RU2372073C1

RU2372073C1 - Доставка гетероциклических антибиотиков к раковым клеткам с помощью нанонуклеотидных фармакосом

Info

Publication number: RU2372073C1
Application number: RU2008107667/15A
Authority: RU
Inventors: Николай Лазаревич Векшин (RU); Николай Лазаревич Векшин
Original assignee: Николай Лазаревич Векшин
Priority date: 2008-02-27
Filing date: 2008-02-27
Publication date: 2009-11-10

Abstract

Настоящее изобретение относится к области лекарственных средств, в частности к способу эффективной доставки к опухолевым клеткам гетероциклического антибиотика с помощью малых частиц, содержащих кофеин, отличающемуся тем, что способ включает в себя первоначальное смешивание концентрированных спиртовых растворов антибиотика, одноцепочечного олигонуклеотида и пурина в соотношениях, близких к эквимолярным, и последующее быстрое впрыскивание полученного раствора через тонкую иглу в быстро перемешивающийся большой объем водного раствора, содержащего хлорид натрия, с образованием одиночных не слипающихся нанокомплексов - фармакосом - с очень малыми размерами, от 1 до 100 нанометров, обеспечивающими защиту антибиотика от сорбции на стенках кровеносных капилляров и при этом увеличивающими его проникновение в опухолевые клетки и их ядерную ДНК. Использование данного способа позволяет во много раз снизить концентрацию антибиотика, что обуславливает возможность устранить его токсическое неспецифическое действие на организм, но при этом позволяет резко увеличить его проникновение в опухолевые клетки, что дает возможность проводить их эффективную элиминацию. 1 табл., 6 ил.

Description

Изобретение относится к нанобиотехнологиям для медицины, а именно к способам приготовления биологических наноструктур, способных доставлять лекарственные вещества к опухолевым клеткам с целью проведения успешной противораковой терапии, например при лечении сарком, лимфом и меланом.

Способ направлен на обеспечение эффективной доставки к раковым клеткам гетероциклических антибиотиков, в частности актиномицинов, находящихся в составе фармакосом, носителями в которых являются нуклеотидные наноструктуры - одноцепочечные олигонуклеотиды и кластеры пуринов. Способ реализуется за счет использования защиты гетероциклических антибиотиков от сорбции на стенках сосудов и капилляров одноцепочечными олигонуклеотидами, в частности шпилечными олигонуклеотидами длиной 10-100 оснований, внутрь которых встраивается антибиотик, и за счет лучшего проникновения антибиотика внутрь делящейся клетки в составе фармакосомы, содержащей для этого также кластеры пуринов, в частности кофеина и аденина. Способ включает в себя первоначальное смешивание концентрированных спиртовых растворов гетероциклического антибиотика, одноцепочечного олигонуклеотида и пуринов в соотношениях, близких к эквимолярным, последующее быстрое впрыскивание малого объема полученного раствора через тонкую иглу в быстро перемешивающийся большой объем водного раствора, содержащего для поддержания ионной силы хлорид натрия, в результате чего происходит образование одиночных не слипающихся нанокомплексов - фармакосом - размерами от 1 до 100 нанометров, которые способны, легко проходя по кровеносным капиллярам, доставлять антибиотик к ДНК делящихся опухолевых клеток, успешно проникая через их плазматическую и ядерную мембраны. Использование данного способа позволяет во много раз снизить концентрацию антибиотика, что обуславливает возможность устранить его токсическое неспецифическое действие на организм, но при этом позволяет резко увеличить его проникновение в опухолевые клетки, что дает возможность проводить их эффективную элиминацию.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к биомедицинским нанотехнологиям, прежде всего - к способам доставки гетероциклических антибиотиков, в частности актиномицинов, к ДНК делящихся раковых клеток.

Способ заключается в эффективной доставке к опухолевым клеткам гетероциклического антибиотика с помощью малых частиц, содержащих кофеин, отличающийся тем, что способ включает в себя первоначальное смешивание концентрированных спиртовых растворов антибиотика, одноцепочечного олигонуклеотида и пурина в соотношениях, близких к эквимолярным, и последующее быстрое впрыскивание полученного раствора через тонкую иглу в быстро перемешивающийся большой объем водного раствора, содержащего хлорид натрия, с образованием одиночных не слипающихся нанокомплексов - фармакосом - с очень малыми размерами, от 1 до 100 нанометров, обеспечивающими защиту антибиотика от сорбции на стенках кровеносных капилляров и при этом увеличивающими его проникновение в опухолевые клетки и их ядерную ДНК.

В настоящее время практически нет мощных антибиотиков, не вызывающих при своем применении сопутствующих токсических последствий в организме. Чтобы снизить эти последствия и чтобы увеличить эффективность доставки антибиотиков в делящиеся раковые клетки, необходимо заключить антибиотик в некоторую защитную оболочку, препятствующую его сорбции на стенки кровеносных сосудов и капилляров, но увеличивающую его проникновение в опухолевые клетки к их ядерной ДНК, чтобы заблокировать там работу РНК-полимеразы. Для доставки гетероциклических антибиотиков, в частности актиномицинов, к ДНК раковых клеток заявляемый способ предполагает использование фармакосом - наночастиц диаметром 1-100 нанометров, состоящих из антибиотика, одноцепочечного олигонуклеотида и пуринового кластера.

Актиномицины являются одними из самых эффективных противоопухолевых лекарств (Егоров Н.С. и др. Антибиотики-полипептиды. М.: МГУ, 1987; Гаузе Г.Ф., Дудник Ю.В. Противоопухолевые антибиотики. М.: Медицина, 1987). Особенно широко они используются при химиотерапии сарком, лимфом и меланом (Clementz G.L., Dailey J.W. // Am. Fam. Physician. 1988. V.37. P.167; Traganos F. et al. // Cancer Res. 1991. V.51. P.3682. Farber S.J. // J. Am. Med. Assoc. 1996. V.198. P.826). Типичный их представитель актиномицин Д (АМД) состоит из феноксазонового хромофора и двух пептидо-лактонных колец. Биологическая активность АМД обусловлена его встраиванием в ДНК, ведущим к ингибированию РНК-полимеразной реакции, синтеза белка и клеточного деления (Rill R.L., Hecker K.H. // Biochemistry. 1996. V.35. P.3525. Jeeninga R.E. el al. // Nucleic Acids Research. 1998. V.26. № 23. P.5472).

В отличие от кристаллов и сухих пленок ДНК, где актиномицины интеркалируют по стэкинговому типу в двойную спираль, в растворах ДНК они, как оказалось, с наибольшим сродством встраиваются в расплетенные участки, причем без стэкинга (Vekshin N. et al. // J. Phys. Chem.: B. 2001. V.105. P.8461. Савинцев И.В., Векшин Н.Л. // Мол. биол. 2002. Т.36. №4. С.725. Савинцев И.В., Векшин Н.Л. // Прикл. биох. и микробиол. 2004. Т.40. №4. С.421).

Известно, что АМД проявляет цитотоксичность к раковым клеткам при очень низких концентрациях и его клиническое использование лимитируется побочными токсическими эффектами, например, в отношении сердечной мышцы (Takusagawa F. et al. // Bioorg. Med. Chem. 2001. V.9. P.719). Побочное токсическое действие АМД связывают с его действием на мембраны через образование опасного супероксида. Большая неспецифическая токсичность актиномицинов и плохое проникновение в клетки значительно ограничивают их применение.

Недавно на примере 7-амино-актиномицина D (7ААМД - флуоресцирующий аналог АМД, который можно детектировать в микромолярных концентрациях) было показано, что использование специальных переносчиков вроде синтетических шпилечных олигонуклеотидов позволяет снизить нежелательно высокую концентрацию антибиотика, но при этом - усилить действие в отношении раковых клеток (Векшин Н.Л., Савинцев И.В. // Биофизика, 2008. Т.53, в печати).

Шпилечные олигонуклеотиды, внутри которых связывается антибиотик, способны облегчать его транспорт через плазматическую мембрану внутрь раковых клеток. В пользу этого свидетельствует обнаруженный недавно факт резкого усиления проникновения АМД из комплекса с олигонуклеотидной шпилькой d(5′-AAAAAAATAGTTTTAAATATTTTTTT-3′), называемой НР1, внутрь клеток асцитной карциномы Эрлиха по сравнению со свободным АМД (Векшин Н.Л., Савинцев И.В. // Биофизика, 2008. Т.53, в печати). Причем АМД проникает при этом в ядро и окрашивает там ДНК. Как было показано в модельных опытах (Vekshin N.L., Kovalev A.E. // J. Biochem. 2006. V.140. P.185), олигонуклеотидные шпильки не препятствуют перераспределению антибиотика к ДНК.

Время формирования комплекса между 7ААМД (или АМД) и шпилькой НР1 при 26°С составляет всего 0,29 с (детектировалось на «stopped-flow» флуориметре). АМД и 7ААМД конкурируют за место связывания внутри НР1: добавление избытка АМД приводит к мгновенному падению флуоресценции комплекса 7ААМД/НР1. Молекула 7ААМД способна за 0,31 с замениться в шпильке на АМД. Сходная, но гораздо менее выраженная, конкуренция между 7ААМД и АМД наблюдается при их связывании с ДНК. В отличие от НР1, где есть лишь одно место связывания, в ДНК имеется много таких мест (см. таблицу).

Хромофоры 7ААМД и АМД локализуются в ДНК (и в шпильке НР1) в малополярном окружении, сходном по физико-химическим свойствам с таким растворителем, как пиридин (Vekshin N., et al. // J. Phys. Chem.: B.2001. V.105. P.8461). Встраивание актиномицинов происходит не на поверхности, а в динамической "полости" между двумя цепочками нуклеотидов, но без стэкинга с ними (Савинцев И.В., Векшин Н.Л. // Прикл. биох. и микроб., 2004, т.40, №4, с.421). Именно поэтому актиномицины не являются канцерогенами (в отличие от этидиум бромида, интеркалирующего между основаниями ДНК по стэкинговому типу), а служат противоопухолевыми препаратами.

Кинетика встраивания 7ААМД или АМД в ДНК имеет бифазный характер: 4,6 с и 40 с. Быстрая компонента имеет втрое большую амплитуду. Она соответствует связыванию 7ААМД внутри «разрыхленных» мест или петель, а медленная - встраиванию в двойную спираль. Длительность первой компоненты в случае ДНК во много раз больше, чем в случае НР1, т.к. расплетенные участки и петли ДНК имеют жесткую структуру, а шпилька НP1 - гибкая, "рыхлая", со свободными концами.

В работе (Vekshin N.L., Kovalev A.E. // J. Biochem. 2006. V.140. P.185) обнаружено «переползание» 7ААМД с синтетической шпильки НР1 на ДНК. Поскольку флуоресценция 7ААМД возрастает при связывании с НР1 гораздо сильнее, чем с ДНК (Савинцев И.В., Векшин Н.Л. // Мол. биол. 2002. Т.36. С.725), то это позволяет наблюдать перераспределение 7ААМД из комплекса с НР1 на ДНК после добавления избытка ДНК (фиг.1). "Переползание" состоит из быстрой фазы - 4,5 с и медленной - 101 с. Две компоненты соответствуют двум типам участков ДНК. Первый - это петли и расплетения, а второй - двойная спираль. Увеличение ионной силы приводит к уменьшению амплитуды быстрой компоненты, т.к. при высокой ионной силе ДНК имеет менее "рыхлую" структуру.

Другим переносчиком гетероциклических антибиотиков могут служить кластеры пуринов: аденина и кофеина (1,3,7-триметилксантина). Такие кластеры спонтанно возникают в водных растворах при миллимолярных концентрациях (Origlia-Luster M.L. et. al. // J. Chem. Thermodynamics. 2002. V.34. P.1909). Особенно устойчивы и малы по размеру кластеры кофеина.

Кофеин и его кластеры образуют стабильные нанокомплексы со многими гетероароматическими молекулами (Davies D.B. et al. // Eur. Biophys. J. 2001. V.30. P.354. Веселков Д.А. и др. // Биофизика. 2000. Т.45. №2. С.197). С помощью ЯМР (Веселков Д.А. и др. // Биофизика. 2000. Т.45. №2. С.197) было проведено изучение гетероассоциации АМД с кофеином при миллимолярных концентрациях и найдены константы связывания и другие термодинамические параметры. Однако при миллимолярных концентрациях АМД сильно димеризован и агрегирован (Веселков А.Н. и др. // Биофизика. 2005. Т.50. №1. С.20; Ковалев А.Э., Яковенко А.А., Векшин Н.Л. // Биофизика. 2004. Т.49. №6. С.1030), что может снижать его взаимодействие с кофеиновыми кластерами. Кроме того, в случае применения АМД для терапии в миллимолярных концентрациях он даст большие токсические последствия, т.е такие концентрации не физиологичны.

Кофеин обладает множественными эффектами на клеточном уровне. Он относится к классу мягких психомоторных стимуляторов. Отмечалось (Davies D.B. et al. // Eur. Biophys. J. 2001. V.30. P.354), что кофеин уменьшает канцерогенное действие бромистого этидия, вероятно, за счет образования между ними прочного комплекса.

Безопасная разовая доза кофеина может достигать 100 мг. Кофеин хорошо всасывается в желудочно-кишечном тракте и долго удерживается в крови, а актиномицины нет (Досон Р. и др. Справочник биохимика. М., Мир, 1991, с.210,270). Следует ожидать усиления лечебного действия АМД в присутствии кофеина.

Ранее предполагалось (Веселков А.Н. и др. // Биофизика. 2005. Т.50. №1. С.20. Шестопалова А.В. // Биофизика. 2006. Т.51. №3. С.389), что кофеин будет снижать действие антиопухолевых препаратов, уменьшая их эффективную концентрацию в крови. Однако при этом кофеин будет препятствовать «размазыванию» лекарства по стенкам кровеносных сосудов и капилляров. Кроме того, во многих случаях важна не столько концентрация лекарственного вещества в крови как таковая, сколько его способность проникать к молекулярно-биологическим «мишеням» в раковых клетках. Кофеин легко проникает в клетки, а АМД плохо. Действие актиномицинов в нанокомплексах с кофеином на опухолевые клетки является поэтому более сильным, чем актиномицинов отдельно.

Кофеин хорошо растворяется в воде и спирте; он обладает выраженными амфифильными свойствами. При концентрации порядка 1 мМ в воде он спонтанно формирует небольшие упорядоченные агрегаты - кластеры. Это сопровождается гипохромизмом - снижением коэффициента экстинкции (ε). В максимуме при 273 нм ε кофеина составляет 9740 М^-1 см^-1. При полной кластеризации кофеина (>2 мМ) ε уменьшается на 27% и не изменяется при дальнейшем увеличении концентрации до 8 мМ. Зависимость коэффициента экстинкции кофеина (при 273 нм) от его концентрации показана на фиг.2.

При формировании кофеиновых кластеров раствор остается абсолютно прозрачным, светорассеяние отсутствует. Возникновение гипохромизма в кластерах кофеина не сопровождается появлением дополнительных полос поглощения. Это означает, что нет заметного перераспределения электронной плотности, т.е. взаимодействия между молекулами кофеина в кластере невелики. Такой гипохромизм может быть описан в рамках экранировочной модели (Vekshin N.L. // J. Biol. Physics. 1999. V.25. P.339), предусматривающей конкуренцию за фотон между хромофорами в пределах стопкообразного кластера, охватываемого одной световой волной. В каждом кофеиновом кластере число молекул, вычисленное по экранировочной модели, составляет в среднем не меньше 8, но не превышает 12 (Битехтина М.А., Векшин Н.Л. // Биоорг. химия. 2008, т.34, №2, с.1-6). Эти цифры хорошо согласуются с объемом среднего кофеинового кластера ~250 Ǻ³, измеренного другими авторами (Origlia-Luster M.L. et al. // J. Chem. Thermodynamics. 2002. V.34. P.1909) денситометрическим методом.

Флуоресценция растворенного 7ААМД в воде частично затушена. При добавлении к 7ААМД кофеиновых кластеров наблюдается увеличение интенсивности его флуоресценции, что свидетельствует о переходе антибиотика из полярной водной фазы в менее полярную - на поверхность кофеиновых кластеров. Константа связывания 7ААМД с кластерами кофеин достигает 10⁶ М^-1 (получено путем концентрационного титрования). При связывании возникает заметный длинноволновый сдвиг спектра возбуждения (фиг.3), что говорит о перераспределении электронной плотности в антибиотике, о существенной энергии его взаимодействия с кофеином.

Интересно, однако, что сдвига спектра излучения не возникает (фиг.4): 7ААМД в присутствии кластеров кофеина излучает практически из микроокружения той же полярности, как в их отсутствие. Это однозначно говорит именно о поверхностном связывании антибиотика.

Феноксазоновый хромофор 7ААМД, сильно взаимодействующий с поверхностью кофеинового кластера, контактирует с водой. При фотовозбуждении дипольный момент 7ААМД резко возрастает, а также происходит релаксационный «разогрев» микроокружения (за счет разницы энергий поглощенного и излученного квантов), в результате чего 7ААМД десорбируется с поверхности кластера в водную фазу, откуда и излучает квант света. Именно поэтому степень поляризации флуоресценции 1 мкМ 7ААМД в присутствии кластеров 8 мМ кофеина составляет (при возбуждении 560 нм) почти столько же, сколько свободного 7ААМД в воде - 0,28 и 0,29 соответственно. Об этом же говорит то, что время жизни возбужденного состояния в обоих случаях составляет около 1 нс (Битехтина М.А., Векшин Н.Л., // Биоорг. химия. 2008, т.34, №2, с.1-6).

Одним из наиболее подробных флуоресцентных исследований взаимодействия 7ААМД с ДНК является работа (Wadkins R., Jovin T. // Biochemistry. 1991. V.30. P.9469), в которой было показано, что при связывании 7ААМД с ДНК его время жизни возрастает примерно вдвое, а спектр излучения сдвигается в коротковолновую область. При комплексообразовании 7ААМД с ДНК наблюдается многократное увеличение квантового выхода излучения, так как феноксазоновый хромофор антибиотика в гидрофобном окружении нуклеотидов ДНК подвергается гораздо меньшему тушению, чем в водной фазе. При этом спектр возбуждения 7ААМД претерпевает сильный длинноволновый сдвиг (до 570 нм), в то время как спектр излучения претерпевает коротковолновый сдвиг (до 630 нм). Именно поэтому при добавлении к раствору комплексов 7ААМД с кофеиновыми кластерами аликвот раствора ДНК возникает дополнительный длинноволновый сдвиг спектра возбуждения (фиг.3) и увеличивается интенсивность флуоресценции, причем, спектр излучения сдвигается в коротковолновую область (фиг.4). Это отражает перераспределение антибиотика с поверхности кофеиновых кластеров в гидрофобные области внутри ДНК. Конечная интенсивность флуоресценции 7ААМД в присутствии 200 мкМ нуклеотидов ДНК в буфере без кофеина лишь на 20% выше, чем в присутствии кофеиновых кластеров (фиг.5).

Это говорит о том, что кофеин мало препятствует формированию комплексов антибиотика с ДНК и может служить эффективным переносчиком антибиотика к ДНК. Причем перераспределение антибиотика к ДНК в ходе диссоциации комплексов АМД/кофеин обусловлено как большей прочностью комплексов АМД/ДНК, так и наличием в ДНК гораздо большего количества мест связывания (Битехтина М.А., Векшин Н.Л. // Биоорг. химия. 2008, т.34, №2, с.1-6).

Все вышеперечисленные опыты позволили заключить, что актиномицины смогут хорошо проникать к ядерной ДНК опухолевых клеток, предварительно связавшись со шпилечными олигонуклеотидами и пуринами, например с кофеином.

С помощью люминесцентной микроскопии были исследованы места локализации антибиотика в клеточных структурах после инкубации клеток асцитной карциномы Эрлиха со свободным актиномицином и его комплексом со шпилечным олигонуклеотидом НР1 (Векшин Н.Л., Савинцев И.В. // Биофизика, 2008. Т.53, в печати). Комплекс АМД/НР1 или 7ААМД/НР1 в мольном соотношении 1:1 (в водном растворе) добавлялся при перемешивании в клеточную среду до конечной концентрации 10 мкМ. Клетки инкубировались в такой среде в течение суток при 37°С. Смертность клеток определялась на микроскопе "ЛЮМАМ" в проходящем свете при окрашивании трепановым синим (10 мкМ). Прокрашивание антибиотиком ядерных структур клеток и анализ локализации 7ААМД в клетках проводили на "ЛЮМАМ" при 900-кратном увеличении; флуоресценция 7ААМД регистрировалась в диапазоне 600-700 нм.

Было показано, что свободный 7ААМД и свободный АМД аккумулируются в плазматической мембране клеток. В случае же применения комплекса 7ААМД/НР1 или АМД/НР1 наблюдается также окрашивание ядер. Это означает, что нанокомплекс легко проникает и через плазматическую, и через ядерную мембраны опухолевых клеток. Добавка свободных молекул АМД или 7ААМД в питательную среду вызывала лишь небольшое увеличение гибели клеток карциномы по сравнению с контролем (без АМД или 7ААМД). Это связано с тем, что актиномицины плохо проникают внутрь клеток. При инкубации в присутствии комплекса АМД/НР1 гибель клеток возрастала в несколько раз. При этом цитотоксичность самого НР1 в отношении карциномы была низка и сравнима с цитотоксичностью свободного АМД, не превышая 6%. Шпилька НР1 существенно потенцировала действие АМД. Это можно объяснить не только способностью НР1 переносить актиномицины к ДНК, но также высокой плотностью упаковки олигонуклеотида в комплексе с антибиотиком, что создает условия для эффективного переноса через мембраны (фиг.6).

При введении нанокомплексов (состоящих из АМД, НР1 и кофеина) мышкам с саркомой продолжительность жизни животных увеличивалась с 10-12 дней до 20-25 дней, в то время как введение антибиотика отдельно увеличивало срок жизни всего на 1-2 дня, а введение шпильки или кофеина вообще не влияло.

Таким образом, фармакосомные наноструктуры, в которых носителями являются шпилечные олигонуклеотиды и пурины, могут служить эффективными переносчиками («доставщиками») гетероциклических антибиотиков, в частности актиномицинов, к ядерной ДНК опухолевых клеток и вызывать гибель этих клеток.

В отношении доставки антибиотиков в опухолевые клетки с помощью различных молекулярных носителей (полипептидов, антител, нуклеиновых кислот, синтетических полимеров, фосфолипидных липосом, поверхностно-активных веществ и др.) известны, например, такие авторские свидетельства и патенты:

№2005100840/04 от 2003.06.16. ФТОРСИЛОКСАНОВЫЕ МАТРИКСНЫЕ СИСТЕМЫ ДОСТАВКИ ЛЕКАРСТВ С РЕГУЛИРУЕМОЙ ДИФФУЗИЕЙ И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ. САЛАМОН Джозеф С. и др. (US). Изобретение относится к сополимерам, используемым при изготовлении матриксных систем доставки лекарств с регулируемой диффузией, содержащая силоксановый сополимер, содержащий фторированную боковую цепь, полученный сополимеризацией фторсилоксанового мономера…, и одного или более сополимеризуемых мономеров…

№2004116475 от 2002.11.01. АНТИТЕЛО, СЕЛЕКТИВНОЕ В ОТНОШЕНИИ РЕЦЕПТОРА ЛИГАНДА, ИНДУЦИРУЮЩЕГО АПОПТОЗ И СВЯЗАННОГО С ФАКТОРОМ НЕКРОЗА ОПУХОЛИ, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ. Ю ЭЙ БИ РИСЕРЧ ФАУНДЕЙШН (US) ЧЖОУ Тун (US). Очищенное антитело, которое специфично связывается с TRAIL-рецептором DR4, где указанное антитело в растворимой форме обладает апоптоз-индуцирующей активностью… Терапевтическое средство выбирают из группы, включающей блеомицин … даунорубицин, актиномицин… Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту… и регуляторный элемент, оперативно связанный с указанной нуклеиновой кислотой… Очищенный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность иммуноглобулиновой тяжелой цепи антитела, способного связывать TRAIL-рецептор DR4 и способного вызывать апоптоз клетки…

№2004120785 от 2002.12.03. КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ПРОИЗВОДНОЕ АРИЛМОЧЕВИНЫ В КОМБИНАЦИИ С ЦИТОТОКСИЧЕСКИМ ИЛИ ЦИТОСТАТИЧЕСКИМ АГЕНТОМ, СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ОПУХОЛЕВЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ И СПОСОБ ИНГИБИРОВАНИЯ ПРОЛИФЕРАЦИИ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК. Байер Фамэсьютиклс Копэрейшн (US). ВИНСЕНТ Патрик У. (US) и др. Композиция, содержащая N-(4-хлор-3-(трифторметил)фенил-N′-(4-(2-(N-метилкарбамоил)-4-пиридилокси)фенил)мочевину, которая является ингибитором киназы raf, и цитотоксический агент или цитостатический агент, или фармацевтически приемлемую соль цитотоксического агента, или фармацевтически приемлемую соль цитостатического агента… Композиция по любому из пп.1-3, в которой цитотоксическим агентом является иринотекан, … актиномицин D…

№98101364 от 1998.01.29. ПРИМЕНЕНИЕ АЛКАЛОИДОВ КОАССА ЛАМЕЛЛАРИНА В СПОСОБАХ ЛЕЧЕНИЯ. Форма Map, C.A. (ES). Хосе Луис Фернандес Нуэнтес (ES) и др. Способ лечения опухолей, устойчивых к действию большого количества лекарств у млекопитающих, включающий введение пациенту… эффективного МЛР-ингибирующего количества анти-МЛР производного ламелларина… Фармацевтическая композиция, где противоопухолевое лекарственное средство, вызывающее МЛР, выбрано из группы включающей винбластин, доксарубицин… и актиномицин D.

№96107922/14 от 1996.04.29. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ДЛЯ НАПРАВЛЕННОЙ ДОСТАВКИ ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА. Гусев C.A. и др. Способ получения препарата для направленной доставки лекарственного средства, включающий обработку сыворотки крови человека и совмещение протеина с лекарственным средством, отличающийся тем, что сыворотку крови человека обрабатывают гепарином и хлоридом металла, выбранным из хлорида кальция и хлорида марганца, с выделением липопротеина в виде водного раствора концентрацией (10) мг/мл, для совмещения с липопротеином используют лекарственное средство, выбранное из группы, включающей антибиотик, витамин, противоопухолевое средство и гормон, совмещение липопротеина с указанным лекарственным средством осуществляют при их массовом соотношении 2-50:1 … в течение 6-18 ч… добавляют к препарату липопротеин в количестве, необходимом для восстановления исходного массового соотношения компонентов 2-50:1 с последующей стерилизацией и консервацией препарата…. Для совмещения с липопротеином используют антибиотик, выбранный из группы, включающей … циклоспорин, … тетрациклин, … актиномицин-Д …

№2005100777/13 от 2003.06.16. МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО РАМ4 И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ РАКА ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ. ИММУНОМЕДИКС, ИНК. (US). ГОЛД Дэвид В. и др. (US). Антитело или его фрагмент, который связывает домен, находящийся между N-концом и началом домена повторов MUC 1, где указанное антитело получено путем иммунизации муцином и/или селекции с его использованием… Направленный на раковую клетку диагностический или терапевтический конъюгат, содержащий антительный компонент, который включает в себя антитело или его фрагмент по п.1, который связывается с указанной клеткой, где указанный антительный компонент связан по меньшей мере с одним средством диагностики/детекции и/или по меньшей мере с одним терапевтическим средством…. Терапевтический конъюгат…, где указанное терапевтическое средство выбрано из группы, состоящей из радионуклида, иммуномодулятора, гормона, антагониста гормона, фермента, ингибитора фермента, олигонуклеотида, светочувствительного терапевтического средства, цитотоксического средства, антитела, ингибитора ангиогенеза и их комбинации… Терапевтический конъюгат…, где указанный олигонуклеотид представляет собой антисмысловой олигонуклеотид…. Способ…, где указанное средство усиления ультразвукового изображения представляет собой липосому, которая содержит химеризованное антитело РАМ4 или его фрагмент… Терапевтический конъюгат по п.80, где указанный олигонуклеотид представляет собой антисмысловой олигонуклеотид против онкогена…

№2006106173/14 от 2004.07.30. УСОВЕРШЕНСТВОВАННАЯ СИСТЕМА ДОСТАВКИ ЛЕКАРСТВ. ДРАГ ДЕЛИВЕРИ СОЛЮШНЗ ЛИМИТЕД (GB). ЧАРМАН Уилльям (AU) и др. Предназначенная для перорального приема система доставки лекарств, включающая в себя бижидкостную пену, содержащую от 1 до 20% по массе непрерывной гидрофильной фазы, от 70 до 98% по массе фармацевтически приемлемого масла, образующего дискретную фазу, причем в указанном фармацевтически приемлемом масле растворено или диспергировано малорастворимое в воде лекарственное средство в количестве от 0,1 до 20% по массе, где малорастворимое лекарственное средство представляет собой лекарственное средство, которое растворяется в воде в количестве, не превышающем 1% по массе, и бижидкостную пену, включающую в себя ПАВ в количестве от 0,5 до 10% по массе, для формирования стабильной бижидкостной пены, где все количества указаны в процентах от общей массы единичной лекарственной формы… Предназначенная для перорального приема система доставки лекарств…, где ПАВ содержит простой эфир алкилполигликоля, сложный эфир алкилполигликоля, этоксилированный спирт, сложный полиоксиэтиленсорбитановый эфир жирной кислоты, сложный полиоксиэтиленовый эфир жирной кислоты, ионное или неионное ПАВ, аддукт гидрогенизированного касторового масла/полиоксиэтиленгликоля, содержащий от 25 до 60 этоксигрупп, аддукт касторового масла/полиоксиэтиленгликоля, содержащий от 25 до 45 этоксигрупп, либо их смеси… Предназначенная для перорального приема система доставки лекарств…, где соэмульгатор представляет собой фосфоглицерид или фосфолипид…

№2003132694/15 от 2002.04.10. СИСТЕМА ДОСТАВКИ ЛЕКАРСТВ ДЛЯ ГИДРОФОБНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ. Авторы: БОК Рональд Э. (СА) и др. Изобретение относится к области фармации. Сущность его заключается в разработке композиций, включающих микроагрегаты, содержащие гидрофобные лекарственные препараты, а также способы их производства. Такие микроагрегаты включают мицеллярные структуры или их комбинацию с микросомами, составляющие эффективный носитель доставки для гидрофобного агента. Способы производства микроагрегатов включают использование предпочтительных липидных соединений и условий обработки, способствующих улучшенной фильтрационной стерилизации. Технический результат - повышение эффективности доставки лекарственного средства, усиления фильтрационной стерилизации.

№2005131950 от 2004.04.14. КОВАЛЕНТНОЕ И НЕКОВАЛЕНТНОЕ СШИВАНИЕ ГИДРОФИЛЬНЫХ ПОЛИМЕРОВ И АДГЕЗИВНЫЕ КОМПОЗИЦИИ, ПОЛУЧЕННЫЕ С НИМИ. КОРИУМ ИНТЕРНЭШНЛ (US) и ИНСТИТУТ НЕФТЕХИМИЧЕСКОГО СИНТЕЗА ИМ. А.В.ТОПЧИЕВА РАН (RU). Авторы: ФЕЛЬДШТЕЙН М.М. и др. Водонерастворимый сшитый гидрофильный адгезивный полимер, полученный полимеризацией композиции, состоящей, по существу, из гидрофильного мономера и мономера с двойной функциональностью, который как (а) подвергается полимеризации с гидрофильным мономером, так и (b) обеспечивает ковалентные сшивки в полимере… Жидкая пленкообразующая композиция, состоящая, по существу, из водонерастворимого пленкообразующего полимера и полимера… Композиция…, в которой водонерастворимый пленкообразующий полимер выбран из акрилатсодержащих полимеров и сополимеров, поливинилацетата, сополимеров этилена-винилацетата, алкилцеллюлозы, нитроцеллюлозы и полисилоксанов… Композиция…, в которой активный агент выбран из бактериостатических и бактерицидных средств, антибиотиков… Водонерастворимая гидрофильная адгезивная полимерная смесь, которая не содержит ковалентных сшивок, состоящая из по меньшей мере одного гидрофильного длинноцепочечного полимера и, по меньшей мере, одного амфифильного сшивающего агента…

№2002122745/15 от 2001.03.06. НОВАЯ САМОЭМУЛЬГИРУЮЩАЯСЯ СИСТЕМА ДОСТАВКИ ЛЕКАРСТВ. ХОЛЬМБЕРГ Кристина (SE) и СЬЕКМАНН Бритта (SE). Стабильный безводный лекарственный препарат, содержащий, по меньшей мере, одно лекарственное средство, и безводный однофазный носитель, который содержит, по меньшей мере, один полимер и, по меньшей мере, один растворитель, данный носитель является растворимым в воде, где данное лекарственное средство не растворяется в одном или более из компонентов носителя, и данный лекарственный препарат является стабильным при 37°С, по меньшей мере, в течение двух месяцев… Стабильный безводный лекарственный препарат…, где лекарственное средство содержит вещество в виде частиц… Стабильный безводный лекарственный препарат…, где лекарственное средство выбрано из группы, состоящей из… окситоцина,… рибозимов и антисмысловых олигонуклеотидов…

№2005133427/15 от 2004.03.31. БЕЗВОДНЫЕ ОДНОФАЗНЫЕ НОСИТЕЛИ И ПРЕПАРАТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ТАКИХ НОСИТЕЛЕЙ. АЛЗА КОРПОРЕЙШН (US). ФЕРЕЙРА Пимела (US) и др…. Наряду с одним или более чем одним неионогенным поверхностно-активным веществом; при этом указанная композиция образует in situ эмульсию типа масло-в-воде при контакте с водными средами, такими как желудочно-кишечные жидкости… Полученная композиция обладает высокой биодоступностью активного начала и превосходными самоэмульгирующими свойствами, без дополнительного добавления масляного компонента и в присутствии только небольших количеств поверхностно-активного вещества.

№2005121571 от 2003.12.15. ВЫСОКОСПЕЦИФИЧЕСКАЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВАЯ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ ЛЕКАРСТВЕННАЯ СИСТЕМА, СИНТЕЗ ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА И СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА. УОЛКЕР КЭНСЕР РИСЕРЧ ИНСТИТЬЮТ, ИНК. (US). УОЛКЕР Эван Харрис (US) и др. Комбинация, характеризующаяся биологически инертным протолекарством и биологически инертным активационным лекарственным средством, где протолекарство представляет собой дифференциально концентрирующий фрагмент, токсический фрагмент и покрывающий фрагмент, связанные вместе таким образом, чтобы само протолекарство было, по существу, инертным… Способ избирательной доставки цитотоксического соединения к опухолевой ткани, характеризующийся использованием протолекарства… и активирующего количества фтористой соли как активационного лекарственного средства для получения фармацевтической композиции, где протолекарство доставляет цитотоксическое соединение к опухолевой ткани таким образом, чтобы предотвратить значительное повреждение нормальных тканей путем сохранения покрывающего фрагмента на протолекарстве до тех пор, пока протолекарство не сконцентрируется дифференциально в опухолевой ткани в течение периода отсрочки, и после такого периода отсрочки протолекарство продуцирует цитотоксическое соединение при воздействии фтористой соли.

№2004109228/15 от 2002.08.30. СОЕДИНЕНИЕ. ПКИ БИОТЕК АС (NO). РИМИНГТОН К. и др. Фотосенсибилизирующий агент, который содержит сульфированный мезотетрафенилхлорин или его фармацевтически приемлемую соль. Способ введения доставляемой молекулы в цитозоль клетки… Фармацевтическая композиция…, в которой доставляемую молекулу выбирают из группы, включающей органические соединения, белки, фрагменты белков и нуклеиновые кислоты… Применение фотосенсибилизирующего агента… и доставляемой молекулы, которую выбирают из группы, включающей ген, кодирующий терапевтический белок, десенсибилизирующую молекулу ДНК или РНК… триплекс-образующий олигонуклеотид, пептид нуклеиновой кислоты, фактор транскрипции ДНК-"ловушки" и химерный олигонуклеотид, для получения лекарства для использования в методе генной терапии, в частности в методе лечения рака…

Хотя вышеперечисленные способы позволяют в целом улучшить доставку антибиотиков и других лекарственных соединений к опухолевым клеткам, но они обладают некоторыми общими недостатками: а) сложностью и трудоемкостью приготовления комплексов; б) преобладанием в комплексах не природных биологических веществ, а синтетической «химии», чуждой организму человека; в) слипанием частиц друг с другом, ведущим к снижению активности и повышению риска закупорки мелких кровеносных капилляров; г) налипанием комплексов на стенки кровеносных сосудов и капилляров, ведущим к снижению эффективности и к появлению неспецифической токсичности; д) плохим проникновением комплексов в опухолевые клетки; е) плохим проникновением комплексов в клеточное ядро; ж) низким сродством комплексов к ядерной ДНК; з) слишком медленным высвобождением антибиотика из комплекса.

Наиболее близким аналогом (прототипом) может являться способ, описанный в патенте №2004122919 от 2002.12.27. ТОНКОИЗМЕЛЬЧЕННОЕ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЕ ИЛИ НУТРИЦЕВТИЧЕСКОЕ ПОРОШКООБРАЗНОЕ СРЕДСТВО С НЕМЕДЛЕННЫМ ВЫСВОБОЖДЕНИЕМ. БЕЗЕНС ИНТЕРНЭШНЛ БЕЛЬЖИК (BE) и ГАЛЕНИКС ИННОВАСЬОН (FR). БЕСС Жером (FR) и БЕСС Лоранс (FR). Фармацевтическое или нутрицевтическое тонкоизмельченное порошкообразное средство с немедленным высвобождением, имеющее размер частиц не более 100 мкм и включающее сочетание, по меньшей мере, одного активного вещества, по меньшей мере, одного смачивающего средства и, по меньшей мере, одного наполнителя… Порошкообразное средство…, характеризующееся тем, что оно имеет размер частиц не более 10 мкм… Порошкообразное средство…, в котором активное вещество является, по меньшей мере, одним членом, выбранным из группы, включающей… никотин…, кофеин…

Удачным решением в данном способе является: а) применение относительно небольших частиц размерами до 10-100 микрон, что повышает эффективность действия активного вещества, б) трехкомпонентность частиц, где один компонент является активным веществом, второй - смачивающим адгезивным веществом, а третий - наполнителем; в) использование в составе частиц кофеина, который не только обеспечивает удержание лекарственного вещества в крови, но и его легкое высвобождение в опухолевые клетки.

Недостатками данного способа являются:

1. Недостаточно маленький размер частиц. Как известно, диаметр капилляров, по которым эритроциты проходят к тканям, составляет порядка 10 микрон. Поэтому жесткие частицы такого размера могут повреждать капилляры и даже закупоривать их.

2. Порошкообразные частицы склонны к слипанию. Это может снижать эффективность активного вещества, а также увеличивать риск закупорки капилляров.

3. Активное вещество не защищено плотной молекулярной «оболочкой», вследствие чего происходит слишком быстрое, немедленное, высвобождение активного вещества. В результате лекарство мало достигает опухолевых клеток, в значительной степени «размазываясь» по кровеносным капиллярам.

В отличие от указанного прототипа и вышеописанных аналогов, предлагаемый в настоящем изобретении способ позволяет устранить перечисленные недостатки и получить гораздо более эффективное средство доставки гетероциклических антибиотиков к ядерной ДНК раковых клеток. Действительно, данный способ:

A) Не сложен и не трудоемок; для приготовления фармакосомных нанокомплексов хватает элементарных лабораторных принадлежностей (шприц, игла, магнитная мешалка, спирт, вода) и трех вполне доступных компонентов, для приготовления фармакосом из которых достаточно 5 минут.

Б) Фармакосомные наночастицы состоят из природных веществ, не чуждых организму человека.

B) Фармакосомы не слипаются друг с другом и не налипают на стенки кровеносных сосудов и капилляров.

Г) Антибиотик защищен снаружи олигонуклеотидной шпилькой и пуриновым кластером.

Д) Частицы имеют чрезвычайно малый размер - до 100 нм, что позволяет повысить эффективность действия, а также надежно уйти от риска закупорки капилляров.

Е) Нанокомплексы хорошо проникают через плазматическую и ядерную мембраны клетки.

Ж) Нанокомплексы имеют высокое сродство к ядерной ДНК.

3) Антибиотик начинает высвобождаться из нанокомплекса только после проникновения в клетку; время перераспределения к ДНК составляет порядка 1 мин.

Способ реализуется следующим образом. Приготавливают отдельные концентрированные спиртовые растворы гетероциклического антибиотика, одноцепочечного олигонуклеотида и пурина. Затем растворы смешивают в некотором соотношении, не слишком сильно отличающимся от эквимолярного. После этого осуществляют быстрое впрыскивание малого объема полученного раствора через тонкую иглу в быстро перемешивающийся большой объем водного раствора, содержащего для поддержания ионной силы хлорид натрия. В результате спонтанно образуются одиночные не слипающиеся нанокомплексы - фармакосомы - размерами от 1 до 100 нанометров, которые способны доставлять антибиотик к ДНК делящихся опухолевых клеток. Фармакосомы принимаются пациентом перорально или вводятся ему внутривенно.

Пример

1. Приготовить спиртовой раствор актиномицина Д в концентрации 1 мг/мл.

2. Приготовить спиртовой раствор шпилечного олигонуклеотида HP1 в концентрации 5 мг/мл.

3. Приготовить спиртовой раствор кофеина в концентрации 2 мг/мл.

4. Смешать растворы в соотношении 1:1:1.

5. Набрать полученный раствор в шприц.

6. Приготовить 20-кратно больший объем водного раствора, содержащего 150 мМ хлористого натрия.

7. Подвергнуть этот водный раствор интенсивному перемешиванию на магнитной мешалке.

8. Быстро, под давлением, впрыснуть раствор из шприца в быстро перемешивающийся водный раствор.

9. Образовавшиеся фармакосомы, характеризующиеся появлением релеевского светорассеяния в виде опалесценции, хранить на холоду (при 6°С - до 3 месяцев) и вводить пациенту внутривенно или перорально.

Таблица
Быстрая и медленная компоненты связывания 7ААМД и АМД с НР1 и ДНК
	t1 (с)	t2 (с)	a2/a1
7ААМД + НР1	0,29	-	-
7ААМД/НР1 + АМД	0,31	-	-
7ААМД + ДНК	4,6	40	0,3
7ААМД/НР1 + ДНК	4,5	101	1,7
7ААМД/НР1 + NaCl + ДНК	4,9	147	3,5
Примечание: Концентрация 7ААМД - 1 µM, HP1 - 2,4 µМ (0,021 мг/мл), ДНК - 0,014 мг/мл, NaCl - 50 мМ. Буфер - 20 мМ трис-HCl с 1 мМ ЭДТА (pH 7,5). Возбуждение 570 нм, эмиссия 610 нм. В ряде опытов «stopped-flow» концентрация 7ААМД была 2 µM, HP1 - 10 µM, АМД - 10 µM; возбуждение 550 нм, эмиссия >570 нм.

Claims

Способ эффективной доставки к опухолевым клеткам гетероциклического антибиотика с помощью малых частиц, содержащих кофеин, отличающийся тем, что способ включает в себя первоначальное смешивание концентрированных спиртовых растворов антибиотика, одноцепочечного олигонуклеотида и пурина в соотношениях близких к эквимолярным, и последующее быстрое впрыскивание полученного раствора через тонкую иглу в быстро перемешивающийся большой объем водного раствора, содержащего хлорид натрия, с образованием одиночных не слипающихся нанокомплексов - фармакосом - с очень малыми размерами, от 1 до 100 нм, обеспечивающими защиту антибиотика от сорбции на стенках кровеносных капилляров и при этом увеличивающими его проникновение в опухолевые клетки и их ядерную ДНК.