RU2345781C2 - Method of production of skin cell culture - Google Patents
Method of production of skin cell culture Download PDFInfo
- Publication number
- RU2345781C2 RU2345781C2 RU2007102377/15A RU2007102377A RU2345781C2 RU 2345781 C2 RU2345781 C2 RU 2345781C2 RU 2007102377/15 A RU2007102377/15 A RU 2007102377/15A RU 2007102377 A RU2007102377 A RU 2007102377A RU 2345781 C2 RU2345781 C2 RU 2345781C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- petri dish
- explant
- skin
- fragments
- culture
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 15
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims abstract description 35
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 32
- 238000003825 pressing Methods 0.000 claims abstract description 19
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 14
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 claims abstract description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 2
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 abstract 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 33
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 5
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 5
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 2
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 2
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 210000001217 buttock Anatomy 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 1
- 241001448434 Pirex Species 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229930194936 Tylosin Natural products 0.000 description 1
- 239000004182 Tylosin Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 1
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000002316 cosmetic surgery Methods 0.000 description 1
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 238000002690 local anesthesia Methods 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011505 plaster Substances 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229960004059 tylosin Drugs 0.000 description 1
- WBPYTXDJUQJLPQ-VMXQISHHSA-N tylosin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)O[C@H]([C@@H]([C@H]1N(C)C)O)O[C@@H]1[C@@H](C)[C@H](O)CC(=O)O[C@@H]([C@H](/C=C(\C)/C=C/C(=O)[C@H](C)C[C@@H]1CC=O)CO[C@H]1[C@@H]([C@H](OC)[C@H](O)[C@@H](C)O1)OC)CC)[C@H]1C[C@@](C)(O)[C@@H](O)[C@H](C)O1 WBPYTXDJUQJLPQ-VMXQISHHSA-N 0.000 description 1
- 235000019375 tylosin Nutrition 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, точнее к клеточным технологиям, и к способам культивирования клеток человека и животных, используемых в косметологии, пластической хирургии и научных исследованиях.The invention relates to medicine, more specifically to cell technology, and to methods for culturing human and animal cells used in cosmetology, plastic surgery and scientific research.
Известен метод получения культуры клеток кожи, использующий обработку кожного эксплантата протеолитическими ферментами (см. Akira Takashima, Establishment of Fibroblast Cultures, Current Protocols in Cell Biology, 1998, 2.1.1-2.1.12.; патент РФ № 281776, опубл. 20.08.2006). Недостаток этого метода в агрессивном воздействии протеолитических ферментов на клетки, негативно отражающемся на их жизнеспособности.A known method of obtaining a culture of skin cells using the treatment of skin explant with proteolytic enzymes (see Akira Takashima, Establishment of Fibroblast Cultures, Current Protocols in Cell Biology, 1998, 2.1.1-2.1.12; RF patent No. 281776, publ. 20.08. 2006). The disadvantage of this method is the aggressive effect of proteolytic enzymes on cells, which negatively affects their viability.
Описан метод получения культур клеток кожи (см. патент США № 660850), при осуществлении которого фрагменты эксплантата помещаются на культуральную поверхность без применения каких-либо способов их фиксации на поверхности. Отсутствие фиксации неизбежно приводит к подвижности фрагментов, что негативно сказывается на процессе выхода клеток на культуральную поверхность. Скорость миграции клеток из эксплантата на поверхность чашки Петри или культурального матраса составляет менее 1 мм в сутки, и для эффективного перемещения клеток на поверхность фрагменты эксплантата должны сохранять неподвижность в течение, по меньшей мере, 2-3 суток. При периодической смене культуральной среды (что является необходимым для выращивания клеток), а также при неизбежном перемещении чашки Петри или матраса для микроскопирования либо для других целей происходит неизбежное смещение фрагментов эксплантата относительно культуральной поверхности. Подобные смещения сдерживают выход клеток на культуральную поверхность в большом количестве. Если фрагмент эксплантата перестает соприкасаться с поверхностью и начинает свободно плавать в среде, клетки в этом фрагменте оказываются полностью лишены возможности выхода на культуральную поверхность.A method for producing skin cell cultures is described (see US Pat. No. 6,608,550), in which the explant fragments are placed on the culture surface without using any methods of fixing them on the surface. The absence of fixation inevitably leads to the mobility of the fragments, which negatively affects the process of cell exit to the culture surface. The rate of migration of cells from the explant to the surface of the Petri dish or culture mattress is less than 1 mm per day, and to effectively move cells to the surface, the fragments of the explant must remain immobile for at least 2-3 days. With a periodic change in the culture medium (which is necessary for growing cells), as well as with the inevitable movement of a Petri dish or mattress for microscopy or for other purposes, an inevitable shift of the explant fragments relative to the culture surface occurs. Such displacements inhibit the exit of cells to the culture surface in large numbers. If the fragment of the explant ceases to come into contact with the surface and begins to float freely in the medium, the cells in this fragment are completely deprived of the opportunity to reach the culture surface.
Описанный метод выращивания клеток кожи является малоэффективным в связи с отсутствием фиксации эксплантата или его фрагментов, так как выход клеток на поверхность происходит лишь из некоторых фрагментов эксплантата, а количество вышедших клеток является небольшим.The described method of growing skin cells is ineffective due to the lack of fixation of the explant or its fragments, since the exit of cells to the surface occurs only from some fragments of the explant, and the number of released cells is small.
Для решения проблемы фиксации существует способ прижатия фрагментов эксплантата к поверхности чашки Петри тонким покровным стеклом (см. Akira Takashima, Establishment of Fibroblast Cultures, из кн. Current Protocols in Cell Biology, 1998, 2.1.1-2.1.12.). При этом покровное стекло несколько ограничивает подвижность фрагментов эксплантата. Однако, поскольку само стекло не закреплено, а прижатие фрагментов эксплантата обеспечивается его массой, фрагменты эксплантата и стекло в водной среде сохраняют подвижность. Проблема фиксации фрагментов эксплантата относительно культуральной поверхности остается нерешенной.To solve the fixation problem, there is a method of pressing the explant fragments to the surface of the Petri dish with a thin cover glass (see Akira Takashima, Establishment of Fibroblast Cultures, from the book Current Protocols in Cell Biology, 1998, 2.1.1-2.1.12.). In this case, the coverslip somewhat limits the mobility of the explant fragments. However, since the glass itself is not fixed, and the pressing of the fragments of the explant is ensured by its mass, the fragments of the explant and glass in the aquatic environment retain mobility. The problem of fixation of explant fragments relative to the culture surface remains unresolved.
Известен метод закрепления тонкого покровного стекла, прижимающего фрагменты эксплантата к поверхности, с помощью силиконового клея. Стекло приклеивается к поверхности чашки несколькими каплями силиконового клея после того, как на поверхности размещаются фрагменты эксплантата. Культуральная среда заливается после высыхания клея (см. Calvin В. Harley, Aging of cultured human skin fibroblasts, из кн. Animal cell culture - гл. 3 с.25-32; Volker Meske, Frank Albert, Thomas G. Ohm, Cell Cultures of Autopsy-Derived Fibroblasts, из кн. Human Cell Culture Protocols - гл. 7, с.111-123). Этот способ позволяет добиться надежной фиксации прижимающего стекла, вследствие чего выход клеток на поверхность существенно улучшается. Однако этот метод требует существенных затрат времени, необходимого для нанесения и высыхания силиконового клея (20-30 минут). Во время высыхания клея фрагменты эксплантата не находятся в жидкой среде и подвергаются воздействию высушивания, что снижает жизнеспособность клеток вследствие отсутствия трофики и нарушения осмотического баланса. В связи с этим их помещение в культуральную среду должно быть произведено как можно быстрее.A known method of fixing a thin coverslip, pressing fragments of the explant to the surface, using silicone glue. The glass adheres to the surface of the cup with a few drops of silicone glue after fragments of the explant are placed on the surface. The culture medium is poured after the glue has dried (see Calvin B. Harley, Aging of cultured human skin fibroblasts, from the book Animal cell culture - chap. 3 pp. 25-32; Volker Meske, Frank Albert, Thomas G. Ohm, Cell Cultures of Autopsy-Derived Fibroblasts, from the book Human Cell Culture Protocols - chap. 7, pp. 111-123). This method allows to achieve reliable fixation of the pressing glass, as a result of which the exit of cells to the surface is significantly improved. However, this method requires a significant investment of time required for applying and drying silicone glue (20-30 minutes). During the drying of the glue, the explant fragments are not in the liquid medium and are exposed to drying, which reduces the viability of the cells due to the absence of trophism and the violation of the osmotic balance. In this regard, their placement in the cultural environment should be carried out as quickly as possible.
Поскольку данный метод предполагает заливание культуральной среды только после высыхания клея, затраты времени достаточно велики для того, чтобы негативно сказаться на жизнеспособности клеток. При этом силиконовый клей, контактируя с культуральной средой, изменяет ее состав, что также негативно сказывается на последующем культивировании клеток кожи. Силиконовый клей трудно поддается стерилизации без ухудшения его потребительских свойств, что существенно повышает риск занесения инфекции внутрь чашки Петри. Поскольку во время культивирования фрагменты эксплантата контактируют не только с поверхностью чашки, но и с поверхностью стекла, клетки кожи заселяют обе поверхности одновременно. При извлечении из чашки прижимающего стекла, закрепленного с помощью клея, оно, как правило, ломается, что делает затруднительным снятие и использование клеток, заселивших поверхность стекла, и затрудняет работу сотрудников лаборатории.Since this method involves flooding the culture medium only after the glue dries, the time spent is large enough to adversely affect cell viability. In this case, silicone glue, in contact with the culture medium, changes its composition, which also negatively affects the subsequent cultivation of skin cells. Silicone glue is difficult to sterilize without compromising its consumer properties, which significantly increases the risk of infection inside the Petri dish. Since during the cultivation fragments of the explant come into contact not only with the surface of the cup, but also with the surface of the glass, skin cells populate both surfaces simultaneously. When the adhesive glass fixed with glue is removed from the cup, it usually breaks, which makes it difficult to remove and use the cells that populate the glass surface and complicates the work of laboratory staff.
Задачей изобретения является создание способа повышения эффективности и ускорения культивирования клеток кожи при использовании чашек Петри с прижимающим стеклом, позволяющим быстро фиксировать в чашке эксплантат без применения клея и создавать увеличенную площадь для заселения клетками.The objective of the invention is to provide a method for increasing the efficiency and accelerating the cultivation of skin cells using Petri dishes with pressing glass, which allows you to quickly fix the explant in the cup without the use of glue and create an increased area for colonization by cells.
Задача решается изготовлением и использованием специальной стеклянной пластинки, которая точно соответствует внутренним размерам чашки Петри и способна, упираясь в бортики чашки Петри в точках фиксации, плотно закрепляться параллельно культуральной поверхности чашки Петри и прижимать эксплантат к ее дну. Количество точек фиксации (углов пластинки) составляет не менее трех. Точки фиксации (углы пластинки) закругляются для того, чтобы предотвратить скалывание углов при вставлении пластинки в чашку Петри. Прижимающая стеклянная пластинка имеет площадь 40-70% от площади дна чашки Петри, это сохраняет полноценный газообмен между газовой и жидкой фазами. Толщина пластинки составляет не менее 0,5 мм, это обеспечивает достаточную прочность стекла для того, чтобы не сломать при извлечении из чашки. Благодаря этому можно снимать и использовать те клетки, которые в процессе культивирования выползли на поверхность стеклянной пластинки. Поскольку клетки, как правило, выходят на поверхность чашки и на поверхность пластинки в равных количествах, возможность снимать клетки со стеклянной пластинки позволяет увеличить количество получаемых клеток не менее чем в 2 раза. Благодаря этому количество времени, которое затрачивается на получение необходимого объема клеточной массы, существенно сокращается.The problem is solved by the manufacture and use of a special glass plate, which exactly corresponds to the internal dimensions of the Petri dish and is capable of abutting against the sides of the Petri dish at the fixation points, tightly fixed parallel to the cultural surface of the Petri dish and pressing the explant to its bottom. The number of fixation points (plate angles) is at least three. Fixation points (plate angles) are rounded in order to prevent chipping of the corners when inserting the plate into a Petri dish. The pressing glass plate has an area of 40-70% of the bottom area of the Petri dish, this preserves full gas exchange between the gas and liquid phases. The thickness of the plate is at least 0.5 mm, this provides sufficient strength of the glass so as not to break when removed from the cup. Due to this, it is possible to remove and use those cells that crawled to the surface of the glass plate during the cultivation process. Since cells, as a rule, reach the surface of the cup and the surface of the plate in equal amounts, the ability to remove cells from the glass plate allows you to increase the number of cells obtained by at least 2 times. Due to this, the amount of time spent on obtaining the necessary volume of cell mass is significantly reduced.
Основные параметры прижимающей стеклянной пластины: толщина - 0,5-3 мм; радиус закругления углов - 0,2-4 мм; допуск фиксирующих размеров - 0,1-0,15 мм; площадь пластины - 40-70% от площади чашки Петри. Размеры определены опытным путем и являются оптимальными для выращивания первичной культуры клеток кожи.The main parameters of the pressing glass plate: thickness - 0.5-3 mm; radius of curvature of the corners - 0.2-4 mm; tolerance of the fixing sizes - 0.1-0.15 mm; plate area - 40-70% of the area of the Petri dish. The sizes are determined empirically and are optimal for growing a primary culture of skin cells.
Прижимающая пластина, враспор вставленная внутрь чашки Петри, способна фиксировать фрагменты эксплантата на культуральной поверхности, лишив их какой-либо подвижности. При этом вставление пластинки в чашку, также как и ее демонтаж, требуют минимальных затрат времени, что позволяет сохранить клетки максимально жизнеспособными. Предложенное изобретение позволяет уменьшить время и трудозатраты, необходимые для помещения кожного эксплантата на культуральную поверхность. Благодаря этому могут быть снижены требования к квалификации персонала, выполняющего эту работу.The pressing plate, inserted into the Petri dish, is capable of fixing the explant fragments on the culture surface, depriving them of any mobility. At the same time, insertion of a plate into a cup, as well as its dismantling, require a minimum investment of time, which allows the cells to be kept as viable as possible. The proposed invention allows to reduce the time and labor required to place a skin explant on a culture surface. Due to this, the qualification requirements of the personnel performing this work can be reduced.
Способ обеспечивает надежную фиксацию фрагментов эксплантата без применения клея, что позволяет сохранить неизменным состав культуральной среды.The method provides reliable fixation of fragments of the explant without the use of glue, which allows you to maintain unchanged the composition of the culture medium.
Поскольку предложенная стеклянная пластинка не повреждается при использовании, она может быть отмыта, простерилизована и использована повторно, что повышает экономичность способа. Поскольку все компоненты системы фиксации легко поддаются стерилизации, отсутствует опасность занесения инфекции в чашку Петри, что также повышает эффективность способа и снижает возможные затраты.Since the proposed glass plate is not damaged during use, it can be washed, sterilized and reused, which increases the efficiency of the method. Since all components of the fixation system are easily sterilizable, there is no danger of infection in the Petri dish, which also increases the efficiency of the method and reduces possible costs.
Стеклянная пластинка для осуществления способа может быть изготовлена без существенных затрат времени и усилий. Наиболее удобно изготовить стекло треугольной формы, обработав его таким образом, чтобы углы пластинки, вставленной в чашку Петри, плотно упирались в ее боковые стенки, фиксируя стекло на чашке (см. чертеж).A glass plate for implementing the method can be made without significant investment of time and effort. It is most convenient to make glass of a triangular shape, having processed it in such a way that the corners of the plate inserted in the Petri dish firmly abut against its side walls, fixing the glass on the cup (see drawing).
На чертеже представлена чашка Петри (позиция 1), закрытая крышкой (позиция 2), с фрагментами эксплантата (позиция 3), прижимающей пластинкой треугольной формы (позиция 4) и культуральной средой (позиция 5).The drawing shows a Petri dish (position 1), closed by a lid (position 2), with fragments of the explant (position 3), a pressing plate with a triangular shape (position 4) and culture medium (position 5).
Предложенный способ выращивания первичной культуры осуществляется следующим образомThe proposed method for growing primary culture is as follows
У пациента производят иссечение кожного эксплантата. Область кожи, выбранная для иссечения, должна быть как можно менее подвержена процессам старения благодаря защищенности от воздействия ультрафиолета. Одним из наиболее удобных мест для иссечения является ягодичная область. Иссечение производят скальпелем на всю глубину кожи. Площадь эксплантата - 8-15 мм2. На рану накладывают косметический шов или специальный лейкопластырь, предназначенный для бесшовного сведения краев раны. Иссеченный эксплантат помещают в пробирку с солевым буферным раствором, содержащим антибиотики в концентрации, двукратно превышающей культуральную: пенициллин - 200 ЕД/мл, стрептомицин - 200 мкг/мл, тилозин - 20 мкг/мл, амфотерицин-В - 5 мкг/мл.A skin explant is excised from the patient. The area of the skin selected for excision should be as less susceptible to aging processes as it is protected from ultraviolet radiation. One of the most convenient places for excision is the gluteal region. Excision is done with a scalpel to the entire depth of the skin. The explant area is 8-15 mm 2 . A cosmetic suture or special adhesive plaster is applied to the wound, designed to seamlessly reduce the edges of the wound. The excised explant is placed in a test tube with saline buffer solution containing antibiotics at a concentration twice as high as the culture: penicillin - 200 U / ml, streptomycin - 200 μg / ml, tylosin - 20 μg / ml, amphotericin-B - 5 μg / ml.
Эксплантат разделяют на отдельные фрагменты, которые помещаются на поверхность чашки Петри. Предварительно простерилизованное (например, с помощью автоклавирования) прижимающее стекло вставляют в чашку таким образом, что оно прижимает фрагменты эксплантата к поверхности чашки, при этом плотно фиксируясь за счет упора своими углами во внутренние борта чашки (см. фиг.1). Незамедлительно заливают культуральную среду, содержащую все необходимые для культивирования компоненты. Культивирование производят при 37°С, 5% CO2 в составе газовой фазы среды и 95%-ной влажности. Культуральную среду меняют через каждые 2-3 дня. Производится регулярный визуальный контроль клеточной популяции.The explant is divided into separate fragments, which are placed on the surface of the Petri dish. A pre-sterilized (e.g., by autoclaving) pressing glass is inserted into the cup in such a way that it presses the explant fragments to the surface of the cup, while being firmly fixed due to the abutment with its corners to the inner sides of the cup (see Fig. 1). Immediately fill the culture medium containing all the components necessary for cultivation. Cultivation is carried out at 37 ° C, 5% CO 2 in the composition of the gas phase of the medium and 95% humidity. The culture medium is changed every 2-3 days. Regular visual control of the cell population is performed.
После того как фибробласты вышли на внутренние поверхности чашки и стекла в необходимом количестве, стекло вынимают из чашки и помещают на другую чистую чашку Петри, перевернув вверх той стороной, на которой находятся клетки. Не допуская высыхания стекла, его заливают солевым буферным раствором либо культуральной средой. Поверхности чашки и стекла многократно промывают солевым буферным раствором, после чего обрабатывают раствором трипсина в соответствии с общепринятыми методами (см. Akira Takashima, Establishment of Fibroblast Cultures, Current Protocols in Cell Biology, 1998, 2.1.1-2.1.12; Volker Meske, Frank Albert, Thomas G. Ohm, Cell Cultures of Autopsy-Derived Fibroblasts, Human Cell Culture Protocols - гл.7, с 111-123; патент США № 5660850; патент РФ № 2281776). После трипсинизации клетки отделяются от культуральной поверхности, остатки трипсина ингибируют с помощью сыворотки либо с помощью специального ингибитора трипсина.After the fibroblasts have reached the inner surfaces of the cup and glass in the required quantity, the glass is removed from the cup and placed on another clean Petri dish, turned upside down on the side on which the cells are located. Preventing drying of the glass, it is poured with saline buffer solution or culture medium. The surfaces of the cup and glass are washed repeatedly with saline buffered saline and then treated with trypsin solution in accordance with generally accepted methods (see Akira Takashima, Establishment of Fibroblast Cultures, Current Protocols in Cell Biology, 1998, 2.1.1-2.1.12; Volker Meske, Frank Albert, Thomas G. Ohm, Cell Cultures of Autopsy-Derived Fibroblasts, Human Cell Culture Protocols - chap. 7, pp. 111-123; US patent No. 5660850; RF patent No. 2281776). After trypsinization, the cells are separated from the culture surface, the trypsin residues are inhibited using serum or using a special trypsin inhibitor.
Снятые клетки могут быть перенесены для дальнейшего культивирования, использованы в исследовательских или терапевтических целях.Harvested cells can be transferred for further cultivation, used for research or therapeutic purposes.
Неочевидным эффектом предложенного способа выращивания первичной культуры клеток кожи является то, что за счет применения прижимающей стеклянной пластинки заданных параметров, изготовленной под серию чашек Петри, удается существенно (в 2 и более раза) увеличить выход первичной культуры клеток кожи при снижении трудозатрат и времени на культивирование.An unobvious effect of the proposed method for growing a primary culture of skin cells is that due to the use of a pressing glass plate of predetermined parameters, made for a series of Petri dishes, it is possible to significantly (2 or more times) increase the yield of the primary skin cell culture while reducing labor costs and time for cultivation .
Способ отличается простотой и удобством, а также возможностью многократного использования прижимающего стекла, предусмотренного в способе, благодаря чему способ может найти применение в широкой практике.The method is simple and convenient, as well as the ability to reuse the pressing glass provided for in the method, so that the method can find application in wide practice.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.The invention is illustrated by the following examples.
Пример 1.Example 1
Применяли прижимающие стеклянные пластины из стекла Pirex треугольной формы, толщиной стекла 1,5 мм и радиусом закругления углов 1 мм, количество пластинок - 6 штук. Размер пластин точно соответствовал внутреннему размеру стерильных пластиковых чашек Петри диаметром 40 мм и позволял стеклянным пластинам плотно вставляться враспор внутрь культуральной чашки. Прижимающие стеклянные пластинки стерилизовали с помощью автоклавирования.We used clamping glass plates made of triangular-shaped Pirex glass with a glass thickness of 1.5 mm and a corner radius of 1 mm, the number of plates was 6 pieces. The size of the plates corresponded exactly to the internal size of the sterile plastic Petri dishes with a diameter of 40 mm and allowed the glass plates to be inserted tightly into the culture dish. The pressing glass plates were sterilized by autoclaving.
Кожный эксплантат иссекали под местной анестезией с ягодичной области у двух добровольцев женского пола возрастом 45 и 52 года. Площадь эксплантата в обоих случаях составляла 12 мм2. Иссеченные эксплантаты помещались в пробирку с солевым буферным раствором PBS и антибиотиками. Каждый полученный эксплантат разделяли на 9 фрагментов, после чего фрагменты возвращали в пробирку с солевым буферным раствором PBS. Все манипуляции с эксплантатами и клетками производились в ламинарном боксе 2-го класса биологической защиты.The skin explant was excised under local anesthesia from the gluteal region in two female volunteers aged 45 and 52 years. The explant area in both cases was 12 mm 2 . Excised explants were placed in a test tube with PBS saline buffer and antibiotics. Each obtained explant was divided into 9 fragments, after which the fragments were returned to the tube with PBS saline buffer solution. All manipulations with explants and cells were performed in a laminar box of the 2nd class of biological protection.
Фрагменты помещали на дно сухих стерильных пластиковых чашек Петри в количестве 3 фрагмента на чашку, после чего в каждую чашку вставляли стеклянную пластину, добиваясь прижатия фрагментов эксплантата ко дну чашки. Заливали культуральную среду DIMEM, содержащую 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 10% фетальной телячьей сыворотки. Время, прошедшее между извлечением фрагментов кожи из солевого буферного раствора и помещением их в культуральную среду, составляло не более 1 мин.Fragments were placed on the bottom of dry sterile plastic Petri dishes in the amount of 3 fragments per cup, after which a glass plate was inserted into each cup, ensuring that the fragments of the explant were pressed to the bottom of the cup. Poured DIMEM culture medium containing 100 IU / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin and 10% fetal calf serum. The time elapsed between the extraction of skin fragments from the saline buffer solution and their placement in the culture medium was no more than 1 min.
Чашки с фрагментами кожи помещали в CO2-инкубатор, содержащий 5% CO2 в составе газовой фазы среды. Инкубировали в течение 9 суток, сменяя среду на чашках через каждые 3 суток.Cups with skin fragments were placed in a CO 2 incubator containing 5% CO 2 in the gas phase of the medium. Incubated for 9 days, changing the medium on the plates every 3 days.
По прошествии 9 суток из всех чашек извлекали прижимающие стеклянные пластины и помещали на чистые чашки Петри в перевернутом виде. Поверхности всех 6 чашек, на которых производилось культивирование, и поверхности всех 6 стекол промывали от остатков среды с помощью солевого буферного раствора PBS. Затем поверхности обрабатывали с помощью 0,25%-ного раствора трипсина в течение 5 минут для снятия клеток, после чего в чашки добавляли культуральную среду, содержащую 10% фетальной телячьей сыворотки. Среду, содержащую остатки трипсина и клетки кожи, отделившиеся от культуральных поверхностей, помещали в стерильные пробирки и центрифугировали при 150 g в течение 10 минут.After 9 days, pressing glass plates were removed from all cups and placed on clean Petri dishes upside down. The surfaces of all 6 cups on which cultivation was performed and the surfaces of all 6 glasses were washed from residual media using PBS saline buffer. Then the surfaces were treated with a 0.25% trypsin solution for 5 minutes to remove cells, after which culture medium containing 10% fetal calf serum was added to the dishes. Medium containing trypsin residues and skin cells separated from the culture surfaces was placed in sterile tubes and centrifuged at 150 g for 10 minutes.
Полученный при центрифугировании осадок клеток ресуспендировали в 100 мкл солевого буферного раствора PBS. Полученную взвесь клеток помещали в камеру Гаряева и подсчитывали их количество общепринятым способом.The cell pellet obtained by centrifugation was resuspended in 100 μl of PBS saline buffer solution. The resulting suspension of cells was placed in the Garyaev chamber and their number was calculated in the conventional manner.
В результате общее количество клеток кожи, полученное из эксплантата добровольца 45 лет за 9 суток, составило 360000 клеток, а из эксплантата добровольца 52 лет - 325000 клеток. Описанный пример демонстрирует надежность и эффективность разработанного способа.As a result, the total number of skin cells obtained from a 45-year-old volunteer explant in 9 days amounted to 360,000 cells, and 325,000 cells from a 52-year-old volunteer explant. The described example demonstrates the reliability and effectiveness of the developed method.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2007102377/15A RU2345781C2 (en) | 2007-01-22 | 2007-01-22 | Method of production of skin cell culture |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2007102377/15A RU2345781C2 (en) | 2007-01-22 | 2007-01-22 | Method of production of skin cell culture |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2007102377A RU2007102377A (en) | 2008-08-10 |
| RU2345781C2 true RU2345781C2 (en) | 2009-02-10 |
Family
ID=39745730
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2007102377/15A RU2345781C2 (en) | 2007-01-22 | 2007-01-22 | Method of production of skin cell culture |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2345781C2 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2588835C1 (en) * | 2014-11-27 | 2016-07-10 | Олег Германович Макеев | Method for therapy of skin damages and biotransplant therefor |
| RU2617237C2 (en) * | 2015-06-23 | 2017-04-24 | Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Северный государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for production of isolated dermis cells preparations |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2014359C1 (en) * | 1992-02-12 | 1994-06-15 | Радюхин Виктор Алексеевич | Three-dimensional bioactive carrier for mammalian cells and tissues cultivation |
| US5591444A (en) * | 1995-07-28 | 1997-01-07 | Isolagen Technologies, Inc. | Use of autologous dermal fibroblasts for the repair of skin and soft tissue defects |
| RU2280459C2 (en) * | 1999-05-14 | 2006-07-27 | Скинмедика, Инк. | Agent for growth rate or cells reproduction alteration, method for its preparing, method for stimulation of wound healing or burn treatment, method for correction of cosmetic defect, method for inhibition of skin aging and method for stimulation of hair growth |
-
2007
- 2007-01-22 RU RU2007102377/15A patent/RU2345781C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2014359C1 (en) * | 1992-02-12 | 1994-06-15 | Радюхин Виктор Алексеевич | Three-dimensional bioactive carrier for mammalian cells and tissues cultivation |
| US5591444A (en) * | 1995-07-28 | 1997-01-07 | Isolagen Technologies, Inc. | Use of autologous dermal fibroblasts for the repair of skin and soft tissue defects |
| US5665372A (en) * | 1995-07-28 | 1997-09-09 | Isolagen Technologies, Inc. | Autologous dermal fibroblasts for the repair of skin and soft tissue defects |
| RU2280459C2 (en) * | 1999-05-14 | 2006-07-27 | Скинмедика, Инк. | Agent for growth rate or cells reproduction alteration, method for its preparing, method for stimulation of wound healing or burn treatment, method for correction of cosmetic defect, method for inhibition of skin aging and method for stimulation of hair growth |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| TAKASHIMA A. Esteblishment offibroblast cultures. Current protocols in cell biology, 1998, 2.1.1-2.1.12. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2588835C1 (en) * | 2014-11-27 | 2016-07-10 | Олег Германович Макеев | Method for therapy of skin damages and biotransplant therefor |
| RU2617237C2 (en) * | 2015-06-23 | 2017-04-24 | Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Северный государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for production of isolated dermis cells preparations |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2007102377A (en) | 2008-08-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9206391B2 (en) | Method for preparing biological tissue | |
| US20180042220A1 (en) | Method for cryopreserving sheet-shaped cell culture | |
| US20100184182A1 (en) | Method for preparing biological tissue | |
| US9440004B2 (en) | Method for preparing biological tissue | |
| CN105647857A (en) | Separation and purification method for skeletal muscle satellite cells in goats | |
| CN109486753A (en) | A kind of fat stem cell extracting method | |
| JP7282232B2 (en) | Methods for modifying adherent cell cultures | |
| Goodwin et al. | 3D tissue-like assemblies: A novel approach to investigate virus–cell interactions | |
| WO2019015584A1 (en) | Human dental pulp stem cell growth medium and preparation method for human dental pulp stem cells | |
| JP6468714B2 (en) | Cultivation container and method for producing a plurality of laminated cell sheets using the same | |
| RU2345781C2 (en) | Method of production of skin cell culture | |
| Bellu et al. | Isolating stem cells from skin: Designing a novel highly efficient non-enzymatic approach | |
| US20200362310A1 (en) | Method for producing sheet-shaped cell culture | |
| CN221701549U (en) | Cultivation device and culture vessel thereof | |
| WO2025157093A1 (en) | Culture device, method for processing culture device, and cell culture method | |
| CN209602552U (en) | A fixed device for seeding cells on ordinary slides | |
| EP4257668A1 (en) | Cell culture device for producing cell sheet, kit for producing cell sheet and method for producing cell sheet | |
| CN111518743A (en) | A method for constructing an in vitro thermal injury model of human dermal fibroblasts and its application | |
| RU2620981C2 (en) | Method of obtaining the culture of mesenchymal human stem cells from the perivascular space of the vein of umbilical cord | |
| CN110628706A (en) | Method for extracting and culturing embryonic neural stem cells in vitro and preparation of culture medium | |
| CN109771697B (en) | Dermal fibroblast skin sheet and construction method and application thereof | |
| JP2023067822A (en) | Cell detachment solution, cell detachment method, and cell preservation method | |
| WO2021065986A1 (en) | Container for separating live cells | |
| CN110592005A (en) | Method for separating mesenchymal stem cells | |
| EP4578942A1 (en) | Method for obtaining stem cells from dental pulp |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20090123 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20120210 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20170123 |