RU2234535C2 - Субстрат для определения активности интегразы вируса иммунодефицита человека - Google Patents
Субстрат для определения активности интегразы вируса иммунодефицита человека Download PDFInfo
- Publication number
- RU2234535C2 RU2234535C2 RU2002126506/13A RU2002126506A RU2234535C2 RU 2234535 C2 RU2234535 C2 RU 2234535C2 RU 2002126506/13 A RU2002126506/13 A RU 2002126506/13A RU 2002126506 A RU2002126506 A RU 2002126506A RU 2234535 C2 RU2234535 C2 RU 2234535C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- substrate
- integrase
- dna
- activity
- determination
- Prior art date
Links
- 239000000758 substrate Substances 0.000 title claims abstract description 53
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 title claims abstract description 50
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 title claims abstract description 49
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 36
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 title claims abstract description 21
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 22
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 9
- 230000001566 pro-viral effect Effects 0.000 claims description 8
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 claims description 5
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 claims description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 abstract description 46
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 19
- 239000013615 primer Substances 0.000 abstract description 11
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 abstract description 10
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 abstract description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 7
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 abstract description 7
- 108040002590 retroviral 3' processing activity proteins Proteins 0.000 abstract description 7
- 238000006713 insertion reaction Methods 0.000 abstract description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 abstract description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 abstract description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 4
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 abstract description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 2
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 abstract description 2
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 abstract 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 abstract 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 abstract 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 abstract 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 11
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 108010002459 HIV Integrase Proteins 0.000 description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 4
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 4
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 4
- GIXWDMTZECRIJT-UHFFFAOYSA-N aurintricarboxylic acid Chemical compound C1=CC(=O)C(C(=O)O)=CC1=C(C=1C=C(C(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C(C(O)=O)=C1 GIXWDMTZECRIJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 4
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 4
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 241001143500 Aceraceae Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 2
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 2
- 101150030339 env gene Proteins 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 description 2
- 101150098622 gag gene Proteins 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000002601 radiography Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000001226 reprecipitation Methods 0.000 description 2
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- 241000208140 Acer Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 108700020129 Human immunodeficiency virus 1 p31 integrase Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- 108010015078 Pregnancy-Associated alpha 2-Macroglobulins Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101710136739 Teichoic acid poly(glycerol phosphate) polymerase Proteins 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002259 anti human immunodeficiency virus agent Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 108010052305 exodeoxyribonuclease III Proteins 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 229940124524 integrase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000002850 integrase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940057995 liquid paraffin Drugs 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- XZNXVSDNACTASG-RZNNTOFGSA-M sodium;3,5-diacetamido-2,4,6-triiodobenzoate;3,5-diacetamido-2,4,6-triiodobenzoic acid;(2r,3r,4r,5s)-6-(methylamino)hexane-1,2,3,4,5-pentol Chemical compound [Na+].CNC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO.CC(=O)NC1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C(O)=O)=C1I.CC(=O)NC1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C([O-])=O)=C1I XZNXVSDNACTASG-RZNNTOFGSA-M 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Субстрат предназначен для определения активности интегразы вируса иммунодефицита человека in vitro. Субстрат получают синтезом олигонуклеотидных праймеров комплементарных консервативной области наибольшего сходства геномов различных штаммов вируса иммунодефицита человека, амплификацию последовательности ДНК, комплементарной ковалентно замкнутым кольцевым формам ДНК вируса иммунодефицита, полимеразной цепной реакцией. Затем повторной амплификацией парой гнездовых праймеров получают ДНК продукт, состоящий из двух параллельно ориентированных интактных LTR-последовательностей длиной 1200-1300 п.н. Полученный ДНК продукт метится посредством фрагмента Кленова и [α-р32]ТТР для определения активности интегразы в реакции 3’-процессинга и посредством фрагмента Кленова и набора [α-p32]dNTP для определения активности интегразы в реакции встраивания. Меченный ДНК продукт используют для определения активности интегразы in vitro с дальнейшим анализом продуктов реакции в полиакриламидном геле и радиоавтографированием. Предложенный субстрат повышает быстроту проведения измерения активности интегразы in vitro при сохранении специфичности и идентичности сконструированного субстрата природному субстрату интегразы вируса иммунодефицита человека. 2 з.п. ф-лы, 3 ил.
Description
Изобретение относится к молекулярной биологии, а именно к энзимологии, и может быть использовано в вирусологии для выявления потенциальных ингибиторов интегразы вируса иммунодефицита человека.
Вирус иммунодефицита человека, относящийся к семейству ретровирусов, вызывает хроническую инфекцию чувствительных клеток, используя при этом стратегию репликации, которая выделяет его среди других животных вирусов. После связывания вируса с клеткой-мишенью вирусный геном в виде одноцепочечной РНК высвобождается в цитоплазму хозяйской клетки. В ходе репликации в клетке вирусная РНК проходит стадию обратной транскрипции, которую осуществляет вирус специфичный фермент - обратная транскриптаза, с образованием двуцепочечной ДНК с длинными концевыми повторами (LTR) [1]. В процессе репродукции вируса иммунодефицита человека образуются по крайней мере три формы ДНК провируса: линейная копия вирусного генома, которая является субстратом для интеграции [2] и две кольцевые формы с одним или двумя LTR, функциональная роль которых до сих пор остается неясной [3]. Встраивание линейной формы ДНК провируса в геном клетки-хозяина осуществляется при помощи вирусного фермента - интегразы.
Вирусная интеграза (ИН) в несколько стадий осуществляет встраивание ДНК провируса в геном клетки-хозяина. На первой стадии удаляются два нуклеотида с 3’-концов LTR вновь синтезированной провирусной ДНК. Эта сайт-специфичная эндонуклеазная активность называется реакцией 3’-процессинга. Последующие стадии интеграции происходят после проникновения комплекса из цитоплазмы в ядро. Ядерный этап интегрирования включает образование одноцепочечных разрезов в хозяйской ДНК и лигирование с процессированными 3’-ОН LTR-концами - реакция встраивания.
До настоящего времени для определения активности интегразы ретровирусов in vitro используются различные радиоактивные двуцепочечные дуплексы длиной 20-26 нуклеотидов.
Известен радиоактивный дуплекс, используемый в способе определения активности интегразы [4].
Дуплекс получают синтезом комплементарных дезоксиолигонуклеотидов, конструированием из гибридизованных комплементарных олигонуклеотидов, мечением радиоактивными изотопами. Полученный радиоактивно меченный дуплекс инкубируют с препаратом очищенной интегразы и полученные продукты анализируют в полиакриламидном геле.
Известен флуоресцентно меченный дуплекс из метода измерения активности ретровирусной интегразы [5]. Измерение активности ретровирусной интегразы в реакции 3’-процессинга происходит по возрастанию интенсивности флуоресценции при отщеплении GT-динуклеотида.
К недостаткам данных субстратов можно отнести то, что при ингибиторном анализе результаты, полученные при помощи тест-системы оценки активности интегразы in vitro на основе олигонуклеотидных дуплексов, не коррелируют с результатами, полученными в культуре ВИЧ-инфицированных клеток [6]. Это ставит вопрос об адекватной интерпретации существующих на сегодняшний день данных о функциональной роли интегразы. Вследствие этого на сегодняшний день ведутся поиски тест-системы оценки активности интегразы, основанной на использовании протяженного ДНК-субстрата фланкированного LTR-фрагментами, которые узнаются интегразой вируса иммунодефицита человека.
Наиболее близким к предлагаемому изобретению является субстрат, полученный конструированием плазмиды, содержащей концевые последовательности провирусной ДНК, известный из способа определения активности интегразы ВИЧ [7, прототип]. Субстрат получают так: проводят амплификацию концов провирусной ДНК при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР), в присутствии двух пар ВИЧ-специфических праймеров, клонируют в векторную плазмиду pBKRSV ("Stratagene", Канада), нарабатывают полученную плазмидную конструкцию, линеаризуют плазмиду при помощи рестриктазы, получают 5’-выступающий конец посредством нуклезы ExoIII и в дальнейшем достраивают Т7 ДНК-полимеразой с использованием радиоактивно меченных нуклеотидов. Полученный радиоактивно меченный субстрат используется для определения активности интегразы в реакции встраивания с последующим разделением продуктов реакции в полиакриламидном геле и радиоавтографированием. Для определения активности интегразы в реакции 3’-процессинга проводят рестрикцию полученной плазмидной конструкции для получения фрагмента 107 п.н. с последующим введением радиоактивной метки.
Основным недостатком данного субстрата является то, что он получается различный по длине и составу, что влияет на результаты определения активности интегразы в реакциях 3’-процессинга и встраивания. Применение данной системы для скриннинга ингибиторов интегразы для отбора потенциальных анти-ВИЧ препаратов затрудняется из-за многостадийности конструирования субстрата, использования дорогостоящих малодоступных ферментов, а также из-за дополнительной стадии наработки плазмиды в бактериальной системе Е.coli. Также из-за трудоемкости получения субстрата использование данного способа затрудняет конструирование субстратов, гомологичных различным штаммам вируса иммунодефицита человека, для исследования влияния природных нуклеотидных замен в субстрате на функциональную активность интегразы.
Технической задачей изобретения является конструирование субстрата, идентичного природному субстрату интегразы ВИЧ, позволяющего повысить быстроту проведения измерения активности интегразы in vitro и дающего возможность комплексного исследования функциональной активности интегразы в нескольких реакциях (3’-процессинга и встраивания) на одном субстрате.
Поставленная техническая задача изобретения решается выбором и синтезом олигонуклеотидных праймеров, таким образом, что амплифицируются только фрагменты ДНК, гомологичные кольцевым формам кДНК вируса иммунодефицита человека.
Субстрат для определения активности интегразы состоит из фрагмента 1200-1300 п.н. комплементарного интактным параллельно ориентированным длинным концевым повторам (LTR) ВИЧ. Субстрат является неинфекционной мини-копией вирусного генома, что позволяет изучать процесс интеграции в условиях, максимально приближенных к естественным.
Длинные концевые повторы (размер 600-650 п.н.) расположены на 5’ и 3’ концах провирусной ДНК, причем ориентация относительно друг друга параллельная. 5’ район LTR является промоторно-энхансерным районом вируса и состоит из множества функциональных элементов, осуществляющих базальную и регулируемую экспрессию вирусных генов. LTR ВИЧ делится на три области: U3, R и U5, которые содержат различные районы для связывания клеточных факторов транскрипции.
Первичная последовательность LTR играет важную роль в процессе интеграции. Оба 3’-ОН конца LTR играет важную роль в процессе интеграции. Оба 3’-ОН конца LTR несут консервативный СА-динуклеотид в позиции 3,4, с которым специфично связывается интеграза. После связывания с субстратом интеграза отщепляет два концевых динуклеотида GT с 3’-ОН конца. Полученный ДНК-продукт с гидролизованными 3’-ОН концами интеграза встраивает в геном хозяйской клетки. При использовании предлагаемого субстрата в качестве ДНК для встраивания используют избыток ДНК плазмиды.
Праймеры выбирают в консервативной области геномов различных штаммов вируса иммунодефицита человека так, что имеют 100% гомологию между различными штаммами вируса иммунодефицита человека, что позволяет амплифицировать субстрат для интегразы, гомологичный различным штаммам вируса, используя одни и те же праймеры. Первой парой праймеров амплифицируют последовательность, состоящую из двух параллельно ориентированных LTR-последовательностей, с 5’ конца части гена env и с 3’ конца части гена gag. Второй парой праймеров на внутреннюю область полученного фрагмента амплифицируется непосредственно субстрат для интегразы, содержащий на концах динуклеотид СА, в положениях 3, 4 3’-ОН конца, который специфически узнается интегразой. Далее полученный ДНК фрагмент радиоактивно метится с помощью фрагмента Кленова и используется для определения активности интегразы в реакциях 3’-процессинга и встраивания. О положительном результате реакции судили по появлению продукта, выявляемого электрофорезом в полиакриламидном геле.
Субстрат получают следующим образом.
На первом этапе выбираются и синтезируются две пары олигонуклеотидных праймеров, комплементарных консервативной области наибольшего сходства геномов различных штаммов вируса иммунодефицита человека 1-го типа. Причем ориентированность праймеров должна быть таким образом, что амплифицируется только фрагмент, комплементарный кольцевым формам ДНК (фиг.1). Например: S1–5’-GGGGTGGGAGCAGCATCTCG-3’ (на конец гена env) и S2–5’-TCTTGCCGTGCGCGCTTCAG-3’ (на начало гена gag). Затем повторным амплифицированием парой гнездовых праймеров непосредственно на концы LTR: N1-5’-ACTGGAAGGGCTAATTCACTCC-3’ и N2-5’-ACTGCTAGAGATTTTCCACACTG-3’; получают ДНК продукт, который содержит сайт - СА-динуклеотид на 3’-ОН конце для специфического узнавания интегразы и состоит из двух параллельно ориентированных интактных LTR-последовательностей длинной 1200-1300 п.н. Полученный ДНК продукт метится посредством фрагмента Кленова и [α-р32]ТТР для определения активности интегразы в реакции 3’-процессинга и посредством фрагмента Кленова и набора [α-p32]dNTP для определения активности интегразы в реакции встраивания.
Существенное отличие заявляемого субстрата от известного прототипа:
в качестве субстрата используется протяженная 1200-1300 п.н. последовательность ДНК, гомологичная кДНК вируса иммунодефицита человека, состоящая только из длинных концевых повторов, что дает возможность исследовать функциональную активность интегразы in vitro с использованием неинфекционной копии мини-генома ВИЧ.
Следовательно, можно считать заявляемое техническое решение соответствующим критерию "изобретательный уровень".
ГРАФИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ
Фиг.1 Схематическое изображение конструирования LTR-содержащего ДНК субстрата.
Фиг.2 Зависимость накопления продукта в реакции 3’-процессинга, катализируемой интегразой, от времени: 1 - Контроль; 2-5 мин; 3-15 мин; 5-45 мин; 6-90 мин.
Фиг.3 Активность рекомбинантной интегразы ВИЧ в реакции встраивания с использованием ЛТР-содержащего ДНК субстрата. Радиоавтограф с 4%-ного полиакриламидного геля.
Сущность технического решения раскрыта в конкретных примерах осуществления способа.
Пример 1. Конструирование LTR-содержащего субстрата для определения активности интегразы на основе кольцевых форм ДНК вируса.
Операция 1. Выделение провирусной ДНК вируса иммунодефицита человека из лимфоцитов периферической крови ВИЧ-инфицированных пациентов.
Забор периферической крови пациентов для предотвращения образования тромба проводят в пробирки, содержащие 0,5 М ЭДТА рН 8,0, конечная концентрация ЭДТА - 4 мМ. Выделение лимфоцитов проводят разделением крови пациента в градиенте фиколл-верографин. Готовят 60 мл 15% раствора фиколла на деионизированной воде и при перемешивании приливают к нему 20 мл 76% раствора верографина ("Spofa", Чехословакия). Из этого раствора под контролем ареометра готовят растворы плотностью 1,097 г/мл и 1,075 г/мл. Приготовленные растворы стерилизуют автоклавированием при 121°С в течение 30 мин. На градиент, составленный из 5 мл раствора плотностью 1,097 г/мл и 5 мл раствора плотностью 1,075 г/мл, наслаивают 10 мл разведенной раствором Хенкса в соотношении 1:2 крови. Центрифугируют 40 мин при 400 g и температуре 22°С. Отбирают легкую фракцию, которая содержит лимфоциты и моноциты, отмывают, центрифугируя (2-3 мин при 400 g) раствором Хенкса.
Клетки ресуспендируют в лизирующем буфере (10 мМ трис рН 8,3; 1 мМ ЭДТА; 0,5% твин 20; 0,5% NP-40) с добавлением протеиназы К (концентрация 8 мг/мл) и инкубируют в термостате при 56°С в течение 3 часов. Затем проводят экстракцию фенолом и переосаждение ДНК этанолом.
Операция 2. Выделение суммарной клеточной ДНК из суспензии культуры клеток.
В работе используют высокочувствительную к вирусу иммунодефицита человека культуру клеток МТ-4, инфицированную штаммами ВИЧ-1/ГКВ4046, ВИЧ-1/Bru, с инфекционным титром 104-106 инфекционных единиц / мл и концентрацией 0,5×106 клеток/мл.
Клетки, предварительно отмытые раствором Хенкса или DMEM(M), ресуспендируют в лизирующем буфере (10 мМ трис рН 8,3; 1 мМ ЭДТА; 0,5% твин 20; 0,5% NP-40) с добавлением протеиназы К (концентрация 8 мг/мл) и инкубируют в термостате при 56°С в течение 3 ч. Затем проводят экстракцию фенолом и переосаждение ДНК этанолом.
Операция 3. Полимеразная цепная реакция.
ПЦР проводят в 50 мкл реакционной смеси, содержащей 1,6 мМ (NH4)2SO4, 6,7 мМ трис НСl (рН 8,8), 1,5 мМ MgCl2, 0,01% твин-20, по 0,1 мМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP, 2 единицы Tag-полимеразы, по 2 мкМ праймера S1 и S2 и добавляют 5 мкл выделенной ДНК из инфекционного материала. Поверх реакционной смеси наслаивают 30 мкл вазелинового масла. ПЦР состоит из 30 циклов: 95°С в течение 1 мин, 55°С в течение 1,2 мин, 72°С в течение 1,5 мин. В конце реакции проводят завершающий синтез при 72°С в течении 5 мин. После завершения ПЦР отбирают водную фазу и смешивают ее с равным объемом раствора, содержащего фенол:хлороформ:изоамиловый спирт (25:25:1). После центрифугирования при 14000 об/мин в течение 30 с, водную фазу отбирают и осаждают ДНК этиловым спиртом с ацетатом натрия. Осадок растворяют в 20 мкл воды. ПЦР проводят в тех же условиях гнездовыми праймерами N1 и N2, добавляя 5 мкл раствора, полученного в результате амплификации праймерами S1 и S2.
Операция 4. Получение радиоактивно меченного ДНК субстрата для измерения активности интегразы в реакции 3’-процессинга.
Фрагмент ДНК с тупыми концами метят с помощью фрагмента Кленова путем замещения dTTP нуклеотида на 3’-гидроксильном конце.
Реакцию замещения проводят в 50 мкл реакционной смеси, содержащей 10 мМ трис НСl (рН 7,5), 5 мМ MgCl2, 7,5 мМ DTT, 33 мкМ [32р]ТТР (50 мкКи), 1,2 единицы Большого (Кленов) фрагмента ДНК-полимеразы I и 1-3 мкг ДНК субстрата, синтезированного в полимеразной цепной реакции. Смесь инкубируют в течение 1 часа при 37°С. При завершении реакции добавляют 5 мкл раствора, содержащего 0,4 М ЭДТА, 60% глицерин, 0,1% бромфеноловый синий. Очистку радиоактивно меченного субстрата проводят препаративным электрофорезом в 4% полиакриламидном геле в нативных условиях с последующей радиоавтографией.
Операция 5. Получение радиоактивно меченного ДНК субстрата для измерения активности интегразы в реакции встраивания.
Фрагмент ДНК подвергают частичному гидролизу с 3’-ОН концов за счет 3’-5’ экзонуклеазной активности фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I Е.coli. Затем после добавления dNTP выступающие 5’-концы достраивают за счет 5’-3’ полимеразной активности фрагмента Кленова.
Реакционная смесь содержит 10 мМ трис НСl (рН 7,5), 5 мМ MgCl2, 7,5 мМ DTT, 1,2 единицы Большого (Кленов) фрагмента ДНК-полимеразы I и 1-3 мкг ДНК субстрата, синтезированного в полимеразной цепной реакции. Смесь инкубируют 30 мин при 37°С, затем добавляют по 33 мкМ dATP, dGTP, dCTP и [32p]TTP (50 мкКи). Инкубируют смесь 60 мин при 37°С. Очистку радиоактивно меченного субстрата проводят препаративным электрофорезом в 4% полиакриламидном геле в нативных условиях с последующей радиоавтографией.
Операция 6. Элюция радиоактивно меченного ДНК субстрата из полиакриламидного геля.
Полосу, соответствующую ДНК субстрату по данным радиоавтографии, вырезают из геля и добавляют к ней 1 объем элюирующего буфера, содержащего 0,5 М NН4СН3СO2, 1 мМ ЭДТА (рН 8,0). Инкубируют при вращении (100 rpm) в течение 12 ч при 37°С. Центрифугируют 10 мин при 10000 g. Собирают надосадочную жидкость и осаждают ДНК этиловым спиртом. Осадок растворяют в 50 мкл буфера 50 мМ трис-НСl (рН 8,0), 2 мМ ЭДТА (рН 8,0). Измеряют спектрофотометрически концентрацию полученного ДНК субстрата.
Пример 2. Определение скорости реакции 3’-процессинга, катализируемой ИН ВИЧ.
Активность интегразы измеряют по отщеплению радиоактивно меченного динуклеотида GT* с 3’ конца обеих цепей ДНК-субстрата. Реакционная смесь (45-50 мкл) содержит: 10 мМ HEPES, рН 7,5, 5 мМ дитиотреитол, 10 мМ MgCl2, 80 мМ NaCl, 10% PEG 6000, 70 нг рекомбинантной интегразы ВИЧ и 2 нМ радиоактивно меченного субстрата.
Реакционную смесь помещают в лед на 10 мин и затем инкубируют 60 мин при 37°С. В процессе инкубации отбирают аликвоты по 10 мкл через каждые 10-20 мин. Продукты реакции анализируют электрофоретически, используя 20% ПААГ в денатурирующих условиях (7,5 М мочевина), с последующей радиоавтографией (фиг.2). Для количественного определения продукта реакции фрагменты геля, соответствующие продукту на радиоавтографе, вырезают и измеряют радиоактивность на счетчике (Mark-III).
Пример 3. Определение кинетических параметров реакции 3’-процессинга, катализируемой интегразой.
При определении кинетических параметров реакционная смесь (45-50 мкл) для реакции 3’-процессинга содержит: 10 мМ HEPES, рН 7,5, 5 мМ дитиотреитол, 10 мМ MgCl2, 80 мМ NaCl, 10% PEG 6000, 70 нг рекомбинантной интегразы ВИЧ и варьируемые концентрации радиоактивно меченного субстрата (10-11-10-8 М).
Реакционную смесь помещают в лед на 10 мин и затем инкубируют 60 мин при 37°С. В процессе инкубации отбирают аликвоты по 10 мкл через каждые 10-20 мин. Продукты реакции анализируют, как в примере 2.
Km реакции 3’ процессинга находят по уравнению Михаэлиса-Ментен, используя программу Origin Professional 5.0 (Micrococal inc.). Все измерения проводят на линейных участках зависимостей накопления продуктов от времени и концентрации фермента. Ошибка определения констант не превышает 10-30%. Для используемой в работе рекомбинантной интегразы ВИЧ величины Км в реакции 3’-процессинга для радиоактивно меченного субстрата составляет (1,2±0,3)·10-10 М. Все измерения проводят на линейных участках зависимостей накопления продуктов от времени и концентрации фермента. Ошибка определения констант не превышает 10-30%.
Пример 4. Ингибирование рекомбинантной интегразы ВИЧ ауринтрикарбоновой кислотой в реакции 3’-процессинга с использованием ДНК субстрата.
При определении концентрации ауринтрикарбоновой кислоты, при которой относительная активность фермента составляет 50% ([I]50); реакционная смесь (45-50 мкл) содержит: 10 мМ HEPES, рН 7,5, 5 мМ дитиотреитол, 10 мМ MgCl2, 80 мМ NaCl, 10% PEG 6000, 70 нг рекомбинантной интегразы ВИЧ, 2 нМ радиоактивно меченного ДНК субстрата и ауринтрикарбоновую кислоту в различных концентрациях (10-7-10-3 М)
Реакционную смесь помещают в лед на 10 мин и затем инкубируют 60 мин при 37°С. В процессе инкубации отбирают аликвоты по 10 мкл через каждые 10-20 мин. Продукты реакции анализируют как, в примере 2.
[I]50 ауринтрикарбоновой кислоты находят графически с помощью построения экспериментальных данных в координатах зависимости концентрации АТК от относительной скорости реакции 3’-процессинга. [I]50 ауринтрикарбоновой кислоты в реакции 3’-процессинга, катализируемой интегразой, для данного ДНК-субстрата составляет (7,2±0,7)·10-7 М.
Пример 5. Измерение активности интегразы ВИЧ в реакции встраивания.
Активность интегразы в реакции встраивания оценивают по количеству встраивания радиоактивно меченного ДНК субстрата в плазмиду pUC19 (фиг.3). Реакционная смесь (45-50 мкл) содержит: 10 мМ HEPES, рН 7,5, 5 мМ дитиотреитол, 10 мМ MgCl2, 80 мМ NaCl, 10% PEG 6000, 0,5 мкг pUC19, 70 нг интегразы и 1 нМ радиоактивно меченного субстрата. Реакцию поводят при 37°С в течение 30-90 мин. Продукты реакции анализируют электрофоретически, используя 4% ПААГ в нативных условиях с последующей радиоавтографией. Для количественного определения продукта реакции фрагменты геля, соответствующие продукту на радиоавтографе, вырезают и измеряют радиоактивность на счетчике (Mark-III).
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1. Fausi A.S. // Science. 1988. V.239. Р.617-622; Weiss R.A. // Science. 1993. V.260. Р.1273-1279; De Clercq E. // Clinical Microbiology Reviews V.8, №12, P.200-239.
2. Hindmarsh P., Leis J. // Microbiology and Molecular Biology Reviews, Dec. 1999, p.836-843.
3. Гашникова Н.М. и др. // ДАН, №4, 2001 г.
4. Chow S.A. (1997) In vitro assays for activities of retroviral integrase // Methods, 12, 306-317.
5. Патент США №5763181.
6. O’Brien С. //Science. 1994. V.266. Р.1946; Sourgen F. et all // Eur. J. Biochem. V.240. P.765-73.
7. Activity of recombinant HIV-1 integrase on mini-HIV DNA. Cherepanov P., Surratt D., Toelen J., Pluymers W., Griffith J., De Clercq E. and Debyser Z. (1999) Nucleic Acids Res., 27, 2202-2210.
Claims (3)
1. Субстрат для определения активности интегразы вируса иммунодефицита человека, содержащий концевые последовательности провирусной ДНК и меченный радиоактивной меткой, отличающийся тем, что в качестве субстрата используют фрагмент провирусной ДНК ВИЧ-1, состоящий из двух параллельно ориентированных интактных LTR-последовательностей длиной 1200-1300 п.н.
2. Субстрат по п.1, отличающийся тем, что длинные концевые повторы (размер 600-650 п.н.) расположены на 5’ и 3’ концах провирусной ДНК.
3. Субстрат по п.1, отличающийся тем, что в качестве ДНК для встраивания используют избыток ДНК плазмиды.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2002126506/13A RU2234535C2 (ru) | 2002-10-03 | 2002-10-03 | Субстрат для определения активности интегразы вируса иммунодефицита человека |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2002126506/13A RU2234535C2 (ru) | 2002-10-03 | 2002-10-03 | Субстрат для определения активности интегразы вируса иммунодефицита человека |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2002126506A RU2002126506A (ru) | 2004-03-27 |
| RU2234535C2 true RU2234535C2 (ru) | 2004-08-20 |
Family
ID=33413023
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2002126506/13A RU2234535C2 (ru) | 2002-10-03 | 2002-10-03 | Субстрат для определения активности интегразы вируса иммунодефицита человека |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2234535C2 (ru) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5763181A (en) * | 1994-12-30 | 1998-06-09 | Georgetown University | Continous fluorometric assay for detecting nucleic acid cleavage |
| RU2139284C1 (ru) * | 1994-05-06 | 1999-10-10 | Фармация Энд Апджон Компани | 4-гидроксипиран-2-оны, циклооктил-или бензопиран-2-оны, 4-гидрокси-2н-пиран-2-оны и 4-гидрокси-циклооктапиран-2-оны |
-
2002
- 2002-10-03 RU RU2002126506/13A patent/RU2234535C2/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2139284C1 (ru) * | 1994-05-06 | 1999-10-10 | Фармация Энд Апджон Компани | 4-гидроксипиран-2-оны, циклооктил-или бензопиран-2-оны, 4-гидрокси-2н-пиран-2-оны и 4-гидрокси-циклооктапиран-2-оны |
| US5763181A (en) * | 1994-12-30 | 1998-06-09 | Georgetown University | Continous fluorometric assay for detecting nucleic acid cleavage |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Cherepanov P. et al. Activity of recombinant HIV-1 integrase on mini - HIV DNA. J. Nucleic Acids Res., 27, 27, 1999, р.2202-2210. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2002126506A (ru) | 2004-03-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Guatelli et al. | Nucleic acid amplification in vitro: detection of sequences with low copy numbers and application to diagnosis of human immunodeficiency virus type 1 infection | |
| Mulder et al. | Rapid and simple PCR assay for quantitation of human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma: application to acute retroviral infection | |
| JP4339427B2 (ja) | Ｈｉｖ−１および／またはｈｉｖ−２の増幅と検出 | |
| DK175630B1 (da) | Fremgangsmåde til forstærkning af et RNA-målsegment | |
| JP5205346B2 (ja) | Ｈｉｖ−１の増幅及び検出試薬 | |
| US20030124514A1 (en) | Methods of assessing HIV integrase inhibitor therapy | |
| JPH02503054A (ja) | 核酸配列の増幅および検出 | |
| IE69846B1 (en) | Nucleic acid derivatives | |
| JP2838084B2 (ja) | Ｈｉｖ−１の検出のためのプライマー | |
| CN109196124A (zh) | 同时检测及定量分析四种血源性病毒的多重Taqman探针qPCR的试剂盒及方法 | |
| Thomas et al. | Determination of the ex vivo rates of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcription by using novel strand-specific amplification analysis | |
| EP1960554B1 (en) | Methods, plasmid vectors and primers for assessing hiv viral fitness | |
| JPH07505533A (ja) | 定量的ウイルスアッセイ | |
| US8575324B2 (en) | Methods and reagents for molecular detection of HIV-1 groups M, N and O | |
| WO2008062385A2 (en) | Antiretroviral drug resistance testing | |
| JP2004500014A (ja) | Ｈｉｖを検出するための新規のプライマーおよびプローブ | |
| CN118240979B (zh) | 一种可视化检测HIV的CRISPR-Cas12a系统以及检测方法 | |
| US5660979A (en) | Detection of human retrovirus infection | |
| RU2234535C2 (ru) | Субстрат для определения активности интегразы вируса иммунодефицита человека | |
| JP3351773B2 (ja) | Ｈｉｖ−１のサブタイプ決定法 | |
| JP2023552693A (ja) | 標的遺伝子変異及びウイルスゲノムの検出システム並びにその製造及び使用の方法 | |
| Merzouki et al. | Accurate and differential quantitation of HIV-1 tat, rev and nef mRNAs by competitive PCR | |
| Hoad et al. | Virus genome detection by the polymerase chain reaction (PCR) | |
| CN120006037A (zh) | 一种用于检测HBV pgRNA和HBV pgRNA剪接变体的引物组、试剂盒及其应用 | |
| Zaia et al. | Confirmation of HIV infection using gene amplification |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20141004 |