RU2377247C2 - Молекулярный конъюгат на основе синтетических аналогов люлиберина и его применение в качестве средства доставки днк в клетки гормон-чувствительных опухолей (варианты) - Google Patents
Молекулярный конъюгат на основе синтетических аналогов люлиберина и его применение в качестве средства доставки днк в клетки гормон-чувствительных опухолей (варианты) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2377247C2 RU2377247C2 RU2007148383/04A RU2007148383A RU2377247C2 RU 2377247 C2 RU2377247 C2 RU 2377247C2 RU 2007148383/04 A RU2007148383/04 A RU 2007148383/04A RU 2007148383 A RU2007148383 A RU 2007148383A RU 2377247 C2 RU2377247 C2 RU 2377247C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- lys
- cells
- luliberin
- pro
- dna
- Prior art date
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims description 16
- XLXSAKCOAKORKW-AQJXLSMYSA-N gonadorelin Chemical class C([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)C1=CC=C(O)C=C1 XLXSAKCOAKORKW-AQJXLSMYSA-N 0.000 title claims description 16
- 239000005556 hormone Substances 0.000 title claims description 12
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 title claims description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 10
- 102000008238 LHRH Receptors Human genes 0.000 claims description 13
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 13
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims description 12
- 108010021290 LHRH Receptors Proteins 0.000 claims description 9
- KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N D-lysine group Chemical group N[C@H](CCCCN)C(=O)O KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N 0.000 claims description 8
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 8
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 8
- -1 aromatic D-amino acid Chemical class 0.000 claims description 7
- QIVBCDIJIAJPQS-SECBINFHSA-N D-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-SECBINFHSA-N 0.000 claims description 5
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 claims description 4
- XDMCWZFLLGVIID-SXPRBRBTSA-N O-(3-O-D-galactosyl-N-acetyl-beta-D-galactosaminyl)-L-serine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](OC[C@H]([NH3+])C([O-])=O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1OC1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 XDMCWZFLLGVIID-SXPRBRBTSA-N 0.000 claims description 4
- ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 5-oxo-L-proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 3
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims description 3
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N D-alanine Chemical compound C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 claims description 2
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 claims description 2
- 101000857870 Squalus acanthias Gonadoliberin Proteins 0.000 claims description 2
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 abstract description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 8
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 abstract description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 abstract description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 abstract description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 abstract description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 abstract 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 42
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 37
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 21
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 17
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 17
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 8
- MKUXAQIIEYXACX-UHFFFAOYSA-N aciclovir Chemical compound N1C(N)=NC(=O)C2=C1N(COCCO)C=N2 MKUXAQIIEYXACX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229960004150 aciclovir Drugs 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108700004695 alarelin Proteins 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 6
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 4
- 101150110792 GNRHR gene Proteins 0.000 description 4
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 4
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 4
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 4
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 4
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 3
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 3
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 3
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 3
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 3
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 3
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 125000001151 peptidyl group Chemical group 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 230000010837 receptor-mediated endocytosis Effects 0.000 description 3
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- ITMCEJHCFYSIIV-UHFFFAOYSA-N triflic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C(F)(F)F ITMCEJHCFYSIIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical class C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010010144 Completed suicide Diseases 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-MRVPVSSYSA-N D-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-MRVPVSSYSA-N 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 2
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 2
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 2
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000000018 receptor agonist Substances 0.000 description 2
- 229940044601 receptor agonist Drugs 0.000 description 2
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 2
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- UMRUUWFGLGNQLI-JOCHJYFZSA-N (2r)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-6-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]hexanoic acid Chemical group C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@H](CCCCNC(=O)OC(C)(C)C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 UMRUUWFGLGNQLI-JOCHJYFZSA-N 0.000 description 1
- DHBXNPKRAUYBTH-UHFFFAOYSA-N 1,1-ethanedithiol Chemical compound CC(S)S DHBXNPKRAUYBTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 7-Cyan-hept-2t-en-4,6-diinsaeure Natural products C1=2C(O)=C3C(=O)C=4C(OC)=CC=CC=4C(=O)C3=C(O)C=2CC(O)(C(C)=O)CC1OC1CC(N)C(O)C(C)O1 STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000000116 DAPI staining Methods 0.000 description 1
- WEAHRLBPCANXCN-UHFFFAOYSA-N Daunomycin Natural products CCC1(O)CC(OC2CC(N)C(O)C(C)O2)c3cc4C(=O)c5c(OC)cccc5C(=O)c4c(O)c3C1 WEAHRLBPCANXCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000010190 G1 phase Effects 0.000 description 1
- 230000010337 G2 phase Effects 0.000 description 1
- 239000000579 Gonadotropin-Releasing Hormone Substances 0.000 description 1
- XMAUFHMAAVTODF-STQMWFEESA-N His-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 XMAUFHMAAVTODF-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- 108010070875 Human Immunodeficiency Virus tat Gene Products Proteins 0.000 description 1
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000012435 analytical chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N daunorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(C)=O)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000002149 gonad Anatomy 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 231100001231 less toxic Toxicity 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- SGDBTWWWUNNDEQ-LBPRGKRZSA-N melphalan Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 SGDBTWWWUNNDEQ-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 229960001924 melphalan Drugs 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 1
- CMWYAOXYQATXSI-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylformamide;piperidine Chemical compound CN(C)C=O.C1CCNCC1 CMWYAOXYQATXSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000030648 nucleus localization Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000004237 preparative chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N thioanisole Chemical compound CSC1=CC=CC=C1 HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицины и может быть использовано как эффективное средство адресной доставки комплексов ДНК с молекулярными конъюгатами в определенные органы и ткани млекопитающих. Техническим результатом изобретения является повышение эффективности воздействия на клетки опухоли, который достигается за счет введения модифицированного сигнала ядерной локализации (NLS), что позволит конъюгатам образовывать комплексы с плазмидной ДНК, содержащей суицидный ген, а также обеспечит более высокую концентрацию конъюгата в ядрах опухолевых клеток, что приводит к усилению цитотоксических свойств доксорубицина. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 5 ил.
Description
Изобретение относится к области медицины и может быть использовано как эффективное средство адресной доставки комплексов ДНК с молекулярными конъюгатами в определенные органы и ткани млекопитающих. Основной проблемой генотерапии опухолевых заболеваний является разработка эффективных средств доставки (СД) генетических конструкций в клетки-мишени. Важно, чтобы СД обладали адресованным действием, не были токсичны и иммуногенны для организма, а также не вызывали побочных эффектов. На данный момент не существует оптимальных СД «лечащих» генов, полностью соответствующих выше перечисленным требованиям. Удачным может явиться использование для доставки в клетки чужеродных генетических конструкций невирусных носителей, которые могут применяться неоднократно, поскольку в отличие от вирусных СД они менее токсичны и практически не вызывают иммунного ответа.
Наиболее популярным подходом в этой области является использование молекулярных конъюгатов, состоящих из катионного носителя для конденсации ДНК за счет электростатических взаимодействий и лигандной части, взаимодействующей с клеточными рецепторами и обеспечивающей адресность доставки комплексов ДНК с молекулярными конъюгатами в определенные органы и ткани млекопитающих [1].
Рецепторы к люлиберинам представлены в норме на очень ограниченном числе тканей человека (гипофиз, гонады). Вместе с тем показано, что целый ряд опухолей человека, преимущественно карцином, синтезируют значительное количество рецепторов люлиберина. Данное обстоятельство делает эти рецепторы привлекательными для адресной доставки биологически активных молекул в клетки опухолей [2]. Использование люлиберинов для направленной химиотерапии гормон-чувствительных опухолей широко применяется в клинической практике ряда стран.
Известно использование конъюгатов аналогов люлиберина с различными цитотоксическими агентами (мелфалан, дауномицин, ингибиторы рибосом) для стерилизации животных и борьбы с гормон-зависимыми заболеваниями человека (в том числе гормон-чувствительными опухолями) [3].
Описываемое в данном патенте техническое решение состоит в использовании аналогов люлиберина для адресной доставки биологически активных молекул в клетки с высоким уровнем рецепторов GnRH. К недостаткам описанного решения следует отнести невозможность формирования комплексов плазмидной ДНК с молекулярными конъюгатами на основе аналогов люлиберина и их адресной доставки в опухолевые клетки.
Известно изобретение [4], в котором рассматриваются вопросы разработки структур аналогов люлиберина - агонистов и антагонистов рецепторов люлиберинов, ковалентно сцепленных с различными цитотоксическими агентами, в том числе с доксорубицином. В рамках данного подхода оказались нереализованными возможности, связанные с осуществлением синтеза молекулярных конъюгатов NLS-GnRH, способных формировать комплексы с плазмидной ДНК и адресно доставлять ее в опухолевые клетки, экспрессирующие рецепторы люлиберина.
Известен конъюгат аналогов люлиберина [5], наиболее близкий к предлагаемому изобретению, который используется совместно с цитотоксическим агентом доксирубицином и его производным в целях терапии гормон-чувствительных опухолей.
Недостатком известного конъюгата с агентами является сравнительно невысокая эффективность воздействия на клетки опухоли.
Техническим результатом заявленного изобретения является повышение эффективности воздействия на клетки опухоли.
Указанный технический результат в предлагаемом изобретении достигается за счет введения модифицированного сигнала ядерной локализации (NLS), что позволит конъюгатам образовывать комплексы с плазмидной ДНК, содержащей суицидный ген, а также обеспечит более высокую концентрацию конъюгата в ядрах опухолевых клеток, что, как показывают результаты многочисленных исследований, проведенных в лабораторных условиях Санкт-Петербургского государственного университета, приводит к усилению цитотоксических свойств доксорубицина. Указанный технический результат достигается двумя вариантами заявляемого молекулярного конъюгата.
Указанный технический результат по первому варианту достигается тем, что в молекулярном конъюгате на основе синтетических аналогов люлиберина, включающем катионную составляющую, представляющую собой модифицированный сигнал ядерной локализации Т-антигена вируса SV40, используемый для конденсации плазмидной ДНК, и лигандную составляющую для взаимодействия с опухоль-специфическими рецепторами, в соответствии с заявленным изобретением в качестве лигандной составляющей используют синтетические аналоги люлиберина с формулой X-R1-His-R3-Ser-R5-D-Lys-Leu-Arg-Pro-R10, где R1 - pGlu; R3 - Trp, D-Trp, Pro или D-Pal(3); R5 - Tyr или Arg; R10 - Gly-NH2, D-Ala-NH2 или NH-СН2-СН3; Х - атом водорода или низшая алканоильная группа (С2-С3), обладающие активностью агонистов люлибериновых рецепторов, а катионная составляющая конъюгата имеет структуру H-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val и присоединена к лигандной составляющей через е-аминогруппу D-Lys (R6).
Помимо этого, указанный технический результат достигается тем, что полученную систему молекулярного конъюгата применяют в качестве средства доставки ДНК в клетки гормон-чувствительных опухолей.
Указанный технический результат по второму варианту достигается тем, что в молекулярном конъюгате на основе синтетических аналогов люлиберина, включающем катионную составляющую, представляющую собой модифицированный сигнал ядерной локализации Т-антигена вируса SV40, используемый для конденсации плазмидной ДНК, и лигандную составляющую для взаимодействия с опухоль-специфическими рецепторами, в соответствии с заявленным изобретением в качестве лигандной составляющей используют синтетические аналоги люлиберина с формулой H-D-Lys-Pro-Gly-R2-R3-Ser-Tyr-R6-Leu-Arg-Pro-R10-NH2, где R2 - ароматическая D-аминокислота; R3 - Trp, D-Trp, Pro или D-Pal(3); R6 - D-аминокислота; R10 - Gly-NH2 или D-Ala-NH2, обладающие активностью антагонистов люлибериновых рецепторов, а катионная составляющая конъюгата имеет структуру H-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val и присоединена к лигандной составляющей через s-аминогруппу N-концевого D-Lys.
Кроме того, указанный технический результат достигается тем, что полученную систему молекулярного конъюгата применяют в качестве средства доставки ДНК в клетки гормон-чувствительных опухолей.
Заявляемое изобретение было апробировано в Санкт-Петербургском государственном университете в лаборатории эмбриологии, и по результатам проведенных испытаний ниже приведены конкретные примеры реализации по первому и второму предлагаемым вариантам изобретения.
Примеры конкретной реализации.
Синтезированы молекулярные конъюгаты NLS-LHRH:
а также их флюоресцентно меченные производные.
Примеры по первому варианту
Пример 1
В опытах по конкурентному вытеснению меченых конъюгатов с поверхности клеток гепатомы человека HepG2 молярными избытками немеченых аналогов люлиберина показан рецептор-опосредованный характер взаимодействия данных молекулярных конъюгатов с опухолевыми клетками (Фиг.1, на которой показано влияние избытков синтетических аналогов люлиберина (V-7 и аларелина) на связывание флюоресцентно меченного NLS-LHRH с клетками HepG2). К клеткам HepG2 (30 мм чашки) добавляли 5 мкг NLS-LHRH-F и указанные молярные избытки немеченого V7 или аларелина. Инкубацию проводили 4 ч при 4°С. Отмывали 5 раз холодным PBS, оставляли на 10 мин в 0.5% альбумине на PBS при 4°С, лизировали и измеряли флюоресценцию. Значения флюоресценции выравнивали по концентрации клеточного белка. Белые столбцы соответствуют конкуренции с пептидом V7, а темные соответствуют конкуренции с пептидом аларелином.
Пример 2
Стехиометрию комплексов ДНК/NLS-LHRH исследовали путем очистки комплексов, приготовленных в присутствии насыщающих количеств NLS-LHRH (десятикратный избыток по зарядам), от не связавшегося пептида методом ультрафильтрации. В результате был выделен комплекс, содержащий в своем составе насыщающие количества пептида. Известно, что гепарин, являясь более сильным полианионом, чем ДНК, способен вытеснять ее из комплекса с поликатионами [8, 9]. Определение содержания ДНК в выделенном комплексе проводили спектрофотометрически после его полного разрушения избытком гепарина. Содержание пептида в исследуемом комплексе определяли обратным титрованием гепарином. С этой целью построили калибровочную кривую (Фиг.2а) зависимости количества гепарина, достаточного для полного разрушения комплекса ДНК/NLS-LHRH, от содержания пептида в реакционной среде при формировании комплексов. По оси абсцисс приведен избыток положительных зарядов в комплексе относительно отрицательных зарядов ДНК, а по оси ординат отложено количество гепарина (мкг), необходимого для полного разрушения комплекса, содержащего 1 мкг ДНК. На Фиг.2(б) приведены результаты титрования NLS-LHRH в комплексе ДНК/NLS-LHRH
(1 мкг ДНК), приготовленном с насыщающими количествами NLS-LHRH и очищенным от не связавшегося пептида ультрафильтрацией гепарином методом гель-ретардации. 1 - pCMVluc; 2 - без гепарина; 3-е 0,292 мкг гепарина; 4 - с 0,4 мкг гепарина; 5 - с 0,52 мкг гепарина; 6 - с 0,65 мкг гепарина; 7 - с 0,975 мкг гепарина; 8 - с 1,46 мкг гепарина; 9 - с 2,19 мкг гепарина; 10 - с 3,29 мкг гепарина. Звездочками на Фиг.2а и 2б отмечены позиция на калибровочной кривой, соответствующая полному разрушению комплекса гепарином (а), и экспериментальная точка, соответствующая полному разрушению комплекса гепарином, выявленная гель-ретардацией (б). Установлено, что максимально возможное содержание NLS-LHRH в комплексах соответствует 1.5-кратному избытку положительных зарядов NLS-LHRH относительно отрицательных зарядов ДНК. Аналогичные результаты были получены нами ранее для комплексов ДНК с ТАТ-пептидом [8] и К8 [9].
Нижеприведенные примеры 3, 4, 5 являются общими для первого и второго вариантов заявленного изобретения.
Пример 3
Интернализацию комплексов ДНК с флюоресцентно меченными молекулярными конъюгатами NLS-LHRH (вариант 1) и Nuk-1 (вариант 2) исследовали методом конфокальной микроскопии. Клетки инкубировали с комплексами, приготовленными при соотношении зарядов ДНК : пептид 1:1 (10 мкМ) в течение 2 ч, фиксировали 4% формальдегидом, проводили дополнительную окраску DAPI и анализировали методом конфокальной лазерной флюоресцентной микроскопии. Результаты представлены на Фиг.3: а - клетки HepG2 после инкубации с комплексами ДНК с молекулярным конъюгатом NLS-LHRH (вариант 1); б - клетки HepG2 после инкубации с комплексами ДНК с молекулярным конъюгатом Nuk-1 (вариант 2); в - фибробласты человека после инкубации с комплексами ДНК с молекулярным конъюгатом NLS-LHRH (вариант 1); г - фибробласты человека после инкубации с комплексами ДНК с молекулярным конъюгатом Nuk-1 (вариант 2). Оба комплекса (ДНК/NLS-LHRH и ДНК/Nuk-l) выявлялись в эндосомах клеток гепатомы человека HepG2 ((содержат рецепторы люлиберинов), но не в фибробластах человека (не содержат люлибериновых рецепторов). Полученные результаты свидетельствуют в пользу рецептор-опосредованного эндоцитоза как основного пути проникновения в клетки комплексов ДНК с молекулярными конъюгатами NLS-LHRH и Nuk-1.
Пример 4
Способность NLS-LHRH (вариант 1) и Nuk-1 (вариант 2) доставлять ДНК в клетки HepG2 была проверена с помощью люциферазного теста. Клетки трансфецировали комплексами плазмиды pCMVluc, содержащей ген-репортер, кодирующий люциферазу, под контролем промотора ранних генов цитомегаловируса человека, с конъюгатами NLS-LHRH и Nuk-1. Оба комплекса оказались трансфекционно активными. На Фиг.4 показано влияние избытков аларелина на эффективность трансфекции клеток HepG2 комплексами pCMVluc/NLS-LHRH и pCMVluc/Nuk1 (люциферазный тест). Светлые столбцы соответствуют NLS-LHRH (вариант 1), темные столбцы - Nuk-1 (вариант 2). По оси абсцисс указаны молярные избытки аларелина, по оси ординат - активность люциферазы в относительных световых единицах. Добавление во время инкубации клеток с комплексами избытка аларелина приводило к снижению уровня экспрессии перенесенного гена при использовании NLS-LHRH, но не оказывало влияния на трансфекцию клеток комплексом pCMVluc/Nuk-1. На основании полученных данных можно заключить, что проникновение в клетки комплексов ДНК с NLS-LHRH происходит по тому же механизму, что и интернализация свободного LHRH - рецептор-опосредованным эндоцитозом.
На основании полученных данных можно заключить, что оба варианта молекулярного конъюгата способны эффективно доставлять ДНК в клетки гепатомы человека HepG2. Проникновение в клетки комплексов ДНК с NLS-LHRH происходит по тому же механизму, что и интернализация свободного LHRH - рецептор-опосредованным эндоцитозом.
Пример 5
Полученные данные о рецептор-опосредованном характере проникновения комплексов ДНК с молекулярным конъюнатом в клетки HepG2 позволили перейти к моделированию «суицидной» генотерапии опухолей путем переноса в клетки вектора экспрессии гена тимидин-киназы вируса HSV1 (рРТК1) с последующей обработкой трансфецированных клеток ацикловиром. Клетки HepG2 трансфецировали комплексами pPTK1/NLS-LHRH (первый вариант) и pPTK1/Nuk1 (второй вариант), приготовленными при соотношении зарядов 1:1. Через 2 ч после трансфекции в среду добавляли ацикловир до концентрации 50 мкг/мл. Через 24 ч клетки отмывали фосфатно-солевым буфером, фиксировали холодным 70% этанолом, окрашивали пропидий-йодидом (70 мкМ в 40 мМ цитрате натрия (рН 7.4)) 1 ч при 37°С в присутствии РНКазы А (500 мкг/мл). На Фиг.5 приведен анализ распределения клеток HepG2 по фазам клеточного цикла методом проточной цитофлюорометрии: а - интактные клетки (контроль); б - клетки после обработки ацикловиром (50 мкг/мл) в течение 24 ч; в - клетки, трансфецированные комплексами pPTK1/NLS-LHRH после обработки ацикловиром (50 мкг/мл) в течение 24 ч; г - клетки, трансфецированные комплексами pPTK1/Nuk1 после обработки ацикловиром (50 мкг/мл) в течение 24 ч. Обработка клеток, трансфецированных комплексами pPTKl/NLS-LHRH, ацикловиром приводила к полному исчезновению клеток в фазах G2 и S клеточного цикла и практически полному исчезновению клеток в фазе G1. Более 90% клеточной популяции ушли в апоптоз (Фиг.5в). В случае использования конъюгата Nuk1 (Фиг.5г) также наблюдалась массовая гибель клеток, однако эффект был менее выражен, так как около 15% клеток оставались в фазе G1. Клетки в фазах S и G2 также отсутствовали. Апоптоз клеток обусловлен именно экспрессией «суицидного» гена, так как обработка интактных клеток HepG2 ацикловиром (Фиг.5б) не приводила к существенным отклонением клеточного цикла по сравнению с контролем (Фиг.5а).
Пример 6
Синтез молекулярного конъюгата (первый и второй варианты).
Синтез
Молекулярный конъюгат NLS-LHRH (первый вариант) и Nuk1 (второй вариант) синтезировали на 4-метилбензгидриламино-полимере с содержанием аминогрупп 0.62 ммоль/г. До присоединения остатка Fmoc-D-Lys(BOC)-OH наращивание пептидной цепи проводили при использовании стандартного протокола Boc/Bzl стратегии (Протокол 1). После удаления ВОС-защиты с s-аминогруппы D-лизина проводили синтез последовательности ядерной локализации. При этом на стадии нейтрализации применяли 5%-ный раствор DIEA в DMF, а для присоединения N-концевого аминокислотного остатка использовали ВОС-Рerо-ОН. Затем удаляли Fmoc-защиту с α-аминогруппы D-лизина и продолжали наращивание пептидной цепи с применением Fmoc/Вut-стратегии (Протокол 2).
Отщепление синтезированных пептидов от полимера с одновременным деблокированием проводили с помощью TFMSA (Протокол 3). Деблокированные пептиды обессоливали на колонке 15×500 мм с сефадексом G-15 в 50% уксусной кислоте. Дальнейшую очистку проводили с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ.
ВЭЖХ проводили с использованием хроматографа System Gold (Beckman, США) на колонках Vydac С 18; Zorbax ODS С 18; Zorbax 300SB-C18 (4.6×150 мм, 5 мкм) для аналитической хроматографии и Vydac C18 (22×250 мм); Delta Pak C18 (19×300 мм); Discovery C18 (10×250 мм, 5 мкм) для препаративной. Условия хроматографии: УФ-детекция при 230 нм, градиент ацетонитрила в 0.1% TFA или 0.1% Н2РO4 при скорости потока 1 мл/мин для аналитической и градиент ацетонитрила в 0.1% TFA при скорости потока 5 мл/мин для препаративной хроматографии.
Полученные соединения охарактеризованы данными аналитической ВЭЖХ, аминокислотного анализа и масс-спектрометрии.
NLS-LH-RH. Масс-спектр, найдено: m/z: 2117.28 [М+H]+.
Вычислено: М 2117.25.
Nuk-1. Масс-спектр, найдено: m/z: 2209.40 [М+Н]+. Вычислено: М 2209.37.
Протокол 1. Синтез пептидов с помощью BOC/Bzl стратегии.
При проведении твердофазного пептидного синтеза использовали следующую комбинацию защитных групп в боковых цепях аминокислотных остатков: Ser - Bzl; Туr - Bzl(Cl2), Bzl(Br); Trp - For; Arg - Mts; Lys - Z(Cl). В качестве временной Nα-защиты служила ВОС-группировка.
Наращивание пептидной цепи проводили на полуавтоматическом пептидном синтезаторе или в ручном варианте по следующему протоколу для каждого цикла:
1) СН2Сl2 (1 мин); 2) 65% TFA/CH2Cl2 (1 и 15 мин); 3) CH2Cl2 (2х0 мин); 4) CH2Cl2 (2×1 мин); 5) DMF (1 мин); 6) 5% TEA/DMF (1 и 2 мин); 7) DMF (3×1 мин); 8) реакция конденсации (2 ч); 9) DMF (2×1 мин); 10) СН2Сl2 (1 мин).
Для конденсации использовали четырехкратные избытки активированных 1-оксибензотриазоловых эфиров соответствующих ВОС-аминокислот, полученных in situ (по 1 экв. ВОС-аминокислоты, DIC и HOBt, перемешивание в DMF при 0°С, 30 мин). По окончании реакции проводили тест на полноту ацилирования. При необходимости стадии 5)-10) повторяли.
В случае неполного прохождения реакции конденсации при ее повторении 1-2 раза непрореагировавшие группировки ацетилировали (после промывки СН2Сl2 к пептидил-полимеру добавляли 10 экв. уксусного ангидрида, 10 экв. 10% ТЕА/СН2Сl2 и перемешивали в течение 10 мин).
Протокол 2. Синтез пептидов с помощью Fmoc/But стратегии.
При проведении пептидного синтеза использовали следующую комбинацию защитных групп в боковых цепях аминокислотных остатков: Ser и Тyr - Вut; Lys - ВОС; His - Trt; Trp - ВОС. В качестве временной Nα-защиты служила Fmoc-группировка.
Наращивание пептидной цепи проводили на полуавтоматическом пептидном синтезаторе или в ручном варианте по следующему протоколу для каждого цикла: 1) СН2Сl2 (1 мин); 2) DMF (1 мин); 3) 20% пиперидин/DMF (2 и 8 мин); 4) DMF (3×1 мин); 5) Изопропиловый спирт (3×1 мин); 6) DMF (3×1 мин); 7) реакция конденсации (2 ч); 8) DMF (2×1 мин); 9) СН2Сl2 (1 мин).
Для конденсации использовали четырехкратные избытки активированных 1-оксибензотриазоловых эфиров соответствующих Fmoc-аминокислот, полученных in situ (по 1 экв. Fmoc-аминокислоты, DIC и HOBt, перемешивание в DMF при 0°С, 30 мин). По окончании реакции проводили тест на полноту ацилирования по методике, описанной в предыдущей главе. При необходимости повторной конденсации использовали следующий протокол:
а) DMF (1 мин); б) 5% DIEA/DMF (1 и 2 мин), после чего стадии 6)-9) повторяли.
В случае неполного прохождения реакции конденсации при ее повторении 1-2 раза непрореагировавшие группировки ацетилировали (после промывки СН2Сl2 к пептидилполимеру добавляли 10 экв. уксусного ангидрида, 10 экв. 10% DIEA/СН2Сl2 и перемешивали в течение 10 мин).
Протокол 3. Отщепление пептидов от полимерного носителя под действием TFMSA.
К 100 мг пептидил-полимера добавляли 100 мкл тиоанизола и 50 мкл этандитиола и перемешивали в течение 10 мин, после чего добавляли 1 мл TFA и перемешивали в течение 5-10 мин. К полученной суспензии при охлаждении на ледяной бане и перемешивании по каплям добавляли 100 мкл TFMSA. Реакционную смесь перемешивали в течение 2 ч при комнатной температуре, затем разбавляли безводным диэтиловым эфиром. Выпавший осадок вместе с частицами полимера отфильтровывали и промывали на фильтре диэтиловым эфиром. Фильтрат отбрасывали, после чего осадок растворяли в TFA и полученный раствор фильтровали от частиц полимерного носителя в колбу, содержащую 25 мл безводного диэтилового эфира. Выпавший осадок выдерживали в холодильнике в течение 10-15 мин, после чего отфильтровывали, промывали на фильтре диэтиловым эфиром и высушивали. Полученный продукт растворяли в 50%-ной уксусной кислоте и отделяли от избытка солей и скавэнджеров с помощью гель-фильтрации.
Как показывают результаты проведенных исследований, заявленное изобретение по первому и второму вариантам имеет высокую эффективность в «суицидной» генотерапии культивируемых клеток гепатомы человека HepG2 и относится к системе невирусного переноса генов в клетки гормон-чувствительных опухолей млекопитающих.
Заявленные молекулярные конъюгаты на основе агонистов рецепторов люлиберина позволяют добиться существенно лучших результатов по сравнению с конъюгатами на основе антагонистов люлибериновых рецепторов по применению их в качестве средства доставки ДНК в клетки гормон-чувствительных опухолей. Вместе с тем, стоит отметить, что в условиях in vivo предпочтительными могут оказаться конъюгаты на основе антагонистов, так как они не вызывают активацию специфичных для люлиберина сигнальных путей.
На основании полученных результатов можно заключить, что заявленное изобретение (в двух вариантах) позволяет эффективно и адресно доставлять гены в клетки гормон-чувствительных опухолей. Кроме того, высокая специфичность проникновения люлиберинов в опухолевые клетки предполагает перспективность их использования и в целях генотерапии опухолей.
Результаты подобного рода исследований, которые приведены в примерах заявленного изобретения, отсутствуют в литературе и неизвестны заявителю и авторам на день подачи материалов заявки.
Список использованной литературы
1. Molas М., Gomez-Valades A. G., Vidal-Alabro A., Miguel-Turu M., Bermudez J., Bartrons R., Perales J. C. Receptor-mediated gene transfer vectors: progress towards genetic pharmaceuticals (2003) Curr. Gene Ther. 3(5):468-485.
2. Schally A.V. Luteinizing hormone-releasing hormone analogs: their impact on the control of tumorigenesis (1999) Peptides 20(10):1247-1262.
3. Патент US 5,378,688.
4. Патент US 6,214,969.
5. Международная заявка РСТ/ЕР96/05029 (номер международной публикации W097/19954); патент US 6,184,374 В.
6. Xu Y., Szoka Jr. F. C. Mechanism of DNA release from cationic liposome/DNA complexes used in cell transfection (1996) Biochemistry 35:5616-5623.
7. Ramsay E., Gumbleton M. Polylysine and polyomithine gene transfer complexes: a study of complex stability and cellular uptake as a basis for their differential in-vitro transfection efficiency (2002) J. Drug Target. 10(1): 1-9.
8. Ignatovich I.A., Dizhe E. В., Pavlotskaya A. V., Akifiev B. N., Burov S. V., Orlov S. V., Perevozchikov A. P. Complexes of plasmid DNA with basic domain 47-57 of the HIV Tat protein are transferred to mammalian cells by endocytosis-mediated pathways (2003). J. Biol. Chem. 278(24):42625-42636.
9. Диже Э.Б., Игнатович И.А., Буров С.В., Акифьев Б.Н., Ефремов А.М., Перевозчиков А.П., Орлов С.В. Комплексы ДНК с катионными пептидами: условия формирования и факторы, влияющие на эффективность проникновения в клетки млекопитающих (2006). Биохимия 71(12):1659-1667.
Молекулярный конъюгат состоит из катионной составляющей, ответственной за электростатическое взаимодействие с плазмидной ДНК, и лигандной составляющей, представляющей собой синтетический аналог люлиберина. Во всех вариантах в качестве катионной составляющей использован модифицированный сигнал ядерной локализации Т-антигена вируса SV40. Последовательность катионной составляющей:
Н-Рrо-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val
Первый вариант молекулярного конъюгата содержит в качестве лигандной составляющей следующую последовательность:
Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2
Катионная составляющая присоединена через ε-аминогруппу 6-го D-Lys. Последовательность лигандной составляющей является частным случаем множества пептидов, описываемых следующей формулой:
X-R1-His-R3-Ser-R5-D-Lys-Leu-Arg-Pro-R10-NH2, где R1 - pGlu; R2 - His или D-Phe(4Cl); R3-Trp, D-Trp или D-Pal(3); R5 - Тyr или Arg; R10-Gly или D-Ala; Х - атом водорода или низшая алкильная группа (С2-С5).
Второй вариант молекулярного конъюгата содержит в качестве лигандной составляющей следующую последовательность:
D-Lys-Pro-Gly-D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2. Катионная составляющая присоединена через ε-аминогруппу первого D-Lys.
Claims (3)
1. Молекулярный конъюгат, представляющий собой синтетический аналог люлиберина формулы
X-R1-His-R3-Ser-R5-D-Lys-Leu-Arg-Pro-R10,
где R1 - pGlu;
R3 - Trp, D-Trp, Pro или D-Pal(3);
R5 - Tyr или Arg;
R10 - Gly-NH2, D-Ala-NH2 или NH-CH2-CH3;
X - атом водорода или низшая алканоильная группа (C2-C5),
в котором через ε-аминогруппу D-Lys в положении 6 присоединен H-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-.
X-R1-His-R3-Ser-R5-D-Lys-Leu-Arg-Pro-R10,
где R1 - pGlu;
R3 - Trp, D-Trp, Pro или D-Pal(3);
R5 - Tyr или Arg;
R10 - Gly-NH2, D-Ala-NH2 или NH-CH2-CH3;
X - атом водорода или низшая алканоильная группа (C2-C5),
в котором через ε-аминогруппу D-Lys в положении 6 присоединен H-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-.
2. Молекулярный конъюгат по п.1, отличающийся тем, что его применяют в качестве средства доставки ДНК в клетки гормон-чувствительных опухолей.
3. Молекулярный конъюгат для доставки ДНК в клетки гормон-чувствительных опухолей, содержащих рецепторы люлиберинов, в котором катионная составляющая, конденсирующая плазмидную ДНК, представляет собой модифицированный сигнал ядерной локализации Т-антигена вируса SV40 формулы H-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val- и присоединена через ε-аминогруппу N-концевого D-Lys лигандной составляющей, а лигандная составляющая, взаимодействующая с опухоль-специфическими рецепторами, представляет собой синтетический аналог люлиберина (антагонист) формулы
D-Lys-Pro-Gly-R2-R3-Ser-Tyr-R6-Leu-Arg-Pro-R10-NH2,
где R2 - ароматическая D-аминокислота;
R3 - Trp, D-Trp, Pro или D-Pal(3);
R6 - D-аминокислота;
R10 - Gly, D-Ala.
D-Lys-Pro-Gly-R2-R3-Ser-Tyr-R6-Leu-Arg-Pro-R10-NH2,
где R2 - ароматическая D-аминокислота;
R3 - Trp, D-Trp, Pro или D-Pal(3);
R6 - D-аминокислота;
R10 - Gly, D-Ala.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2007148383/04A RU2377247C2 (ru) | 2007-12-27 | 2007-12-27 | Молекулярный конъюгат на основе синтетических аналогов люлиберина и его применение в качестве средства доставки днк в клетки гормон-чувствительных опухолей (варианты) |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2007148383/04A RU2377247C2 (ru) | 2007-12-27 | 2007-12-27 | Молекулярный конъюгат на основе синтетических аналогов люлиберина и его применение в качестве средства доставки днк в клетки гормон-чувствительных опухолей (варианты) |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2007148383A RU2007148383A (ru) | 2009-07-10 |
| RU2377247C2 true RU2377247C2 (ru) | 2009-12-27 |
Family
ID=41045170
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2007148383/04A RU2377247C2 (ru) | 2007-12-27 | 2007-12-27 | Молекулярный конъюгат на основе синтетических аналогов люлиберина и его применение в качестве средства доставки днк в клетки гормон-чувствительных опухолей (варианты) |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2377247C2 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2529034C2 (ru) * | 2012-12-28 | 2014-09-27 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Санкт-Петербургский государственный университет" (СПбГУ) | Модульный молекулярный конъюгат для направленной доставки генетических конструкций и способ его получения |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997019954A1 (en) * | 1995-11-27 | 1997-06-05 | Asta Medica Aktiengesellschaft | Targeted cytotoxic anthracycline analogs |
| WO2005116058A1 (en) * | 2004-05-27 | 2005-12-08 | Curepeptide Ltd. | Peptides useful for treating gnrh associated diseases |
| RU2005136221A (ru) * | 2003-04-22 | 2006-05-27 | Сосьете Де Консей Де Решерш Э Д`Аппликасьонсьентифик С.А.С. (Fr) | Пептидные векторы |
-
2007
- 2007-12-27 RU RU2007148383/04A patent/RU2377247C2/ru active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997019954A1 (en) * | 1995-11-27 | 1997-06-05 | Asta Medica Aktiengesellschaft | Targeted cytotoxic anthracycline analogs |
| RU2005136221A (ru) * | 2003-04-22 | 2006-05-27 | Сосьете Де Консей Де Решерш Э Д`Аппликасьонсьентифик С.А.С. (Fr) | Пептидные векторы |
| WO2005116058A1 (en) * | 2004-05-27 | 2005-12-08 | Curepeptide Ltd. | Peptides useful for treating gnrh associated diseases |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Буров С.В. и др. «АНАЛОГИ ЛЮЛИБЕРИНА, ОБЛАДАЮЩИЕ ЦИТОТОКСИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ НА ОПУХОЛЕВЫЕ КЛЕТКИ in vitro». БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2006, т.32, №5, с.459-466. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2529034C2 (ru) * | 2012-12-28 | 2014-09-27 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Санкт-Петербургский государственный университет" (СПбГУ) | Модульный молекулярный конъюгат для направленной доставки генетических конструкций и способ его получения |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2007148383A (ru) | 2009-07-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2361621T3 (es) | Péptidos de lactoferrina útiles como péptidos de penetración celular. | |
| CN100506841C (zh) | 将分子递送到细胞的方法和载体复合物 | |
| JP5635512B2 (ja) | 遺伝子調節化合物の改良された送達のための化学的に修飾された細胞透過性ペプチド | |
| ES2766755T3 (es) | Análogos de compstatina con propiedades farmacocinéticas mejoradas | |
| CN109952376B (zh) | αvβ6整联蛋白配体及其应用 | |
| SK111897A3 (en) | Pharmaceutical composition suitable for nucleic acid transfection and use such composition for transferring nucleic acid | |
| EP0832269A1 (en) | Nucleic acid transporters for delivery of nucleic acids into a cell | |
| WO2014053882A1 (en) | Cell penetrating peptides for intracellular delivery of molecules | |
| EP4108676A1 (en) | Human transferrin receptor binding peptide | |
| AU2018342909B2 (en) | Castration resistant prostate cancer | |
| KR20160035081A (ko) | 생체 내에서 RNAi 유발제를 종양 세포로 전달하기 위한 폴리콘주게이트 | |
| JP2014508521A (ja) | 細胞内へのカーゴ送達のためのシステム | |
| JPH07507330A (ja) | ポリペプチドのボンベシン拮抗物質 | |
| CN111093718A (zh) | 治疗性纳米缀合物及其用途 | |
| RU2377247C2 (ru) | Молекулярный конъюгат на основе синтетических аналогов люлиберина и его применение в качестве средства доставки днк в клетки гормон-чувствительных опухолей (варианты) | |
| CN118201966A (zh) | 人转铁蛋白受体结合抗体-肽缀合物 | |
| ES2303636T3 (es) | Metodo para la inhibicion selectiva del gen humano n-myc a traves de acidos nucleicos peptidicos (pna) en tumores que expresan n-myc a traves de proteinas pna sentido y antisentido. | |
| US20170369529A1 (en) | Cell penetrating peptides | |
| RU2529034C2 (ru) | Модульный молекулярный конъюгат для направленной доставки генетических конструкций и способ его получения | |
| Freulon et al. | Spacer length dependence on the efficiency of dimeric anionic peptides in gene transfer by glycosylated polylysine/plasmid complexes | |
| LU102571B1 (en) | An artificial protein-cage comprising encapsulated therein a guest cargo | |
| US20250282820A1 (en) | Peptide complex having trkb binding activity | |
| US20250326865A1 (en) | C-met protein-binding peptide complex | |
| CN116947969A (zh) | 一种靶向pd-l1的多肽、制备方法，组装形成纳米球及应用 | |
| HK40083520A (en) | Human transferrin receptor binding peptide |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD4A | Correction of name of patent owner |