RU2346050C2 - Biotransformation of colchicine compounds - Google Patents
Biotransformation of colchicine compounds Download PDFInfo
- Publication number
- RU2346050C2 RU2346050C2 RU2006139742/13A RU2006139742A RU2346050C2 RU 2346050 C2 RU2346050 C2 RU 2346050C2 RU 2006139742/13 A RU2006139742/13 A RU 2006139742/13A RU 2006139742 A RU2006139742 A RU 2006139742A RU 2346050 C2 RU2346050 C2 RU 2346050C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- compounds
- biotransformation
- demethylated
- culture
- carried out
- Prior art date
Links
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 title claims abstract description 23
- IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N (S)-colchicine Chemical class C1([C@@H](NC(C)=O)CC2)=CC(=O)C(OC)=CC=C1C1=C2C=C(OC)C(OC)=C1OC IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N 0.000 title description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 42
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 18
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims abstract description 13
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims abstract description 13
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 13
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims abstract description 13
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 238000005273 aeration Methods 0.000 claims abstract description 6
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 claims abstract description 6
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 claims abstract description 5
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 19
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 19
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 19
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 9
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 claims description 7
- 239000005018 casein Substances 0.000 claims description 6
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 claims description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 6
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 claims description 5
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 claims description 5
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 claims description 5
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 4
- JRRUSQGIRBEMRN-HNNXBMFYSA-N n-[(7s)-3-hydroxy-1,2,10-trimethoxy-9-oxo-6,7-dihydro-5h-benzo[a]heptalen-7-yl]acetamide Chemical compound O=C1C(OC)=CC=C2C3=C(OC)C(OC)=C(O)C=C3CC[C@H](NC(C)=O)C2=C1 JRRUSQGIRBEMRN-HNNXBMFYSA-N 0.000 claims description 4
- 150000008444 O-glycosides Chemical group 0.000 claims description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 3
- 230000001279 glycosylating effect Effects 0.000 claims description 3
- PKYOHQGXPPVIGD-HNNXBMFYSA-N n-[(7s)-3-hydroxy-1,2-dimethoxy-10-methylsulfanyl-9-oxo-6,7-dihydro-5h-benzo[a]heptalen-7-yl]acetamide Chemical compound O=C1C(SC)=CC=C2C3=C(OC)C(OC)=C(O)C=C3CC[C@H](NC(C)=O)C2=C1 PKYOHQGXPPVIGD-HNNXBMFYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims description 3
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 claims description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 13
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 13
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 11
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 abstract description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 abstract description 5
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 abstract description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 abstract 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 abstract 1
- IAKHMKGGTNLKSZ-UHFFFAOYSA-N colchicine Chemical class C1CC(NC(C)=O)C2=CC(=O)C(OC)=CC=C2C2=C1C=C(OC)C(OC)=C2OC IAKHMKGGTNLKSZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 abstract 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 235000010633 broth Nutrition 0.000 description 10
- CMEGANPVAXDBPL-INIZCTEOSA-N n-[(7s)-1,2,3-trimethoxy-10-methylsulfanyl-9-oxo-6,7-dihydro-5h-benzo[a]heptalen-7-yl]acetamide Chemical compound C1([C@@H](NC(C)=O)CC2)=CC(=O)C(SC)=CC=C1C1=C2C=C(OC)C(OC)=C1OC CMEGANPVAXDBPL-INIZCTEOSA-N 0.000 description 9
- LEQAKWQJCITZNK-AXHKHJLKSA-N N-[(7S)-1,2-dimethoxy-10-(methylthio)-9-oxo-3-[[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)-2-oxanyl]oxy]-6,7-dihydro-5H-benzo[a]heptalen-7-yl]acetamide Chemical compound C1([C@@H](NC(C)=O)CCC2=C3)=CC(=O)C(SC)=CC=C1C2=C(OC)C(OC)=C3O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O LEQAKWQJCITZNK-AXHKHJLKSA-N 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 229960000287 thiocolchicoside Drugs 0.000 description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 6
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 6
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical class CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 4
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 4
- 229940066779 peptones Drugs 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 3
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 3
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 3
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 3
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 3
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 3
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 2
- 229960001338 colchicine Drugs 0.000 description 2
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 2
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 2
- 230000001335 demethylating effect Effects 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 235000001727 glucose Nutrition 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000011027 product recovery Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 241000206672 Gelidium Species 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N aldehydo-D-glucose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124599 anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- UXTMROKLAAOEQO-UHFFFAOYSA-N chloroform;ethanol Chemical compound CCO.ClC(Cl)Cl UXTMROKLAAOEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011968 cross flow microfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000017858 demethylation Effects 0.000 description 1
- 238000010520 demethylation reaction Methods 0.000 description 1
- FHHZOYXKOICLGH-UHFFFAOYSA-N dichloromethane;ethanol Chemical compound CCO.ClCCl FHHZOYXKOICLGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000010829 isocratic elution Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 210000002346 musculoskeletal system Anatomy 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Настоящее изобретение относится к способу биотрансформации, осуществляемой посредством отобранных микробных штаммов, для получения 3-О-гликозильных производных колхициноидных соединений.The present invention relates to a biotransformation method, carried out by means of selected microbial strains, to obtain 3-O-glycosyl derivatives of colchicinoid compounds.
В частности, способ по настоящему изобретению предоставляет колхициноидное соединение, эксклюзивно гликозилированное по С-3 ароматического кольца А, исходя их колхицина, тиоколхицина или их производных. Способ, дающий в результате высокую производительность и чистоту полученного продукта, основан на ранней активации гликозилирующего фермента, определенной интермедиатом деметилированного колхицина. Предпочтительно способ по изобретению состоит из процесса ферментации с многократной загрузкой сырья, включающего дробную подпитку источником азота, источником углерода и субстратом, который должен быть трансформирован.In particular, the method of the present invention provides a colchicinoid compound exclusively glycosylated at C-3 of aromatic ring A, based on their colchicine, thiocolchicine or derivatives thereof. The method, resulting in high performance and purity of the obtained product, is based on the early activation of a glycosylating enzyme determined by the intermediate demethylated colchicine. Preferably, the method according to the invention consists of a multiple-charge fermentation process comprising a fractional feed with a nitrogen source, a carbon source and a substrate to be transformed.
Колхициноидные соединения, гликозилированные по С-3 бензольного кольца, имеют большое фармацевтическое значение ввиду их высокой эффективности и как промежуточные при получении новых лекарств.Colchicinoid compounds glycosylated at the C-3 of the benzene ring are of great pharmaceutical importance due to their high efficacy and as intermediates in the preparation of new drugs.
В частности, тиоколхицид (3-О-глукозилтиоколхицин) является привлекательным и интересным активным ингредиентом в фармацевтической области, главным образом, в терапии заболеваний скелетно-мышечной системы и как исходное вещество для получения новых противоопухолевых, иммуносуппрессорных, противопсориазных и противовоспалительных лекарств.In particular, thiocolchicide (3-O-glucosylthiocolchicine) is an attractive and interesting active ingredient in the pharmaceutical field, mainly in the treatment of diseases of the musculoskeletal system and as a starting material for the preparation of new antitumor, immunosuppressive, antiporizant and anti-inflammatory drugs.
WO 98/15642 описывает способ получения колхициноидных гликозил-производных с высокими выходами превращения (до 90%) исходя из колхициноидных соединений, таких как колхицин, тиоколхицин и их производные, при начальной концентрации до 1 г/л. Способ основан на стадии предварительного региоселективного деметилирования С-3 метокси-группы, связанной с ароматическим кольцом колхициноида, и последующего гликозилирования деметилированного производного по тому же месту в молекуле.WO 98/15642 describes a method for producing colchicinoid glycosyl derivatives with high conversion yields (up to 90%) based on colchicinoid compounds, such as colchicine, thiocolchicine and their derivatives, at an initial concentration of up to 1 g / L. The method is based on the stage of preliminary regioselective demethylation of the C-3 methoxy group associated with the aromatic ring of colchicinoid, and subsequent glycosylation of the demethylated derivative at the same place in the molecule.
Способ по настоящему изобретению, сохраняя такой же высокий выход конверсии, как предыдущий, делает возможной трансформацию значительно большего количества суммарного субстрата, улучшая тем самым и суммарную производительность, выраженную как суммарное количество полученного продукта на литр загрузки, и удельную производительность, выраженную как количество полученного продукта на литр загрузки в единицу времени (т.е. час) во время процесса биотрансформации.The method of the present invention, while maintaining the same high conversion yield as the previous one, makes it possible to transform a much larger amount of the total substrate, thereby improving both the total productivity, expressed as the total amount of product obtained per liter of load, and specific productivity, expressed as the amount of product obtained per liter of load per unit time (i.e. hour) during the biotransformation process.
Способ по изобретению характеризуется механизмом активации стадии гликозилирования, основанным на введении специфичного фермента. В действительности, было неожиданно обнаружено, что фермент, вовлеченный в стадию гликозилирования, эффективно индуцируется деметилированными колхициноидами, такими как 3-О-деметилколхицина (ДМК) или 3-О-деметилтиоколхицина (ДМТК). Добавление малых количеств (200-600 мг/л) 3-деметилпроизводного на ранних стадиях процесса биотрансформации или, предпочтительно, в предварительно инокулированную культуру, используется для ранней активации гликозилирующей системы. В таких условиях деметилированное производное, постепенно выделяемое деметилирующим ферментом, может быть эффективно конвертировано в конечное гликозил-производное, и биотрансформация может протекать очень быстро в течение первых 15-18 часов ферментации. Кроме того, отсутствует значительное накопление промежуточного соединения, что означает отсутствие ингибирования деметилирующей активности и высокую скорость конверсии. Биотрансформация завершается после 18-21 ч и является поэтому значительно более быстрой, чем биотрансформация по известному способу (26-28 ч). Выход (конверсия) остается очень высоким, от 80% до 100%, обычно около 90-95%, но со значительным увеличением суммарного трансформированного субстрата и соответственно конечного продукта.The method according to the invention is characterized by the mechanism of activation of the glycosylation stage, based on the introduction of a specific enzyme. In fact, it was unexpectedly discovered that an enzyme involved in the glycosylation step is effectively induced by demethylated colchicinoids such as 3-O-demethylcolchicine (DMC) or 3-O-demethylthiocolchicine (DMTC). The addition of small amounts (200-600 mg / l) of the 3-demethyl derivative in the early stages of the biotransformation process or, preferably, in a pre-inoculated culture, is used for early activation of the glycosylation system. Under such conditions, the demethylated derivative, which is gradually secreted by the demethylating enzyme, can be effectively converted to the final glycosyl derivative, and biotransformation can proceed very quickly during the first 15-18 hours of fermentation. In addition, there is no significant accumulation of the intermediate compound, which means the absence of inhibition of demethylating activity and a high conversion rate. Biotransformation is completed after 18-21 hours and is therefore much faster than biotransformation according to the known method (26-28 hours). The yield (conversion) remains very high, from 80% to 100%, usually about 90-95%, but with a significant increase in the total transformed substrate and, accordingly, the final product.
Поэтому изобретение предлагает способ получения 3-О-гликозилколхициноидных соединений формулы (I):Therefore, the invention provides a method for producing 3-O-glycosylcolchicinoid compounds of the formula (I):
где R1 представляет О-гликозидный остаток, R2 представляет водород или С1-С7 ацил, R3 представляет С1-С6 алкокси или С1-С6 тиоалкил, включающий биотрансформацию соединений, в которых R1 представляет ОН или метокси, посредством Bacillus megaterium, отличающийся тем, что для индуцирования гликозилирующей ферментной системы используют деметилированные колхициноиды;where R 1 represents an O-glycoside residue, R 2 represents hydrogen or C 1 -C 7 acyl, R 3 represents C 1 -C 6 alkoxy or C 1 -C 6 thioalkyl, including the biotransformation of compounds in which R 1 represents OH or methoxy , by Bacillus megaterium, characterized in that demethylated colchicinoids are used to induce a glycosylating enzyme system;
R1 предпочтительно представляет О-гликозидный остаток.R 1 preferably represents an O-glycoside residue.
Предпочтительное осуществление способа по изобретению заключается в многократной дробной подпитке субстрата в сочетании с источником азота и углерода, подобным пептону и глюкозе. Это условие, обеспечивая стабильную скорость роста микробной культуры, позволяет значительно увеличить суммарное количество субстрата, добавляемого при загрузке ферментера (2-4 г/л вместо 1 г/л) и соответственно производительность процесса (до 2,5-5,2 г/л гликозилированного продукта на одну загрузку вместо 1-1,2 г/л) без какой-либо потери эффективности конверсии и риска токсических воздействий на бактериальную культуру из-за значительного накопления непревращенного субстрата.A preferred embodiment of the method according to the invention consists in multiple fractional feeding of the substrate in combination with a nitrogen and carbon source like peptone and glucose. This condition, providing a stable growth rate of the microbial culture, can significantly increase the total amount of substrate added when loading the fermenter (2-4 g / l instead of 1 g / l) and, accordingly, the productivity of the process (up to 2.5-5.2 g / l glycosylated product per batch instead of 1-1.2 g / l) without any loss of conversion efficiency and risk of toxic effects on the bacterial culture due to significant accumulation of unconverted substrate.
Настоящее изобретение является также выгодным уменьшенным временем процесса, приводящим в результате к высокой жизнестойкости культуры и ограниченному клеточному лизису с уменьшенным образованием остатков клеток и значительными преимуществами для переработки выходящего потока и извлечения продукта. Это преимущество может быть дополнительно усилено использованием абсорбционных смол, подобных XAD 1180 (Rohm and Haas) или НР 21 (Mitsubishi), используемых для селективной абсорбции колхициноидных соединений и эффективного извлечения продукта из ферментационного бульона.The present invention is also an advantageous reduced process time, resulting in high culture viability and limited cell lysis with reduced cell debris formation and significant advantages for outflow processing and product recovery. This advantage can be further enhanced by the use of absorption resins, such as XAD 1180 (Rohm and Haas) or HP 21 (Mitsubishi), used to selectively absorb colchicinoid compounds and efficiently recover the product from the fermentation broth.
Дополнительное преимущество касается возможности проведения полунепрерывного процесса путем извлечения основной части (75-90%) конечного ферментационного бульона, содержащего продукт, добавления новой ферментационной среды к оставшейся части бульона в биореакторе и начала новой операции. Этот подход может быть распространен на повторные стадии ферментации с пропорциональным увеличением суммарной производительности.An additional advantage relates to the possibility of conducting a semi-continuous process by extracting the main part (75-90%) of the final fermentation broth containing the product, adding a new fermentation medium to the remaining part of the broth in the bioreactor and starting a new operation. This approach can be extended to repeated fermentation stages with a proportional increase in total productivity.
Кроме того, постоянная региоселективность катализа обеспечивает, в добавление к поразительно высоким выходам продукции, высокое качество получаемого продукта, позволяющее получить чистоту 99% при простой переработке выходного потока и пониженной нагрузке на стадию очистки и извлечения продукта. Этот аспект означает дополнительные преимущества в показателях сокращения растворителей и высокой экологической совместимости процесса.In addition, the constant regioselectivity of catalysis provides, in addition to the amazingly high yields of products, a high quality of the resulting product, which allows to obtain a purity of 99% with a simple processing of the output stream and reduced load on the stage of purification and extraction of the product. This aspect means additional benefits in terms of reducing solvents and the high environmental compatibility of the process.
Микроорганизмы Bacillus megaterium, используемые в настоящем изобретении, являются микроорганизмами, описанными в WO 98/15642, введенном в описание настоящей ссылкой.The microorganisms of Bacillus megaterium used in the present invention are the microorganisms described in WO 98/15642, incorporated herein by reference.
Они могут быть выведены на различных агаровых средах, содержащих источник органического азота (пептоны, экстракты дрожжей, мясные экстракты, аспарагин и т.п.), источник углерода (глицерин, крахмал, мальтоза, глюкоза и т.п.) с рН от 5 до 8, предпочтительно 6-7. Температура инкубации лежит в интервале от 20°С до 45°С, предпочтительно 28-40°С.They can be removed on various agar media containing a source of organic nitrogen (peptones, yeast extracts, meat extracts, asparagine, etc.), a carbon source (glycerin, starch, maltose, glucose, etc.) with a pH of 5 up to 8, preferably 6-7. The incubation temperature lies in the range from 20 ° C to 45 ° C, preferably 28-40 ° C.
Культуральные среды, используемые для сохранения культуры, являются типичными микробиологическими субстратами, содержащими источники органического азота (пептоны, экстракты дрожжей, триптон, мясные экстракты и т.п.), источник углерода (глюкоза, мальтоза, глицерин и т.п.), при рН от 5 до 8, предпочтительно 6-7. Температура инкубации лежит в интервале от 20°С до 45°С, предпочтительно 28-40°С.The culture media used to preserve the culture are typical microbiological substrates containing sources of organic nitrogen (peptones, yeast extracts, tryptone, meat extracts, etc.), a carbon source (glucose, maltose, glycerin, etc.), when pH 5 to 8, preferably 6-7. The incubation temperature lies in the range from 20 ° C to 45 ° C, preferably 28-40 ° C.
Отобранные микроорганизмы могут быть испытаны на способность роста в погруженной культуре в присутствии колхициноидных соединений, добавленных, как описано в настоящем изобретении, и трансформации последних в соответствующие 3-гликозильные производные.Selected microorganisms can be tested for growth ability in a submerged culture in the presence of colchicinoid compounds added as described in the present invention and transformation of the latter into the corresponding 3-glycosyl derivatives.
Указанные испытания проводили в 100 мл колбах, содержащих 20 мл жидкой среды различного состава, включающие один или несколько источников органического азота (экстракты дрожжей, пептоны, триптон, гидролизаты казеина, мясной экстракт, кукурузный сироп и т.п.), один или несколько источников углерода (глюкоза, глицерин, крахмал, сахароза и т.п.), источники неорганического фосфора и азота и неорганические соли различных ионов (K+, Na+, Mg++, Ca++, Fe++, Mn++ и т.п.).These tests were carried out in 100 ml flasks containing 20 ml of a liquid medium of various compositions, including one or more sources of organic nitrogen (yeast extracts, peptones, tryptone, casein hydrolysates, meat extract, corn syrup, etc.), one or more sources carbon (glucose, glycerin, starch, sucrose, etc.), sources of inorganic phosphorus and nitrogen and inorganic salts of various ions (K + , Na + , Mg ++ , Ca ++ , Fe ++ , Mn ++ , etc. .P.).
Образцы культуры могут быть, необязательно, подвергнуты мутагенным обработкам посредством обычных методов мутагенеза (облучение УФ-лучами и т.п.), чтобы индуцировать мутанты, имеющие специфическую активность в отношении биоконверсии, которая может быть оценена такой же методикой, как описана выше.Culture samples may optionally be subjected to mutagenic treatments using conventional mutagenesis methods (UV irradiation, etc.) to induce mutants having specific bioconversion activity, which can be evaluated by the same procedure as described above.
Способность выведенных бактерий трансформировать в соответствующие 3-гликозильные производные колхициноидные субстраты, добавленные в культуральный бульон повторяющимися долями вместе с источниками азота и углерода, была подтверждена посредством испытаний биоконверсии в колбах 300 мл объема, содержащих среды различного состава, включающие один или несколько источников органического азота (экстракты дрожжей, пептоны, триптон, гидролизаты казеина, мясной экстракт, кукурузный сироп и т.п.), один или несколько источников углерода (глюкоза, глицерин, крахмал, сахароза и т.п.), источники неорганического фосфора и азота и неорганические соли различных ионов (K+, Na+, Mg++, Ca++, Fe++, Mn++, NH4 ++ и т.п.).The ability of the excreted bacteria to transform into the corresponding 3-glycosyl derivative colchicinoid substrates added to the culture broth in repeated portions together with nitrogen and carbon sources was confirmed by bioconversion tests in 300 ml volumetric flasks containing media of various compositions, including one or more sources of organic nitrogen ( yeast extracts, peptones, tryptone, casein hydrolysates, meat extract, corn syrup, etc.), one or more carbon sources (glucose , glycerin, starch, sucrose, etc.), sources of inorganic phosphorus and nitrogen, and inorganic salts of various ions (K + , Na + , Mg ++ , Ca ++ , Fe ++ , Mn ++ , NH 4 ++ etc.).
Рост бактерий и биотрансформация поддерживаются одним или несколькими источниками органического азота, предпочтительно мясным экстрактом, пептоном, триптоном, гидролизатами казеина, кукурузным сиропом и т.п. Источниками углерода, используемыми для роста и биотрансформации, являются глюкоза, фруктоза, сахароза, глицерин, солодовый экстракт и т.п., предпочтительно глюкоза, фруктоза и глицерин. Культуральная среда содержит, кроме того, источники неорганического фосфора и соли K+, Na+, Mg++, Mn++, NH4 ++ и т.п.Bacterial growth and biotransformation are supported by one or more sources of organic nitrogen, preferably meat extract, peptone, tryptone, casein hydrolysates, corn syrup, and the like. The carbon sources used for growth and biotransformation are glucose, fructose, sucrose, glycerin, malt extract and the like, preferably glucose, fructose and glycerin. The culture medium also contains sources of inorganic phosphorus and salts K + , Na + , Mg ++ , Mn ++ , NH 4 ++ , etc.
Источниками углерода, используемыми при подпитке процесса, предпочтительно являются глюкоза и фруктоза. Источником азота для подпитки процесса предпочтительно является источник органического азота, подобный пептону, гидролизата казеина, триптону, или неорганический источник, подобный сульфату аммония, или сочетание обоих.The carbon sources used in fueling the process are preferably glucose and fructose. The nitrogen source for feeding the process is preferably a source of organic nitrogen, like peptone, casein hydrolyzate, tryptone, or an inorganic source, like ammonium sulfate, or a combination of both.
Предварительные эксперименты показали, что ввод до стадии биотрансформации погруженной инокулированной культуры, содержащей среду, имеющую состав подобный составу продуктивной среды, дает в результате очень однородную и высоко активную микробную популяцию в начале биотрансформации.Preliminary experiments showed that the introduction to the biotransformation stage of a submerged inoculated culture containing a medium having a composition similar to the composition of the productive medium results in a very homogeneous and highly active microbial population at the beginning of biotransformation.
Были проведены дополнительные эксперименты с использованием различных параметров ферментации, таких как количество, время, форма и состав добавляемого субстрата, кратность подпитки, время инкубации, степень инокуляции и т.д.Additional experiments were carried out using various fermentation parameters, such as the amount, time, form and composition of the added substrate, the frequency of the feed, the incubation time, the degree of inoculation, etc.
Раннее добавление деметилированного колхициноида в качестве индуктора в начале стадии биотрансформации или, лучше, во время предварительного инокулируемой культуры, может значительно повысить эффективность конверсии и суммарную производительность процесса.The early addition of demethylated colchicinoid as an inducer at the beginning of the biotransformation stage or, better, during a preliminary inoculable culture, can significantly increase the conversion efficiency and the overall process productivity.
Дополнительное увеличение может быть достигнуто подпиткой субстрата, который должен конвертироваться, несколькими частями во время процесса в сочетании с источником углерода и источником азота.Additional increase can be achieved by feeding the substrate, which must be converted, in several parts during the process in combination with a carbon source and a nitrogen source.
Типичная процедура, объединяющая описанные выше параметры, может поэтому основываться на следующей программе:A typical procedure that combines the above parameters can therefore be based on the following program:
- предварительное добавление 3-О-деметилколхициноида (200-600 мг/л, предпочтительно 300-500 мг/л) в инокулированную культуру;- preliminary addition of 3-O-demethylcolchicinoid (200-600 mg / l, preferably 300-500 mg / l) in an inoculated culture;
- добавление аликвот (300-800 мг/л, предпочтительно 500-600 мг/л) колхициноидного субстрата, который должен быть конвертирован, в начале и каждые 1-3 часа, предпочтительно 1,5-2,5 часа, в течение первых 14-18 часов, предпочтительно 15-16 часов, биотрансформации;- the addition of aliquots (300-800 mg / l, preferably 500-600 mg / l) of a colchicinoid substrate, which must be converted, at the beginning and every 1-3 hours, preferably 1.5-2.5 hours, during the first 14 -18 hours, preferably 15-16 hours, biotransformation;
- добавление при каждой подпитке субстратом раствора, содержащего следующие исходные материалы:- adding at each replenishment of the substrate with a solution containing the following starting materials:
пептон или триптон, или гидролизат казеина с конечной концентрацией между 2 и 4 г/л, предпочтительно 2,5-3,5 г/л (также в сочетании с 1-3 г/л, предпочтительно 1,5-2,5 г/л, сульфата аммония;peptone or tryptone or casein hydrolyzate with a final concentration of between 2 and 4 g / l, preferably 2.5-3.5 g / l (also in combination with 1-3 g / l, preferably 1.5-2.5 g / l, ammonium sulfate;
глюкозу или фруктозу с конечной концентрацией между 5 и 15 г/л, предпочтительно 8-12 г/л.glucose or fructose with a final concentration of between 5 and 15 g / l, preferably 8-12 g / l.
Принимая во внимание общее время ферментации 20 часов, начальную концентрацию субстрата 500 г/л, интервал подпитки в ходе процесса 3 часа и общее число стадий подпитки 7 (последнее добавление субстрата на 14-ом часу ферментации), к культуре будет добавлено суммарное количество субстрата 4 г/л (вместо 1 г/л/ как описано в WO 98/15642).Taking into account the total fermentation time of 20 hours, the initial concentration of the substrate is 500 g / l, the feeding interval during the process is 3 hours and the total number of feeding stages is 7 (the last addition of substrate at the 14th hour of fermentation), the total amount of substrate 4 will be added to the culture g / l (instead of 1 g / l / as described in WO 98/15642).
Биотрансформация может быть проведена при 25-35°С, предпочтительно при 28-32°С, и при рН между 4 и 8, предпочтительно 5-7, в колбах и перемешиванием на ротационном встряхивателе.Biotransformation can be carried out at 25-35 ° C, preferably at 28-32 ° C, and at a pH between 4 and 8, preferably 5-7, in flasks and stirring on a rotary shaker.
Биотрансформация по изобретению может быть увеличена в масштабе до уровня ферментационного танка при сохранении неизменными условий состояния культуры, в особенности в том, что касается культуральной среды, температуры и временного графика операций. Для того чтобы получить хороший рост, важны соответствующие уровни перемешивания-аэрации, в частности требуются уровни аэрации 1-2 литра воздуха на литр культуры в минуту (vvm), предпочтительно 1,4-1,8 vvm. При таких условиях процесс идет очень быстро, и после 20-21 ч биотрансформация завершается.The biotransformation according to the invention can be scaled up to the level of a fermentation tank while maintaining the conditions of the culture state unchanged, in particular with regard to the culture medium, temperature and time schedule of operations. In order to achieve good growth, appropriate levels of mixing-aeration are important, in particular, aeration levels of 1-2 liters of air per liter of culture per minute (vvm), preferably 1.4-1.8 vvm, are required. Under such conditions, the process is very fast, and after 20-21 hours the biotransformation is completed.
Продукт является внеклеточным и может быть экстрагирован из культурального бульона после отделения биомассы от жидкой фракции центрифугированием и извлечением супернатанта или микрофильтрацией и извлечением пермеата. Культура может быть обработана спиртами для оптимального извлечения продукта.The product is extracellular and can be extracted from the culture broth after separation of the biomass from the liquid fraction by centrifugation and extraction of the supernatant or microfiltration and extraction of permeate. The culture can be treated with alcohols for optimal product recovery.
Очистка может проводиться методами хроматографии, жидкостной экстракции спиртами и липофильными органическими растворителями и кристаллизацией, как описано в WO 98/15642.Purification can be carried out by chromatography, liquid extraction with alcohols and lipophilic organic solvents and crystallization, as described in WO 98/15642.
Нижеследующие примеры более подробно раскрывают настоящее изобретение.The following examples disclose the present invention in more detail.
Пример 1Example 1
Аликвоту замороженной культуры Bacillus megaterium использовали как инокулят посевных культур (т.е. предкультуру) в 1000 мл колбе Эрленмейера, содержащей 250 мл среды SF2 (таблица) с добавлением 3-О-деметилтиоколхицина до конечной концентрации 0,4 г/л. Указанные культуры инкубировали в течение ночи при 30°С на ротационном встряхивателе при 250 об/мин. После инкубации 500 мл предкультуры переносили стерильно в 14 л ферментер, содержащий 9,5 л свежей среды SF2 (см. таблицу 2) с добавленным тиоколхицином до конечной концентрации 0,5 г/л. Ферментацию проводили при 30°С, поддерживая требуемые уровни перемешивания-аэрации (перемешивание до 900 об/мин, аэрация от 1 до 1,8 vvm в зависимости от роста культуры). Каждые 2 часа в течение первых 14 часов ферментации к культуре добавляли тиоколхицин (конечная концентрация 0,5 г/л), пептон (2 г/л), сульфат аммония (2 г/л) и глюкозу (10 г/л). Перед каждым добавлением (т.е. каждые 2 часа) из культуральных бульонов отбирали пробы и подвергали их следующим анализам:An aliquot of the frozen Bacillus megaterium culture was used as an inoculum of inoculum cultures (i.e., preculture) in a 1000 ml Erlenmeyer flask containing 250 ml of SF2 medium (table) with the addition of 3-O-demethylthiocolchicine to a final concentration of 0.4 g / l. These cultures were incubated overnight at 30 ° C. on a rotary shaker at 250 rpm. After incubation, 500 ml of the preculture was transferred sterilely into a 14 L fermenter containing 9.5 L of fresh SF2 medium (see Table 2) with thiocolchicin added to a final concentration of 0.5 g / L. Fermentation was carried out at 30 ° C, maintaining the required levels of mixing-aeration (mixing up to 900 rpm, aeration from 1 to 1.8 vvm depending on the growth of the culture). Every 2 hours during the first 14 hours of fermentation, thiocolchicine (final concentration 0.5 g / l), peptone (2 g / l), ammonium sulfate (2 g / l) and glucose (10 g / l) were added to the culture. Before each addition (i.e., every 2 hours), samples were taken from the culture broths and subjected to the following analyzes:
- Уровень роста как оптическая плотность (ОП) на 600 нм;- Growth rate as optical density (OD) at 600 nm;
- Анализ на стерильность и чистоту штамма на LB агаре;- Analysis of the sterility and purity of the strain on LB agar;
- Микроскопическая морфология (окраска по Граму);- Microscopic morphology (Gram stain);
- Анализ содержания тиоколхикозида методами ТСХ и ЖХВР.- Analysis of the content of thiocolchicoside by TLC and HPLC.
Анализ ТСХ проводили на силикагеле с элюентной системой ацетон:этилацетат:вода 5:4:1. Для анализа ЖХВР 1 мл фракций культурального бульона разбавляли 9 мл метанола и центрифугировали при 13000 об/мин в течение 2 минут. Содержание тиоколхикозида в супернатанте анализировали ЖХВР обратной фазы с изократическим элюированием элюентной системой вода:ацетонитрил 80:20. Анализ ЖХВР доказывает, что превращение тиоколхицина в тиоколхикозид начинается очень рано и почти полностью завершается спустя 20 часов. Суммарное количество 4 г/л тиоколхицина превращается в 5,2 г/л тиоколхикозида с конверсией 96% и удельной производительностью 0,26 г/л·ч гликозилированного колхициноида.TLC analysis was performed on silica gel with an eluent system acetone: ethyl acetate: water 5: 4: 1. For HPLC analysis, 1 ml of culture broth fractions was diluted with 9 ml of methanol and centrifuged at 13000 rpm for 2 minutes. The thiocolchicoside content in the supernatant was analyzed by reverse phase HPLC with isocratic elution with an 80:20 water: acetonitrile eluent system. An analysis of HPLC proves that the conversion of thiocolchicine to thiocolchicoside begins very early and almost completely ends after 20 hours. The total amount of 4 g / l of thiocolchicine is converted to 5.2 g / l of thiocolchicoside with a conversion of 96% and a specific productivity of 0.26 g / l · h of glycosylated colchicinoid.
Пример 2Example 2
Конечный культуральный бульон с ферментации (общий объем около 10 л), содержащий около 5,2 г/л тиоколхикозида по определению анализом ЖХВР, подвергали микрофильтрации с поперечным потоком на керамическом картридже 0,22 мкм, чтобы отделить клетки от бульона. Пермеат абсорбировали на колонке, заполненной абсорбционной смолой XAD 180 (Rohm and Haas). После промывки водой продукт элюировали метанолом. Метанольный элюат концентрировали до сухого остатка под вакуумом, затем снова растворяли в метаноле. После экстракции метиленхлоридом спиртовую фракцию концентрировали до сухого остатка и перерастворяли в смеси этанол-метиленхлорид 1:1. После осветления силикагелем раствор концентрировали под вакуумом; затем метиленхлорид замещали этанолом. Результирующую суспензию концентрировали и оставляли кристаллизоваться. Вторую кристаллизацию с этанолом проводили после дополнительных стадий перерастворения твердого вещества в смесях этанол-хлороформ и осветления на силикагеле. После очистки получали суммарное количество продукта 49,9 г с выходом очистки 96% и чистотой 99,5%.The final fermentation culture broth (total volume of about 10 L) containing about 5.2 g / L of thiocolchicoside as determined by HPLC was subjected to cross-flow microfiltration on a 0.22 μm ceramic cartridge to separate cells from the broth. The permeate was absorbed on a column filled with XAD 180 absorption resin (Rohm and Haas). After washing with water, the product was eluted with methanol. The methanol eluate was concentrated to dryness under vacuum, then redissolved in methanol. After extraction with methylene chloride, the alcohol fraction was concentrated to a dry residue and redissolved in a 1: 1 ethanol-methylene chloride mixture. After clarification with silica gel, the solution was concentrated in vacuo; then methylene chloride was replaced with ethanol. The resulting suspension was concentrated and allowed to crystallize. The second crystallization with ethanol was carried out after additional stages of solid re-dissolution in ethanol-chloroform mixtures and clarification on silica gel. After purification, a total product amount of 49.9 g was obtained with a purification yield of 96% and a purity of 99.5%.
Полученный в результате продукт, проанализированный методами ЖХВР, С-ЯМР, Н-ЯМР и масс-спектроскопии, оказывается таким же, как стандартный тиоколхикозид.The resulting product, analyzed by HPLC, C-NMR, H-NMR and mass spectroscopy, turns out to be the same as standard thiocolchicoside.
Сравнительный пример 3Reference Example 3
Повторяли процедуру, описанную в примере 1, но тиоколхицин полностью добавляли в один прием при конечной концентрации 4 г/л в начале ферментации. Полученный в результате рост был очень слабым и практически блокировался после нескольких часов инкубации. Явный лизис клеток обнаруживался микроскопическим анализом. Анализ ТСХ и ЖХВО не показал заметной биотрансформации.The procedure described in example 1 was repeated, but thiocolchicine was completely added in one go at a final concentration of 4 g / l at the beginning of fermentation. The resulting growth was very weak and almost blocked after several hours of incubation. Explicit cell lysis was detected by microscopic analysis. TLC and HPLC analysis did not show significant biotransformation.
Сравнительный пример 4Reference Example 4
Повторяли процедуру, описанную в примере 1, но тиоколхицин полностью добавляли в один прием при конечной концентрации 1 г/л в начале ферментации, используя ферментационную среду ST, которая описана в WO 98/15642. Биотрансформация протекает медленнее, чем в примере 1, и была остановлена после 28 часов при конечной конверсии 90%, суммарной производительности 1,22 г/л и удельной производительности 0,044 г/л·ч тиоколхикозида.The procedure described in Example 1 was repeated, but thiocolchicine was completely added in one go at a final concentration of 1 g / L at the beginning of the fermentation using the ST fermentation medium described in WO 98/15642. Biotransformation proceeds more slowly than in example 1, and was stopped after 28 hours at a final conversion of 90%, a total productivity of 1.22 g / l and a specific productivity of 0.044 g / l · h of thiocolchicoside.
Таблица 1 показывает сравнение величин общей производительности, удельной производительности и конверсии тиоколхицина в тиоколхикозид по способу настоящего изобретения (А) и по способу по WO 98/15642 (В).Table 1 shows a comparison of the total productivity, specific productivity and conversion of thiocolchicine to thiocolchicoside according to the method of the present invention (A) and according to the method according to WO 98/15642 (B).
*добавленный субстрат (тиоколхицин); 4 г/л (А); 1 г/л (В).* added substrate (thiocolchicine); 4 g / l (A); 1 g / l (B).
Состав культуральной средыtable 2
The composition of the culture medium
Claims (10)
где R1 представляет O-гликозидный остаток, R2 представляет водород или C1-С7 ацил, R3 представляет C1-С6 алкокси или C1-С6 тиоалкил, включающий биотрансформацию соединений, в которых R1 представляет ОН или метокси, посредством Bacillus megaterium, где указанный способ включает многократную дробную подпитку предварительно инокулированной культуры, содержащей деметилированный колхициноид, соединением формулы (I), в котором R1 представляет ОН или метокси, для индуцирования гликозилирующей ферментной системы используют деметилированные колхициноиды.1. The method of obtaining 3-O-glycosylcolchicinoid compounds of the formula
where R 1 represents an O-glycoside residue, R 2 represents hydrogen or C 1 -C 7 acyl, R 3 represents C 1 -C 6 alkoxy or C 1 -C 6 thioalkyl, including the biotransformation of compounds in which R 1 represents OH or methoxy , by means of Bacillus megaterium, wherein said method comprises multiple fractional feeding of a pre-inoculated culture containing demethylated colchicinoid with a compound of formula (I) in which R 1 is OH or methoxy, demethylated colchicinoids are used to induce a glycosylating enzyme system.
предварительное добавление 3-O-деметилколхициноида в инокулированную культуру;
добавление аликвот колхициноидного субстрата по 300-800 мг/л, который должен быть конвертирован, в начале и каждые 1-3 ч в течение первых 14-18 ч биотрансформации;
добавление при каждой подпитке субстратом раствора, содержащего следующие исходные материалы;
a) пептон или триптон, или гидролизат казеина до конечной концентрации 2-4 г/л в сочетании с 1-3 г/л сульфата аммония:
b) глюкозу или фруктозу до конечной концентрации 5-15 г/л.8. The method according to any one of claims 1 to 7, including:
preliminary addition of 3-O-demethylcolchicinoid to the inoculated culture;
the addition of aliquots of a colchicinoid substrate of 300-800 mg / l, which should be converted, at the beginning and every 1-3 hours during the first 14-18 hours of biotransformation;
adding at each substrate feed a solution containing the following starting materials;
a) peptone or tryptone, or casein hydrolyzate to a final concentration of 2-4 g / l in combination with 1-3 g / l of ammonium sulfate:
b) glucose or fructose to a final concentration of 5-15 g / l.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2006139742/13A RU2346050C2 (en) | 2004-05-12 | 2004-05-12 | Biotransformation of colchicine compounds |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2006139742/13A RU2346050C2 (en) | 2004-05-12 | 2004-05-12 | Biotransformation of colchicine compounds |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2006139742A RU2006139742A (en) | 2008-05-27 |
| RU2346050C2 true RU2346050C2 (en) | 2009-02-10 |
Family
ID=39586061
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2006139742/13A RU2346050C2 (en) | 2004-05-12 | 2004-05-12 | Biotransformation of colchicine compounds |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2346050C2 (en) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR1344157A (en) * | 1959-05-22 | 1963-11-29 | Roussel Uclaf | New colchicines and their process for obtaining |
-
2004
- 2004-05-12 RU RU2006139742/13A patent/RU2346050C2/en active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR1344157A (en) * | 1959-05-22 | 1963-11-29 | Roussel Uclaf | New colchicines and their process for obtaining |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2006139742A (en) | 2008-05-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2252725C (en) | A process for the biotransformation of colchicinoid compounds into the corresponding 3-glycosyl derivatives | |
| Yoshimoto et al. | New anthracycline metabolites from mutant strains of Streptomyces galilaeus MA144-M1 I. Isolation and characterization of various blocked mutants | |
| US7910334B2 (en) | Biotransformation of colchicinoid compounds | |
| RU2346050C2 (en) | Biotransformation of colchicine compounds | |
| US6372458B1 (en) | Process for the biotransformation of colchicone compounds into the correspondence 3-glycosyl derivatives | |
| HK1103304B (en) | Biotransformation of colchicinoid compounds | |
| JP4198883B2 (en) | Method for biological conversion of colchicone compounds to the corresponding 3-glycosyl derivatives | |
| HK1019620B (en) | A process for the biotransformation of colchicinoid compounds into the corresponding 3-glycosyl derivatives |