RU2376031C1

RU2376031C1 - Method for increase of melioidosis antigens protectivity by cytokines

Info

Publication number: RU2376031C1
Application number: RU2008127677/14A
Authority: RU
Inventors: Светлана Ивановна Жукова (RU); Светлана Ивановна Жукова; Ольга Борисовна Демьянова (RU); Ольга Борисовна Демьянова; Владимир Валерьевич Алексеев (RU); Владимир Валерьевич Алексеев; Ирина Владимировна Авророва (RU); Ирина Владимировна Авророва; Наталья Петровна Храпова (RU); Наталья Петровна Храпова; Лидия Васильевна Ломова (RU); Лидия Васильевна Ломова
Priority date: 2008-07-07
Filing date: 2008-07-07
Publication date: 2009-12-20

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: invention is related to the field of medicine, in particular to microbiology and immunology and may be used in development of vaccine against melioidosis. Substance of method consists in the fact that animals are immunised with surface melioidosis complex, which consists of antigen 6 (AG6) and antigen d, which is injected to animals subcutaneously, twice, with interval of 10 days, in doses of 30 mcg by protein for mice or 150 mcg for rats. Simultaneously with primary immunisation recombinant interferon-γ - ingaron is injected in doses 8 ME for mice or 120 ME for rats, and in case of secondary immunisation, recombinant interleukin-2 - roncoleukin in doses of 0.6 mcg for mice or 10 mcg for rats, besides cytokines are injected to animals subcutaneously, daily, simultaneously with immunisation and in the next 2 days. In 21 days after primary immunisation animals are infected with 4-32 LD₅₀ of highly virulent strain 100 of melioidosis causative agent, in 30 days after infection parametres of animal lethality are identified.

EFFECT: application of invention makes it possible to increase protectivity of melioidosis antigens due to cytokine stimulation of primary and secondary immune response to these antigens.

5 tbl, 2 ex

Description

Изобретение относится к области медицины, в частности к микробиологии и иммунологии, и касается способа повышения протективности мелиоидозных антигенов для специфической профилактики мелиоидозной инфекции.The invention relates to medicine, in particular to microbiology and immunology, and relates to a method for increasing the protection of melioid antigens for the specific prevention of melioid infection.

Мелиоидоз - особо опасное инфекционное заболевание, эндемичное для стран Юго-Восточной Азии. В связи с ростом туризма и постоянно развивающимися экономическими и культурными связями России с данным регионом мира возрастает опасность завоза мелиоидоза в нашу страну, что диктует необходимость разработки соответствующих мер и средств защиты.Melioidosis is a particularly dangerous infectious disease endemic to countries in Southeast Asia. In connection with the growth of tourism and Russia's constantly developing economic and cultural ties with this region of the world, the risk of bringing melioidosis into our country increases, which necessitates the development of appropriate measures and remedies.

Наиболее адекватным способом защиты от инфекций является, как известно, вакцинопрофилактика, которая в отношении мелиоидозной инфекции пока не разработана. Основные трудности на пути создания мелиоидозной вакцины связаны с низкой протективностью мелиоидозных антигенов, поэтому особую актуальность приобретает поиск эффективных иммуностимулирующих препаратов, а также разработка новых современных подходов к проблеме иммунорегуляции при мелиоидозе. Одним из таких подходов является направленная стимуляция определенных звеньев иммунной системы препаратами цитокинов.The most appropriate way to protect against infections is, as you know, vaccination, which has not yet been developed with respect to melioid infection. The main difficulties in creating a melioid vaccine are associated with the low protective efficacy of melioid antigens, therefore, the search for effective immunostimulating drugs and the development of new modern approaches to the problem of immunoregulation in melioidosis are of particular relevance. One of these approaches is the directed stimulation of certain parts of the immune system by cytokine preparations.

В доступной литературе мы не обнаружили сведений о возможности использования цитокинов для стимуляции поствакцинального иммунитета, хотя имеются отдельные публикации о применении цитокиновых препаратов с целью повышения иммунореактивности организма при экспериментальных инфекциях. В ряде зарубежных работ показана важная роль провоспалительных цитокинов (ТНФ-α, ИЛ-1, ИЛ-6) при экспериментальной мелиоидозной инфекции, а также цитокинов, продуцируемых Th-1 лимфоцитами (ИЛ-2, ИНФ-γ), отвечающими за развитие клеточного типа иммунного ответа [1, 2, 3]. По данным Cheng е.а. [4], применение для лечения наряду с антибиотиками препаратов гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF) существенно снижало смертность людей, больных мелиоидозом, хотя в экспериментах на мышах использование G-CSF не оказывало заметного влияния на результаты антибиотикотерапии острого мелиоидоза [5]. В литературе нам не встретилось сообщений о применении цитокиновых препаратов для повышения иммунного ответа при иммунизации мелиоидозными антигенами.In the available literature, we did not find information about the possibility of using cytokines to stimulate post-vaccination immunity, although there are some publications on the use of cytokine drugs in order to increase the body's immunoreactivity in experimental infections. A number of foreign studies have shown the important role of pro-inflammatory cytokines (TNF-α, IL-1, IL-6) in experimental melioid infection, as well as cytokines produced by Th-1 lymphocytes (IL-2, INF-γ), responsible for the development of cellular type of immune response [1, 2, 3]. According to Cheng E.A. [4], the use of granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) preparations for treatment along with antibiotics significantly reduced the mortality of people with melioidosis, although in experiments on mice the use of G-CSF did not significantly affect the results of antibiotic therapy of acute melioidosis [5]. In the literature, we have not come across reports on the use of cytokine drugs to increase the immune response during immunization with melioid antigens.

Наиболее близким аналогом предлагаемому способу повышения протективности мелиоидозных антигенов является работа Зезюлина П.Н. с соавт. [6], изучавших противоинфекционные действия ИЛ-1β на модели экспериментальной псевдотуберкулезной инфекции у мышей. Показано, что ИЛ-1β при введении мышам в первые 3 дня после инфицирования летальными дозами Y.pseudotuberculosis достоверно увеличивал выживаемость животных. В данной статье речь идет о повышении иммунного ответа цитокином ИЛ-1 при инфекционном процессе, мы же преследовали цель использовать цитокины для стимуляции иммунного ответа при иммунизации с целью создания протективного иммунитета. Учитывая важность формирования специфического иммунитета к мелиоидозу преимущественно клеточного типа, с нашей точки зрения, целесообразно использовать как при первичной, так и при повторной иммунизации мелиоидозными антигенами препараты цитокинов, стимулирующие преимущественно Т-систему иммунитета.The closest analogue to the proposed method for increasing the protection of melioid antigens is the work of Zezulin P.N. et al. [6], who studied the anti-infectious effects of IL-1β in a model of experimental pseudotuberculosis infection in mice. It was shown that IL-1β when administered to mice in the first 3 days after infection with lethal doses of Y. pseudotuberculosis significantly increased the survival of animals. This article is about increasing the immune response by the IL-1 cytokine in the infectious process, but we aimed to use cytokines to stimulate the immune response during immunization in order to create protective immunity. Considering the importance of the formation of specific immunity to predominantly cellular type melioidosis, from our point of view, it is advisable to use cytokine preparations stimulating mainly the T-system of immunity during both primary and repeated immunization with melioid antigens.

Целью изобретения является повышение протективности мелиоидозных антигенов препаратами цитокинов при использовании их для стимуляции первичного и вторичного иммунного ответа.The aim of the invention is to increase the protection of melioid antigens with cytokine preparations when used to stimulate the primary and secondary immune response.

Поставленная цель достигается тем, что при первичной иммунизации совместно с мелиоидозными антигенами применяют цитокины первой фазы иммунного ответа, а именно медиатор клеточного иммунитета - ИФН-γ, а при вторичной иммунизации используют цитокины, регулирующие, главным образом, клеточные механизмы специфического иммунитета, в частности, ИЛ-2.This goal is achieved by the fact that during primary immunization together with melioid antigens, cytokines of the first phase of the immune response are used, namely the mediator of cellular immunity - IFN-γ, and during secondary immunization they use cytokines that regulate mainly the cellular mechanisms of specific immunity, in particular IL-2.

Для иммунизации животных применяют поверхностные мелиоидозные антигенные комплексы, в частности, смесь антигена 6 и антигена d по классификации Пивня Н.Н. [7] (АГ6+d), в дозах - 30 мкг по белку для мышей и 150 мкг по белку - для крыс. Животных иммунизируют дважды подкожно, без адъюванта, с интервалом 10 сут. Препараты рекомбинантных цитокинов вводят животным подкожно, одновременно с иммунизацией мелиоидозными антигенами и в последующие 2 сут, причем при первичной иммунизации используют ИФН-γ (ингарон) в дозах 0,6 мкг для мышей и 10 мкг для крыс, а для вторичной иммунизации - ИЛ-2 (ронколейкин) в дозах 8 ME для мышей и 120 ME для крыс. На 21 сут после первичной иммунизации животных заражают подкожно суточной агаровой культурой высоковирулентного штамма 100 возбудителя мелиоидоза. За животными наблюдают 30 сут, после чего определяют показатели летальности: процент погибших и среднюю продолжительность жизни (СПЖ), по которым судят о протективной активности изучаемых мелиоидозных антигенов.For immunization of animals, surface melioid antigen complexes are used, in particular, a mixture of antigen 6 and antigen d according to the classification of N. Pivnya [7] (AG6 + d), at doses of 30 μg protein for mice and 150 μg protein for rats. Animals are immunized twice subcutaneously, without adjuvant, with an interval of 10 days. Recombinant cytokine preparations are administered subcutaneously to animals, simultaneously with immunization with melioid antigens and in the next 2 days, with IFN-γ (ingaron) in doses of 0.6 μg for mice and 10 μg for rats, and for secondary immunization, IL- is used for primary immunization. 2 (roncoleukin) in doses of 8 ME for mice and 120 ME for rats. On the 21st day after the primary immunization, the animals are infected subcutaneously with a daily agar culture of a highly virulent strain 100 of the causative agent of melioidosis. Animals are observed for 30 days, after which mortality indicators are determined: the percentage of deaths and average life expectancy (LSS), which are used to judge the protective activity of the studied melioid antigens.

Пример 1Example 1

Из поверхностных антигенных мелиоидозных комплексов, изучавшихся на предмет возможного использования для конструирования вакцинного препарата, нами был получен комплекс АГ6+d, представляющий собой смесь двух поверхностных антигенов белковополисахаридной природы. При анализе данного комплекса в иммуноэлектрофорезе и вертикальном электрофорезе в полиакриламидном геле он разделялся на 2 компонента: один - АГ6 - с м.м. 500 кД, другой - AГd - с м.м. 40-55 кД.From surface antigenic melioid complexes that were studied for possible use in constructing a vaccine preparation, we obtained the AG6 + d complex, which is a mixture of two surface antigens of a protein-polysaccharide nature. When analyzing this complex in immunoelectrophoresis and vertical electrophoresis in polyacrylamide gel, it was divided into 2 components: one — AG6 — with m.m. 500 kD, the other - AGd - with m.m. 40-55 kD.

В предварительных опытах на белых мышах АГ6+d при изолированном применении был слабоиммуногенным: в дозе 30-50 мкг он защищал всего 14-17% животных, зараженных 4-150 ЛД₅₀ B.pseudomallei 100. В последующих экспериментах на мышах были испытаны различные схемы стимуляции иммунного ответа на АГ6+d цитокинами. Препараты рекомбинантных цитокинов ИЛ-1 (беталейкин) в дозе 0,4 нг, ИФН-α (интераль) в дозе 400 ME. ИФН-γ (ингарон) в дозе 8 ME вводили в течение 3 сут для стимуляции первичного иммунного ответа (в первые сутки - совместно с АГ 6+d), препарат ИЛ-2 (ронколейкин) в дозе 0,6 мкг применяли для стимуляции вторичного иммунного ответа на 10 сут после первичной иммунизации также в течение 3 сут (в первые сутки - совместно с АГ6+d). Иммунизированных животных заражали на 21 сут после первичной иммунизации B.pseudomallei 100 в дозах 4-150 ЛД₅₀, после чего, спустя 30 сут, вычисляли показатели летальности, по которым делали вывод о влиянии той или иной схемы стимуляции иммунного ответа на протективность мелиоидозных антигенов. Результаты этих и других опытов обрабатывали статистически, используя t - критерий Стьюдента, а также непараметричный критерий Вилкинсона [8, 9].In preliminary tests on white mice AG6 + d when used alone was poorly immunogenic: at a dose of 30-50 ug it protected only 14-17% of the animals infected with 4-150 _LD50 B.pseudomallei 100. In subsequent experiments, various schemes have been tested on mice stimulation of the immune response to AG6 + d by cytokines. Preparations of recombinant cytokines IL-1 (betaleukin) at a dose of 0.4 ng, IFN-α (integral) at a dose of 400 ME. IFN-γ (ingaron) at a dose of 8 ME was administered for 3 days to stimulate the primary immune response (on the first day - together with AH 6 + d), the drug IL-2 (roncoleukin) at a dose of 0.6 μg was used to stimulate the secondary the immune response on the 10th day after the primary immunization also within 3 days (on the first day - together with AH6 + d). Immunized animals were infected 21 days after primary immunization with B. pseudomallei 100 at doses of 4-150 LD ₅₀ , after which, after 30 days, mortality rates were calculated, which made a conclusion about the influence of one or another immune stimulation scheme on the protection of melioid antigens. The results of these and other experiments were statistically processed using t-student test, as well as non-parametric Wilkinson test [8, 9].

Результаты экспериментов приведены в табл.1, 2. Как видно из данных табл.1, включение в схему иммунизации одного цитокинового препарата существенно не отражалось на протективности комплекса АГ6+d, использование же двух цитокинов в разных фазах иммунного ответа (ИЛ-1 при первичной иммунизации, ИЛ-2 при вторичной) способствовало повышению выживаемости мышей от 4 ЛД₅₀ на 23% и достоверно значимому увеличению СПЖ по сравнению с контролем.The experimental results are shown in Tables 1, 2. As can be seen from the data in Table 1, the inclusion of one cytokine preparation in the immunization schedule did not significantly affect the protection of the AG6 + d complex, while the use of two cytokines in different phases of the immune response (IL-1 in primary immunization, IL-2 in the secondary) increased the survival of mice from 4 LD ₅₀ by 23% and a significantly significant increase in SJ compared with the control.

В следующем опыте для стимуляции клеточного иммунного ответа при первичной иммунизации был применен ИФН-γ, являющийся, по современным представлениям, одним из ключевых цитокинов клеточного иммунитета [10]. Как следует из результатов этого опыта (табл.2), ИФН-γ был более эффективен при стимуляции первичного иммунного ответа, чем ИЛ-1, а при дополнительной стимуляции вторичного иммунного ответа ИЛ-2 протективность АГ6+d еще более возрастала: он защищал 50% мышей от 15 ЛД₅₀ высоковирулентного штамма и достоверно увеличивал СПЖ животных. Применение для стимуляции иммунитета схемы ИЛ-1+ИЛ-2 также способствовало увеличению показателей выживаемости и СПЖ, хотя и в меньшей степени, чем при использовании схемы ИФН-γ+ИЛ-2.In the following experiment, IFN-γ was used to stimulate the cellular immune response during primary immunization, which, according to modern concepts, is one of the key cytokines of cellular immunity [10]. As follows from the results of this experiment (Table 2), IFN-γ was more effective at stimulating the primary immune response than IL-1, and with additional stimulation of the secondary immune response, IL-2, AG6 + d increased even more: it protected 50 % of mice from 15 LD ₅₀ highly virulent strain and significantly increased the LSS of animals. The use of the IL-1 + IL-2 regimen to stimulate immunity also contributed to an increase in survival and life expectancy, although to a lesser extent than when using the IFN-γ + IL-2 regimen.

Известно, что иммунитет при мелиоидозной инфекции связан, в основном, с клеточными факторами защиты [11]. В связи с этим становится понятным, что повышение протективности мелиоидозных антигенов возможно при максимальном вовлечении в процессе иммуногенеза различных субпопуляций Т-клеток. Подобное действие, по-видимому, обеспечивается в наших опытах ИФН-γ, который на самых ранних этапах иммунной перестройки организма стимулирует неспецифические клеточные реакции, прежде всего, за счет активации макрофагов, а также усиливает иммунологические реакции с участием Т-хелперов. Дополнительная стимуляция вторичного иммунного ответа ИЛ-2, являющегося преимущественно Т-клеточным ростовым фактором, способствует формированию специфического иммунитета за счет активации процессов пролиферации и дифференцировки Т-лимфоцитов.It is known that immunity in melioid infection is associated mainly with cellular defense factors [11]. In this regard, it becomes clear that an increase in the protection of melioid antigens is possible with the maximum involvement of various T-cell subpopulations in the process of immunogenesis. A similar effect, apparently, is provided in our experiments by IFN-γ, which at the earliest stages of the immune restructuring of the body stimulates nonspecific cellular reactions, primarily due to the activation of macrophages, and also enhances immunological reactions involving T-helpers. Additional stimulation of the secondary immune response of IL-2, which is predominantly a T-cell growth factor, contributes to the formation of specific immunity by activating the proliferation and differentiation of T-lymphocytes.

Таким образом, направленная стимуляция первичного и вторичного иммунного ответа на АГ6+d цитокинами ИФН-γ и ИЛ-2, регулирующими неспецифические и специфические механизмы клеточного иммунитета, способствует существенному повышению защитных свойств мелиоидозных антигенов.Thus, directed stimulation of the primary and secondary immune response to AG6 + d by IFN-γ and IL-2 cytokines, which regulate non-specific and specific mechanisms of cellular immunity, contributes to a significant increase in the protective properties of melioid antigens.

Пример 2Example 2

В экспериментах на мышах нами было установлено, что более эффективным для стимуляции иммунного ответа на мелиоидозный антигенный комплекс АГ6+d является комбинированное воздействие двумя цитокинами по сравнению с использованием одного из цитокиновых препаратов. Схемы двойного применения цитокинов в процессе иммуногенеза при мелиоидозе были испытаны нами на крысах как экспериментальной модели, наиболее приближенной к человеку по уровню чувствительности к возбудителю мелиоидоза.In experiments on mice, we found that the combined effect of two cytokines is more effective for stimulating the immune response to the melioid antigenic AG6 + d complex compared to using one of the cytokine preparations. The double use of cytokines in the process of immunogenesis in melioidosis was tested by us in rats as an experimental model closest to humans in terms of sensitivity to the causative agent of melioidosis.

Белых крыс массой 250-300 г иммунизировали двукратно подкожно АГ6+d в дозе 150 мкг, без адъюванта. Стимуляцию первичного иммунного ответа осуществляли ИЛ-1 в дозе 6 нг или ИФН-γ в дозе 120 ME, вторичного - ИЛ-2 в дозе 10 мкг. Цитокины вводили подкожно в течение 3 сут, в первые сутки совместно с АГ6+d. На 21 сут после первичной иммунизации животных заражали 32 ЛД₅₀ B.pseudomallei 100. Протективность АГ6+d оценивали через 30 сут после заражения по показателям летальности. Результаты опыта суммированы в табл.3. Как видно из данных табл.3, АГ6+d при изолированном применении не защищал крыс от 17 ЛД₅₀ высоковирулентного штамма 100 возбудителя мелиоидоза. При стимуляции иммунного ответа двумя цитокинами единичные крысы выживали, а показатель СПЖ был достоверен выше, чем в контроле, особенно при использовании схемы ИФН-γ+ИЛ-2. Следует отметить, что применение цитокинов без специфических антигенов было неэффективным в защите крыс от инфекции.White rats weighing 250-300 g were immunized twice subcutaneously with AG6 + d at a dose of 150 μg, without adjuvant. The primary immune response was stimulated by IL-1 at a dose of 6 ng or IFN-γ at a dose of 120 ME, of the secondary one by IL-2 at a dose of 10 μg. Cytokines were injected subcutaneously for 3 days, on the first day together with AG6 + d. At 21 days after primary immunization, animals were infected with 32 LD _{50 of} B. pseudomallei 100. AG6 + d efficacy was evaluated 30 days after infection by mortality rates. The results of the experiment are summarized in table 3. As can be seen from the data in Table 3, AG6 + d, when used alone, did not protect rats from 17 LD _{50 of the} highly virulent strain 100 of the causative agent of melioidosis. When the immune response was stimulated by two cytokines, single rats survived, and the LSS was significantly higher than in the control, especially when using the IFN-γ + IL-2 scheme. It should be noted that the use of cytokines without specific antigens was ineffective in protecting rats from infection.

В данном опыте за 1 сут до заражения у части иммунизированных и контрольных крыс (по 5 животных в каждой группе) изучали показатели клеточного иммунитета: фагоцитарную активность перитональных макрофагов (ПМ) и уровень ГЗТ. Фагоцитарную активность ПМ определяли хемилюминесцентным методом [12], используя в качестве тест-объекта частицы зимозана, для определения ГЗТ крысам за 24 ч до опыта вводили в подушечку правой задней лапки разрешающую дозу АГ6+d (30 мкг) в объеме 20 мкл. Уровень ГЗТ определяли по выраженности отека правой лапки по сравнению с левой, в которую вводили 20 мкл физиологического раствора [13].In this experiment, 1 day before infection in some immunized and control rats (5 animals in each group), cellular immunity indices were studied: phagocytic activity of peritoneal macrophages (PM) and HRT level. The phagocytic activity of PM was determined by the chemiluminescent method [12], using zymosan particles as a test object, to determine HRT in rats, a resolution dose of AG6 + d (30 μg) in a volume of 20 μl was injected into the right hind paw pad 24 hours before the experiment. The level of HRT was determined by the severity of edema of the right paw compared to the left, into which 20 μl of physiological saline was injected [13].

Результаты определения уровня иммунореактивности крыс перед заражением представлены в табл.4, 5.The results of determining the level of immunoreactivity of rats before infection are presented in tables 4, 5.

Как видно из приведенных данных, стимуляция иммунного ответа на мелиоидозные антигены ИФН-γ+ИЛ-2 в наибольшей степени способствовала повышению функциональной активности ПМ крыс, при этом уровень хемилюминесценции ПМ в 4,5 раза превышал таковой у контрольных животных (табл.4). Уровень ГЗТ также был более высоким в группе животных, получавших вместе с АГ6+d рекомбинантные цитокины ИФН-γ и ИЛ-2 (табл.5).As can be seen from the above data, stimulation of the immune response to melioid antigens IFN-γ + IL-2 contributed to the greatest increase in the functional activity of PM rats, while the level of PM chemiluminescence was 4.5 times higher than that in control animals (Table 4). The level of HRT was also higher in the group of animals that received recombinant cytokines IFN-γ and IL-2 together with AG6 + d (Table 5).

Таким образом, применения ИФН-γ и ИЛ-2 для стимуляции иммунного ответа позволяет в значительной степени повысить показатели клеточного иммунитета как наиболее значимые в защите от мелиоидозной инфекции.Thus, the use of IFN-γ and IL-2 to stimulate the immune response can significantly increase cellular immunity as the most significant in protection against melioid infection.

Приведенные примеры показывают, что предлагаемый способ повышения протективности мелиоидозных антигенов позволяет существенно стимулировать иммунный ответ, что приводит к увеличению показателей выживаемости животных. Предлагаемый способ может использоваться в учреждениях, занимающихся разработкой средств специфической профилактики особо опасных инфекций.The above examples show that the proposed method for increasing the protection of melioid antigens can significantly stimulate the immune response, which leads to an increase in survival rates of animals. The proposed method can be used in institutions involved in the development of specific prophylaxis of especially dangerous infections.

ЛИТЕРАТУРАLITERATURE

1. Elevated plasma concentrations of interferon (IFN) - gamma and IFN -gamma - inducing cytokines interleukin (IL)-18, IL-12 and IL-15 in severe melioidosis / Lauw F.N., Simpson A.Y., Prins Y.M. et al // J.Infect. Dis. - 1999. - 180(6). - P.1878-1885.1. Elevated plasma concentration of interferon (IFN) - gamma and IFN-gamma - inducing cytokines interleukin (IL) -18, IL-12 and IL-15 in severe melioidosis / Lauw F.N., Simpson A.Y., Prins Y.M. et al // J. Infect. Dis. - 1999 .-- 180 (6). - P.1878-1885.

2. Ulett G.C., Ketheesan N., Tlirst R.G. Proinflamatory cytokine mRNA responses in experimental Burkcholderia pseudomallei infection in mice // Acta Trop. - 2000. - N 74 (2-3). - P.229-234.2. Ulett G.C., Ketheesan N., Tlirst R.G. Proinflamatory cytokine mRNA responses in experimental Burkcholderia pseudomallei infection in mice // Acta Trop. - 2000. - N 74 (2-3). - P.229-234.

3. Prognostic value of cytokine concentrations (tumor necrosis factor - alpha, interleukin-6 and interleukin-10) and clinical parameters in severe melioidosis / Simpson A.J., Smith M.D., Weverling G.J. et al // J. Infect. Dis. - 2000. - N18(2). P.621-625.3. Prognostic value of cytokine concentration (tumor necrosis factor - alpha, interleukin-6 and interleukin-10) and clinical parameters in severe melioidosis / Simpson A.J., Smith M.D., Weverling G.J. et al // J. Infect. Dis. - 2000 .-- N18 (2). P.621-625.

4. Cheng A.C., Stephens D.P., Anstey N.M., Currie B.Y. / Adjunctive granulocyte colonystimulatiug factor for treatment of seplic shock due to melioidosis // Clin.Infect. Dis. - 2004. - N 38 (l). - P.32-37.4. Cheng A.C., Stephens D.P., Anstey N.M., Currie B.Y. / Adjunctive granulocyte colonystimulatiug factor for treatment of seplic shock due to melioidosis // Clin.Infect. Dis. - 2004 .-- N 38 (l). - P.32-37.

5. Powell K., Ulett G., Hirst R., Norton R. / G-CSF - immunotherapy for treatment of acute disseminated murine melioidosis // FEMS Microbiol lett - 2003 / - № 224(2). - P.315-318.5. Powell K., Ulett G., Hirst R., Norton R. / G-CSF - immunotherapy for treatment of acute disseminated murine melioidosis // FEMS Microbiol lett - 2003 / - No. 224 (2). - P.315-318.

6. Зезюлин П.Н., Минаева E.H., Синкевич И.Е., Симбирцев А.С. Изучение противоинфекционного защитного действия рекомбинантного интерлейкина-1 бета на модели летальной бактериальной инфекции // Мед. иммунол. - 2005. - Т.7, № 2-3, С.299.6. Zezyulin P.N., Minaeva E.H., Sinkevich I.E., Simbirtsev A.S. Studying the anti-infective protective effect of recombinant interleukin-1 beta on a model of a lethal bacterial infection // Med. immunol. - 2005. - T.7, No. 2-3, C.299.

7. Пивень Н.Н. Антигенный состав возбудителей мелиоидоза и сапа в аспектах идентификации, диагностики и патогенности // Дисс…докт.мед. наук. - Волгоград, - 1997. - 296 с.7. Piven N.N. The antigenic composition of pathogens of melioidosis and glanders in the aspects of identification, diagnosis and pathogenicity // Diss ... Doct. sciences. - Volgograd, - 1997 .-- 296 p.

8. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в макробиологических исследованиях.- Л., 1962. - 180 с.8. Ashmarin I.P., Vorobyov A.A. Statistical methods in macrobiological research. - L., 1962. - 180 p.

9. Гублер Е.В., Генкин А.А. Применение непараметрических критериев статистики в медико-биологических исследованиях. - Л.: Медицина, 1973. - 141 с.9. Gubler E.V., Genkin A.A. Application of nonparametric statistical criteria in biomedical research. - L .: Medicine, 1973. - 141 p.

10. Железникова Г.Ф., Иванова В.В., Скрипченко Н.В. Уникальная защитная роль гамма-интерферона при острых инфекциях у детей // Мед. иммунол. - 2007. - т.9. - № 2-3. - С.223.10. Zheleznikova G.F., Ivanova V.V., Skripchenko N.V. The unique protective role of gamma-interferon in acute infections in children // Honey. immunol. - 2007.- vol. 9. - No. 2-3. - S. 223.

11. Тихонов Н.Г., Рыбкин B.C., Жукова С.И., Авророва И.В. Иммунология мелиоидоза // Мелиоидоз: Сб. научн. трудов. Волгоград. н.-иссл. противочум. ин-та. - Волгоград: Нижнее Волжское книжное изд-во, 1995. - С.119-141.11. Tikhonov N.G., Rybkin B.C., Zhukova S.I., Avrorova I.V. Immunology of melioidosis // Melioidosis: Sat. scientific labor. Volgograd. research antiplague. in-that. - Volgograd: Lower Volga Book Publishing House, 1995. - P.119-141.

12. Любимов Г.Ю., Зенков Н.К., Вольский Н.Н., Козлов В.А. Хемилюминесценция перитонеальных макрофагов при действии макрофагактивирующего фактора // Иммунология. - 1992.- № 1. - С.40-43.12. Lyubimov G.Yu., Zenkov N.K., Volsky N.N., Kozlov V.A. Chemiluminescence of peritoneal macrophages under the action of a macrophage activating factor // Immunology. - 1992.- No. 1. - P.40-43.

13. Попова А.Е. Методические рекомендации по определению отекогенного эффекта на белых мышах. - Волгоград. - 1980. - 18 с.13. Popova A.E. Guidelines for determining the edematous effect on white mice. - Volgograd. - 1980. - 18 p.

Таблица 1Table 1 Протективная активность мелиоидозных антигенов для мышей при сочетанном применении с цитокиновыми препаратамиProtective activity of melioid antigens for mice when combined with cytokine preparations Препараты для иммунизацииImmunization Products Летальность при заражении B.pseudomallei 100:Mortality after B.pseudomallei 100 infection: 4ЛД₅₀ 4LD ₅₀ 40 ЛД₅₀ 40 LD ₅₀ пало/взятоfallen / taken % павших% of the fallen СПЖSPG пало/взятоfallen / taken % павших% of the fallen СПЖSPG АГ6+dAG6 + d 10/1210/12 8383 8,28.2 12/1212/12 100one hundred 6,96.9 АГ6+d+ИЛ-1AG6 + d + IL-1 10/1310/13 7777 9,89.8 13/1313/13 100one hundred 7,57.5 АГ6+d+ИФН-αAG6 + d + IFN-α 12/1412/14 8686 8,88.8 12/1212/12 100one hundred 6,36.3 АГ6+d+ИЛ-2AG6 + d + IL-2 12/1412/14 8686 8,38.3 9/99/9 100one hundred 7,07.0 АГ6+d+ИЛ-1+ИЛ-2AG6 + d + IL-1 + IL-2 8/128/12 6767 11,4*11.4 * 11/1211/12 9292 9,89.8 Контроль (интактные) Control (intact) 9/109/10 9090 6,26.2 10/1010/10 100one hundred 5,95.9 * - здесь и далее - различия с контролем статически достоверны. Иммунизирующая доза АГ6+d - 30 мкг (двукратно).* - hereinafter - the differences with the control are statically significant. The immunizing dose of AG6 + d is 30 mcg (twice).

Таблица 2table 2 Влияние цитокиновых препаратов на протективность мелиодозных антигенов для мышейThe effect of cytokine drugs on the protection of melioid antigens in mice Препараты для иммунизацииImmunization Products Летальность при заражении B.pseudomallei 100:Mortality after B.pseudomallei 100 infection: 15 ЛД₅₀ 15 LD ₅₀ 150 ЛД₅₀ 150 LD ₅₀ пало/взятоfallen / taken % павших% of the fallen СПЖSPG пало/взятоfallen / taken % павших% of the fallen СПЖSPG АГ6+dAG6 + d 12/1412/14 8686 8,58.5 13/1513/15 8787 6,66.6 AГ6+d+ИЛ-1AG6 + d + IL-1 10/1310/13 7777 8,98.9 11/1311/13 8585 6,96.9 АГ6+d+ИЛ-2AG6 + d + IL-2 9/119/11 8282 8,18.1 10/1110/11 9191 6,16.1 АГ6+d+ИФН-γAG6 + d + IFN-γ 10/1510/15 6767 10,4*10.4 * 14/1514/15 9393 8,18.1 АГ6+d+ИЛ-1+ИЛ-2AG6 + d + IL-1 + IL-2 8/148/14 57*57 * 11,7*11.7 * 12/1512/15 8080 10,4*10.4 * АГ6+d+ИФН-γ+ИЛ-2AG6 + d + IFN-γ + IL-2 5/105/10 50*fifty* 12,4*12.4 * 8/108/10 8080 10,5*10.5 * Контроль (интактные)Control (intact) 10/1010/10 100one hundred 6,36.3 10/1010/10 100one hundred 5,85.8 Иммунизирующая доза АГ6+d - 50 мкг (двукратно).The immunizing dose of AG6 + d is 50 μg (twice).

Таблица 3Table 3 Влияние рекомбинантных цитокинов на иммуногенность мелиоидозных антигенов для крысThe effect of recombinant cytokines on the immunogenicity of melioid antigens in rats Препараты для иммунизацииImmunization Products Летальность при заражении 32 ЛД₅₀ B.pseudomallei 100:Mortality at infection 32 LD ₅₀ B.pseudomallei 100: пало/взятоfallen / taken % павших% of the fallen СПЖSPG АГб+dAGB + d 10/1010/10 100one hundred 9,09.0 АГ6+d+ИЛ-1+ИЛ-2AG6 + d + IL-1 + IL-2 9/109/10 9090 12,3*12.3 * AГ6+d+ИФН-γ+ИЛ-2AG6 + d + IFN-γ + IL-2 8/108/10 8080 14,1*14.1 * ИЛ-1+ИЛ-2IL-1 + IL-2 10/1010/10 100one hundred 8,48.4 ИФН-γ+ИЛ-2IFN-γ + IL-2 10/1010/10 100one hundred 8,78.7 Контроль (интактные)Control (intact) 10/1010/10 100one hundred 7,37.3 Иммунизирующая доза АГ6+d - 150 мкг (двукратно)The immunizing dose of AG6 + d - 150 mcg (twice)

Таблица 4Table 4 Хемилюминесцентный ответ перитонеальных макрофагов крыс на зимозан в конце периода иммунизации мелиоидозными антигенами и цитокинамиChemiluminescent response of rat peritoneal macrophages to zymosan at the end of the immunization period with melioid antigens and cytokines Препараты для иммунизацииImmunization Products Уровень хемилюминесценции ПМ (светосумма, mv)PM chemiluminescence level (light sum, mv) АГ6+dAG6 + d 52,53±4,2*52.53 ± 4.2 * AГ6+d+ИЛ-1+ИЛ-2AG6 + d + IL-1 + IL-2 70,24±2,3*70.24 ± 2.3 * AГ6+d+ИФН-γ+ИЛ-2AG6 + d + IFN-γ + IL-2 96,8±1,8*96.8 ± 1.8 * ИЛ-1+ИЛ-2IL-1 + IL-2 40,3±2,6*40.3 ± 2.6 * ИФН-γ+ИЛ-2IFN-γ + IL-2 45,6±1,9*45.6 ± 1.9 * Контроль (интактные)Control (intact) 21,5±0,821.5 ± 0.8

Таблица 5Table 5 Уровень ГЗТ у крыс, иммунизированных мелиоидозными антигенами и цитокинами, перед контрольным заражениемHRT level in rats immunized with melioid antigens and cytokines before control infection Препараты для иммунизацииImmunization Products Индекс реакции ГЗТ (ИР, %)HRT reaction index (IR,%) АГ6+dAG6 + d 16,1±2,1*16.1 ± 2.1 * АГ6+d+ИЛ-1+ИЛ-2AG6 + d + IL-1 + IL-2 28,4±3,3*28.4 ± 3.3 * АГ6+d+ИФН-γ+ИЛ-2AG6 + d + IFN-γ + IL-2 36,8±1,9*36.8 ± 1.9 * Контроль (интактные)Control (intact) 5,85±0,85.85 ± 0.8

Claims

A method of increasing the protection of melioid antigens, characterized in that the animals are immunized with a surface melioid complex consisting of antigen 6 (AG6) and antigen d, which is administered to the animals subcutaneously, twice, with an interval of 10 days, in doses of 30 μg for mouse protein or 150 μg for rats, at the same time as primary immunization, recombinant IFN-γ-ingarone is administered in doses of 8 ME for mice or 120 ME for rats, and for secondary immunization, recombinant IL-2 - roncoleukin is administered in doses of 0.6 μg for mice or 10 μg for rats wherein cytokines are administered animals subcutaneously, daily, simultaneously with immunization and for the next 2 days, 21 days after primary immunization, animals 4-32 LD _{50 of} highly virulent strain 100 of the causative agent of melioidosis are infected, 30 days after infection, the mortality rate of animals is determined.