RU2226275C2

RU2226275C2 - Method for detecting cytotoxic effect and growth-stimulating activity of substances for preclinical trials

Info

Publication number: RU2226275C2
Application number: RU2002109710/15A
Authority: RU
Inventors: В.А. Быков; Ю.И. Денисов-Никольский; Л.Б. Ребров; В.Г. Черников; С.С. Шишкин; С.М. Терехов; Т.Б. Крохина; Е.А. Калашникова
Original assignee: Научно-исследовательский и учебно-методический центр биомедицинских технологий ВИЛАР
Priority date: 2002-04-15
Filing date: 2002-04-15
Publication date: 2004-03-27

Abstract

FIELD: medicine, cellular biology and biochemistry. SUBSTANCE: the present innovation deals with detecting biological activity of substances (BAS) by preparing the samples of preparation, growing tested cells upon nutritive medium, counting alive cells and comparing with control in cultures without addition of preparation. As tested cells one should apply test-system consisting of four mammalian cultures, that is diploid human fibroblasts, diploid human myoblasts, minimal hypotomes and hybridomas, moreover, after growing cells they should be dyed with organic dyestuff to count viable cells and detect the value of cytotoxic effect and growth-stimulating activity of tested substance. EFFECT: higher efficiency, reliability and simplicity. 2 dwg, 3 ex

Description

Изобретение относится к клеточной биологии и биохимии, а именно к определению биологической активности веществ (БАВ), которые прямо повреждают ДНК или влияют на работу генетического аппарата, например антибиотиков, алкалоидов, детергентов, мембранотропных и гормоноподобных веществ. Областью применения изобретения являются фармакология, медицина.The invention relates to cell biology and biochemistry, and in particular to the determination of the biological activity of substances (BAS), which directly damage DNA or affect the functioning of the genetic apparatus, for example, antibiotics, alkaloids, detergents, membranotropic and hormone-like substances. The scope of the invention are pharmacology, medicine.

Известны способы определения БАВ, основанные на введении животному испытуемого вещества и наблюдении у него обменных процессов, например липидного обмена (пат. США № 4440786). Этот способ позволяет определить БАВ по реакции живого организма в целом, которая состоит как из непосредственного действия БАВ на клеточные мембраны, так и опосредственного действия на них через другие системы организма. Это не позволяет определить прямое действие БАВ на клетку. Недостатком этого способа является необходимость использования для их реализации животных.Known methods for the determination of biologically active substances, based on the introduction of the test substance to the animal and observation of metabolic processes, for example, lipid metabolism (US Pat. US No. 4440786). This method allows the determination of biologically active substances by the reaction of a living organism as a whole, which consists of both the direct action of biologically active substances on cell membranes and their indirect action through other body systems. This does not allow to determine the direct effect of biologically active substances on the cell. The disadvantage of this method is the need to use animals for their implementation.

Известен способ определения БАВ, при котором определяют их антиокислительную активность с использованием хрусталика глаза млекопитающих (пат. США № 4615877). Способ сложен, малоинформативен, т.к. позволяет определить БАВ только в отношении антиокислительной активности. Он не позволяет выявить влияние БАВ на метоболизм малонового альдегида. Способ требует забоя животного.A known method for determining biologically active substances, in which they determine their antioxidant activity using the lens of the mammalian eye (US Pat. US No. 4615877). The method is complex, uninformative, because allows you to determine biologically active substances only in relation to antioxidant activity. It does not allow to reveal the effect of biologically active substances on the metabolism of malondaldehyde. The method requires the slaughter of an animal.

Известен способ определения биологической активности вещества, включающий приготовление контрольного и рабочего биологического препарата клеточной субстанции живого организма, добавление испытуемого вещества в рабочий биологический препарат, инкубацию контрольного и рабочего биологических препаратов, определение в них показателей метоболизма, в качестве одного из которых используют содержание в биологическом препарате малонового альдегида, сравнение показателей метоболизма в контрольном и рабочем биологических препаратах и суждение о степени биологической активности испытуемого вещества заданной концентрации по величине изменений показателей метоболизма (пат. РФ № 2008680). В качестве клеточной субстанции биологических препаратов использовали свежеприготовленные эритроциты, в качестве показателей метоболизма дополнительно использовали степень гемолиза эритроцитов, интенсивность деградации малонового альдегида и антиоксидантную активность. Этот способ недостаточно информативен, имеет недостаточно высокую достоверность и сложен. Для осуществления способа необходимо использовать животных и забивать их.A known method for determining the biological activity of a substance, including the preparation of a control and working biological preparation of the cellular substance of a living organism, adding a test substance to a working biological preparation, incubating the control and working biological preparations, determining metabolic rates in them, as one of which uses the content in the biological preparation malondialdehyde, a comparison of metabolic rates in control and working biological preparations and su denie degree of biological activity of a given concentration of the test substance on changes in the magnitude indicators metobolizma (Pat. Russian № 2,008,680). Freshly prepared erythrocytes were used as the cellular substance of biological preparations, and the degree of erythrocyte hemolysis, the rate of malondialdehyde degradation, and antioxidant activity were additionally used as indicators of metabolism. This method is not informative enough, has a low reliability and is complicated. To implement the method, it is necessary to use animals and slaughter them.

Известен способ выявления токсичности химических реагентов на культурах фибропластов кожи и легких эмбриона человека для определения повреждающего действия химических соединений на метоболизм клеток соединительной ткани человека в культуре (пат. РФ № 2079130). При этом в способе оценивается активность лактатдегидрогеназы, как индикатора нарушений целостности клеточных мембран, активность ДТ-даифоразы, как фермента детоксикационной защиты, а также уровень индуцированного перекисного окисления в качестве показателя устойчивости к стрессу на клеточном уровне.A known method of detecting the toxicity of chemical reagents in cultures of fibroplasts of the skin and lungs of a human embryo to determine the damaging effect of chemical compounds on the metabolism of cells of human connective tissue in culture (US Pat. RF No. 2079130). Moreover, the method evaluates the activity of lactate dehydrogenase as an indicator of cell membrane integrity disorders, the activity of DT daiphorase, as an enzyme of detoxification protection, and the level of induced peroxidation as an indicator of stress resistance at the cellular level.

Известны способы оценки токсичности биологических объектов, включающие исследование воздействия вещества на суспензию подвижных биологических микрообъектов с последующей оценкой токсичности по изменению подвижности объектов во времени непосредственно после добавления исследуемого вещества (пат. РФ № 1725120). В качестве микрообъектов используют суспензию сперматозоидов быка в глюкоцитратном растворе. Способ недостаточно точен.Known methods for assessing the toxicity of biological objects, including the study of the effect of a substance on a suspension of mobile biological microobjects with subsequent toxicity assessment by the change in the mobility of objects in time immediately after adding the test substance (US Pat. RF No. 1725120). As microobjects, a suspension of bovine spermatozoa in gluco-citrate solution is used. The method is not accurate enough.

Наиболее близким техническим решением к заявляемому объекту является способ определения биологической активности препарата, который включает подготовку проб препарата, выращивание тестируемых клеток на питательной среде, подсчет живых клеток и сравнение с контролем в культурах без добавления препарата (пат. РФ № 2154270). При этом клетки выращивают на среде α МЕМ с эмбриональной телячьей сывороткой до получения монослоя, затем среду культивирования удаляют и добавляют раствор трипсина, после чего в культуру добавляют раствор Версена и инкубируют при 37°С в течение 10 мин, далее открепившиеся клетки собирают и отмывают 2 раза от раствора Версена путем центрифугирования и подсчитывают число живых клеток, после чего определяют уровень включений ³H-тимидина пролиферирующими клетками, при этом препарат считается обладающим биологической активностью, если степень подавления суммарного включения ³H-тимидина и/или адгезии составляет не менее 50% от контрольного уровня в культурах без добавления препарата.The closest technical solution to the claimed object is a method for determining the biological activity of the drug, which includes the preparation of samples of the drug, growing test cells in a nutrient medium, counting living cells and comparing with control in cultures without adding the drug (US Pat. RF No. 2154270). In this case, cells are grown on α MEM medium with fetal calf serum until a monolayer is obtained, then the culture medium is removed and trypsin solution is added, then Versen solution is added to the culture and incubated at 37 ° C for 10 min, then the detached cells are collected and washed 2 Versions times from solution by centrifugation, and counted the number of living cells after which the level of incorporation of ³ H-thymidine incorporation by proliferating cells, wherein the drug is considered to have biological activity if step Hb total suppression enable ³ H-thymidine and / or adhesion of at least 50% of the control level in cultures without the addition of drug.

Задача, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, состоит в создании высокоэффективного способа определения БАВ за счет расширения информативности способа, повышения достоверности и упрощения способа. При этом возможно определение на клеточном уровне токсических и стимулирующих эффектов от действия БАВ.The problem to which the invention is directed, is to create a highly effective method for determining biologically active substances by expanding the information content of the method, increasing the reliability and simplification of the method. In this case, it is possible to determine toxic and stimulating effects from the action of biologically active substances at the cellular level.

Поставленная цель достигается за счет использования способа определения биологической активности веществ, включающего подготовку проб препарата, выращивание тестируемых клеток на питательной среде, подсчет живых клеток и сравнение с контролем в культурах без добавления препарата. В качестве тестируемых клеток используют тест-систему, состоящую из четырех культур млекопитающих, а именно диплоидных фибробластов человека, диплоидных миобластов человека, минимальных гипотом и гибридом. После выращивания клеток их окрашивают органическим красителем и определяют показатель цитотоксического эффекта и ростстимулирующей активности испытуемого вещества.This goal is achieved through the use of a method for determining the biological activity of substances, including the preparation of samples of the drug, growing test cells in a nutrient medium, counting living cells and comparing with control in cultures without adding the drug. As the test cells, a test system consisting of four mammalian cultures is used, namely human diploid fibroblasts, human diploid myoblasts, minimal hypothesis and hybridomas. After growing the cells, they are stained with an organic dye and the cytotoxic effect and growth-stimulating activity of the test substance are determined.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.The invention is illustrated by the following examples.

Пример 1. Построение калибровочной кривой.Example 1. Construction of a calibration curve.

Клеточные культуры, используемые в биотест-системе: нормальные (диплоидные) фибропласты и миобласты человека; гепатомные клетки человека линии НЕР G2 и гепатомные клетки сирийского хомячка линии ГТ-11Б; гибридомные клетки мышь/мышь линии 12D5 и линии MLC-1. Отбирают 4-5 штаммов клеточных культур. Культивирование клеток проводят в питательной среде DMEM с добавлением 5% сыворотки крупного рогатого скота и 5% сыворотки пуповинной крови человека или 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Клетки выращивают в 96-луночных планшетах. В стандартных условиях роста за 14 суток плотность насыщения культуры достигает 100 тыс. клеток на 1 см². Клетки окрашивают метиленовым синим, или кристаллическим фиолетовым, или красителем Гимзы, или МТТ. Затем окрашенные клетки дважды споласкивают холодной водой и краситель элюируют 50%-ным раствором этанола. Измерение оптической плотности материала лунок проводят на электрофотометре “ЭФОС 9305” при 594 нм. Строят калибровочные кривые с определенным красителем. Для построения кривой зависимости между интенсивностью окрашивания клеток в лунках метиленовым синим и количеством просеянных клеток в этих лунках результаты обрабатывают с помощью известной компьютерной программы. Аналогично строят калибровочную кривую по результатам окрашивания клеток кристаллическим фиолетовым, красителем Гимзы, красителем МТТ.Cell cultures used in the biotest system: normal (diploid) human fibroplasts and myoblasts; human hepatoma cells of the HEP G2 line and hepatoma cells of the Syrian hamster of the GT-11B line; hybridoma mouse / mouse cells of the 12D5 line and the MLC-1 line. 4-5 strains of cell cultures are selected. Cell cultivation is carried out in DMEM nutrient medium with the addition of 5% cattle serum and 5% human cord blood serum or 10% fetal calf serum. Cells are grown in 96-well plates. Under standard growth conditions for 14 days, the saturation density of the culture reaches 100 thousand cells per 1 cm ² . Cells are stained with methylene blue, or crystalline violet, or Giemsa dye, or MTT. Then, the stained cells are rinsed twice with cold water and the dye is eluted with a 50% ethanol solution. The measurement of the optical density of the material of the holes is carried out on an EFOS 9305 electrophotometer at 594 nm. Build calibration curves with a specific dye. To plot the relationship between the intensity of staining cells in wells with methylene blue and the number of sifted cells in these wells, the results are processed using a known computer program. A calibration curve is constructed similarly according to the results of staining the cells with crystalline violet, Giemsa dye, MTT dye.

Пример 2. Определение цитотоксического эффекта.Example 2. Determination of the cytotoxic effect.

При изучении цитотоксического влияния различных препаратов с помощью окрашивания любым органическим красителем схема использования предлагаемой биотест-системы остается такой же, как и при построении калибровочной кривой, за исключением того, что у образцов клеточных культур, высеянных на 96-луночные платы, через сутки роста культуральную среду меняют на свежую, содержащую исследуемый препарат в различных концентрациях с тем, чтобы получить зависимость “доза-эффект”. Лунки двух вертикальных рядов служат контролем, в них исследуемое вещество не добавляется. Далее проводят 96-часовой рост клеток и окрашивание красителем, а также измерение оптической плотности материала лунок выполняют как в примере 1. Результаты определения оптической плотности обрабатывают с помощью компьютерной программы Sigma-Plot. Параллельно все пробы микроскопировались с помощью МБИ-3, ЛОМО, адаптированного как инвертированный микроскоп с помощью специальной насадки, для оценки морфологического состояния растущих клеток.When studying the cytotoxic effect of various drugs by staining with any organic dye, the scheme for using the proposed biotest system remains the same as when constructing a calibration curve, except that in cell culture samples plated on 96-well plates, after 24 hours of culture growth the medium is changed to fresh, containing the studied drug in various concentrations in order to obtain a dose-effect relationship. Wells of two vertical rows serve as a control; the analyte is not added to them. Next, 96-hour cell growth and staining with dye, as well as the measurement of the optical density of the material of the wells, are performed as in Example 1. The results of determining the optical density are processed using the Sigma-Plot computer program. In parallel, all samples were microscopically using MBI-3, LOMO, adapted as an inverted microscope using a special nozzle, to assess the morphological state of growing cells.

Результаты эксперимента см. на фиг. 1, где представлено цитотоксическое влияние аминогликозидного антибиотика генетицина (кривая “доза-эффект”) на культивируемые фибробласты (1), миобласты (2), гибридомные (3) и гепатомные (4) клетки, окраска кристаллическим фиолетовым и МТТ. По оси ординат - относительная оптическая плотность проб в процентах, отражающая количество живых клеток, выращенных без добавок антибиотика, по оси абсцисс - концентрация генетицина в пробах.The experimental results are shown in FIG. 1, which shows the cytotoxic effect of the aminoglycoside antibiotic geneticin (dose-response curve) on cultured fibroblasts (1), myoblasts (2), hybridoma (3) and hepatoma (4) cells, crystal violet and MTT staining. The ordinate axis is the relative optical density of the samples in percent, which reflects the number of living cells grown without antibiotic additives, and the abscissa shows the concentration of geneticin in the samples.

Пример 3. Определение ростстимулирующей активности БАВ.Example 3. Determination of growth-promoting activity of biologically active substances.

Пример проводят аналогично примеру 1 за исключением, что высеянную на 96-луночные платы культуры через сутки после посева культуральную среду меняют на свежую, не содержащую сыворотку. На бессывороточной среде клетки культивируются в течение двух суток. По истечении двух суток среда вновь меняется на свежую, содержащую не 10% сыворотки как при посеве, а только 3% сыворотки и к пробам добавляют исследуемый препарат в различных концентрациях. Лунки двух вертикальных рядов, содержащие среду с 3% сывороткой, служат контролем - в них исследуемое вещество не добавляется. В качестве дополнительного контроля используют еще один вертикальный ряд лунок, где к пробам после удаления бессывороточной среды добавляется вновь бессывороточная среда без препарата. Далее проводят 96-часовой рост клеток и окрашивание красителем также, как описано в примере 1. Затем краситель удаляют, лунки дважды промывают и каждую лунку заполняют 100 мкл элюирующего раствора. Плату инкубируют при комнатной температуре 15 мин при непрерывном перемешивании. Итоговое измерение оптической плотности проводят на фотометре “ЭФОС 9305” при длине волны 594 нм либо 620 нм. Параллельно все пробы микроскопировались с помощью МБИ-3, ЛОМО, адаптированного как инвертированный микроскоп с помощью специальной насадки, для оценки морфологического состояния растущих клеток,The example is carried out analogously to example 1 with the exception that the culture medium seeded on 96-well culture plates is changed to fresh, not containing serum one day after seeding. In serum-free medium, cells are cultured for two days. After two days, the medium again changes to fresh, containing not 10% serum as when sowing, but only 3% serum and the test drug in various concentrations is added to the samples. Wells of two vertical rows containing medium with 3% serum serve as a control - the test substance is not added to them. As an additional control, another vertical row of wells is used, where serum-free medium is again added to the samples after removal of serum-free medium. Next, 96-hour cell growth and staining with dye is carried out as described in Example 1. Then, the dye is removed, the wells are washed twice and each well is filled with 100 μl of elution solution. The plate was incubated at room temperature for 15 minutes with continuous stirring. The final measurement of optical density is carried out on an EFOS 9305 photometer at a wavelength of 594 nm or 620 nm. In parallel, all samples were microscopically using MBI-3, LOMO, adapted as an inverted microscope using a special nozzle, to assess the morphological state of growing cells,

Результаты эксперимента см. фиг. 2, где представлено ростстимулирующее влияние стероидного препарата дексаметазона на культивируемые фибробласты (1), миобласты (2), гепатомные (3) и гибридомные (4) клетки, окраска кристаллическим фиолетовым и МТТ. По оси ординат - относительная оптическая плотность проб в процентах, отражающая количество живых клеток в пробе; за 100% принята оптическая плотность клеток, выращенных без добавок дексаметазона, по оси абсцисс - концентрации дексаметазона в пробах.The experimental results see FIG. 2, where the growth-stimulating effect of the steroid preparation dexamethasone on cultured fibroblasts (1), myoblasts (2), hepatoma (3) and hybridoma (4) cells, staining with crystal violet and MTT is presented. The ordinate axis is the relative optical density of the samples in percent, reflecting the number of living cells in the sample; the optical density of cells grown without dexamethasone was taken as 100%, and the concentration of dexamethasone in the samples along the x-axis.

Предлагаемый способ определения биологической активности препарата позволяет определить цитотоксические и ростстимулирующие эффекты БАВ, обеспечивает высокую информативность анализа и является более экономичным, чем применение лабораторных животных при сопоставимых уровнях информативности, позволяет определять различные количественные показатели, включая LD₅₀ и LD₁₀₀.The proposed method for determining the biological activity of the drug allows you to determine the cytotoxic and growth-stimulating effects of biologically active substances, provides high information content analysis and is more economical than the use of laboratory animals with comparable levels of information content, allows you to determine various quantitative indicators, including LD ₅₀ and LD ₁₀₀ .

Claims

A method for determining the cytotoxic effect and growth-stimulating activity of a substance, including preparation of drug samples, growing test cells on a nutrient medium, counting live cells and comparing with control in cultures without adding a drug, characterized in that the test system consisting of four is used as test cells cultures of mammals, namely human diploid fibroblasts, human diploid myoblasts, minimal hypothyroids and hybridomas, while after growing the cells they are stained with a chemical dye to count viable cells and determine the rate of cytotoxic effect and growth-stimulating activity of the test substance.