RU2359689C2

RU2359689C2 - Способы и композиции для лечения ожирения, инсулинзависимых заболеваний и гиперхолестеринемии

Info

Publication number: RU2359689C2
Application number: RU2007101492/15A
Authority: RU
Inventors: Муралидхаран Дж. НАИР (US); Муралидхаран Дж. НАИР; Болледдула ДЖАЙАПРАКАСАМ (US); Болледдула ДЖАЙАПРАКАСАМ; Лоренс К. ОСЛОН (US); Лоренс К. ОСЛОН; Роберт Е. ШУТЦКИ (US); Роберт Е. ШУТЦКИ
Original assignee: Мичиган Стэйт Юниверсити
Priority date: 2004-07-29
Filing date: 2005-07-25
Publication date: 2009-06-27
Also published as: WO2006031293A3; AU2005285463B2; US20060025354A1; US7772195B2; RU2007101492A; MX2007000679A; JP2008508284A; AU2005285463A1; WO2006031293A2; US20110003762A1; US8198249B2; US20120283203A1; CA2573539A1; NZ552395A; EP1771188A4; WO2006031293A8; BRPI0513840A; EP1771188A2

Abstract

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к композициям для лечения ожирения и резистентности к инсулину при регуляции уровней глюкозы в крови. Способ лечения ожирения и резистентности к инсулину при регуляции уровней глюкозы в крови, включающий введение терапевтически эффективного количества композиции, содержащей соединение, выбираемое из группы, включающей антоцианин, антоцианидин и их смеси, для лечения резистентности к инсулину при регуляции уровней глюкозы и лечения ожирения у пациента. Способ лечения ожирения у людей, страдающих диабетом, ожирением и резистентностью к инсулину при регуляции уровней глюкозы в крови и принимающих лекарственный препарат для лечения диабета, который включает введение терапевтически эффективного количества композиции, содержащей соединение, выбираемое из группы, включающей антоцианин, антоцианидин и их смеси в сочетании с принимаемым лекарственным препаратом для регуляции уровней глюкозы и лечения людей, страдающих диабетом. Способ лечения ожирения и резистентности к инсулину при регуляции уровней глюкозы в крови и лечения гипергликемии, включающий введение терапевтически эффективного количества композиции, содержащей соединение, выбираемое из группы, включающей антоцианин, антоцианидин и их смеси, для лечения ожирения, резистентности к инсулину и гипергликемии. Способ лечения ожирения, резистентности к инсулину при регуляции уровней глюкозы в крови и липидных нарушений, включающий введение терапевтически эффективного количества композиции, содержащей соединение, представляющее собой антоцианин, антоцианидин или их смеси, для лечения ожирения, резистентности к инсулину и липидных нарушений. Способ лечения ожирения, резистентности к инсулину при регуляции уровней глюкозы в крови и гиперхолестеринемии, включающий введение терапевтически эффективного количества композиции, содержащей соединение, представляющее собой антоцианин, антоцианидин или их смеси, для лечения ожирения, резистентности к инсулину при регуляции уровней глюкозы в крови, гиперхолистеринемии. Способ лечения ожирения, резистентности к инсулину при регуляции уровней глюкозы в крови и атеросклероза, включающий введение терапевтически эффективного количества композиции, содержащей соединение, выбираемое из группы, включающей антоцианин, антоцианидин или их смеси, для лечения ожирения, резистентности к инсулину при регуляции уровней глюкозы в крови и атеросклероза. Вышеописанные способы лечения ожирения, резистентности к инсулину при регуляции уровней глюкозы в крови, липидных нарушений, гиперхолестеринемии, атеросклероза являются эффективными. 6 н. и 10 з.п. ф-лы, 9 ил.

Description

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно предварительной патентной заявке США No. 60/591806 от 29 июля 2000 г.

ГОСУДАРСТВЕННЫЕ ПРАВА

[0002] Настоящее изобретение было финансировано грантом USDA No. 2003-35504-13618. Правительство США имеет определенные права на это изобретение.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

(1) ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0003] Настоящее изобретение относится к лечению инсулинозависимых заболеваний, ожирения, сахарного диабета, гипергликемии, липоидных нарушений, гиперлипедемии или низкого показателя липопротеида высокой плотности (ЛВП, HDL), гиперхолестеринемии, гиперглициридемии, дислипедимии и атеросклероза. В частности, настоящее изобретение относится к способу применения антоцианинов, антоцианидинов, урсоловой кислоты и бетулиновой кислоты. В частности, настоящее изобретение относится к экстрактам плодов Cornus spp. (вид кизила), а также к другим плодам, содержащим указанные соединения, таким как вишня и ягоды, или их смесям, применяемым с целью усиления выработки инсулина клетками in vivo. В частности, настоящее изобретение также относится к композициям, применяемым согласно указанному способу, с целью усиления выработки инсулина in vivo при лечении связанных с выработкой инсулина заболеваний. В частности, настоящее изобретение также относится к композициям, применяемым для предотвращения развития ожирения и снижения холестерина и массы тела.

(2) УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0004] Функция инсулина состоит в поддержании нормальных уровней глюкозы в крови либо за счет подавления выработки глюкозы печенью, либо за счет стимуляции потребления глюкозы и ее метаболизма (Ross, S.A.; Gulve, E.А.; Wang, M. Chemistry and Biochemistry of diabetes. Chem. Rev. 2004, 104, 1255-1282). Недостаточная выработка инсулина или отсутствие воздействия инсулина на целевые ткани вызывает нарушение метаболизма глюкозы и липидного метаболизма. Это приводит к повышению уровня глюкозы в крови, что является признаком диабета (Jovanovic, L; Gondos, В. Type-2 diabetes: The epidemic of new millennium. Ann. Clin. Lab. Sci. 1999, 29, 33-42). Существуют два типа диабета: диабет I типа (инсулинозависимый диабет), диабет II типа (неинсулинозависимый диабет). Диабет I типа возникает из-за аутоиммунной деструкции или ингибирования β-клеток поджелудочной железы, клеток, вырабатывающих инсулин, что приводит к инсулиновой недостаточности. Диабет II типа имеет большее распространение и вызывается неспособностью β-клеток выделять количества инсулина, достаточные для преодоления резистентности к инсулину, вызванной генетическими факторами или воздействием окружающей среды (Henquin, J.С. Triggering and amplifying pathways of regulation of insulin secretion by glucose. Diabetes 2000, 49, 1751-1760). Резистентность к инсулину представляет собой нарушение, при котором инсулин недостаточно стимулирует транспорт глюкозы к скелетным мускулам и жиру и недостаточно подавляет выработку глюкозы в печени. Механизм, предотвращающий выработку β-клетками количеств инсулина, достаточных для преодоления периферийной резистентности к инсулину, все еще не установлен.

[0005] Однако применение гипогликемических агентов, принимаемых перорально, которые непосредственно стимулируют высвобождение инсулина из β-клеток (например, медикаментов на основе сульфонилмочевины, описанных в патенте США No. 6852738, Jones et al., включенном в настоящее описание в качестве ссылки), показало, что у пациентов, страдающих диабетом II типа, секреция инсулина островковыми клетками может быть повышена в достаточной степени для преодоления периферийной резистентности к инсулину и нормализации уровня глюкозы в крови. Одним из недостатков применения медикаментов на основе сульфонилмочевины является то, что они не могут регулировать нормальный уровень глюкозы крови (Pfeiffer, A.F.H. Oral hypoglycemic agents: Sulfonylureas and meglitinides. In B.J.Goldstein, D.Müller-Wieland (Eds.), Text book of Type-2 Diabetes. Martin Dunitz Ltd., London, 2003, pp.77-85). Эти медикаменты также отрицательно влияют на способность β-клеток вырабатывать инсулин и вызывают увеличение массы тела (Pfeiffer, A.F.H. Oral hypoglycemic agents: Sulfonylureas and meglitinides. In B.J.Goldstein, D.Müller-Wieland (Eds.), Text book of Type-2 Diabetes. Martin Dunitz Ltd., London, 2003, pp.77-85). Следовательно, существует необходимость в пищевых составляющих, способных, наряду с традиционным лечением медикаментами, отпускаемыми только по рецепту врача, регулировать уровень глюкозы в крови или индуцировать выработку инсулина β-клетками поджелудочной железы.

[0006] Опубликованные данные указывают на то, что потребление плодов и овощей, особенно богатых полифенолами, снижает частоту заболеваемости диабетом II типа (Anderson, R.A.; Polansky, M.M., Tea Enhanced Insulin Activity. J. Agric. Food Chem. 2002, 50, 7182-7186; Anderson, R.A.; Broadhurst, C.L.; Polansky, M.M.; Schmidt, W.F.; Khan, A.; Flanagan, V.P., Schoene, N.W.; Graves, D.J. Isolation and Characterization of Polyphenol Type-A Polymers from Cinnamon with Insulin-like Biological Activity. J. Agric. Food Chem. 2004, 52, 65-70; Landrault, N.; Poucheret, P.; Azay, J.; Krosniak, M.; Gasc, F.; Jenin, C.; Cros, G., Teissedre, P. Effect of a Polyphenols-Enriched Chardonnay White Wine in Diabetic Rats. J. Agric. Food Chem. 2003, 51, 311-318). Также хорошо известно, что пищевые антиоксиданты защищают β-клетки поджелудочной железы от индуцированного глюкозой окислительного стресса. Большое количество антоцианинов находится в плодах, овощах и обработанных пищевых продуктах, таких как вино, сидр и чай. Однако об их способности снижать или предотвращать диабет известно мало.

[0007] Кроме того, антоцианины нетоксичны и, как сообщалось, обладают антиоксидантной, противовоспалительной и противораковой активностью (Wang, H., Nair, M.G., Strasburg, G.M., Chang, Y., Booren, A.M. Gray, J.I., DeWitt, D.L. (1999) Antioxidant and anti-inflammatory activities of anthocyanins and their aglycon, cyanidin, from tart cherries. J. Nat. Prod. 62, 294-296; Tall, J.M., Seeram, N.P., Zhao, C, Nair, M.G., Meyer, R.A., Raja, S.N. (2004) Tart cherry anthocyanins suppress inflammation-induced pain behavior in rat. Behav. Brain Res. 153, 181-188; Kang, S., Seeram, N.P., Nair, M.G., Bourquin, L.D. (2003) Tart cherry anthocyanins inhibit tumor development in ApcMin mice and reduce proliferation of human colon cancer cells. Cane. Lett. 194, 13-19; Zhang, Y., Vareed, S.K., and Nair, M.G. (2005) Human tumor cell growth inhibition by nontoxic anthocyanidins, the pigments in fruits and vegetables. Life Sci. 16, 1465-1472).

[0008] Способность природных биоактивных продуктов, присутствующих в овощах, плодах и травах, предотвращать и излечивать дегенеративные нарушения здоровья человека, такие как рак, диабет и сердечно-сосудистые заболевания, вызывает значительный интерес. Например, орехи, цельные зерна, плоды и овощи являются мощным источником антиоксидантов, таких как полифенолы, терпеноиды и пигменты, а действие указанных соединений давно связывали с уменьшением интенсивности симптомов некоторых заболеваний. Также известно, что фитохимические соединения, содержащиеся в чесноке, соевых бобах, капусте, имбире, лакрице и овощах семейства зонтичных, обладают противораковой активностью (Rui, H.L. (2004) Potential synergy of phytochemicals in cancer prevention: mechanism of action. J. Nutr. 134, 3479S-3485S). Также сообщали, что полифенолы, содержащиеся в чае, обладают противодиабетическими свойствами (Vanessa, С., Gary, W. (2004) A review of the health effects of green tea catechins in in-vivo animal models. J. Nutr. 134, 3431S-3440S; Mary E.W., Xiaohui, L.W., Brian, K.L., Robert K.H., Masao, N., Daryl K.G. (2002) Epigallocatechin gallate, a constituent of green tea, represses hepatic glucose production. J. Biol. Chem. 277, 34933-34940).

[0009] Соблюдение диеты с пониженным содержанием жиров, обогащенной антиоксидантами, снижает риск возникновения ожирения и резистентности к инсулину (Blakely, S.; Herbert, A.; Collins, M.; Jenkins, M.; Mitchell, G.; Grundel, E.; O′Neill, K.R.; Khachik, F. Lutein interacts with ascorbic acid more frequently than with α-tocopherol to alter biomarkers of oxidative stress in female Zucker obese rats. J. Nutr. 2003, 133, 2838-2844).

[0010] Антоцианины входят в группу полифенолов-антиоксидантов и содержатся в пище и напитках различных видов. Потребление антоцианинов связывают с пониженным риском возникновения некоторых дегенеративных заболеваний, таких как атеросклероз, сердечно-сосудистые заболевания, рак и диабет (Jayaprakasam, В.; Strasburg, G.A.; Nair, M.G. Potent lipid peroxidation inhibitors from Withania somnifera. Tetrahedron 2004, 60, 3109-3121). Эти соединения являются хорошо известными акцепторами свободных радикалов и, как сообщалось, потенциальными химиопрофилактическими агентами (Duthie, G.G.; Duthie, S.J.; Kyle, J.A.M. Plant polyphenols in cancer and heart disease: implications as nutritional antioxidants. Nutr. Res. Rev. 2000, 13, 79-106). Например, при потреблении земляники, вишни и красного вина повышается антиоксидантная способность сыворотки крови (Kang, S.Y.; Seeram, N.Р.; Nair, M.G.; Bourquin, L.D. Tart cherry anthocyanins inhibit tumor development in ApcMin mice and reduce proliferation of human colon cancer cells. Cane. Lett. 2003, 194, 13-19; Van Velden, D.P.; Mansvelt, E.P.G.; Fourie, E.; Rossouw, M.; Marais, A.D. The cardioprotective effect of wine on human blood chemistry. Ann. New York Acad. Sci. 2002, 957, 337-340; Wang, H.; Nair, M.G.; Strasburg, G.M.; Chang, Y.C; Booren, A.M.; Gray, I.J.; DeWitt, D.L. Antioxidant and anti-inflammatory - activities of anthocyanins and their aglycone, cyanidin, from tart cherries. J. Nat. Prod. 1999, 62, 294-296). Недавние исследования показали, что антоцианин, цианидин-3-глюкозид, снижает ожирение, вызванное употреблением пищи с повышенным содержанием жиров, у мышей (Espin, J.С; Soler-Rivas, С; Wichers, H.J.; Garcia-Viguera, С. Anthocyanin-based natural colorants. A new source of antiradical activity for foodstuff. J. Agri. Food Chem. 2000, 48, 1588-1592). Таким образом, природные красители, находящиеся в пище, привлекают потребителей своей безопасностью, а также пищевой и терапевтической ценностью (Millspaugh, С.F. In American Medicinal Plants; Dover Publications: New York, 1974; стр.282). Так как потребление антоцианинов достаточно распространено, исследование дополнительной биологической активности указанных соединений представляет собой огромный интерес.

[0011] Некоторые исследования показывают, что употребление пищи, обогащенной жирами и обедненной волокнистым материалом, приводит к возникновению ожирения. Ожирение приводит к изменению липидного обмена (метаболизма), что, в свою очередь, приводит к резистентности к инсулину. В этих условиях жировая ткань производит огромное количество свободных жирных кислот (СЖК). Затем СЖК ингибируют усвоение глюкозы, синтез гликогена и окисление глюкозы (Saltiel, A.R. and Kahn, С.R. (2001) Insulin signaling and the regulation of glucose and lipid metabolism. Nature 414, 799-806) и приводит к возникновению гипергликемии и диабета II типа. Диабет II типа является обычным заболеванием, частота возникновения которого постоянно растет и которым страдают приблизительно от 150 до 300 миллионов людей во всем мире; ожидается, что в течение последующих 25 лет эта цифра удвоится (King, H., Aubert, R.E., and Herman, W.H. (1998) Global burden of diabetes, 1995-2025: prevalence, numerical estimates, and projections. Diabetes Care 21, 1414-1431). В недавнее время особое внимание было уделено пище, которая может оказаться полезной для снижения накоплений жира, образуемого в результате питания, и для снижения потенциального риска возникновения диабета и сердечных заболеваний.

[0012] Усвоение пищи контролируется несколькими биохимическими процессами. В ответ на прием питательных веществ в эндокринных клетках синтезируются глюкагоноподобные пептид-1 и пептид-2 (GLP-1 и -2), которые высвобождаются в кровь. GLP-2 усиливает поглощение за счет расширения эпителия слизистой оболочки (Ahren, В. (1998) Glucagon-like peptide-1 (GLP-I): a gut hormone of potential interest in the treatment of diabetes. BioEssays 20, 642-651 and Drucker, D.J. (2002) Biological action and therapeutic potential of glucagons like peptides. Gastroenterology 122, 531-544). GLP-1 в основном вырабатывается в кишечных L-клетках; он ингибирует выработку глюкагона печенью и опорожнение желудка, что, в свою очередь, замедляет усвоение пищи и стимулирует биосинтез инсулина и его секрецию β-клетками поджелудочной железы (Ahren, В. (1998) Glucagon-like peptide-1 (GLP-I): a gut hormone of potential interest in the treatment of diabetes. BioEssays 20, 642-651 and Drucker, D.J. (2002) Biological action and therapeutic potential of glucagons like peptides. Gastroenterology 122, 531-544). Первичная функция β-клеток поджелудочной железы состоит в выработке биоактивного инсулина в ответ на появление питательных веществ, гормонов и нервных раздражителей, с целью поддержания нормальных физиологических концентраций глюкозы в организме (Rohit, N.К. (2004) The islet β-cell. The Int. J. Biochem. Cell Biol. 36, 365-371). Прогрессирующая потеря β-клетками поджелудочной железы их функций в ответ на повышенные уровни глюкозы в крови создает дефицит инсулина, который приводит к возникновению диабета II типа (Pinget, M.; Boullu-Sanchis, S. (2002) Physiological basis of insulin secretion abnormalities. Diabet. Met. 28 (6, Suppl.), 4S21-4S32). Как дефицит инсулина, так и резистентность к инсулину приводят к возникновению проблем со здоровьем, таким как гиперлипидемия, атеросклероз и повышенное давление (Saltiel, A.R.; Kahn, С.R. (2001) Insulin signaling and the regulation of glucose and lipid metabolism. Nature 414, 799-806), и они часто взаимосвязаны с нарушениями углеводного и липидного обмена (Brosche, Т. (2001) Plasmalogen levels in serum from patients with impaired carbohydrate or lipid metabolism and in elderly subjects with normal metabolic values. Arch. Gerontol. Geriatrics 32, 283-294). Взаимодействие указанных систем контроля происходит в соответствии со сложной схемой, и любое изменение генетических факторов, окружающей среды или социальных условий может вызывать ожирение и диабет (Ross, S.A., Gulve, E.A., Wang, M. (2004) Chemistry and biochemistry of type 2 diabetes. Chem. Rev. 104, 1255-1282). Однако развитие некоторых осложнений, возникающих из-за воздействия социальных факторов и окружающей среды, может быть задержано или вовсе устранено при помощи физических нагрузок и правильного питания (Christian, К.R., Barnard, R.J. (2005) Effects of exercise and diet on chronic disease. J. Appl. Physiol. 98, 3-30). Эпидемиологические исследования показали, что питание, обогащенное плодами и овощами, снижает заболеваемость раком, сердечно-сосудистыми заболеваниями, диабетом, катарактой и воспалительными заболеваниями (World Cancer Research Fund/American Institute for Cancer Research (1997) Food, nutrition and the prevention of cancer: A global perspective 1997, American Institute for Cancer Research Washington, DC; U.S. Department of Agriculture, U.S. Department of Health and Human Services (1995) Nutrition and Your Health: Dietary Guidelines for Americans 1995, U.S. Government Printing Office Washington, DC; American Heart Association (1996) Dietary guidelines for healthy American adults: A statement for health professionals from the nutrition committee, American Heart Association. Circulation 94, 1795-1800; American Cancer Society (1996) Guidelines on diet, nutrition, and cancer prevention: reducing the risk of cancer with healthy food choices and physical activity. Cancer J. Clin. 46, 325-341; World Health Organization (1990) Diet, Nutrition and the prevention of chronic diseases: Report of a WHO study group, Technical Report Series 797, WHO Geneva, Switzerland; Willett, W.C. (1999) Goals for nutrition in the year 2000. Cancer J. Clin. 49, 331-352 and Willett, W.C. (1998) Nutritional Epidemiology 1998, Press: Oxford University, New York, NY, USA).

[0013] В последнее время все возрастающий интерес вызывают природные гипогликемические соединения, полученные из растений, плодов и овощей, которые обычно считают безопасными (generally regarded as safe - GRAS), поскольку они, как полагают, являются менее токсичными и обладают меньшим количеством побочных эффектов. Эти биоактивные соединения, присутствующие в пище, могут изменять экспрессию генов и клеточные реакции (Milner, J. А. (2004) Molecular targets for bioactive food components. J. Nutr. 134, 2492S-2498S), что приводит к модификации белков и их функций. Несмотря на то, что результаты нескольких исследований позволяют предположить, что фитохимические соединения, присутствующие в плодах и овощах, полезны для снижения риска возникновения ухудшения здоровья, их защитные воздействия не были систематически изучены.

[0014] Плоды кизила применяют в составе традиционных китайских медикаментов, отпускаемых по рецепту, таких как "Hachimi-Gan" (Yamahara, J.; Mibu, H.; Sawada, Т.; Fujimura, H.; Takino, S.; Yoshikawa, M.; Kitagawa, I. Biologically active principles of crude drugs. Anti-diabetic principles of corni fructus in experimental diabetes induced by streptozotocin. Yakugaku Zasshi 1981, 101, 86-90). Ранее мы опубликовали количественный анализ антоцианинов в плодах кизила (Cornus spp.) (Seeram, N.Р.; Schutzki, R.; Chandra, A.; Nair, M.G. Characterization, Quantification, and Bioactivities of Anthocyanins in Cornus Species. J. Agri. Food Chem. 2002, 50, 2519-2523).

[0015] Плоды кизила являются богатым источником антоцианинов. Плоды кизила мужского (Cornus mas L.), также известные под названием европейского и азиатского кизила настоящего (Cornelian cherry), в Европе используют для приготовления напитков (Kirn, D.К.; Kwak, J.H. A Furan derivative from Cornus officinalis. Arch. Pharm. Res. 1998, 21, 787-789). В традиционной медицине известно анальгетическое и диуретическое действие плодов кизила лекарственного (Cornus officinalis) (Yamahara, J.; Mibu, H.; Sawada, Т.; Fujimura, H.; Takino, S.; Yoshikawa, M.; Kitagawa, I. Biologically active principles of crude drugs. Anti-diabetic principles of corni fructus in experimental diabetes induced by streptozotocin. Yakugaku Zasshi 1981, 101, 86-90). В азиатских странах плоды кизила также являются одним из главных составляющих нескольких противодиабетических растительных препаратов (Seeram, N.Р.; Schutzki, R.; Chandra, A.; Nair, M.G. Characterization, Quantification, and Bioactivities of Anthocyanins in Cornus Species. J. Agri. Food Chem. 2002, 50, 2519-2523). Более ранние исследования плодов кизила мужского и кизила лекарствнного показали, что в обоих видах содержатся высокие концентрации антоцианинов (Beckwith, A.G.; Zhang, Y.; Seeram, N.Р.; Cameron, А.С; Nair, M.G. Relationship of Light Quantity and Anthocyanin Production in Pennisetum setaceum Cvs. Rubrum and Red Riding Hood. J. Agric. Food Chem. 2004, 52, 456-461).

[0016] Плоды растения кизила мужского похожи на плоды кислой вишни (Р.cerasus). Он принадлежит к семейству кизиловых (Cornaceae) и является лиственным деревом, произрастающим в Европе и Восточной Азии (Millspaugh, С.F. American Medicinal Plants; Dover Publications: New York, 1974; стр.282). В Турции плоды растений этого вида применяли для получения некоторых отваров. Более ранние исследования показали, что спиртовой экстракт кизила лекарственного увеличивает экспрессию GLUT 4 mRNA, переносчика глюкозы 4 матричной РНК, у крыс, страдающих неинсулинозависимым сахарным диабетом (non-insulin dependent diabetes mellitus (NIDDM)) (Qian, D., Zhu, Y., and Zhu, Q. (2001) Effect of alcohol extract of Cornus officinalis Sieb. et Zucc on GLUT4 expression in skeletal muscle in type 2 (non-insulin-dependent) diabetes mellitus rats. Zhongguo Zhongyao Zazhi 26, 859-862). Плоды кизила также хорошо известны в китайской медицине, и в Китае эти плоды также использовали для лечения диабета. Однако активные соединения, проявляющие противодиабетическую активность, так и не были охарактеризованы. Более ранние исследования плодов некоторых Cornus spp., выращенных в Мичигане, показали, что кизил мужской содержит большие количества антоцианинов (Seeram, N.Р., Schutzki, R., Chandra, A., and Nair, M. G. (2002) Characterization, quantification, and bioactivities of anthocyanins in Cornus species. J. Agric. Food Chem. 50, 2519-2523).

ЦЕЛИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0017] Целью настоящего изобретения является предоставление композиций и способов, пригодных для лечения нарушений, связанных с выработкой инсулина, высокой концентрацией холестерина и большой массой тела. В частности, целью настоящего изобретения является предоставление способа и композиций для повышения выработки инсулина in vivo. Другие цели настоящего изобретения будут пояснены последующим описанием и чертежами.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0018] Настоящее изобретение относится к способу контролирования ожирения у млекопитающего пациента, который нуждается в таком лечении, который включает введение пациенту терапевтически эффективного количества композиции, включающей соединение, выбираемое из группы, состоящей из антоцианина, антоцианидина, урсоловой кислоты, бетулиновой кислоты или их смесей. В частности, настоящее изобретение относится к добавкам из плодов кизила и других плодов, которые по существу не содержат кислот и сахаров, обычно присутствующих в плодах.

[0019] Настоящее изобретение также относится к способу лечения ожирения у людей, страдающих диабетом и принимающих медикамент для лечения диабета, отпускаемый по рецепту, который включает введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества композиции, включающей соединение, выбираемое из группы, состоящей из антоцианина, антоцианидина, урсоловой кислоты, бетулиновой кислоты или их смесей в сочетании с медикаментом, отпускаемым по рецепту. Предпочтительно указанная композиция представляет собой добавку или фармацевтический состав.

[0020] Предпочтительно антоцианин, антоцианидин, урсоловую кислоту или бетулиновую кислоту выделяют из плодов, овощей или цветов. Предпочтительно антоцианин выбирают из группы, состоящей из цианидин-3-гликозида, делфинидин-3-гликозида, пеларгонидин-3-гликозида или их смесей. «Гликозид» представляет собой любое соединение, которое содержит молекулу углевода (сахара), в частности любой такой натуральный продукт, содержащийся в растениях, который при помощи гидролитического расщепления может быть превращен в сахар и несахарный компонент (агликон), и специально названный в соответствии с содержащимся в нем сахаром, например, гликозидом (глюкоза), пентозидом (пентоза), фруктозидом (фруктоза) и т.д. Предпочтительно, антоцианин, урсоловую кислоту или бетулиновую кислоту извлекают из кизила мужского. Предпочтительно антоцианидин или антоцианин, урсоловую кислоту, бетулиновую кислоту или их смеси выделяют и очищают.

[0021] Настоящее изобретение также относится к способу лечения сахарного диабета у млекопитающего пациента, который нуждается в таком лечении, с целью контролирования сахарного диабета, который включает введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества композиции, включающей соединение, выбираемое из группы, состоящей из антоцианина, антоцианидина, урсоловой кислоты, бетулиновой кислоты или их смесей.

[0022] Предпочтительно антоцианин, урсоловую кислоту или бетулиновую кислоту выделяют из плодов, овощей или цветов. Предпочтительно антоцианин выбирают из группы, состоящей из цианидин-3-гликозида, делфинидин-3-гликозида, пеларгонидин-3-гликозида или их смесей. Предпочтительно антоцианин, урсоловую кислоту или бетулиновую кислоту извлекают из плодов кизила мужского. Однако антоцианины могут быть выделены из других плодов, таких как плоды вишни и ягоды.

[0023] Настоящее изобретение также относится к способу лечения или контролирования гипергликемии у млекопитающего пациента, который нуждается в таком лечении, который включает введение терапевтически эффективного количества композиции, включающей соединение, выбираемое из группы, состоящей из антоцианина, урсоловой кислоты, бетулиновой кислоты или их смесей, применяемой, в частности, в виде добавки.

[0024] Предпочтительно антоцианин, антоцианидин, урсоловую кислоту или бетулиновую кислоту извлекают из плодов, овощей или цветов. Предпочтительно антоцианин выбирают из группы, состоящей из цианидин-3-гликозида, делфинидин-3-гликозида, пеларгонидин-3-гликозида или их смесей. Предпочтительно антоцианин, урсоловую кислоту или бетулиновую кислоту извлекают из кизила мужского. Предпочтительно антоцианин, антоцианидин, урсоловую кислоту, бетулиновую кислоту или их смеси выделяют и очищают.

[0025] Настоящее изобретение также относится к композиции, применяемой для лечения таких заболеваний, как ожирение, диабет или гипергликемия, включающей антоцианин, антоцианидин, урсоловую кислоту, бетулиновую кислоту или их смеси в виде стандартной суточной лекарственной формы для лечения заболевания в течение некоторого периода времени, и фармацевтический носитель.

[0026] Наиболее предпочтительно антоцианин выбирают из группы, состоящей из цианидин-3-гликозида, делфинидин-3-гликозида, пеларгонидин-3-гликозида или их смесей. Предпочтительно антоцианин, антоцианидин, урсоловую кислоту или бетулиновую кислоту выделяют из плодов, овощей или цветов. Предпочтительно антоцианин, урсоловую кислоту или бетулиновую кислоту извлекают из кизила мужского.

[0027] Настоящее изобретение также относится к способу лечения или контролирования липидных нарушений, гиперлипидемии или низкого показателя ЛВП у млекопитающего пациента, который нуждается в таком лечении, включающему введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества композиции, содержащей соединение, выбираемое из группы, состоящей из антоцианина, антоцианидина, урсоловой кислоты, бетулиновой кислоты или их смесей, применяемой, в частности, в виде добавки.

[0028] Настоящее изобретение также относится к способу лечения или контролирования гиперхолестеринемии у млекопитающего пациента, который нуждается в таком лечении, включающему введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества композиции, содержащей соединение, выбираемое из группы, состоящей из выделенных антоцианина, антоцианидина, урсоловой кислоты, бетулиновой кислоты или их смесей, применяемой, в частности, в виде добавки.

[0029] Настоящее изобретение также относится к способу лечения или контролирования гиперглициридемии у млекопитающего пациента, который нуждается в таком лечении, включающему введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества композиции, включающей соединение, выбираемое из группы, состоящей из выделенных антоцианина, антоцианидина, урсоловой кислоты, бетулиновой кислоты или их смесей, применяемой, в частности, в виде добавки.

[0030] Настоящее изобретение также относится к способу лечения или контролирования дислипедимии и/или низкого ЛВП холестерина у млекопитающего пациента, который нуждается в таком лечении, включающему введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества композиции, включающей соединение, выбираемое из группы, состоящей из выделенного антоцианина, антоцианидина, урсоловой кислоты, бетулиновой кислоты или их смесей, применяемой, в частности, в виде добавки.

[0031] Настоящее изобретение также относится к способу лечения атеросклероза у млекопитающего пациента, который нуждается в таком лечении, включающему введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества композиции, включающей соединение, выбираемое из группы, состоящей из выделенных антоцианина, антоцианидина, урсоловой кислоты, бетулиновой кислоты или их смесей, применяемой, в частности, в виде добавки.

[0032] Наиболее предпочтительно, соединение выделяют из кизила мужского. Предпочтительно антоцианин, антоцианидин, урсоловую кислоту, бетулиновую кислоту или их смеси извлекают из плодов указанного растения или других плодов и очищают.

[0033] Терапевтически активные метаболиты соединений, предлагаемых согласно настоящему изобретению, также попадают в область, защищаемую настоящим изобретением, как и заявляемые исходные соединения. Пролекарства, которые представляют собой соединения, превращаемые в заявляемые соединения в том виде, в котором их вводят пациенту или после того, как они были введены пациенту, также попадают в область, защищаемую настоящим изобретением, как и заявляемые активные соединения.

СПОСОБЫ ВВЕДЕНИЯ И ИНТЕРВАЛ ДОЗ

[0034] Для обеспечения млекопитающего, в частности человека, эффективной дозой соединения, предлагаемого согласно настоящему изобретению, может быть применен любой подходящий для этого способ введения. Например, может быть применен пероральный, перректальный, топический, парентеральный, глазной, пульмональный, назальный и подобные им способы введения. Лекарственные формы включают таблетки, драже, дисперсии, суспензии, растворы, капсулы, кремы, мази, аэрозоли и подобные им формы. Предпочтительно соединения вводят перорально.

[0035] Эффективную дозу применяемого активного ингредиента можно варьировать в зависимости от конкретного применяемого соединения, способа введения, состояния пациента и тяжести состояния пациента, которого подвергают лечению. Указанная доза может быть легко определена специалистом в данной области техники.

[0036] При лечении или предотвращении ожирения, сахарного диабета и/или гипергликемии или гипертриглицеридимии или других заболеваний, в общем удовлетворительные результаты были получены, если суточная доза вводимого соединения, предлагаемого в соответствии с настоящим изобретением, составляла от приблизительно 0.1 миллиграмма до 100 миллиграммов на килограмм живой массы; предпочтительно соединение вводят в виде единичной суточной дозы или отдельных доз, принимаемых от двух до шести раз в сутки, или в виде лекарственной формы с замедленным высвобождением.

Для большинства крупных млекопитающих полная суточная доза составляет приблизительно от 1.0 миллиграмма до 1000 миллиграммов, предпочтительно от 1 миллиграмма до 50 миллиграммов. В случае взрослого человека с массой тела 70 кг полная суточная доза составляет приблизительно от 7 миллиграммов до 350 миллиграммов. Указанная схема приема может быть изменена с целью получения оптимальной терапевтической реакции.

[0037] В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложены фармацевтические композиции и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтические композиции, предлагаемые согласно настоящему изобретению, включают в качестве активного ингредиента заявляемые соединения или их фармацевтически приемлемые соли или пролекарства, а также фармацевтически приемлемый носитель и, возможно, другие терапевтические ингредиенты. Термин «фармацевтически приемлемые соли» относится к солям, приготовленным из фармацевтически приемлемых нетоксичных оснований или кислот, включающих неорганические основания или кислоты и органические основания или кислоты.

[0038] Указанные композиции включают композиции, пригодные для перорального, перректального, топического, парентерального (включая подкожное, внутримышечное и внутривенное введение) глазного (офтальмологического введения), пульмонального (назальной или внутриротовой ингаляции) или назального введения; однако наиболее подходящий способ в каждом случае зависит от природы и тяжести состояния пациента, подвергаемого лечению, и от природы активного ингредиента. Композиции могут быть подходящим образом представлены в виде стандартных лекарственных форм и приготовлены любым способом, известным в области фармакологии.

[0039] На практике соединения, применяемые в качестве активного ингредиента, могут быть смешаны с фармацевтическим носителем до однородной смеси в соответствии с традиционными методиками составления фармацевтических композиций. Носитель может принимать разнообразные формы, в зависимости от формы препарата, требуемой для введения, например, пероральной или парентеральной (включая внутривенную). При приготовлении композиций для пероральных лекарственных форм может быть применена любая из обычных фармацевтических сред, например вода, гликоли, масла, спирты, вкусовые вещества, консерванты, красители и подобные им вещества могут быть применены в случае жидких препаратов для перорального введения; например, суспензии, эликсиры и растворы или носители, такие как крахмалы, сахара, микрокристаллическая целлюлоза, разбавители, гранулирующие агенты, скользящие вещества, связующие вещества, дезинтегрирующие агенты и подобные им вещества могут быть применены в случае твердых пероральных препаратов, таких как, например, порошки, твердые и мягкие капсулы и таблетки; при этом твердые пероральные препараты предпочтительнее, чем жидкие пероральные препараты.

[0040] По способу введения таблетки и капсулы представляют собой наиболее удобную пероральную стандартную лекарственную форму, в которой, как очевидно, применяют твердые фармацевтические носители. При необходимости на таблетки при помощи стандартных водных и неводных методик может быть нанесено покрытие. Такие композиции и препараты должны содержать по меньшей мере 0.1% активного соединения. Разумеется, процентное содержание активного соединения в указанных композициях может быть изменено; удобно, если оно составляет приблизительно от 2 до 60 мас.% от стандартной формы. Количество активного соединения в таких терапевтически применимых композициях таково, что оно составляет эффективную дозу. Активные соединения также могут быть введены интраназальным способом, например, в виде жидких капель или спрея.

[0041] Таблетки, пилюли, капсулы и подобные им формы также могут содержать связывающее вещество, такое как трагакантовая камедь, гуммиарабик, кукурузный крахмал или желатин; наполнители, такие как дикальция фосфат; дезинтегрирующие агенты, такие как кукурузный крахмал, картофельный крахмал, альгиновая кислота; скользящее вещество, такое как стеарат магния; и подсластитель, такой как мальтодекстрин, лактоза или сахарин. В случае, если стандартная лекарственная форма представляет собой капсулу, то кроме материалов вышеуказанного типа она может содержать жидкий носитель, такой как жирное масло.

[0042] В качестве покрытий или для модификации физической формы стандартной лекарственной формы могут быть применены и другие различные материалы. Например, таблетки могут быть покрыты шеллаком, сахаром или и тем и другим. Кроме активного ингредиента сироп или эликсир может содержать в качестве подсластителя сахарозу, в качестве консервантов - метил- и пропилпарабены, краситель и вкусовую добавку, такую как вишневая или апельсиновая вкусовая добавка.

[0043] Соединения также могут быть введены парентерально. В воде могут быть приготовлены растворы или суспензии указанных активных ингредиентов, которые могут быть подходящим образом смешаны с поверхностно-активным веществом, таким как гидроксилпропилцеллюлоза. Также могут быть приготовлены дисперсии в глицерине, жидких полиэтиленгликолях и их смесях в маслах. Для предотвращения роста микроорганизмов в обычных условиях использования и хранения эти препараты содержат консерванты.

[0044] Фармацевтические формы, пригодные для инъекционного введения, включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки, предназначенные для приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсий для немедленного приема. Во всех случаях форма должна быть стерильной и должна быть достаточно текучей для вывода жидкости из шприца. Она должна быть устойчива в условиях изготовления и хранения и должна выдерживать загрязняющее действие микроорганизмов, таких как бактерии и грибки. Носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль), подходящие смеси указанных веществ и растительные масла.

[0045] Соединения могут быть использованы в сочетании с другими медикаментами, которые могут применяться для лечения, предотвращения, подавления или снижения интенсивности симптомов заболеваний или состояний. Указанные другие медикаменты могут быть введены обычным для них способом в обычном количестве одновременно или последовательно с соединением. Если соединение применяют одновременно с одним или несколькими другими медикаментами, предпочтительно применять стандартную лекарственную форму, содержащую фармацевтическую композицию, включающую указанные другие медикаменты и соединение. Однако комбинированная терапия также включает терапии, при которых соединение Формулы I и один или несколько медикаментов вводят в соответствии с различными перекрывающимися схемами. Также следует понимать, что при использовании в сочетании с одним или несколькими другими активными ингредиентами, соединение, предлагаемое согласно настоящему изобретению, и другие активные ингредиенты могут быть использованы в меньших дозах, чем при использовании их по отдельности. Соответственно, фармацевтические композиции, предлагаемые согласно настоящему изобретению, включают композиции, которые кроме соединения содержат один или несколько других активных ингредиентов.

ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0046] На Фиг.1 представлены структуры антоцианинов 1-4 и антоцианидинов 5-9.

[0047] На Фиг.2А изображен график, показывающий количество инсулина, выделенного на миллиграмм белка при воздействии соединений 1 и 2, а на Фиг.2В - под действием соединений 5 и 6 в присутствии 4 и 10 мМ глюкозы. Конечная концентрация диметилсульфоксида (ДМСО) в лунках для анализа (assay wells) составляла 0.1%. В качестве результата брали среднее значение трех или пяти независимых экспериментов, и каждый образец анализировали дважды. Как было определено при помощи наименьшей квадратичной разности (LSD, least square difference) с использованием t-теста (проверки по критерию Стьюдента), выработка инсулина при воздействии соединений 1, 2, 5 и 6 была значительной при * (95% или p≤0.05) или ** (99% или p≤0.01).

[0048] На Фиг.3 изображен график, показывающий количество инсулина, выделенного при воздействии соединений 3, 7-9 при концентрациях глюкозы 4 и 10 мМ. Количество выделенного инсулина нормализовали на 1 миллиграмм белка. Конечная концентрация ДМСО в лунках для анализа составляла 0.1%. В качестве результата брали среднее значение трех независимых экспериментов, и каждый образец анализировали дважды. Как было определено при помощи LSD с использованием проверки по критерию Стьюдента, выработка инсулина под действием соединений 3, 7-9 имела значимость * (95% или p≤0.05).

[0049] На Фиг.4 изображен график, показывающий потребление пищи (в г) животными в течение 12-недельного исследования ожирения. Цифры представляют собой средние значения ± SEM (standard error of the mean - стандартная ошибка среднего), n=8. Потребление пищи измеряли каждый день и усредняли значение за неделю. Значительного различия между питанием с высоким содержанием жиров (HF, 60% килокалорий жира) у контрольной и испытуемой групп не было. Испытуемая группа получала питание с высоким содержанием жиров в течение 4 недель, а затем ее переводили на пищу с высоким содержанием жиров, смешанную с испытуемыми соединениями, антоцианинами (1.0 г/кг), бетулиновой и урсоловой кислотами (по 0.5 г/кг каждой). Нормальная пища содержала 10% килокалорий.

[0050] На Фиг.5А, 5В и 5С изображены графики, показывающие изменение массы тела мышей группы C57BL/6J при исследовании ожирения в течение 12 недель питания. В течение всего эксперимента питание нормальной контрольной группы мышей и питание группы с высоким содержанием жиров в пище содержали 10% и 60% ккал соответственно. Антоцианины, бетулиновую и урсоловую кислоту отдельно смешивали при питании с высоким содержанием жиров в концентрациях, соответственно, 1.0, 0.5 и 0.5 г на кг пищи. Группы, на которых испытывали воздействие указанных соединений, потребляли пищу с высоким содержанием жиров (60% ккал) в течение четырех недель, а затем их переводили на на диету с соответствующим лечением. Цифры представляют собой средние значения ± SEM, n=8.

[0051] На Фиг.6 изображен график, показывающий результаты теста толерантности к глюкозе при исследовании ожирения, проводимого в течение 90 минут после нагрузки глюкозой. Раствор глюкозы в воде (2 г глюкозы на 1 кг массы тела) вводили внутрибрюшинно и измеряли уровень глюкозы в крови спустя 0, 5, 15, 30, 60 и 90 минут. Кровь отбирали из хвостовой вены. Вертикальные штрихи представляют собой S.E. (стандартную ошибку) в каждой полученной точке, n=5.

[0052] На Фиг.7 изображен график, показывающий уровни инсулина в плазме мышей группы C57BL/6J, определенные по окончании эксперимента с питанием. Концентрации инсулина в плазме, определенные для групп с пониженным и повышенным содержанием жиров в пище, составляли 0.47±0.14 и 0.41±0.1 нг/мл соответственно. Количественное определение инсулина в плазме было выполнено при помощи радиоиммунного анализа (RIA). Каждый образец исследовали дважды и значения представляют собой средние значения ± SEM, n=8.

[0053] На Фиг.8 изображен график, показывающий уровень холестерина в плазме мышей, определенный по окончании эксперимента с питанием и представленные в мг/дл. Уровни холестерина у животных, которым вводили урсоловую кислоту, не определяли из-за недостаточного количества образца плазмы. Цифры представляют собой средние значения ± SEM, n=4 или 5.

[0054] На Фиг.9 показаны соединения, выделенные из 10-12 кизила мужского (Cornus mas L).

ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ПРИМЕРОВ РЕАЛИЗАЦИИ

[0055] В настоящем описании изложена и показана способность антоцианинов, цианидин-3-глюкозида, делфинидин-3-глюкозида, цианидин-3-галактозида и пеларгонидин-3-галактозида, а также антоцианидинов, цианидина, делфинидина, пеларгонидина, малвидина и петунидина стимулировать секрецию инсулина, вырабатываемого бета-клетками поджелудочной железы грызунов (INS-I 813/32) in vitro. Соединения испытывали в присутствии концентраций глюкозы, равных 4 и 10 мМ. Наиболее эффективными средствами, усиливающими секрецию, среди протестированных в присутствии концентраций глюкозы 4 и 10 мМ антоцианинов и антоцианидинов оказались цианидин-3-глюкозид и делфинидин-3-глюкозид. Пеларгонидин-3-галактозид является одним из основных антоцианинов, и его агликон, пеларгонидин, вызывал увеличение секреции инсулина в 1.4 раза при концентрации глюкозы, равной 4 мМ. Остальные протестированные в присутствии концентраций глюкозы, равных 4 и 10 мМ, антоцианины и антоцианидины оказывали на инсулин лишь небольшое воздействие.

ПРИМЕРЫ СТИМУЛИРОВАНИЯ ВЫРАБОТКИ ИНСУЛИНА

Материалы и способы

[0056] Химические реактивы. Эмбриональная бычья сыворотка (FBS) и среда RPMI-1640 были поставлены компанией Invitrogen (Grand Island, NY). Все использованные органические растворители имели чистоту, соответствующую ACS reagent grade. HEPES (N-2-hydroxyethyl-piperazine-N-2-ethanesulfonic acid, N-2-гидроксиэтилпиперазин-N-2-этансульфоновая кислота), пенициллин-стрептомицин, глутамин, пируват натрия, 2-меркаптоэтанол, трипсин-ЭДТА, бычий сывороточный альбумин (BSA, Bovine, Albumin; RIA Grade), реактив Folin-Ciolatues и химические реактивы, применяемые для приготовления буферных растворов, были приобретены у Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, МО). Антоцианидины, цианидин, делфинидин, пеларгонидин, малвидин и петунидин, применяемые для экспериментов, были приобретены у Chromadex (Laguna Hills, CA).

[0057] Антоцианидины. Делфинидин-3-глюкозид был получен очисткой из плодов кизила лекарственного. Цианидин-3-галактозид и пеларгонидин-3-галактозид были выделены из плодов С. mas. Чистый цианидин-3-глюкозид, применяемый в настоящем исследовании, был извлечен из нашего хранилища, где он находился при температуре -20°С.

[0058] Извлечение и очистка антоцианов. Плоды кизила смешали с водой (рН=3) и отфильтровали. Фильтрат пропустили через колонку, содержащую смолу XAD-16 AMBERLITE, и смолу с адсорбированными антоцианинами, несколько раз промыли водой. Затем смолу XAD-16 элюировали подкисленным МеОН (рН=3) и полученный раствор концентрировали под уменьшенном давлением, получая фракцию сырого антоцианина. Эту фракцию очищали на колонке при помощи MPLC (жидкостной хроматографии среднего давления (medium-pressure liquid chromatography)) (оксид кремния C₁₈) с использованием MeOH:H₂О (рН=3) в условиях градиента. Антоцианины элюировали системой растворителей МеОН:Н₂O (65:35, по объему). Чистоту соединений проверяли при помощи ВЭЖХ (Waters Corp.) с использованием аналитической колонки Capcell С₁₈ в градиентных условиях. Применяли следующие растворители: А:CF₃COOH:H₂O (99.9:0.1, по объему) и В:Н₂O:СН₃CN:CH₃СООН:CF₃СООН (50.4:48.5:1.0:0.1, по объему). Градиент составлял от 20% В до 60% В в течение 26 минут и до 20% В в течение 30 минут при скорости течения, равной 0.8 мл/мин. Пики детектировали при длине волны 520 нм с использованием детектора на основе светодиодного массива.

[0059] Исследование секреции инсулина. Клетки INS-1 832/13 (любезно предоставленные доктором Christopher Newgard, Duke University, NC) обычным образом культивировали в атмосфере 5% СО₂/воздух при 37°С в среде RPMI-1640, содержащей 11.1 мМ глюкозы с добавлением 10% FBS, 10 мМ HEPES, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 4 мМ глутамина, 1 мМ пирувата натрия и 50 мкМ 2-меркаптоэтанола. Клетки еженедельно проходили процедуру отслаивания в растворе трипсина-ЭДТА. Для исследования статической секреции клетки помещали на планшеты с 24 лунками при плотности 0.64×10⁶ клеток на лунку и периоде роста 24 часа. Затем клетки культивировали еще 24 часа в RPMI-1640, содержащем 4 мМ глюкозы и вышеуказанную добавку. Затем клетки дважды инкубировали в течение 30 минут в бикарбонатном буферном растворе Кребса-Рингера (Krebs Ringer Bicarbonate buffer (KRBB)), содержащем 4 мМ глюкозы и 0.1% BSA. Клетки быстро промывали KRBB и инкубировали в течение 60 минут в KRBB, содержащем 4 или 10 мМ глюкозы с добавлением или без добавления указанных антоцианов или антоцианидинов. Затем среду удаляли и определяли высвобождение инсулина. Затем клетки дважды промывали фосфатным буфером и растворяли в 1 М NaOH. Затем концентрации клеточного белка определяли при помощи метода Лоури. Для получения необходимых концентраций антоцианины и антоцианидины растворяли в ДМСО. Конечная концентрация ДМСО составляла 0.1%. Инсулин, выделенный клетками в среду, определяли при помощи радиоиммунного анализа и нормализовали по содержанию общего клеточного белка.

[0060] Радиоиммунный анализ (RIA). Набор для RIA был приобретен у LINCO Research Inc. (St Charles, МО); анализ проводили в соответствии с инструкциями изготовителя. В кратком изложении, 0.1-10 нг инсулинового стандарта (100 мкл) помещали в пробирки 12×75. Аналогично образцы (25 мкл), полученные при исследовании секреции инсулина, также помещали в пробирки. К ним добавляли аликвоту (75 мкл) буферного раствора, предназначенного для проведения анализа. Затем в каждую пробирку добавили инсулин (100 мкл), меченный ¹²⁵I. В пробирки затем добавляли аликвоту 100 мкл антител против крысиного инсулина, перемешивали и инкубировали при 4°С в течение 24 часов, вновь инкубировали с 1 мл аликвоты осаждающего реагента в течение 20 минут при 4°С для осаждения инсулина, связанного с антителом. Затем пробирки центрифугировали и радиоактивность измеряли при помощи счетчика гамма-излучения.

[0061] Анализ белка по методу Лоури. Количество белка в исследуемых лунках было определено методом Лоури. Аналитический раствор Лоури был приготовлен смешиванием раствора Лоури, CuSO₄•5H₂O (1%) и тартрата натрия (1%). В кратком изложении, образец белка (100 мкл) и смесь Лоури (1 мл) смешивали в пробирке (12×75). В эти пробирки добавляли реактив Folin-Ciolatues (100 мкл), смешивали и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре. Оптическую плотность полученных растворов затем определяли при помощи УФ-спектрометра при длине волны 700 нм.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

[0062] Исследования плодов кизила указывают на то, что первичные биоактивные компоненты, содержащиеся в них, представляют собой гликозиды цианидина, дельфинидина и пеларгонидина. Поэтому внимание было сосредоточено на исследовании способности этих антоцианинов и их агликонов стимулировать секрецию инсулина, вырабатываемого бета-клетками поджелудочной железы, с целью подтверждения непроверенного использования плодов кизила в противодиабетических препаратах. Агликоны петунидина, малвидина и пеонидина были включены в анализ, так как они часто встречаются в других плодах.

[0063] Антоцианины являются водорастворимыми соединениями. Водные экстракты плодов кизила мужского (С. mas) содержат сахара, биофлавоноиды и антоцианины и, следовательно, они разделяются на фракции на смоле XAD-16. Полученную фракцию антоцианинов, элюированую из смолы, очищали при помощи MPLC, получая чистые антоцианины. Выработку инсулина клетками INS-I 832/13 при воздействии глюкозы определяли при концентрациях глюкозы, равных 4, 10 и 16 мМ; при этом обнаружили, что секреция инсулина достигала лаг-фазы (латентной фазы) при концентрации глюкозы, равной 10 мМ (данные не представлены). Концентрации глюкозы на уровне 4 мМ представляют собой нормальный уровень глюкозы в крови человека. Выработка инсулина клетками на 1 мг белка при концентрации глюкозы, равной 10 мМ, была в три раза выше, чем выработка инсулина при концентрации глюкозы, равной 4 мМ.

[0064] Антоцианины и антоцианидины тестировали при концентрациях глюкозы, равных 4 и 10 мМ, в среде, пригодной для выращивания клеток. Сначала антоцианины и антоцианидины анализировали при концентрации 50 мкг/мл. Было показано, что в присутствии антоцианина цианидин-3-глюкозида выработка инсулина при концентрации глюкозы 4 мМ возросла на 9 нг/мг белка (в 1.3 раза), в то время как при концентрации глюкозы 10 мМ увеличение секреции инсулина в 1.43 раза (119 нг/мг белка) (Фиг.2А). Самым эффективным из испытанных антоцианинов был делфинидин-3-глюкозид, под действием которого секреция инсулина возросла в 1.8 раза (49 нг/мг белка) при концентрации глюкозы 4 мМ. Однако при концентрации глюкозы 10 мМ выработка инсулина возросла лишь в 1.4 раза (113 нг) (Фиг.2А). В этом исследовании инсулин, выделенный клетками при концентрациях глюкозы 4 мМ и 10 мМ, составил 27 и 83 нг инсулина на 1 мг белка соответственно. Такие антоцианины, как цианидин-3-галактозид и пеларгонидин-3-галактозид, не повышали выработку инсулина при концентрации глюкозы, равной 4 мМ. Однако при концентрации глюкозы, равной 10 мМ, цианидин-3-галактозид вызывал увеличение белка инсулина, равное 17 нг/мг (в 1.2 раза) (Фиг.3). Пеларгонидин-3-галактозид испытывали только один раз из-за ограниченного количества образца.

[0065] Действие цианидин-3-глюкозида оценивали по количеству выделенного инсулина в зависимости от дозы этого антоцианина при концентрациях последнего, равных 5, 10, 50, 100 и 250 мкг/мл. В этом исследовании концентрация глюкозы составляла 4 мМ, что соответствует нормальному уровню глюкозы в крови человека. При этой концентрации необработанные клетки выделяли 33 нг инсулина/мг белка. Выработка инсулина клетками, обработанными цианидин-3-глюкозидом, составляла 46 нг инсулина на 1 мг белка при 5 мкг/мл. Однако при концентрациях соединения 1, равных 5, 10, 50, 100 и 250 мкг/мл, значительных различий в секреции инсулина не наблюдали. Количество делфинидин-3-глюкозида было недостаточным для проведения исследований зависимости от дозы этого антоциана.

[0066] Исследование действия антоцианидинов проводили при их концентрациях, равных 50 мкг/мл. Агликон цианидин-3-глюкозида, цианидин, повышал секрецию инсулина в 1.5 раза (29 нг/мг белка) при концентрации глюкозы, равной 4 мМ, в то время как при концентрации глюкозы, равной 10 мМ, секреция составила 88 нг/мг белка (Фиг.2В). В этой серии опытов при концентрациях глюкозы, равных 4 мМ и 10 мМ, необработанные клетки выделяли 19 и 83 нг инсулина/мг белка соответственно. Агликон делфинидин вызывал повышение секреции инсулина на 6 нг/мг белка при концентрации глюкозы, равной 4 мМ, что было несущественно. Делфинидин не проявлял воздействия на выработку инсулина, вызываемую глюкозой, при концентрации последней, равной 10 мМ (Фиг.2В). Наиболее активным антоцианидином был пеларгонидин, который при концентрациях глюкозы, равных 4 мМ и 10 мМ, вызывал секрецию 49 (в 1.4 раза) и 91 (1.2 раза) нг инсулина/мг белка соответственно (Фиг.3). Агликон петунидин повышал секрецию инсулина на 4 нг инсулина/мг белка при концентрации глюкозы, равной 4 мМ. Однако малвидин не вызывал увеличения секреции инсулина по сравнению с секрецией необработанных клеток.

[0067] Результаты показывают, что как антоцианины, так и антоцианидины являются стимуляторами секреции инсулина. Наиболее мощным среди них оказался делфинидин-3-глюкозид, который значительно повышал секрецию инсулина при концентрациях глюкозы, равных 4 и 10 мМ, по сравнению с секрецией необработанных клеток. Несмотря на то, что цианидин-3-глюкозид был менее активен, чем делфинидин-3-глюкозид при более низких концентрациях глюкозы, он оказался более активен при более высоких ее концентрациях. Что касается галактозидов, пеларгонидин-3-галактозид не вызывал секреции инсулина при исследованных концентрациях глюкозы, т.е. 4 и 10 мМ, в то время как цианидин-3-галактозид вызывал значительное повышение секреции инсулина. Способность исследованных антоцианинов повышать секрецию инсулина возрастает в следующем порядке: делфинидин-3-глюкозид > цианидин-3-глюкозид > пеларгонидин-3-галактозид. Это указывает на то, что количество гидроксильных групп в кольце В антоцианинов играет важную роль в их способности повышать секрецию инсулина. Среди протестированных антоцианидинов наиболее активным при концентрации глюкозы, равной 4 мМ, оказался пеларгонидин. Другие агликоны не усиливают секрецию инсулина в значительной степени при исследованных концентрациях глюкозы, т.е. 4 и 10 мМ.

[0068] Результаты показывают, что антоцианы и антоцианидины, выделенные из плодов и овощей и подвергнутые очистке, полезны при лечении диабета.

ПРИМЕРЫ ЛЕЧЕНИЯ ОЖИРЕНИЯ

[0069] Антоцианины (Фиг.9), урсоловая и бетулиновая кислоты, выделенные из плодов кизила мужского (С. Mas), очищали и оценивали их эффективность предотвращать ожирение и инсулиновую резистентность, вызванную потреблением пищи с высоким содержанием жиров, у трансгенных подопытных мышей C57BL/6J. Сначала в течение четырех недель мышей кормили пищей с высоким содержанием жиров, а затем переводили на пищу с высоким содержанием жиров, также содержащую тестируемые соединения в течение последующих восьми недель. Проба на переносимость глюкозы (GTT) показала, что контрольная группа мышей, потребляющая пиццу с высоким содержанием жиров, оказалась резистентной к инсулину, а мыши, потребляющие антоцианины и урсоловую кислоту, преодолевали резистентность к инсулину. Среднее увеличение массы тела у контрольной группы мышей, потреблявших пищу с высоким содержанием жиров (60% ккал), в течение подопытного периода составило 9.76±0.55 г, в то время как мыши, потребляющие антоцианины, бетулиновую и урсоловую кислоты, набирали 7.41±0.93, 7.73±0,44 и 8.78±0.96 г соответственно. Уровни холестерина у мышей, потребляющих антоцианины и бетулиновую кислоту, были значительно ниже, чем у контрольных животных. Уровни инсулина в плазме животных, потреблявших антоцианины и бетулиновую кислоту, составили 576±32.36 и 460.86±93.68 нг/мл соответственно, в то время как уровни инсулина у животных, потребляющих урсоловую кислоту, составили 52.25±8.84 нг/мл по сравнению с контрольной группой животных. Такое исследование in vivo подтвердило, что антоцианины являются прекрасными средствами, усиливающими секрецию инсулина, и могут быть полезны в предотвращении ожирения и инсулиновой резистентности, и, кроме того, для понижения общего холестерина.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ МЕТОДИКИ

[0070] Очистка антоцианинов. Цианидингалактозид, пеларгонидингалактозид и делфинидингалактозид были выделены в виде чистых смесей антоцианинов из плодов кизила мужского (С. Mas), как описано ранее. В кратком изложении, от плодов отделили семена и полученную мякоть смешали с водой (рН=3) и отфильтровали. Фильтрат адсорбировали на смоле XAD-16 AMBERLITE, которую затем несколько раз промывали водой для извлечения сахаров и других органических кислот. Затем адсорбированные антоцианины элюировали подкисленным МеОН (рН=3). Полученную таким образом смесь, содержащую антоцианины, очищали на колонке при помощи жидкостной хроматографии среднего давления (оксид кремния С₁₈) с использованием МеОН:Н₂O (рН=3) в условиях градиента. Фракции элюировали системой растворителей МеОН:Н₂О (65:35, по объему), собирали и испаряли досуха в вакууме. Чистоту антоцианинов проверяли при помощи ВЭЖХ (Waters Corp.) с использованием аналитической колонки Capcell C₁₈ и определяли при длине волны 520 нм (детектор на основе светодионого массива, Waters Corp.).

[0071] Выделение бетулиновой кислоты. Семена (700 г) отделяли от плодов кизила мужского (С.Mas) (5 кг), лиофилизировали и последовательно экстрагировали н-гексаном (3×1 л), этилацетатом (3×1 л) и метанолом (3×1 л). Экстракт в EtOAc (3.0 г) очищали на силикагеле при помощи MPLC в условиях градиента, применяя в качестве подвижных фаз н-гексан и EtOAc. Фракции, собранные в элюате гексан-EtOAc (7:3), испаряли досуха и кристаллизовали из МеОН, получая бетулиновую кислоту (2.5 г).

[0072] Выделение урсоловой кислоты. Лиофилизированную мякоть и кожицу последовательно экстрагировали н-гексаном (3×1 л), EtOAc (3×1 л) и МеОН (3×1 л). Экстракт в EtOAc (3.5 г) очищали при помощи колоночной хроматографии с использованием градиентов н-гексана и EtOAc. Элюаты гексан-EtOAc (7:3) испаряли досуха в вакууме и кристаллизовали полученный остаток из МеОН, получая урсоловую кислоту (2.2 г). Как урсоловая, так и бетулиновая кислоты были охарактеризованы при помощи ¹H и ¹³С ЯМР-спектроскопии (Werner, S., Nebojsa, S., Robert, W., Robert, S., Olaf, K. (2003) Complete assignments of ¹H and ¹³C NMR resonances of oleanolic acid, 18α-oleanolic acid, ursolic acid and their 11-oxo derivatives. Mag. Res. Chem. 41, 635-638).

[0073] Животные и питание. Мыши C57BL/6J мужского пола возрастом 4 недели были приобретены у Jackson Laboratories (Bar Harbor, Maine, USA). Мыши были помещены в отдельные помещения, содержащиеся при контролируемой температуре (70°F) и с 12-часовыми циклами дня-ночи. Мыши (n=40) имели свободный доступ к воде и неочищенной лабораторной пище в течение 5 дней. После акклиматизации мыши были случайным образом разделены на группы 1-5 (n=8) для исследования. Эксперименты проводили в соответствии с этическим руководством University Laboratory Animal Resources (ULAR) в Государственном Университете Мичигана (Michigan State University) East Lansing, MI. Питание, 10% ккал (нормальное) и 60% ккал (высокое содержание жиров), было приобретено в Research Diets (New Brunswick, NJ). Состав питания показан в таблице.

Состав нормального (10% ккал) питания и питания с высоким содержанием жиров (60% ккал)
Ингредиенты	Нормальное	Высокое содержание жиров
Казеин	200	200
L-Цистеин	3	3
Кукурузный крахмал	315	0
Мальтодекстрин	35	125
Сахароза	350	68,8
Целлюлоза	50	50
Соевое мало	25	25
Жир (лярд)	20	245

[0074] Группы 1 и 2 были контрольными и в течение всего исследования получали нормальное (10% ккал) питание и питание с высоким содержанием жиров (60% ккал.) соответственно. Для каждого курса терапии пищу готовили отдельно, смешивая 1 г смеси чистых антоцианинов, по 500 мг бетулиновой и урсоловой кислоты на 1 кг питания с высоким содержанием жиров. Группы 3-5, получавшие терапию, в течение первых 4 недель кормили пищей с высоким содержанием жиров, а затем переводили на пищу, содержащую антоцианины, бетулиновую кислоту или урсоловую кислоту. Пищу меняли каждые три дня во избежание окисления жиров или соединений. В течение всего исследования измеряли суточное потребление пищи (Фиг.1) и еженедельную массу тела каждого животного (Фиг.2А-С).

[0075] Сбор плазмы, печени и жировой ткани. Спустя 12 недель кормление прекратили. Затем животные были подвергнуты анестезии изофлураном, умерщвлены, и кровь собирали через иглу для пункции в сердце в гепаринизировнные трубки. Плазму отделяли центрифугированием при 1600×g в течение 10 минут при 4°С, немедленно замораживали и хранили при -20°С до использования. Печень и белую эпидидимальную жировую ткань (WAT) отбирали в соответствии с анатомическими ориентирами, взвешивали и немедленно замораживали в жидком азоте. Мускулы конечностей также отделяли и замораживали в жидком азоте. Поджелудочные железы отделяли и хранили при оптимальной температуре разрезания (optimal cutting temperature (ОСТ)) (Sakura Finetek, Inc., CA) и замораживали в жидком азоте. Затем все ткани были извлечены из жидкого азота и до анализа хранились при -80°С.

[0076] Проба на переносимость глюкозы (GTT). Пробу на переносимость глюкозы производили на пяти животных из каждой группы (n=5) после питания с добавками, длившегося 6 недель. Уровень глюкозы в крови был измерен в момент времени 0 (мин) при помощи ручного глюкометра Free Style Flash (TheraSense, Inc., CA) с использованием индикаторных полосок (Free Style, TheraSense, Inc., CA). Для проведения GTT внутрибрюшинно (i.p.) вводили стерильный раствор, содержащий 2 г глюкозы на 1 кг массы тела. Отбирали кровь из хвостовой вены и измеряли уровни глюкозы спустя 5, 10, 15, 30, 60 и 90 минут соответственно. Затем строили график зависимости уровня глюкозы в крови от времени (Фиг.3).

[0077] Радиоиммунный анализ (RIA). Уровни инсулина в плазме крови измеряли при помощи набора RIA для определения инсулина у крыс, приобретенного у LINCO Research Inc. (St Charles, МО). Инсулиновые стандарты (аликвоты по 100 мкл) отбирали пипетками в пробирки 12×75 мм. Для построения калибровочной кривой использовали всего 10 концентраций инсулина от 0.1 до 10 нг/мл, образцы плазмы (аликвоты по 1-25 мкл) добавляли в пробирки, а затем прибавляли буферный раствор для анализа для доведения объема образца до 100 мкл. Затем в пробирки добавляли инсулин, меченый ¹²⁵I, и антитело против крысиного инсулина (100 мкл каждого) смешивали и инкубировали при 4°С. Спустя 24 часа добавляли осаждающий реагент (1 мл) и вновь инкубировали при 4°С в течение 20 минут для осаждения инсулина, связанного с антителом. Затем пробирки центрифугировали в течение 20 минут при 3000×g, декантировали и измеряли радиоактивность при помощи гамма-счетчика.

[0078] Определение холестерина плазмы. Общий холестерин плазмы анализировали в Лаборатории клинической патологии в Диагностическом центре Популяций и Здоровья Животных колледжа ветеринарной медицины государственного университета Мичигана (Clinical Pathology Laboratory at the Diagnostic Center for Population and Animal Health, College of Veterinary Medicine, Michigan State University) в соответствии со стандартным аналитическим протоколом определения общего холестерина.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

[0079] Плоды кизила мужского (Cornus mas), также известные как кизил настоящий (cornelian cherry), похожи на кислую вишню (Р.cerasus).

Фитохимическое исследование этого растения позволило в качестве основных антоцианинов получить пеларгонидингалактозид, цианидингалактозид и делфинидингалактозид (Seeram, N.Р., Schutzki, R., Chandra, A., and Nair, M.G. (2002) Characterization, quantification, and bioactivities of anthocyanins in Cornus species. J. Agric. Food Chem. 50, 2519-2523) и такие тритерпеноиды, как урсоловая и бетулиновая кислоты. В качестве модели для исследования нарушений метаболизма и эндокринной системы обычно используют трансгенную линию мышей. Использованные мыши C57BL/6J имеют гомозиготную мутацию по лептиновому рецептору, и у них может развиваться гиперфагия, ожирение, гиперинсулинемия и гипергликемия (Coleman, D. (1978) Obese and diabetes: two mutant genes causing diabetes-obesity syndromes in mice. Diabetologia 14, 141-148). Таким образом, мышей кормили очищенными антоцианинами, бетулиновой и урсоловой кислотами, выделенными из кизила мужского (С. mas), с целью оценить эффективность этих веществ в предотвращении ожирения, вызванного питанием, и резистентности к инсулину. Животных кормили пищей с высоким содержанием жиров в течение четырех недель, а затем кормили такой же пищей, но с добавлением соединений в течение восьми недель. Животные контрольных групп получали либо нормальную пищу, либо пищу с высоким содержанием жиров.

[0080] Масса тела и потребление пищи. Потребление пищи животными группы 1 составило приблизительно ≈4.5 г в течение первых трех недель, а затем снизилось до ≈3.5 г в сутки (Фиг.1) и оставалось постоянным в течение всего эксперимента. Потребление пищи животными группы 2 оставалось постоянным в течение всего эксперимента и составляло приблизительно ≈2.8 г в сутки (Фиг.1). Эти результаты показывают, что прием тестируемых соединений не влияет на потребление пищи животными. Количество пищи, потребляемой животными групп 3-5, также составляло приблизительно ≈2.8 г в сутки в течение всего эксперимента (Фиг.1).

[0081] Масса тела животных группы 1 (нормальное питание) и 2 (высокое содержание жиров) различалась значительно; средние значения составляли 31.5 и 36.91 соответственно. Животные, потребляющие пищу с высоким содержанием жиров, но с добавлением соединений 1 (группа 3), 2 (группа 4) и 3 (группа 5) весили 34.19, 33.54 и 34.89 г соответственно (Фиг.2А-2С). Общий прирост массы за экспериментальный период (12 недель) для групп 1 и 2 составил 13.94 и 18.98 г соответственно. Аналогично животные групп 3, 4 и 5 набрали 15.91, 15.16 и 17.45 г массы тела соответственно. Масса, набранная этими животными в период терапии, составила 7.41, 7.73 и 8.78 г соответственно, в то время как животные контрольных групп 1 и 2 набрали 6.63 и 9.76 г соответственно.

[0082] Проба на переносимость глюкозы. Пробу на переносимость глюкозы (GTT) производили, вводя внутрибрюшинно (i.p.) раствор глюкозы (2 г/кг). Уровень глюкозы в крови животных, которым была введена глюкоза, был измерен отбором крови из хвостовой вены спустя 5, 10, 15, 30, 60 и 90 минут соответственно. Уровень глюкозы в момент времени 0 был практически идентичен во всех группах. Исходные уровни глюкозы в контрольных группах питания с низким содержанием жиров и высоким содержанием жиров (1 и 2) составляли 133.8±15,37 и 119.8±7.24 мг/дл соответственно (Фиг.3). Уровни глюкозы у животных, получавших соединения 10-13, составили 123.4±4.65, 123.4±6.0 и 113.5±5.16 мг/дл соответственно. Концентрация глюкозы в крови достигала максимума спустя 30 минут после введения глюкозы у всех групп, за исключением животных, потреблявших урсоловую кислоту. В этой группе усвоение глюкозы также было замедленным, и концентрация глюкозы в крови достигала максимума спустя 60 минут. После 90 минут после введения глюкозы уровни глюкозы у животных, потребляющих нормальную пищу и пищу с повышенным содержанием жиров, составляли соответственно 190±6.31 и 363±19.76 мг/дл. Аналогично уровни глюкозы у животных групп 3-5 составляли соответственно 221±31.5, 317.8±21.9 и 227±22.982.

[0083] Уровни инсулина в плазме. Количество инсулина в плазме измеряли при помощи радиоиммунного анализа (RIA) (Qian, D., Zhu, Y., and Zhu, Q. (2001) Effect of alcohol extract of Cornus officinalis Sieb. et Zucc on GLUT4 expression in skeletal muscle in type 2 (non-insulin-dependent) diabetes mellitus rats. Zhongguo Zhongyao Zazhi 26, 859-862). Уровни инсулина, определенные у контрольных животных групп 1 и 2, составили 0.47±0.14 и 0.41±0.1 нг/мл соответственно (Фиг.4), в то время как те же показатели у животных, потребляющих антоцианины, бетулиновую и урсоловую кислоту, составляли 567.98±32.36, 460±93.68 и 52.25±8.84 инсулина соответственно.

[0084] Определение глюкозы в крови натощак. Уровни глюкозы в крови натощак у контрольных животных, потребляющих нормальную пищу и пищу с повышенным содержанием жиров, измеряли с целью определения развития диабета у животных, питающихся пищей с повышенным содержанием жиров. Животным не давали пищи в течение 6 часов, после чего определяли уровень глюкозы в крови, взятой из хвостовой вены. Уровни глюкозы у животных, потребляющих нормальную пищу (n=8) и пищу с повышенным содержанием жиров (n=8), составляли 126.6±4.6 и 125±.5.19 мг/дл соответственно.

[0085] Холестерин плазмы. Уровени холестерина в плазме крови контрольных животных, потребляющих нормальную пищу и пищу с повышенным содержанием жиров, составляли 120.5±10.61 и 156.4±8.26 мг/дл соответственно. Уровни холестерина у животных, потребляющих антоцианины и бетулиновую кислоту, составляли 134.2±15.5 и 126.5±14.01 мг/дл соответственно (Фиг.5).

[0086] Потребление пищи животными, которых кормили пищей с повышенным содержанием жиров с добавлением тестируемых соединений и без них, практически не изменялось в течение всего периода исследования. Интересно отметить, что контрольные животные, потребляющие нормальную пищу, съедали больше, чем животные, которых кормили пищей с повышенным содержанием жиров. Количество калорий, потребляемое животными, которых кормили пищей с повышенным содержанием жиров без добавления испытуемых соединений и с ними, составляло приблизительно 14.56 ккал в сутки, в то время как контрольные животные, которых кормили нормальной пищей, потребляли 13.3 ккал в сутки.

[0087] У животных, потребляющих антоцианины, наблюдали заметное снижение массы тела в сравнении с контрольными животными, потребляющими пищу с повышенным содержанием жиров. Потери массы, наблюдаемые у животных, потребляющих антоцианины и бетулиновую кислоту, составили 24 и 21% соответственно (Фиг.5А и 5В). Однако потери массы, наблюдаемые у животных, потребляющих урсоловую кислоту, были несущественны в сравнении с животными, потребляющими пищу с повышенным содержанием жиров. В плазме крови животных, потребляющих антоцианины и бетулиновую кислоту, обнаруживали значительное снижение общего холестерина в сравнении с животными, потребляющими пищу с повышенным содержанием жиров (Фиг.5). Плазмы животных, потреблявших урсоловую кислоту, было недостаточно для проведения анализа на общий холестерин. Потребление пищи животными групп 2-5 было постоянным в течение всего исследования, и, следовательно, потеря массы для животных, потреблявщих антоцианины, подтверждает их потенциальную полезность в предотвращении ожирения.

[0088] Пробу на переносимость глюкозы (GTT) производили у всех животных с целью определения резистентности к инсулину (Фиг.6). Несмотря на то, что урсоловая кислота не вызывала значительного снижения массы тела у потреблявших ее животных, уровни глюкозы животных этой группы были близки к аналогичным показателям у животных, потреблявших нормальную пищу. Потребление антоцианинов оказывало на GTT пробу тот же эффект, что и потребление урсоловой кислоты, с тем лишь исключением, что концентрации глюкозы в крови достигали максимума за 30 минут. Концентрация глюкозы в крови животных, потреблявших урсоловую кислоту, достигала максимума за 60 минут, что указывает на то, что урсоловая кислота способна замедлять усвоение глюкозы. Таким образом, урсоловая кислота может представлять собой полезный продукт для пациентов, страдающих диабетом II типа, так как она способна замедлять усвоение глюкозы. Спустя 90 минут после введения уровень глюкозы в крови животных, потреблявших антоцианины и урсоловую кислоту, оказался аналогичным показателям контрольной группы, получавшей нормальную пищу. Однако проба GTT у животных, получавших бетулиновую кислоту, не изменилась и соответствовала показателям контрольной группы, потреблявшей пищу с повышенным содержанием жиров. В случае животных, потребляющих пищу с повышенным содержанием жиров, концентрация глюкозы в крови достигала максимума спустя 30 минут и не изменялась до момента времени 90 минут, что показывает резистентность этих животных к инсулину.

[0089] Концентрации инсулина в плазме животных, получавших соединения 10-15, показанные на Фиг.9, были значительно выше, чем у контрольных животных, потреблявших нормальную пищу и пищу с повышенным содержанием жиров (Фиг.4). Повышение секреции инсулина у животных, потребляющих антоцианины, было самым высоким из всех животных, получающих одно из тестируемых веществ. Секреция инсулина у животных, потреблявших антоцианины, была в 10 или более раз выше, чем у животных, потребляющих урсоловую кислоту (Фиг.7). В заключение можно сказать, что из трех исследованных веществ лучше всего снижали массу тела животных, потреблявших пищу с повышенным содержанием жиров, антоцианины, выделенные из плодов кизила мужского (С. mas). Кроме того, антоцианины увеличивали секрецию инсулина до очень высоких значений, не вызывая при этом гипогликемии.

[0090] Способы выделения или получения антоцианинов и антоцианидинов описаны в патентах США № 6194469; 6423365; 6623743; 6676978 и 6656914, а также в патентной заявке США S.N. 10/084575 от 27 февраля 2002 г., содержание которых полностью включено в настоящее описание в качестве ссылки.

[0091] Следует понимать, что вышеизложенное описание является лишь иллюстрацией настоящего изобретения и что область действия изобретения ограничена только нижеследующей формулой изобретения.

Claims

1. Способ лечения ожирения и резистентности к инсулину при регуляции уровней глюкозы в крови у млекопитающего пациента, который нуждается в таком лечении, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества композиции, содержащей, по существу, соединение, выделенное из натурального источника и очищенное, выбираемое из группы, включающей антоцианин, антоцианидин и их смеси, для лечения резистентности к инсулину при регуляции уровней глюкозы и лечения ожирения у пациента.

2. Способ лечения ожирения у людей, страдающих диабетом, ожирением и резистентностью к инсулину при регуляции уровней глюкозы в крови и принимающих лекарственный препарат для лечения диабета, который включает введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества выделенной и очищенной композиции, содержащей, по существу, соединение из натурального источника, выбираемое из группы, включающей антоцианин, антоцианидин и их смеси в сочетании с принимаемым лекарственным препаратом для регуляции уровней глюкозы и лечения людей, страдающих диабетом.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что антоцианин, антоцианидин выделены из плода.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанное соединение представляет собой антоцианин, выбираемый из группы, включающей цианидин-3-гликозид, дельфинидин-3-гликозид, пеларгонидин-3-гликозид и их смеси.

5. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что указанные антоцианидин и антоцианин выделены из кизила мужского (Cornus mas) и очищены.

6. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что композиция, по существу, не содержит сахаров и кислот, присутствующих в натуральном источнике.

7. Способ лечения ожирения и резистентности к инсулину при регуляции уровней глюкозы в крови и лечения гипергликемии у млекопитающего пациента, который нуждается в таком лечении, включающий введение терапевтически эффективного количества композиции, содержащей, по существу, соединение, выделенное из натурального источника и очищенное, выбираемое из группы, включающей антоцианин, антоцианидин и их смеси, для лечения ожирения, резистентности к инсулину и гипергликемии у пациента.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что указанные антоцианин и антоцианидин выделены из плода и очищены.

9. Способ по п.7, отличающийся тем, что указанное соединение представляет собой антоцианин, выбираемый из группы, включающей цианидин-3-гликозид, дельфинидин-3-гликозид, пеларгонидин-3-гликозид и их смеси.

10. Способ по п.7, отличающийся тем, что указанные антоцианин и антоцианидин выделены из кизила мужского (Cornus mas).

11. Способ по п.7, отличающийся тем, что композиция, по существу, не содержит сахаров и кислот, присутствующих в натуральном источнике.

12. Способ лечения ожирения, резистентности к инсулину при регуляции уровней глюкозы в крови и липидных нарушений у млекопитающего пациента, который нуждается в таком лечении, включающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества композиции, содержащей соединение, выделенное из натурального источника и очищенное, представляющее собой, по существу, антоцианин, антоцианидин или их смеси, для лечения ожирения, резистентности к инсулину и липидных нарушений у млекопитающего пациента.

13. Способ лечения ожирения, резистентности к инсулину при регуляции уровней глюкозы в крови и гиперхолестеринемии у млекопитающего пациента, который нуждается в таком лечении, включающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества композиции, содержащей, по существу, соединение из натурального источника, представляющее собой выделенные и очищенные антоцианин, антоцианидин или их смеси, для лечения ожирения, резистентности к инсулину при регуляции уровней глюкозы в крови, гиперхолистеринемии у млекопитающего пациента.

14. Способ лечения ожирения, резистентности к инсулину при регуляции уровней глюкозы в крови и атеросклероза у млекопитающего пациента, который нуждается в таком лечении, включающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества композиции, содержащей, по существу, выделенное и очищенное соединение, выбираемое из группы, включающей выделенные антоцианин, антоцианидин или их смеси, для лечения ожирения, резистентности к инсулину при регуляции уровней глюкозы в крови и атеросклероза у млекопитающего пациента.

15. Способ по любому из пп.12, 13, или 14, отличающийся тем, что каждое соединение выделено из кизила мужского (Cornus mas).

16. Способ по любому из пп.12, 13, или 14, отличающийся тем, что композиция, по существу, не содержит сахаров и кислот, присутствующих в натуральном источнике.