinant protein PB1.
Поставленная задача решалась конструированием уникальных праймеров, с помощью которых в полимеразной цепной реакции получали фрагмент нуклеотидной последовательности, кодирующий часть аминокислотной последовательности С5а пептидазы СГВ, которая при образовании третичной структуры белка не формировала центр протеазной активности. С целью быстрого и простого получения рекомбинантного белка РВ1 для клонирования фрагмента ДНК была использована система экспрессионных плазмид pQE. Для создания штамма-продуцента рекомбинантного белка РВ1 был использован штамм Е. coli M15 (The QIAexpress System, Qiagen, США). В результате экспериментальной работы этот штамм приобрел новые свойства: способность экспрессировать рекомбинантный белок РВ1. Новый штамм получил название Е. coli M15-РВ1.The problem was solved by constructing unique primers with which a fragment of the nucleotide sequence encoding part of the C5a amino acid sequence of the HBV peptidase, which did not form a center of protease activity during the formation of the tertiary protein structure, was obtained in the polymerase chain reaction. In order to quickly and easily produce recombinant PB1 protein, the pQE expression plasmid system was used to clone the DNA fragment. To create a producer strain of the recombinant PB1 protein, E. coli M15 strain (The QIAexpress System, Qiagen, USA) was used. As a result of experimental work, this strain acquired new properties: the ability to express recombinant protein PB1. The new strain is called E. coli M15-PB1.
Сущностью предлагаемого изобретения является создание уникальной рекомбинантной ДНК (обозначенной как рВ1), полученной в результате полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием хромосомной ДНК штамма 090R Ia серотипа СГВ, уникальных праймеров Pb1 и Pb2 и последующего клонирования с использованием экспрессионной плазмиды pQE-30 (The QIAexpress System, Qiagen, США). Полученная рекомбинантная ДНК рВ1 кодирует уникальный рекомбинантный белок РВ1.The essence of the invention is the creation of a unique recombinant DNA (designated as pB1) obtained by polymerase chain reaction (PCR) using the chromosomal DNA of strain 090R Ia serotype SGV, unique primers Pb1 and Pb2 and subsequent cloning using expression plasmid pQE-30 (The QIAexpress System, Qiagen, USA). The resulting recombinant pb1 DNA encodes a unique pb1 recombinant protein.
Также сущностью предлагаемого изобретения является создание рекомбинантной плазмидной ДНК pQE-pB1, несущей рекомбинантную ДНК рВ1, и штамма-продуцента Е. coli M15-PB1, позволяющего при определенных условиях экспрессировать рекомбинантный белок РВ1.Also the essence of the invention is the creation of recombinant plasmid DNA pQE-pB1, carrying recombinant DNA pB1, and the producer strain E. coli M15-PB1, allowing under certain conditions to express recombinant protein PB1.
Авторами получен фрагмент гена, кодирующего С5а пептидазу штамма 090R Ia серотипа СГВ, с 114 п.н. по 1049 п.н. (обозначенный как рВ, размером 936 п.н.) с помощью полимеразной цепной реакции с использованием праймеров Pb1 и Pb2 и хромосомной ДНК штамма 090R Ia серотипа СГВ. Также авторами осуществлено клонирование рВ с использованием экспрессионной плазмиды pQE-30 и последующей трансформацией полученной рекомбинантной плазмиды (обозначенной как pQE-pB1) в гетерологическую систему Е.coli M15. Авторами получен штамм-продуцент рекомбинантного белка РВ1, обозначенный как Е. coli M15-PB1. Также авторами реализована экспрессия рекомбинантного белка РВ1 клетками штамма Е. coli M15-PB1 с последующей одноступенчатой аффинной очисткой с использованием Ni-сефарозы (Amersham, США).The authors obtained a fragment of a gene encoding the C5a peptidase of strain 090R Ia of the serotype of HBV, with 114 bp 1049 bp each (designated as pB, size 936 bp) using the polymerase chain reaction using primers Pb1 and Pb2 and chromosomal DNA of strain 090R Ia serotype SGV. The authors also carried out the cloning of pB using the expression plasmid pQE-30 and subsequent transformation of the resulting recombinant plasmid (designated as pQE-pB1) into the heterologous system of E. coli M15. The authors obtained a producer strain of the recombinant protein PB1, designated as E. coli M15-PB1. The authors also realized the expression of the recombinant PB1 protein by cells of the E. coli strain M15-PB1 followed by single-stage affinity purification using Ni-Sepharose (Amersham, USA).
Авторами получены анти-РВ1 антитела при подкожном введении рекомбинантного белка РВ1 млекопитающим (мышам и кроликам).The authors obtained anti-PB1 antibodies by subcutaneous administration of the recombinant protein PB1 to mammals (mice and rabbits).
Авторами также обнаружены анти-РВ1 антитела в сыворотках от больных, перенесших инфекционное заражение СГВ.The authors also found anti-PB1 antibodies in sera from patients who had an infection with HBV.
Авторами также изучены протективные свойства анти-РВ1 антител в модельных экспериментах in vitro (опсонофагоцитарный тест с использованием перитонеальных мышиных макрофагов и стрептококков групп А и В) и in vivo (изучение динамики развития генерализованной СГВ инфекции у мышей, предварительно проиммунизированных рекомбинантным белком РВ1).The authors also studied the protective properties of anti-PB1 antibodies in in vitro model experiments (opsonophagocytic test using peritoneal mouse macrophages and group A and B streptococci) and in vivo (studying the dynamics of the development of generalized HBV infection in mice previously immunized with recombinant PB1 protein).
Представленный здесь новый рекомбинантный белок РВ1 имеет желаемую физиологическую стабильность, не имеет ферментативной активности, вызывает синтез анти-РВ1 антител, обладающих протективными свойствами против Streptococcus pyogenes и Streptococcus agalactiae. Рекомбинантный белок РВ1 полезен в качестве вакцинного компонента для профилактики и лечения бактериальной инфекции, вызванной Streptococcus pyogenes и Streptococcus agalactiae. Рекомбинантный белок РВ1 также полезен как в качестве единственного компонента вакцинного препарата, так и в качестве одной из составляющих частей многокомпонентной вакцины против Streptococcus pyogenes и Streptococcus agalactiae.The novel recombinant PB1 protein presented here has the desired physiological stability, does not have enzymatic activity, and induces the synthesis of anti-PB1 antibodies with protective properties against Streptococcus pyogenes and Streptococcus agalactiae. Recombinant PB1 protein is useful as a vaccine component for the prevention and treatment of bacterial infection caused by Streptococcus pyogenes and Streptococcus agalactiae. Recombinant PB1 protein is also useful both as the sole component of the vaccine preparation and as one of the constituent parts of the multicomponent vaccine against Streptococcus pyogenes and Streptococcus agalactiae.
Получение рекомбинантного белка РВ1Obtaining recombinant protein PB1
Хромосомную ДНК выделяли из референс штамма 090R Ia серотипа СГВ фенольно-хлороформной экстракцией. Ген, кодирующий С5а пептидазу штамма 090R Ia серотипа СГВ, был обозначен как scpB1. Для получения фрагмента гена scpB1 с 114 п.н. по 1049 п.н. (обозначенного как рВ, размером 936 п.н.) использовали метод полимеразной цепной реакции. Полученные в результате ПНР фрагменты ДНК разделяли с помощью горизонтального электрофореза в 1% агарозном геле. Фрагмент рВ выделяли из агарозы с помощью набора «QIAquick Gel Extraction Kit» (Qiagen, США).Chromosomal DNA was isolated from the reference strain 090R Ia serotype SGV phenolic-chloroform extraction. The gene encoding the C5a peptidase of strain 090R Ia of the HBV serotype was designated scpB1. To obtain a scpB1 gene fragment with 114 bp 1049 bp each (designated as rB, size 936 bp) used the method of polymerase chain reaction. The resulting DNA fragments of DNA were separated by horizontal electrophoresis in 1% agarose gel. The pB fragment was isolated from agarose using the QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, USA).
Полученный фрагмент pB клонировали с использованием экспрессионной плазмиды pQE-30 (The QIAexpress System, Qiagen, США). При подготовке к клонированию была проведена двойная рестрикция выделенного из агарозы рВ (936 п.н.) и плазмиды pQE-30 (3462 п.н.) ферментами BamHI и SacI с образованием липких концов. Продукты рестрикции разделяли с помощью горизонтального электрофореза в 1% агарозном геле. Рестрицированный рВ (фрагмент гена scpB1 после рестрикции: с 119 по 1043 п.н., размером 925 п.н., обозначенный как рВ') и рестрицированную плазмиду pQE-30 (обозначенную как pQE-30', размером 3446 п.н.) выделяли из агарозы с помощью набора «QIAquick Gel Extraction Kit» (Qiagen, США). В результате проведенного клонирования была получена рекомбинантная плазмидная ДНК (обозначенная как pQE-pB1), несущая рекомбинантную ДНК (обозначенную как рВ1 и состоящую из 925 п.н. фрагмента гена scpB1 и 50 п.н. фрагмента плазмиды pQE-30). Нуклеотидная последовательность рВ1 представлена на фиг.1.The resulting pB fragment was cloned using the expression plasmid pQE-30 (The QIAexpress System, Qiagen, USA). In preparation for cloning, double restriction of pB (936 bp) and plasmid pQE-30 (3462 bp) with BamHI and SacI enzymes with sticky ends was performed by double restriction. Restriction products were separated by horizontal electrophoresis on a 1% agarose gel. Restricted pB (scpB1 gene fragment after restriction: from 119 to 1043 bp, 925 bp, designated pB ') and the restricted plasmid pQE-30 (designated pQE-30', 3446 bp ) were isolated from agarose using the QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, USA). As a result of the cloning, a recombinant plasmid DNA (designated as pQE-pB1) was obtained containing the recombinant DNA (designated as pB1 and consisting of 925 bp of the scpB1 gene fragment and 50 bp of the plasmid pQE-30). The nucleotide sequence of pB1 is presented in figure 1.
Рекомбинантная плазмидная ДНК pQE-pB1 была трансформирована в Е. coli M15 (The QIAexpress System, Qiagen, США) с помощью кальциевого метода.Recombinant plasmid DNA pQE-pB1 was transformed into E. coli M15 (The QIAexpress System, Qiagen, USA) using the calcium method.
Клоны-трансформанты отбирали после роста на плотных селективных средах, учитывая маркер устойчивости к ампициллину, который несла плазмида pQE-30. Из клонов-трансформантов были отобраны клоны, содержащие рекомбинантную плазмиду pQE-pB1, наличие которой определяли с помощью ПЦР с использованием исходных праймеров Pb1 и Pb2 и последующим электрофоретическим анализом полученных фрагментов ДНК в 1,5% агарозном геле.Transformation clones were selected after growth on solid selective media, given the ampicillin resistance marker carried by plasmid pQE-30. Clones containing the recombinant plasmid pQE-pB1 were selected from transforming clones, the presence of which was determined by PCR using the original primers Pb1 and Pb2 and subsequent electrophoretic analysis of the obtained DNA fragments in a 1.5% agarose gel.
Клоны Е. coli M15, содержащие рекомбинантную плазмиду pQE-pB1, (обозначенные как Е. coli M15-PB1), проверяли на способность экспрессировать белок РВ1. Для получения очищенного препарата рекомбинантного белка клетки Е. coli M15-PB1 культивировали на бульоне ВНЕ (Brain Heart Infusion Broth, Gibco, США) с добавлением антибиотиков (ампициллин (100 мкг/мл) и канамицин (25 мкг/мл)) до поздней логарифмической фазы роста (OD600=0,7÷0,9). Затем экспрессию рекомбинантного белка индуцировали добавлением изопропил-бета-D-тиогалактопиранозида (IPTG), и клетки культивировали еще 4 часа. После этого клетки осаждали центрифугированием, отмывали лизирующим буфером А (20 мМ Na2HPO4, 20 мМ NaH2PO4, 500 мМ NaCl, 20 мМ имидазола, рН=7.4) и суспендировали в том же буфере. Суспензию клеток вскрывали ультразвуком. Клеточный лизат, освобожденный от клеточных обломков центрифугированием, наносили на колонку, заполненную Ni-сефарозой (Amersham, США). После того, как белок связывался на матриксе колонки, ее промывали буфером А для удаления неспецифически связавшихся белков. Рекомбинантный белок РВ1 элюировали с колонки элюирующим буфером Б (20 мМ Na2HPO4, 20 мМ NaH2PO4, 500 мМ NaCl, 500 мМ имидазола, рН=7.4). Полученный после аффинной хроматографии РВ1 был диализован против 20 мМ Na2HPO4, 20 мМ NaH2PO4, pH=7,8 с добавлением 500 мМ NaCl.Clones of E. coli M15 containing the recombinant plasmid pQE-pB1 (designated as E. coli M15-PB1) were tested for their ability to express PB1 protein. To obtain a purified recombinant protein preparation, E. coli M15-PB1 cells were cultured on BHE broth (Brain Heart Infusion Broth, Gibco, USA) supplemented with antibiotics (ampicillin (100 μg / ml) and kanamycin (25 μg / ml) until late logarithmic growth phases (OD 600 = 0.7 ÷ 0.9). Then, expression of the recombinant protein was induced by the addition of isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG), and the cells were cultured for another 4 hours. After this, the cells were precipitated by centrifugation, washed with lysis buffer A (20 mM Na 2 HPO 4 , 20 mM NaH 2 PO 4 , 500 mM NaCl, 20 mM imidazole, pH = 7.4) and suspended in the same buffer. The cell suspension was opened with ultrasound. A cell lysate freed from cell debris by centrifugation was applied to a column filled with Ni-Sepharose (Amersham, USA). After the protein was bound on the column matrix, it was washed with buffer A to remove non-specifically bound proteins. Recombinant PB1 protein was eluted from the column with elution buffer B (20 mM Na 2 HPO 4 , 20 mM NaH 2 PO 4 , 500 mM NaCl, 500 mM imidazole, pH = 7.4). Obtained after affinity chromatography, PB1 was dialyzed against 20 mM Na 2 HPO 4 , 20 mM NaH 2 PO 4 , pH = 7.8 with the addition of 500 mM NaCl.
Молекулярную массу РВ1 определяли с помощью 12% SDS-PAGE, сравнивая пробег белка РВ1 с пробегом белков известной молекулярной массы (Precision Plus Protein standards (№161-0373), Bio-Rad, США). Молекулярная масса рекомбинантного белка РВ1 оказалась равной (43,0±0,5) кДа.The molecular weight of PB1 was determined using 12% SDS-PAGE, comparing the range of protein PB1 with the range of proteins of known molecular weight (Precision Plus Protein standards (No. 161-0373), Bio-Rad, USA). The molecular weight of the recombinant protein PB1 was equal to (43.0 ± 0.5) kDa.
Фиг.1 (нуклеотидная последовательность рекомбинантной ДНК рВ1) представляет полную нуклеотидную последовательность рекомбинантной ДНК pB1, состоящую из 975 п.н. и кодирующую аминокислотную последовательность рекомбинантного белка PB1.Figure 1 (nucleotide sequence of recombinant DNA pB1) represents the complete nucleotide sequence of recombinant DNA pB1, consisting of 975 bp and the coding amino acid sequence of the recombinant protein PB1.
Фиг.2 (аминокислотная последовательность рекомбинантного белка PB1) представляет аминокислотную последовательность рекомбинантного белка PB1, состоящую из 325 аминокислотных остатков.Figure 2 (amino acid sequence of the recombinant protein PB1) represents the amino acid sequence of the recombinant protein PB1, consisting of 325 amino acid residues.
Таким образом, рекомбинантный белок PB1 содержит аминокислотную последовательность С5а пептидазы СГВ штамма 090R Ia серотипа с 39 по 348 аминокислотный остаток, ковалентно связанную с шестнадцатью аминокислотными остатками, кодируемыми pQE-30 (The QIAexpress System, Qiagen, США). Аминокислотная последовательность СГВ С5а пептидазы, входящая в состав рекомбинантного белка PB1 и кодируемая pB', состоит из 309 аминокислотных остатков и содержит лишь два (D130 и Н193) из трех аминокислотных остатков, участвующих в формировании центра ферментативной активности, что гарантирует отсутствие ферментативной активности у рекомбинантного белка PB1.Thus, the recombinant protein PB1 contains the amino acid sequence of the C5a peptidase of the HBV strain 090R Ia of serotype 39 to 348 amino acid residue covalently linked to sixteen amino acid residues encoded by pQE-30 (The QIAexpress System, Qiagen, USA). The amino acid sequence of the HBV C5a peptidase, which is part of the recombinant protein PB1 and encoded by pB ', consists of 309 amino acid residues and contains only two (D 130 and H 193 ) of the three amino acid residues involved in the formation of the center of enzymatic activity, which guarantees the absence of enzymatic activity recombinant protein PB1.
Для лучшего понимания изобретения на фиг.3 схематично представлено положение аминокислотной последовательности, кодируемой рВ' относительно аминокислотной последовательности С5а пептидазы СГВ.For a better understanding of the invention, FIG. 3 schematically shows the position of the amino acid sequence encoded by pB ′ relative to the amino acid sequence C5a of the HBV peptidase.
На фиг.3. (Схема аминокислотной последовательности С5а пептидазы СГВ):In figure 3. (Scheme of the amino acid sequence of C5a peptidase SGV):
1 - сигнальный пептид;1 - signal peptide;
2 - аминокислотная последовательность, кодируемая фрагментом pB';2 — amino acid sequence encoded by the pB ′ fragment;
3 - участок, связанный с пептидогликаном;3 - a site associated with peptidoglycan;
4 - С-повторы;4 - C-repetitions;
5 - LPXTN-мотив;5 - LPXTN motive;
6 - гидрофобный трансмембрантный участок;6 - hydrophobic transmembrane site;
7 - цитоплазматический участок;7 - cytoplasmic site;
D130, H193, S512 - аминокислотные остатки, формирующие центр ферментативной активности.D 130 , H 193 , S 512 - amino acid residues forming the center of enzymatic activity.
Результатом изобретения является рекомбинантная ДНК рВ1, имеющая нуклеотидную последовательность, представленную на фиг.1; рекомбинантная плазмидная ДНК pQE-pB1, представляющая собой плазмиду pQE-30, несущую рекомбинантную ДНК рВ1; штамм Е. coli M15, трансформированный рекомбинантной плазмидной ДНК pQE-pB1, и экспрессирующий рекомбинантный белок РВ1; рекомбинантный белок РВ1, имеющий аминокислотную последовательность, представленную на фиг.2.The result of the invention is recombinant pB1 DNA having the nucleotide sequence shown in figure 1; pQE-pB1 recombinant plasmid DNA, which is pQE-30 plasmid, carrying pB1 recombinant DNA; E. coli M15 strain transformed with recombinant plasmid DNA pQE-pB1 and expressing recombinant protein PB1; recombinant protein PB1 having the amino acid sequence shown in figure 2.
Рекомбинантный белок РВ1 обладает следующими свойствами:Recombinant protein PB1 has the following properties:
а. при введении в организм млекопитающим (мышам и кроликам) вызывает синтез анти-РВ1 антител;but. when introduced into the body of mammals (mice and rabbits) causes the synthesis of anti-PB1 antibodies;
б. синтезируемые анти-РВ1 антитела обладают протективными свойствами в отношении Streptococcus pyogenes и Streptococcus agalactiae;b. the synthesized anti-PB1 antibodies have protective properties against Streptococcus pyogenes and Streptococcus agalactiae;
в. не обладает ферментативной активностью.at. does not have enzymatic activity.
Ниже приводятся конкретные примеры, иллюстрирующие некоторые варианты изобретения, но не ограничивающие его.The following are specific examples illustrating some embodiments of the invention, but not limiting it.
Пример 1. Получение ДНК-фрагмента рВ методом полимеразной цепной реакции.Example 1. Obtaining a DNA fragment of pB by polymerase chain reaction.
К 0,25 мкг геномной ДНК, выделенной из СГВ 090R Ia серотипа, добавляли 10 мкмолей каждого из специфических праймеров (Pb1, Pb2), фланкирующих исследуемую последовательность, буфер с магнием для полимеразы, по 0,2 мМ каждого из 4 дезоксирибонуклеотидтрифосфатов, объем доводили водой до 25 мкл. Добавляли 0,2 мкл термостабильной ДНК полимеразы. На поверхность жидкости наслаивали 40 мкл минерального масла. Пробирки помещали в амплификатор («Терцик», Россия). Смесь инкубировали при 94°С в течение 3 минут. Прибор программировали на цикл денатурации 94°С на 15 секунд, цикл отжига праймеров 68°С на 15 секунд, цикл синтеза ДНК 72°С на 20 секунд. Последовательность таких циклов повторялась 35 раз.10 μmol of each specific primer (Pb1, Pb2) flanking the test sequence, a buffer with polymerase magnesium, 0.2 mM of each of 4 deoxyribonucleotide triphosphates was added to 0.25 μg of genomic DNA isolated from SGV 090R Ia serotype, the volume was adjusted water up to 25 μl. 0.2 μl of thermostable DNA polymerase was added. 40 μl of mineral oil was layered on the surface of the liquid. The tubes were placed in an amplifier (Tertsik, Russia). The mixture was incubated at 94 ° C for 3 minutes. The device was programmed for a denaturation cycle of 94 ° C for 15 seconds, an annealing cycle of primers 68 ° C for 15 seconds, a DNA synthesis cycle of 72 ° C for 20 seconds. The sequence of such cycles was repeated 35 times.
После чего смесь инкубировали при 72°С в течение 1 минуты. Олигонуклеотидные праймеры, использованные в работе, приведены в Таблице 1.After which the mixture was incubated at 72 ° C for 1 minute. Oligonucleotide primers used in the work are shown in Table 1.
В результате полимеразной цепной реакции с праймерами Pb1 и Pb2 был получен ДНК-фрагмент с 114 п.н. по 1049 п.н. (936 п.н.), обозначенный как рВ. Кроме того, на 5'-концах праймеров находились сайты распознавания эндонуклеазами BamHI и SacI с целью последующего клонирования ДНК-фрагмента рВ. Результат ПЦР оценивали с помощью горизонтального электрофореза в 1% агарозном геле (фиг.4). Размеры полученных фрагментов ДНК рассчитывали с помощью компьютерной программы SEQAID, исходя из сравнения их электрофоретической подвижности с электрофоретической подвижностью маркера молекулярных весов (100 п.н. ДНК-маркер, Сибэнзим, Россия).As a result of the polymerase chain reaction with primers Pb1 and Pb2, a DNA fragment with 114 bp was obtained. 1049 bp each (936 bp), designated as pB. In addition, BamHI and SacI endonuclease recognition sites were located at the 5'-ends of the primers for the subsequent cloning of the pB DNA fragment. The result of PCR was evaluated using horizontal electrophoresis in 1% agarose gel (figure 4). The sizes of the obtained DNA fragments were calculated using the SEQAID computer program based on a comparison of their electrophoretic mobility with the electrophoretic mobility of the molecular weight marker (100 bp DNA marker, Sibenzyme, Russia).
На фиг.4. (Получение ДНК-фрагмента рВ методом ПЦР):In figure 4. (Obtaining a rV DNA fragment by PCR):
1 - 100 п.н. ДНК-маркер;1 - 100 bp DNA marker;
2 - продукты ПЦР, полученные при температуре отжига праймеров 67°С;2 - PCR products obtained at annealing temperature of primers 67 ° C;
3 - продукт ПЦР, полученный при температуре отжига праймеров 68°С.3 - PCR product obtained at annealing temperature of the primers 68 ° C.
Пример 2. Клонирование ДНК-фрагмента рВ с использованием экспрессионной плазмиды pQE-30.Example 2. Cloning of the pB DNA fragment using the expression plasmid pQE-30.
Клонирование ДНК-фрагмента рВ осуществляли с использованием экспрессионной плазмиды pQE-30 («The QIAexpress System», Qiagen, США). При подготовке к клонированию была проведена двойная рестрикция выделенного из агарозы рВ (936 п.н.) и плазмиды pQE-30 (3462 п.н.) ферментами BamHI и SacI с образованием липких концов. Продукты рестрикции разделяли с помощью горизонтального электрофореза в 1% агарозном геле. Размеры полученных фрагментов ДНК рассчитывали, как описано в примере 1. Рестрицированные рВ (фрагмент гена scpB1 после рестрикции: с 119 по 1043 п.н., размером 925 п.н., обозначенный как рВ') и плазмиду pQE-30 (обозначенную как pQE-30', размером 3446 п.н.) выделяли из агарозы с помощью набора «QIAquick Gel Extraction Kit» (Qiagen, США).Cloning of the pB DNA fragment was performed using the expression plasmid pQE-30 (The QIAexpress System, Qiagen, USA). In preparation for cloning, double restriction of pB (936 bp) and plasmid pQE-30 (3462 bp) with BamHI and SacI enzymes with sticky ends was performed by double restriction. Restriction products were separated by horizontal electrophoresis on a 1% agarose gel. The sizes of the obtained DNA fragments were calculated as described in Example 1. Restricted pB (scpB1 gene fragment after restriction: from 119 to 1043 bp, 925 bp, designated as pB ') and plasmid pQE-30 (designated as pQE-30 ', 3446 bp in size) was isolated from agarose using the QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, USA).
В ходе клонирования к 30 мкл фрагмента ДНК рВ' добавляли 2 мкл плазмиды pQE-30' (The QIAexpress System, Qiagen, США) в соотношении концентраций 4:1, 5 мкл десятикратного лигазного буфера и 1 мкл лигазы, выделенной из фага Т4. Объем доводили водой до 50 мкл. Смесь инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре и при температуре 4°С в течение 12 часов. В результате проведенного клонирования была получена рекомбинантная плазмидная ДНК (обозначенная как pQE-pB1), несущая рекомбинантную ДНК (обозначенную как рВ1 и состоящую из 925 п.н. фрагмента гена scpB1 и 50 п.н. фрагмента плазмиды pQE-30).During cloning, 2 μl of pQE-30 'plasmid (The QIAexpress System, Qiagen, USA) was added to 30 μl of pB' DNA fragment in a ratio of 4: 1, 5 μl of ten-fold ligase buffer and 1 μl of ligase isolated from T4 phage. The volume was adjusted with water to 50 μl. The mixture was incubated for 1 hour at room temperature and at a temperature of 4 ° C for 12 hours. As a result of the cloning, a recombinant plasmid DNA (designated as pQE-pB1) was obtained containing the recombinant DNA (designated as pB1 and consisting of 925 bp of the scpB1 gene fragment and 50 bp of the plasmid pQE-30).
Пример 3. Трансформация культуры Е. coli M15 плазмидной ДНК pQE-рВ1.Example 3. Transformation of the culture of E. coli M15 plasmid DNA pQE-pB1.
Рекомбинантную плазмидную ДНК pQE-pB1 трансформировали в гетерологичную систему Е. coli M15. В качестве положительного контроля параллельно проводили трансформацию Е. coli M15 исходной плазмидной ДНК pQE-30. Генетическим маркером плазмидной ДНК pQE-30 был ген amp, кодирующий бета-лактамазу, что обеспечивало устойчивость к ампициллину клеток, несущих данную плазмиду. Культуру клеток Е. coli M15 культивировали на бульоне BHI (Brain Heart Infusion Broth, Gibco, США) с канамицином (25 мкг/мл) в течение 12 часов при 37°С и интенсивном перемешивании, пересевали на новый объем той же среды (1/50V) и инкубировали при 37°С в течение 2-3 часов при интенсивном перемешивании до ОД600=0,35. Выращенные клетки в объеме 1,5 мл центрифугировали в течение 1 мин при 12000 об/мин и полученный осадок ресуспендировали в 200 мкл 0,1 М CaCl2. Далее смесь инкубировали во льду 1 час. После центрифугирования осадок ресуспендировали в 187,5 мкл 0,1 М CaCl2 и 62,5 мкл деионизованной воды. Затем в пробирку вносили 0,2 мкг плазмидной ДНК и инкубировали смесь во льду 1 час. Далее смесь выдерживали 2 мин при 42°С и снова переносили в лед на 10 мин. После этого к смеси добавляли 1 мл бульона BHI с канамицином (25 мкг/мл) и инкубировали 1 час при 37°С. После осаждения центрифугированием (8000 об/мин, в течение 1 мин) клетки высевали на чашки с 1% L-агаром (Difco, США), содержащим ампициллин (100 мкг/мл) и канамицин (25 мкг/мл). Отбор клонов-трансформантов проводили через 18 часов роста клеток при 37°С. В качестве отрицательного контроля высевали чистую культуру клеток Е. coli M15.The recombinant plasmid DNA pQE-pB1 was transformed into the heterologous system of E. coli M15. As a positive control, E. coli M15 was transformed in parallel with the original pQE-30 plasmid DNA. The genetic marker of plasmid DNA pQE-30 was the amp gene encoding beta-lactamase, which provided ampicillin resistance to cells carrying this plasmid. The cell culture of E. coli M15 was cultured on BHI broth (Brain Heart Infusion Broth, Gibco, USA) with kanamycin (25 μg / ml) for 12 hours at 37 ° C with vigorous stirring, and were reseeded to a new volume of the same medium (1 / 50V) and incubated at 37 ° C for 2-3 hours with vigorous stirring to OD 600 = 0.35. The grown cells in a volume of 1.5 ml were centrifuged for 1 min at 12000 rpm and the resulting pellet was resuspended in 200 μl of 0.1 M CaCl 2 . The mixture was then incubated in ice for 1 hour. After centrifugation, the pellet was resuspended in 187.5 μl of 0.1 M CaCl 2 and 62.5 μl of deionized water. Then 0.2 μg of plasmid DNA was added to the tube and the mixture was incubated in ice for 1 hour. Then the mixture was kept for 2 min at 42 ° С and again transferred to ice for 10 min. After that, 1 ml of BHI broth with kanamycin (25 μg / ml) was added to the mixture and incubated for 1 hour at 37 ° C. After precipitation by centrifugation (8000 rpm, for 1 min), the cells were plated on plates with 1% L-agar (Difco, USA) containing ampicillin (100 μg / ml) and kanamycin (25 μg / ml). Transformation clones were selected after 18 hours of cell growth at 37 ° C. As a negative control, a pure cell culture of E. coli M15 was seeded.
Наличие рекомбинантной ДНК рВ1 в плазмиде pQE-pB1 определяли ПЦР с использованием исходных праймеров Pb1 и Pb2 и последующим электрофоретическим анализом полученных фрагментов ДНК в 1,5% агарозном геле (фиг.5). Размеры полученных фрагментов ДНК рассчитывали, как описано в примере 1.The presence of recombinant pB1 DNA in plasmid pQE-pB1 was determined by PCR using the initial primers Pb1 and Pb2 and subsequent electrophoretic analysis of the obtained DNA fragments in a 1.5% agarose gel (Fig. 5). The sizes of the obtained DNA fragments were calculated as described in example 1.
На фиг.5. (Электрофорез продуктов ПНР, полученных в результате амплификации ДНК, выделенной из различных клонов-трансформантов):5. (Electrophoresis of the products of the NDP obtained by amplification of DNA isolated from various transforming clones):
1-7 - рекомбинантные клоны, несущие плазмиду pQE-pB1;1-7 - recombinant clones carrying the plasmid pQE-pB1;
8 - пропущенная дорожка;8 - missing track;
9 - клон, несущий исходную плазмиду pQE-30;9 is a clone carrying the original plasmid pQE-30;
10 - продукт ПЦР исходной хромосомной ДНК штамма СГВ 090R.10 is a PCR product of the original chromosomal DNA of strain SGV 090R.
Таким образом, полученные данные позволяют сделать вывод о том, что в результате проведенного клонирования были получены рекомбинантные клоны, несущие плазмиды pQE-pB1 с рекомбинантной ДНК рВ1, которые получили название Е. coli M15-PB1.Thus, the data obtained allow us to conclude that, as a result of the cloning, recombinant clones carrying the plasmids pQE-pB1 with recombinant pB1 DNA, which were called E. coli M15-PB1, were obtained.
Пример 4. Очистка рекомбинантного белка РВ1.Example 4. Purification of recombinant protein PB1.
Культуру штамма Е. coli M15-PB1 выращивали на бульоне ВHI с добавлением ампициллина в концентрации 100 мкг/мл и канамицина в концентрации 25 мкг/мл в течение ночи при интенсивном перемешивании. Клетки культивировали в течение 12 часов, пересевали на 300 мл той же среды (1/50V) и инкубировали при 37°С в течение 2-3 часов при интенсивном перемешивании до OD600=0,7÷0,9. Экспрессию рекомбинантного белка индуцировали добавлением раствора изопропил-бета-D-тиогалактопиранозида до конечной концентрации 2 мМ, после чего инкубировали клетки при тех же условиях еще 4 часа. Полученную суспензию клеток центрифугировали при 6000 об/мин 5 мин. Надосадочную жидкость сливали, а клетки ресуспендировали в буфере А (20 мМ Na2HPO4, 20 мМ NaH2PO4, 500 мМ NaCl, 20 мМ имидазола, рН=7.4), добавляя ингибитор протеаз фенилметилсульфонилфторид (PMSF) до конечной концентрации 1 мМ.The culture of E. coli strain M15-PB1 was grown on BHI broth with the addition of ampicillin at a concentration of 100 μg / ml and kanamycin at a concentration of 25 μg / ml overnight with vigorous stirring. Cells were cultured for 12 hours, subcultured on 300 ml of the same medium (1 / 50V) and incubated at 37 ° C for 2-3 hours with vigorous stirring to OD 600 = 0.7 ÷ 0.9. The expression of the recombinant protein was induced by adding a solution of isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside to a final concentration of 2 mM, after which the cells were incubated under the same conditions for another 4 hours. The resulting cell suspension was centrifuged at 6000 rpm for 5 minutes. The supernatant was discarded and the cells were resuspended in buffer A (20 mM Na 2 HPO 4 , 20 mM NaH 2 PO 4 , 500 mM NaCl, 20 mM imidazole, pH = 7.4), adding a phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) protease inhibitor to a final concentration of 1 mM .
Полученную суспензию клеток центрифугировали при 8000 об/мин 1 мин. Надосадочную жидкость сливали, а клетки ресуспендировали в буфере А. Для лизирования клеток была использована трехкратная ультразвуковая обработка при 4°С в течение 20 сек с перерывом в 40 сек в ультразвуковом дезинтеграторе (УЗДН-1У4.2, СССР). Лизат клеток центрифугировали при 13400 об/мин и 4°С в течение 20 мин. Надосадочную жидкость пропускали через 0,2 мкм фильтры (Millipore, США). Далее профильтрованный лизат клеток наносили на колонку с Ni-сефарозой (Qiagen, США), предварительно уравновешенной буфером А. Далее колонку промывали тем же буфером до тех пор, пока значения OD280 выходящего раствора не были меньше, чем 0,01. Белок элюировали раствором буфера Б (20 мМ Na2HPO4, 20 мМ NaH2PO4, 500 мМ NaCl, 500 мМ имидазола, pH=7.4), создавая градиент имидазола от 20 до 500 мМ. Элюат собирали фракциями по 500 мкл и анализировали в 12% SDS-PAGE. Фракции, в которых содержался белок, диализовали при перемешивании при 4°С против буфера В (20 мМ Na2HPO4, 20 мМ NaH2PO4, 500 мМ NaCl, рН-7,8) в течение 12 часов.The resulting cell suspension was centrifuged at 8000 rpm for 1 min. The supernatant was discarded, and the cells were resuspended in buffer A. Three-time ultrasonic treatment at 4 ° C for 20 seconds was used to lyse the cells with a break of 40 seconds in an ultrasonic disintegrator (UZDN-1U4.2, USSR). The cell lysate was centrifuged at 13,400 rpm and 4 ° C for 20 minutes. The supernatant was passed through 0.2 μm filters (Millipore, USA). Next, the filtered cell lysate was applied onto a Ni-Sepharose column (Qiagen, USA), previously equilibrated with buffer A. The column was then washed with the same buffer until the OD 280 values of the resulting solution were less than 0.01. The protein was eluted with buffer B solution (20 mM Na 2 HPO 4 , 20 mM NaH 2 PO 4 , 500 mM NaCl, 500 mM imidazole, pH = 7.4), creating an imidazole gradient of 20 to 500 mM. The eluate was collected in 500 μl fractions and analyzed in 12% SDS-PAGE. The fractions containing the protein were dialyzed with stirring at 4 ° C against buffer B (20 mM Na 2 HPO 4 , 20 mM NaH 2 PO 4 , 500 mM NaCl, pH-7.8) for 12 hours.
На фиг.6 представлена электрофореграмма рекомбинантного белка РВ1 на разных этапах очистки.Figure 6 presents the electrophoregram of the recombinant protein PB1 at different stages of purification.
На фиг.6. (Электрофореграмма рекомбинантного белка РВ1 на разных стадиях очистки с помощью Ni-сефарозы):In Fig.6. (Electrophoregram of recombinant PB1 protein at different stages of purification using Ni-Sepharose):
1,8 - маркеры молекулярной массы;1.8 - molecular weight markers;
2 - супернатант белков после ультразвукового вскрытия клеток Е. coli М15-РВ1;2 - protein supernatant after ultrasonic dissection of E. coli M15-PB1 cells;
3 - препарат белков, не связавшихся с Ni-сефарозой;3 - preparation of proteins not bound to Ni-Sepharose;
4 - препарат белков в отмывочном буфере после отмывки Ni-сефарозы 30-кратным объемом буфера;4 - protein preparation in washing buffer after washing Ni-Sepharose with 30-fold buffer volume;
5, 6, 7 - фракции препарата чистого белка (К=0,5 мг/мл) при элюции в градиенте имидазола от 20 мМ до 500 мМ.5, 6, 7 — fractions of a pure protein preparation (K = 0.5 mg / ml) upon elution with an imidazole gradient from 20 mM to 500 mM.
Молекулярную массу РВ1 определяли с помощью 12% SDS-PAGE, сравнивая пробег белка РВ1 с пробегом: белков известной молекулярной массы (Precision Plus Protein standards (161-0373), Bio-Rad, США). Молекулярная масса рекомбинантного белка РВ1 оказалась равной (43,0±0,5) кДа.The molecular weight of PB1 was determined using 12% SDS-PAGE, comparing the mileage of the PB1 protein with the mileage of proteins of known molecular weight (Precision Plus Protein standards (161-0373), Bio-Rad, USA). The molecular weight of the recombinant protein PB1 was equal to (43.0 ± 0.5) kDa.
Пример 5. Динамика изменения титра антител к рекомбинантному белку РВ1 после иммунизации млекопитающих.Example 5. The dynamics of changes in the titer of antibodies to the recombinant protein PB1 after immunization of mammals.
Гуморальный иммунный ответ к рекомбинантному белку РВ1 изучали на беспородных белых мышах (самцах массой 16-18 г), и кроликах (самках массой 2,5 кг), полученных из питомника «Рапполово», РАМН. Иммунизацию проводили двукратно и подкожно с адъювантом гидроокиси алюминия. В эксперименте использовали 30 мышей и 2-х кроликов, которым вводили 0,2 мл и 0,5 мл РВ1 с адъювантом в соотношении объемов 1:1 соответственно. Для мышей при первой инъекции вводили 0,2 мл РВ1 с адъювантом в соотношении объемов 1:1 и на 22 день проводили бустирование 0,2 мл РВ1 без адъюванта. При первой инъекции конечная концентрация РВ1 составляла 100 мкг/мл и 50 мкг/мл при второй инъекции, которые делали на 1-й и 22-й дни соответственно. Кроликам дважды вводили подкожно по 0,5 мл РВ1 адъювантом в соотношении объемов 1:1. При первой инъекции конечная концентрация РВ1 была 240 мкг/мл и 120 мкг/мл - при второй инъекции, которые делали на 1-й и 28-й дни соответственно. Мышиные антитела к РВ1 определяли с 22-го по 118-й дни от начала иммунизации, используя пул сывороток от 3-х животных. Кроличьи антитела к РВ1 определяли с 28-го по 66-ой дни от начала иммунизации, используя пул сывороток от 2-х животных.The humoral immune response to the recombinant protein PB1 was studied on outbred white mice (males weighing 16-18 g) and rabbits (females weighing 2.5 kg) obtained from the Rappolovo cattery, RAMS. Immunization was performed twice and subcutaneously with an aluminum hydroxide adjuvant. The experiment used 30 mice and 2 rabbits, which were injected with 0.2 ml and 0.5 ml of PB1 with adjuvant in a volume ratio of 1: 1, respectively. For mice, at the first injection, 0.2 ml of PB1 with an adjuvant in a volume ratio of 1: 1 was administered, and on
Анти-РВ1 антитела определяли с помощью двухслойного метода иммуноферментного анализа (ИФА). В лунки полистеролового планшета с высокой сорбционной емкостью (Costar, США) вносили по 100 мкл антигена (рекомбинантный белок РВ1) в концентрации 2 мкг/мл. Сорбцию проводили в 100 мМ бикарбонатном буфере (рН=9,45) в течение 16-20 часов при 4°С.Anti-PB1 antibodies were determined using a two-layer enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). 100 μl of antigen (recombinant PB1 protein) at a concentration of 2 μg / ml was added to the wells of a polystyrene tablet with a high sorption capacity (Costar, USA). Sorption was carried out in 100 mm bicarbonate buffer (pH = 9.45) for 16-20 hours at 4 ° C.
После этого содержимое из планшета удаляли и добавляли в лунки по 150 мкл забуференного физиологического раствора, рН=7,4 (PBS), содержащего 0,05% Твин-20 (PBST). Инкубацию проводили при 37°С в течение 30 мин. Содержимое планшета удаляли и трижды промывали PBST. Затем в лунки планшета вносили иммунную или нормальную (в качестве отрицательного контроля) сыворотку (с начальным разведением 1:100) с последующим шагом разведения, равным двум. Все разведения осуществляли в PBST, и каждую пробу дублировали. Инкубацию проводили в течение 1 часа при 37°С. Далее содержимое планшета удаляли и дважды промывали планшет PBST. После этого в лунки добавляли по 100 мкл А-ПХ конъюгата (белок А стафилококка, ковалентно связанный с пероксидазой хрена) в концентрации 10-7 моль/л. После часовой инкубации при 37°С содержимое планшета удаляли и трижды отмывали планшет PBST и один раз PBS, чтобы избежать ингибирующего действия Твин-20 на ферментативную активность пероксидазы. Далее для визуализации реакции в лунки планшета вносили по 100 мкл субстратной смеси (0,5 мкг/мл о-фенилендиамин в 150 мМ фосфатно-цитратном буфере (рН=5,0), 10 мкл 30% перекиси водорода), которую готовили непосредственно перед применением. Планшет инкубировали в течение 30 мин в темноте при комнатной температуре, и реакцию останавливали внесением в лунки по 30 мкл 50% концентрированной серной кислоты. Реакцию регистрировали при длине волны 492 нм с помощью прибора Titertek Multiskan (США).After that, the contents of the tablet were removed and 150 μl of buffered saline solution, pH = 7.4 (PBS) containing 0.05% Tween-20 (PBST) was added to the wells. Incubation was carried out at 37 ° C for 30 min. The contents of the tablet were removed and washed three times with PBST. Then, immune or normal (as a negative control) serum (with an initial dilution of 1: 100) was introduced into the wells of the tablet with a subsequent dilution step of two. All dilutions were performed in PBST, and each sample was duplicated. Incubation was carried out for 1 hour at 37 ° C. Next, the contents of the plate were removed and the PBST plate was washed twice. After that, 100 μl of A-PX conjugate (staphylococcus A protein covalently linked to horseradish peroxidase) at a concentration of 10 -7 mol / L was added to the wells. After one hour incubation at 37 ° C, the contents of the plate were removed and the PBST plate and once PBS were washed three times to avoid the inhibitory effect of Tween-20 on the enzymatic activity of peroxidase. Then, to visualize the reaction, 100 μl of the substrate mixture (0.5 μg / ml o-phenylenediamine in 150 mM phosphate-citrate buffer (pH = 5.0), 10 μl of 30% hydrogen peroxide) was prepared immediately before application. The plate was incubated for 30 min in the dark at room temperature, and the reaction was stopped by adding 30 μl of 50% concentrated sulfuric acid to the wells. The reaction was recorded at a wavelength of 492 nm using a Titertek Multiskan device (USA).
Титр специфических антител определяли на разных сроках от начала иммунизации. Через три недели от начала эксперимента по иммунизации лабораторных животных было отмечено появление в крови специфических антител к РВ1. Полученные результаты, представленные на фиг.7, показали наличие выраженного гуморального иммунного ответа на введение рекомбинантного белка РВ1. При этом максимальное значение титра антител к белку РВ1 наблюдалось на 60 (1,6×10-6) день и 52 день (5,1×10-4) от начала иммунизации у кроликов и мышей соответственно.The titer of specific antibodies was determined at different times from the start of immunization. Three weeks after the start of the experiment on immunization of laboratory animals, the appearance of specific antibodies to PB1 in the blood was noted. The results obtained, presented in Fig.7, showed the presence of a pronounced humoral immune response to the introduction of the recombinant protein PB1. The maximum titer of antibodies to PB1 protein was observed at 60 (1.6 × 10 -6 ) days and 52 days (5.1 × 10 -4 ) from the start of immunization in rabbits and mice, respectively.
На фиг.7. (Динамика изменения титра анти-РВ1 антител после иммунизации мышей и кроликов).7. (Dynamics of changes in the titer of anti-PB1 antibodies after immunization of mice and rabbits).
Пример 6. Определение анти-РВ1 антител в сыворотках от больных СГВ.Example 6. Determination of anti-PB1 antibodies in sera from patients with HBV.
Для получения дополнительных доказательств об участии в развитии патогенного процесса поверхностного белка СГВ РВ1 сыворотки от больных СГВ, полученные из НИИ акушерства и гинекологии имени Д.О.Отто, были протестированы на наличие антител к рекомбинантному белку РВ1. Анти-РВ1 антитела в сыворотках от больных определяли с использованием двухслойного метода иммуноферментного анализа, как описано выше в примере 5. Полученные данные представлены в таблице 2.To obtain additional evidence of the participation in the development of the pathogenic process of the surface serum HBV protein PB1 from patients with HBV, obtained from the D.O. Otto Research Institute of Obstetrics and Gynecology, they were tested for the presence of antibodies to the recombinant protein PB1. Anti-PB1 antibodies in serum from patients were determined using a two-layer enzyme-linked immunosorbent assay as described above in example 5. The data obtained are presented in table 2.
Данные таблицы 2 показывают, что из 13 протестированных сывороток более чем у половины (69%) сывороток был обнаружен высокий титр анти-РВ1 антител. Полученные результаты свидетельствуют о том, что в сыворотках от больных среди антител, образовавшихся к интактной клетке СГВ, имеются антитела к рекомбинантному белку РВ1.The data in Table 2 show that of the 13 sera tested, more than half (69%) of the sera had a high titer of anti-PB1 antibodies. The results obtained indicate that in the sera from patients, among antibodies formed to the intact HBV cell, there are antibodies to the recombinant protein PB1.
Пример 7. Изучение опсонизирующей эффективности кроличьих анти-РВ1 антител.Example 7. The study of the opsonizing efficacy of rabbit anti-PB1 antibodies.
Хорошо известно, что основным защитным механизмом макроорганизма от бактериальной инфекции является процесс фагоцитоза, опосредованного специфическими антителами (опсонофагоцитоз). Опсонизирующую активность кроличьих анти-РВ1 антител (с титром = 9,6×10-5) изучали на монослое мышиных перитонеальных макрофагов. Макрофаги индуцировали за двое суток до получения перитонеального экссудата введением мышам 0,5 мл 10% пептона внутрибрюшинно. Перитонеальный экссудат от 4-5 мышей смывали питательной средой IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Media, БиолоТ, Россия), клетки отмывали, суспендировали в концентрации 1 млн/мл и высевали в объеме 0,2 мл на 96-луночные платы для культуры тканей, в объеме 1,0 мл на 24-луночные платы для культуры тканей, содержащие покровные стекла (Sarstedt, Германия). Через 1 час инкубации неприкрепившиеся клетки отмывали, и макрофаги продолжали культивировать в среде IMDM с 10% ЭТС (эмбриональная телячья сыворотка, БиолоТ, Россия) в присутствии стрептомицина (100 мкг/мл) и пенициллина (100 ЕД/мл). Через сутки монослой отмывали от антибиотиков и вносили суспензию СГВ и СГА в среде IMDM, в концентрации 1×107 КОЕ/мл. Бактерии предварительно инкубировали в течение 30 минут с нормальной и иммунной кроличьей сывороткой, разведенной в 50 раз, в среде IMDM. Контакт бактерий с макрофагами продолжался 30 мин, после чего монослой тщательно отмывали от не прикрепившихся к поверхности клеток стрептококков. Все описанные выше этапы проводились при 37°C в атмосфере 5% CO2. Далее препараты фиксировали 30 мин абсолютным спиртом и последовательно окрашивали азидом и азуром в течение 30 мин. Монослой тщательно отмывали от остатков краски. При микроскопии на покровных стеклах исследовали не менее 100 клеток в трех параллельных пробах, подсчитывая процентную долю макрофагов, инфицированных стрептококками, и среднее число кокков на одну клетку. Степень инфицированности оценивали по фагоцитарному индексу (ФИ), который представляет собой произведение обоих показателей.It is well known that the main protective mechanism of a macroorganism against bacterial infection is the process of phagocytosis mediated by specific antibodies (opsonophagocytosis). The opsonizing activity of rabbit anti-PB1 antibodies (with titer = 9.6 × 10 -5 ) was studied on a monolayer of mouse peritoneal macrophages. Macrophages were induced two days before receiving peritoneal exudate by administering to mice 0.5 ml of 10% peptone intraperitoneally. Peritoneal exudate from 4-5 mice was washed with IMDM culture medium (Iscove's Modified Dulbecco's Media, BioloT, Russia), cells were washed, suspended at a concentration of 1 million / ml and sown in a volume of 0.2 ml on 96-well plates for tissue culture, in 1.0 ml per 24-well tissue culture plate containing coverslips (Sarstedt, Germany). After 1 hour of incubation, non-adherent cells were washed, and macrophages were continued to be cultured in IMDM medium with 10% ETS (fetal calf serum, BioloT, Russia) in the presence of streptomycin (100 μg / ml) and penicillin (100 U / ml). After a day, the monolayer was washed from antibiotics and a suspension of SGV and SGA was added in IMDM medium at a concentration of 1 × 10 7 CFU / ml. Bacteria were pre-incubated for 30 minutes with normal and immune rabbit serum diluted 50 times in IMDM medium. The contact of bacteria with macrophages lasted 30 min, after which the monolayer was thoroughly washed from streptococci not attached to the surface of the cells. All the steps described above were carried out at 37 ° C in an atmosphere of 5% CO 2 . Further, the preparations were fixed for 30 min with absolute alcohol and sequentially stained with azide and azure for 30 min. The monolayer was thoroughly washed from paint residues. Microscopy on coverslips examined at least 100 cells in three parallel samples, counting the percentage of macrophages infected with streptococci and the average number of cocci per cell. The degree of infection was assessed by the phagocytic index (PI), which is a product of both indicators.
Результаты опсонофагоцитарного теста представлены в таблице 3. Кратность увеличения индекса инфицирования в два и более раза (2,0-6,4) при обработке стрептококков иммунной кроличьей сывороткой по сравнению с индексом инфицирования при обработке стрептококков нормальной кроличьей сывороткой свидетельствует о протективности анти-РВ1 антител как в отношении СГВ, так и в отношении СГА.The results of the opsonophagocytic test are presented in table 3. The multiplicity of an increase in the infection index by two or more times (2.0-6.4) when treating streptococci with immune rabbit serum compared with the infection index when treating streptococci with normal rabbit serum indicates the anti-PB1 antibody protectiveness both in relation to SGV, and in relation to SGA.
Пример 8. Изучение протективных свойств мышиных анти-РВ1 антител на мышах, инфицированных СГВ.Example 8. The study of the protective properties of murine anti-PB1 antibodies in mice infected with HBV.
Протективная эффективность анти-РВ1 антител in vivo была изучена на «мышиной» модели генерализованной инфекции. Известно, что в этих условиях ведущим защитным механизмом является опсонофагоцитарная реакция.The in vivo protective efficacy of anti-PB1 antibodies has been studied in a mouse model of generalized infection. It is known that under these conditions the opsonophagocytic reaction is the leading defense mechanism.
В экспериментах in vivo лабораторным мышам сначала вводили подкожно белок РВ1 по схеме иммунизации, упомянутой ранее в примере 5, или физиологический раствор (в качестве контроля). Затем обеим группам мышей внутрибрюшинно вводили суспензию СГВ серотипа Iac (штамм 5/70) в сублетальной дозе (LD50=2,7×107 КОЕ/мл) на сроках с максимальной выработкой антител к белку РВ1 (52-й день от начала иммунизации). Контроль развития инфекции осуществляли с помощью высева стрептококков из селезеночной суспензии мышей на среду с кровяным агаром на разных сроках после введения СГВ.In in vivo experiments, laboratory mice were first injected subcutaneously with PB1 protein according to the immunization schedule mentioned previously in Example 5, or saline (as a control). Then, a suspension of IHV serotype Iac (
10-7
The number of colonies of HBV in the mouse spleen, CFU / ml ×
10 -7
Как видно из данных таблицы 4, в контрольной группе на первых часах шло накопление числа СГВ в селезенке мышей, и только через 24 часа начиналась естественная элиминация стрептококков из селезенки. В то время как в опытной группе практически с первых часов происходила элиминация стрептококков из селезенки. Таким образом, результаты опыта показали, что рекомбинантный белок РВ1 способен стимулировать протективный гуморальный иммунный ответ.As can be seen from the data in Table 4, in the control group, the number of HBV in the spleen of mice accumulated in the first hours, and only after 24 hours did the natural elimination of streptococci from the spleen begin. While in the experimental group, from the very first hours, elimination of streptococci from the spleen took place. Thus, the experimental results showed that the recombinant protein PB1 is able to stimulate a protective humoral immune response.
Claims (7)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2008111000/13A RU2378374C2 (en) | 2008-03-21 | 2008-03-21 | Recombinant dna ensuring production of recombinant protein pbi expressing protective properties in relation to streptococcus pyogenes and streptococcus agalactiae |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2008111000/13A RU2378374C2 (en) | 2008-03-21 | 2008-03-21 | Recombinant dna ensuring production of recombinant protein pbi expressing protective properties in relation to streptococcus pyogenes and streptococcus agalactiae |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2008111000A RU2008111000A (en) | 2009-09-27 |
| RU2378374C2 true RU2378374C2 (en) | 2010-01-10 |
Family
ID=41169052
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2008111000/13A RU2378374C2 (en) | 2008-03-21 | 2008-03-21 | Recombinant dna ensuring production of recombinant protein pbi expressing protective properties in relation to streptococcus pyogenes and streptococcus agalactiae |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2378374C2 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2542483C2 (en) * | 2012-05-17 | 2015-02-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины" Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИЭМ" СЗО РАМН) | RECOMBINANT POLYPEPTIDE StV POSSESSING PROTECTIVE PROPERTIES IN RELATION TO Streptococcus agalactiae, RECOMBINANT DNA StV, ITS CODING AND RECOMBINANT STRAIN Escherichia coli M15-StV CONTAINING RECOMBINANT PLASMID PQE-StV |
| RU2587627C2 (en) * | 2014-08-11 | 2016-06-20 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Институт экспериментальной медицины" (ФГБНУ "ИЭМ") | Complex of recombinant polypeptides with protective properties in relation to streptococcus agalactiae and streptococcus pyogenes |
| RU2846996C1 (en) * | 2024-05-24 | 2025-09-22 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Институт экспериментальной медицины" (ФГБНУ "ИЭМ") | Chimeric recombinant protein scpa-spea having protective properties against streptococcus pyogenes |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2113234C1 (en) * | 1989-09-15 | 1998-06-20 | Дзе Дженерал Хоспитал Корпорейшн, Брихэм энд Уимен'з Хоспитал | Vaccine capable to make immunity in host against infection caused by streptococcus group b, method of prevention of infection caused by streptococcus group b and a method of attenuation of infection caused by streptococcus group b |
-
2008
- 2008-03-21 RU RU2008111000/13A patent/RU2378374C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2113234C1 (en) * | 1989-09-15 | 1998-06-20 | Дзе Дженерал Хоспитал Корпорейшн, Брихэм энд Уимен'з Хоспитал | Vaccine capable to make immunity in host against infection caused by streptococcus group b, method of prevention of infection caused by streptococcus group b and a method of attenuation of infection caused by streptococcus group b |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2542483C2 (en) * | 2012-05-17 | 2015-02-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины" Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИЭМ" СЗО РАМН) | RECOMBINANT POLYPEPTIDE StV POSSESSING PROTECTIVE PROPERTIES IN RELATION TO Streptococcus agalactiae, RECOMBINANT DNA StV, ITS CODING AND RECOMBINANT STRAIN Escherichia coli M15-StV CONTAINING RECOMBINANT PLASMID PQE-StV |
| RU2587627C2 (en) * | 2014-08-11 | 2016-06-20 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Институт экспериментальной медицины" (ФГБНУ "ИЭМ") | Complex of recombinant polypeptides with protective properties in relation to streptococcus agalactiae and streptococcus pyogenes |
| RU2846996C1 (en) * | 2024-05-24 | 2025-09-22 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Институт экспериментальной медицины" (ФГБНУ "ИЭМ") | Chimeric recombinant protein scpa-spea having protective properties against streptococcus pyogenes |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2008111000A (en) | 2009-09-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hammerschmidt et al. | SpsA, a novel pneumococcal surface protein with specific binding to secretory immunoglobulin A and secretory component | |
| Mitchell et al. | Streptococcus pneumoniae: virulence factors and variation | |
| CN100443116C (en) | Composition for treating or preventing pneumococcal infection and use thereof | |
| JP6632974B2 (en) | Phenol-soluble modulin, delta toxin, toxoid peptide derived from superantigen, and fusion thereof | |
| EP2319862A1 (en) | Small Streptococcus pyogenes antigens and their use | |
| JP2009521959A (en) | Mycobacterium tuberculosis fusion protein and its application | |
| JP2002503087A (en) | Streptococcus pneumoniae C3 binding protein | |
| AU2018285857B2 (en) | Immunogenic compositions comprising Staphylococcus aureus leukocidin lukA and lukB derived polypeptides | |
| CA2502414A1 (en) | Nucleic acids coding for adhesion factor of group b streptococcus, adhesion factors of group b streptococcus and further uses thereof | |
| JP2021000134A (en) | Vaccine for immunocompromised hosts | |
| RU2378374C2 (en) | Recombinant dna ensuring production of recombinant protein pbi expressing protective properties in relation to streptococcus pyogenes and streptococcus agalactiae | |
| US20150273042A1 (en) | Pilus proteins and compositions | |
| CN107050442B (en) | Multicomponent immunogenic composition for the prevention of beta-hemolytic streptococcal (BHS) disease | |
| JP5911724B2 (en) | Composition comprising a streptococcal sortase immobilized surface protein | |
| RU2846996C1 (en) | Chimeric recombinant protein scpa-spea having protective properties against streptococcus pyogenes | |
| JP2017518373A (en) | Composition for preventing or treating Staphylococcus aureus infection | |
| RU2387715C2 (en) | RECOMBINANT DNA PROVIDING PRODUCTION OF POLYPEPTIDES P6, P7, P8 EXHIBITING PROTECTIVE PROPERTIES AGAINST STREPTOCOCCUS AGALACTIAE AND SELECTIVELY CONNECTING IgA | |
| RU2640250C2 (en) | Method for introgression of pathogenic streptococcus genes in chromosomal dna of probiotic strain of enterococcus faecium l3 for expression in piles | |
| RU2685957C2 (en) | Chimeric recombinant protein, having protective properties against streptococcus pyogenes | |
| RU2542483C2 (en) | RECOMBINANT POLYPEPTIDE StV POSSESSING PROTECTIVE PROPERTIES IN RELATION TO Streptococcus agalactiae, RECOMBINANT DNA StV, ITS CODING AND RECOMBINANT STRAIN Escherichia coli M15-StV CONTAINING RECOMBINANT PLASMID PQE-StV | |
| RU2587627C2 (en) | Complex of recombinant polypeptides with protective properties in relation to streptococcus agalactiae and streptococcus pyogenes | |
| CN105056223A (en) | Combined vaccine for inhibiting and / or preventing type A streptococcal infection | |
| KR100465347B1 (en) | Preparation method of recombinant ApxIIA toxin protein of Actinobacillus pleuropneumoniae in Yeast and use thereof as feedstuff additive | |
| AU758555B2 (en) | Peptides | |
| JP2001523960A (en) | Human complement C3 degrading proteinase from Streptococcus nidumonie |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20121026 |
|
| RH4A | Copy of patent granted that was duplicated for the russian federation |
Effective date: 20140723 |
|
| HE4A | Change of address of a patent owner |
Effective date: 20180720 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20210322 |