RU2221043C2 - ХИМЕРНАЯ ПЛАЗМИДА pZZSA ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ ХИМЕРНОГО БЕЛКА АНГИОГЕНИНА И ШТАММ Escherichia coli BL 21(DE3) pZZSA - ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ХИМЕРНОГО БЕЛКА АНГИОГЕНИНА ЧЕЛОВЕКА - Google Patents
ХИМЕРНАЯ ПЛАЗМИДА pZZSA ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ ХИМЕРНОГО БЕЛКА АНГИОГЕНИНА И ШТАММ Escherichia coli BL 21(DE3) pZZSA - ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ХИМЕРНОГО БЕЛКА АНГИОГЕНИНА ЧЕЛОВЕКА Download PDFInfo
- Publication number
- RU2221043C2 RU2221043C2 RU2002102856/13A RU2002102856A RU2221043C2 RU 2221043 C2 RU2221043 C2 RU 2221043C2 RU 2002102856/13 A RU2002102856/13 A RU 2002102856/13A RU 2002102856 A RU2002102856 A RU 2002102856A RU 2221043 C2 RU2221043 C2 RU 2221043C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- pzzsa
- chimera
- plasmid
- angiogen
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 44
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 35
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 title claims abstract description 19
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title abstract description 27
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 title abstract 3
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 title abstract 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 claims abstract description 9
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 claims abstract description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 6
- 238000012937 correction Methods 0.000 claims abstract description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 3
- 108010072788 angiogenin Proteins 0.000 claims description 38
- 102100022987 Angiogenin Human genes 0.000 claims description 30
- 101000757236 Homo sapiens Angiogenin Proteins 0.000 claims description 11
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 10
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 10
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 6
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 claims description 4
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 claims description 3
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 claims description 2
- 102000028555 IgG binding proteins Human genes 0.000 claims 1
- 108091009325 IgG binding proteins Proteins 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 abstract description 2
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 abstract description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 21
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 4
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 4
- 210000003711 chorioallantoic membrane Anatomy 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 3
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 3
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 2
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 238000007169 ligase reaction Methods 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000000754 repressing effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 201000004384 Alopecia Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZAKOWWREFLAJOT-CEFNRUSXSA-N D-alpha-tocopherylacetate Chemical compound CC(=O)OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C ZAKOWWREFLAJOT-CEFNRUSXSA-N 0.000 description 1
- 206010011985 Decubitus ulcer Diseases 0.000 description 1
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 208000002087 Endarteritis Diseases 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 208000001034 Frostbite Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 244000266036 Pangium edule Species 0.000 description 1
- 235000015413 Pangium edule Nutrition 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 208000004210 Pressure Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102100037968 Ribonuclease inhibitor Human genes 0.000 description 1
- 206010039710 Scleroderma Diseases 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N Sulfurous acid Chemical compound OS(O)=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 206010046996 Varicose vein Diseases 0.000 description 1
- 238000005299 abrasion Methods 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 231100000360 alopecia Toxicity 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O ammonium group Chemical group [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 206010003230 arteritis Diseases 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 101150049515 bla gene Proteins 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 235000020247 cow milk Nutrition 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008175 fetal development Effects 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 235000020251 goat milk Nutrition 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N oxidized gamma-L-glutamyl-L-cysteinylglycine Natural products OC(=O)C(N)CCC(=O)NC(C(=O)NCC(O)=O)CSSCC(C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CCC(N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001936 parietal effect Effects 0.000 description 1
- 235000011837 pasties Nutrition 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 108010024226 placental ribonuclease inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 108010056534 proteinase T Proteins 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000037390 scarring Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 1
- 206010040882 skin lesion Diseases 0.000 description 1
- 231100000444 skin lesion Toxicity 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- HPQYKCJIWQFJMS-UHFFFAOYSA-L tetrathionate(2-) Chemical compound [O-]S(=O)(=O)SSS([O-])(=O)=O HPQYKCJIWQFJMS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001228 trophic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 208000027185 varicose disease Diseases 0.000 description 1
- 210000005166 vasculature Anatomy 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/515—Angiogenesic factors; Angiogenin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в медико-биологической промышленности с целью получения белкового фактора ангиогенеза (химерного белка ангиогенина человека). На основе плазмидного вектора рЕТ-21а-d(+) сконструирована рекомбинантная плазмида pZZSA, содержащая синтетический химерный ген, в котором нуклеотидная последовательность, кодирующая ангиогенин человека, слита с нуклеотитдной последовательностью, кодирующей IgG - связывающий домен белка А стафилококка. Экспрессия химерного гена находится под контролем раннего промотора фага Т7 и индуцируется изопропилтиогалактозидом (ИПТГ). В результате трансформации полученной плазмидой компетентных клеток Е.coli BL21(DE3) и отбора трансформантов по признаку устойчивости к ампициллину получен рекомбинантный штамм Е. coli BL21(DE3) рZZSA - продуцент химерного белка ангиогенина человека, который депонирован в Коллекции микроорганизмов Межрегионального центра коррекции микроценоза человека под номером МЦКМ В-127. Новый штамм обеспечивает высокий уровень экспрессии отличающегося повышенной стабильностью химерного белка ангиогенина. 2 с.п. ф-лы, 6 ил., 1 табл.
Description
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и представляет собой сконструированную in vitro гибридную плазмиду pZZSA, содержащую синтетический ген ангиогенина, слитый с геном IgG-связывающего домена белка А стафилококка, и штамм Escherichia coli BL21(DE3) pZZSA - продуцент рекомбинантного химерного белка ангиогенина человека.
Ангиогенин представляет собой катионный полипептид, состоящий из 123 аминокислот с молекулярной массой 14 кДa и являющийся белковым фактором ангиогенеза. Он стимулирует функции эндотелиальных клеток, важных для развития кровеносных сосудов. Этим объясняется интерес к ангиогенину, как к перспективному средству для лечения ран, ожогов, язв и сердечно-сосудистой патологии.
Известен способ выделения ангиогенина из культуральной среды клеток НТ-29 (патент США 4229531, МПК С 12 Р 1/00, опубл. 21.10.80).
Однако выход ангиогенина составляет 0,5 мкг/л, поэтому для получения ангиогенина данный источник является неэффективным.
Известен способ выделения ангиогенина из плазмы или сыворотки крови (Bond M. D. , Vallee B.L. Isolation of bovine angiogenin using a placental ribonuclease inhibitor binding ussag. Biochemistry, v.27, 17, p.6282-6287, 1988). Выход ангиогенина составляет 30-80 мг из 1 литра плазмы или сыворотки крови.
Известен способ выделения ангиогенина из коровьего или козьего молока (патент РФ 2109748, МПК С 07 К 14/515, опубл. 27.04.98). Выход ангиогенина составляет от 0,27 до 3,27 мг/л.
Однако вышеуказанные способы используют дорогостоящее сырье, количество которого ограничено, а технология очистки длительна, многоэтапна, осуществляется с использованием дорогостоящего оборудования (HPLC).
Известен структурный ген ангиогенина человека, синтезированный химико-ферментативным методом. Проведено клонирование этого гена в нескольких экспрессирующих векторных системах, в частности в генетической конструкции pRITA16, и сконструирован ряд бактериальных штаммов-продуцентов ангиогенина [1, 2, 3] . В частности, получены штаммы Е. coli JM103 - продуценты гибридов ангиогенина с бета-галактозидазой [3] и с доменами белка А стафилококка [1], а также сконструирован бактериальный штамм-продуцент Е. coli VL1222p R AngT (депонирован в ГНИИ генетика, ВКПМ В-6895), продуцирующий свободный ангиогенин [4, 5].
Однако недостатком указанных генетических конструкций и бактериальных штаммов является низкий уровень экспрессии синтетического гена, составляющий 2 мг белка на литр культуральной среды, что эквивалентно всего лишь 0,02% суммарного клеточного белка [6, 7].
Техническим результатом предлагаемых изобретений является создание такой векторной системы биосинтеза белков в виде гибридов (с новым промотором и иным механизмом индукции) и такого рекомбинантного штамма-продуцента Е.соli, которые позволили бы повысить эффективность экспрессии гибридного гена и стабильность белка ангиогенина, а также обеспечили бы возможность аффинной очистки химерного белка на IgG-сорбентах. При этом сами химерные белки такого рода при сохранении специфической биологической активности могут использоваться как активное начало наружных форм медицинских препаратов.
Указанный результат достигается путем клонирования синтетического гена ангиогенина человека, слитого с геном IgG-связывающего домена белка А стафилококка в новую векторную систему рЕТ-21 a-d(+) Vectors [8] no участкам рестриктаз Hind III и Xba I. В результате получена плазмида pZZSA, в которой гибридный ген находится под контролем раннего промотора фага Т7. Полученная плазмида pZZSA введена в клетки E.coli BL21 (DE3) (из коллекции ВНИИ генетики). Полученный рекомбинантный штамм E.coli BL21 (DE3) pZZSA депонирован в Коллекции микроорганизмов Межрегионального центра коррекции микроценоза человека под номером МЦКМ В-127. Синтез белка в полученном штамме осуществляется после индукции 1 мМ изопропил β-D-тиогалактозидом (IРТG). Штамм не имеет протеиназы оmр Т внешней мембраны клетки [8], что исключает деградацию белка в процессе очистки целевого продукта.
Химерная плазмида pZZSA для экспрессии химерного белка ангиогенина, имеющая размер 6192 п.о. и молекулярную массу 3814 кДа и характеризующаяся тем, что состоит из
- Hind III/XbaI фрагмента плазмиды рЕТ-21 a-d(+) и
- синтетического химерного гена, представляющего собой ген ангиогенина (Ang), слитый с нуклеотидной последовательностью, кодирующей IgG-связывающий домен белка А стафиллококка (Spa), и включает
- ранний промотор фага Т7,
- ген бета-лактамазы (bla), определяющий устойчивость к ампициллину,
- ген lacI, репрессирующий экспрессию до индукции IPTG,
- уникальные сайты рестрикции: EcoRI-192 п.о., XbaI-276 п.о., BglII-342 п.о., Sph-539 п.o., EcoNI-599 п.о.
- Hind III/XbaI фрагмента плазмиды рЕТ-21 a-d(+) и
- синтетического химерного гена, представляющего собой ген ангиогенина (Ang), слитый с нуклеотидной последовательностью, кодирующей IgG-связывающий домен белка А стафиллококка (Spa), и включает
- ранний промотор фага Т7,
- ген бета-лактамазы (bla), определяющий устойчивость к ампициллину,
- ген lacI, репрессирующий экспрессию до индукции IPTG,
- уникальные сайты рестрикции: EcoRI-192 п.о., XbaI-276 п.о., BglII-342 п.о., Sph-539 п.o., EcoNI-599 п.о.
Существенным отличием предложенной плазмидной конструкции является то, что гибридный (синтетический) ген ангиогенина находится под контролем раннего промотора фага Т7, что обеспечивает специфическую индукцию продукта (химерного ангиогенина) изопропилтиогалактозидом и дает высокий выход целевого белка по сравнению со штаммами, сконструированными нами ранее - E.Coli JM103 pRITA16 и E.Coli VL1222 pRAngT [1].
Для получения штамма-продуцента рекомбинантного химерного белка ангиогенина человека трансформируют компетентные клетки Escherichia coli BL21 (DE3) рекомбинантной гибридной плазмидой pZZSA.
Полученный штамм Escherichia coli BL21(DE3) pZZSA характеризуется следующими признаками:
Морфологические признаки. Клетки мелкие размером 1мкм х 3-5 мкм палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные, подвижные.
Морфологические признаки. Клетки мелкие размером 1мкм х 3-5 мкм палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные, подвижные.
Культуральные признаки. При росте на плотной среде LA колонии круглые, гладкие, полупрозрачные, блестящие, серые, края ровные; диаметр колоний 1-3 мм; консистенция пастообразная. Рост в жидких средах (LB, минимальная среда с глюкозой) характеризуется ровным помутнением с образованием легкого осадка.
Физико-биохимические признаки. Клетки растут при температуре от +4 до +42oС при оптимуме рН от 6,8 до 7,2. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме, так и органические соединения в виде пептона, триптона, дрожжевого экстракта, аминокислот. В качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин, углеводы.
Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к ампициллину (до 300 мкг/мл), обусловленную наличием в плазмиде гена β-лактамазы, и устойчивость к тетрациклину (до 50 мкг/мл), связанную с наличием транспозона.
Полученный штамм Escherichia coli BL21(DE3) pZZSA обеспечивает индуцируемый IPTG (изопропил-β-D-тиогалактозид) синтез химерного белка ангиогенина человека не ниже 5% от суммарного клеточного белка, что в 10 раз выше, чем в прототипе.
Перечень графических материалов
Фиг.1 - физическая карта сконструированной рекомбинантной плазмиды pZZSA с гибридным геном ангиогенина. Полный перечень условных обозначений:
MCS-полилинкер;
Lac-I-ген, репрессирующий экспрессию до индукции IPTG;
Bla-ген, кодирующий β-лактамазу (селективный маркер);
Lac 0-оператор;
Т7- промотор;
Ang - встроенный химерный ген ангиогенина, слитый с Spa.
Фиг.1 - физическая карта сконструированной рекомбинантной плазмиды pZZSA с гибридным геном ангиогенина. Полный перечень условных обозначений:
MCS-полилинкер;
Lac-I-ген, репрессирующий экспрессию до индукции IPTG;
Bla-ген, кодирующий β-лактамазу (селективный маркер);
Lac 0-оператор;
Т7- промотор;
Ang - встроенный химерный ген ангиогенина, слитый с Spa.
Фиг.2 - нуклеотидная последовательность гена ангиогенина в составе плазмиды pZZSA. Перечень условных обозначений:
EcoRI, XhoI, NcoI, BamHI, SalGI, PstI - эндонуклеазы рестрикции.
EcoRI, XhoI, NcoI, BamHI, SalGI, PstI - эндонуклеазы рестрикции.
Фиг. 3 - представлена динамика роста биомассы продуцента E.coli BL 21 (DЕ3) pZZSA в процессе культивирования, где: 1- рН среды; 2.3 - ОП культуры при 590 нм; 2 - объем питательной среды в биореакторе 3,5 л; 3 - 2,7 л. Пунктирными линиями обозначен момент внесения индуктора IPTG.
На фиг. 4 приведена кривая роста штамма E.coli BL 21 (DE3) pZZSA в вихревом ферментере типа "БИОК".
На фиг.5 представлены данные (электрофореграмма: разделение в 12% ПААГ) рестрикционного анализа рекомбинантных плазмидных ДНК - pAngI, pAng2 и pAng3, наработанных в вихревом биореакторе "БИОК": 1, 9 - PstI-гидролизат ДНК фага λ; 2 - ДНК плазмиды pAng1; 3 - EcoRI-гидролизат ДНК плазмиды pAng1; 4 - ДНК плазмиды pAng2; 5 - EcoRI-гидролизат ДНК плазмиды pAng2; 6 - ДНК плазмиды pAng3; 7 - EcoRI-гидролизат ДНК плазмиды pAng3; 8 - MspI-гидролизат ДНК плазмиды pBluescript.
На фиг.6 приведены данные (электрофорез в 15% денатурирующем ПААГ) анализа химерного белка в процессе отмывания телец включения: 1,2 - обработанный ультразвуком лизат после удаления растворимых клеточных белков; 3,4 - растворимые белки в 6М гуанидинхлориде; 5 - маркер молекулярной массы: 14,2 кДа; 20,0; 24,0; 36,0; 45,0; 66,0 кДа.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Способ конструирования плазмиды pZZSA.
10 мкг плазмидной ДНК рЕТ 21 a-d (+) обрабатывают последовательно рестриктазами Hind III и Xba I в соответствии с методикой, описанной в работе (Sambrook V. , Fritsch E. E., Maniatis T. Molecular Clonind. A Laboratory Manual 2 bd ed Cold Spring Harbor, NY, 1989) и из полученного гидролизата выделяют в 1% геле легкоплавкой агарозы вектор рЕТ21 a-d (+). Синтетический ген ангиогенина (с нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 2), слитый с геном IgG-связывающего домена белка А стафилококка, и векторную часть плазмиды pET21a-d(+) сшивают при помощи лигазной реакции в 50 мкл буфера для лигирования (Sambrook V.). 10 мкг реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток Е-coli с 600 (Hanahan J. //J-Mol. Biol, 1983, V 166, No 4, p.557-580).
Трансформанты высевают на LB - агар, содержащий 100 мкг/мл ампициллина. Из выросших клонов выделяют плазмидную ДНК и анализируют рестрикционным анализом. Отбирают ДНК, содержащую нужный набор рестрикционных фрагментов. Плазмида pZZSA содержит ранний промотор фага Т7, вслед за ним XhoI - сайт, EcoRI - сайт, далее идет синтетический Xho(!) усилитель трансляции и синтетический ген ангиогенина, слитого с геном IgG -связывающего домена белка А стафилоккока, фланкированный сайтами Hind III, XbaI. Физическая карта сконструированной рекомбинантной плазмиды pZZSA с гибридным геном ангиогенина представлена на фиг.1.
Клетки E. coli BL21(DE3), трансформированные плазмидой pZZSA, способны синтезировать полипептид Ang - домен белка А при индукции промотора изопропилтиогалактозидом (IPTG).
Структурно-функциональный анализ рекомбинантной ДНК. Химерный полипептид и векторную ДНК соединяют при помощи лигазной реакции в 50 мкл буфера для лигирования. 5 мкг реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток Е coli BL21 (DE3).
Трансформанты высевают на LB - агар, содержащий 100 мкг/мл ампициллина. Из выросших клонов выделяют плазмидную ДНК pZZSA и анализируют ее путем обработки набором эндонуклеаз рестрикции Hind III, EcoRI, XbaI с последующим электрофоретическим анализом длин рестрикционных фрагментов в 1,8% агарозном геле.
Из 10 проанализированных клонов 5 показали нужный набор рестрикционных фрагментов. Целевая рекомбинантная плазмида pZZSA содержит уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, имеющие следующие координаты: EcoRI-192 п. о.,Xba I -276 п.о., Bgl II - 342 п.о., Sph 539 п.о., EcoN I - 599 п.о.
Окончательную структуру рекомбинантной ДНК pZZSA подтверждают определением нуклеотидной последовательности в районе встроенного фрагмента, содержащего синтетический ген ангиогенина человека.
Пример 2. Получение штамма E.coli BL 21 (DЕ3) pZZSA - продуцента рекомбинантного химерного белка ангиогенина человека
Рекомбинантной плазмидой pZZSA трансформируют компетентные клетки E.coli BL 21 (DE3) и получают штамм E.coli BL 21 (DЕ3) pZZSA - продуцент рекомбинантного химерного белка ангиогенина человека. Методика транформации.
Рекомбинантной плазмидой pZZSA трансформируют компетентные клетки E.coli BL 21 (DE3) и получают штамм E.coli BL 21 (DЕ3) pZZSA - продуцент рекомбинантного химерного белка ангиогенина человека. Методика транформации.
Трансформацию проводили с применением хлористого кальция. 1 мл ночной культуры бактерий вносили в 100 мл бульона L. Выращивали клетки при 37oС 4 часа с интенсивным перемешиванием до плотности 5•107 клеток/мл. Охлаждали культуру во льду (10 мин), центрифугировали клетки при 4000g в течение 5 минут при 4oС. Удаляли надосадочную жидкость. Ресуспендировали клетки в половине начального объема охлажденного во льду стерильного раствора 50 mM СаСl2 + 10 mМ трис-HCl, рН 8.0. Суспензию клеток помещали в ледяную баню на 15 минут, центрифугировали, удаляли надосадочную жидкость. Ресуспендировали клетки в 1/15 начального объема охлажденного во льду стерильного раствора 50 mМ СаСl2+10 mМ трис-HCl, рН 8.0.
Аликвоты объемом 0.2 мл разливали в охлажденные пробирки. Добавляли 40 нг ДНК в 100 мл лигазного буфера, размешивали и инкубировали смесь во льду 30 мин. Переносили пробы в водяную баню 42oС на 2 мин. Добавляли в каждую пробирку по 1 мл бульона L и инкубировали 60 минут при 37oС. Высевали клетки на 1,5% агар, инкубировали их при 37oС, 16 часов. Селекцию вели на устойчивость к ампициллину.
Пример 3. Методика культивирования штамма E.coli BL 21 (DE3) pZZSA и индукции белка ангиогенина человека
Ночную культуру штамма E.coli BL 21 (DE3) pZZSA разводят в 50 раз в среде LB с добавлением ампициллина до концентрации 0,1 мг/мл и культивируют с аэрацией в вихревом ферментере типа "БИОК" (Патент РФ 2135579, МПК С 12 М 1/04, опубл. 27.08.99) в объеме от 2,5 до 5,0 л при 37oС до завершения логарифмической фазы роста, т.е. до достижения оптической плотности 1 о.е. при длине волны 600 нм. Далее в суспензию добавляют IPTG до концентрации 1 мМ и инкубируют для экспрессии рекомбинантного гена ангиогенина в течение 3,5 часов. Динамика роста культуры бактериальных клеток отражена на диаграмме (фиг. 4). По окончании инкубации клетки бактерий осаждают центрифугированием при 5000 об/мин и далее хранят при -20oС до момента лизиса. Результаты культивирования представлены на фиг.3 и 4.
Ночную культуру штамма E.coli BL 21 (DE3) pZZSA разводят в 50 раз в среде LB с добавлением ампициллина до концентрации 0,1 мг/мл и культивируют с аэрацией в вихревом ферментере типа "БИОК" (Патент РФ 2135579, МПК С 12 М 1/04, опубл. 27.08.99) в объеме от 2,5 до 5,0 л при 37oС до завершения логарифмической фазы роста, т.е. до достижения оптической плотности 1 о.е. при длине волны 600 нм. Далее в суспензию добавляют IPTG до концентрации 1 мМ и инкубируют для экспрессии рекомбинантного гена ангиогенина в течение 3,5 часов. Динамика роста культуры бактериальных клеток отражена на диаграмме (фиг. 4). По окончании инкубации клетки бактерий осаждают центрифугированием при 5000 об/мин и далее хранят при -20oС до момента лизиса. Результаты культивирования представлены на фиг.3 и 4.
Пример 4. Методика выделения телец включения и получение химерного белка ангиогенина человека
Клетки суспендируют в буфере "А" (0,1 М трис-HCl; рН 7,2; 0,1 М NaCl; 10 мМ бета-меркаптоэтанол, 10% сахароза), озвучивают в генераторе ультразвука УЗДН2Т и центрифугируют 15 мин при 5000 об/мин. Осадок 5 раз отмывают буфером "А" с добавлением 1% тритона Х-100, 2 М мочевины с обязательной гомогенизацией и последующим центрифугированием в течение 15 мин. После удаления супернатанта осадок растворяют в 50 мл 7М гуанидин хлорида.
Клетки суспендируют в буфере "А" (0,1 М трис-HCl; рН 7,2; 0,1 М NaCl; 10 мМ бета-меркаптоэтанол, 10% сахароза), озвучивают в генераторе ультразвука УЗДН2Т и центрифугируют 15 мин при 5000 об/мин. Осадок 5 раз отмывают буфером "А" с добавлением 1% тритона Х-100, 2 М мочевины с обязательной гомогенизацией и последующим центрифугированием в течение 15 мин. После удаления супернатанта осадок растворяют в 50 мл 7М гуанидин хлорида.
Далее для выделения химерного белка ангиогенина к 50 мл солюбилизированного белка добавляют 2,5 мл 1М трис-НСl рН 8,0; 0,5 г тетратионата Na, 1 г сульфита Na и выдерживают 20 часов при 22 oС. После диализа в 1 л фосфатного буфера, рН 8,0 раствор разбавляют в 10 раз тем же буфером с добавлением 1 мМ глутатиона восстановленного и 0,1 мМ глутатиона окисленного и инкубируют 17 часов при +4 oС. Далее проводят хроматографию на целлюлозе DE-52, выполняя ступенчатую элюцию белка раствором NaCl. Концентрация элюента при выходе белка с колонки составляла 0,5 М NaCL Выход белка составляет 40 мг на 5 г биомассы.
Пример 5. Электрофоретический анализ белков и анализ специфической активности химерного белка ангиогенина
Электрофоретический анализ белков проводят в 15% полиакриламидном геле (ПААГ) в буферной системе Лэммли [10]. О степени чистоты препарата химерного белка ангиогенина после очистки судят на основе анализа электрофореграммы (денситометрии).
Электрофоретический анализ белков проводят в 15% полиакриламидном геле (ПААГ) в буферной системе Лэммли [10]. О степени чистоты препарата химерного белка ангиогенина после очистки судят на основе анализа электрофореграммы (денситометрии).
Аналогичным образом анализируют содержание химерного белка в клетке в процессе культивирования.
Проведенные эксперименты показали, что полученная гибридная плазмида pZZSA действительно обеспечивает экспрессию химерного гена ангиогенина в клетках E. coli. По данным электрофореза в ПААГ молекулярная масса рекомбинантного белка составляет 28,8 кДа (фиг.5 и 6), из которых на ангиогенин приходится 14,1 кДа [1].
Динамику индуцированного IPTG синтеза ангиогенина, слитого с IgG-связывающим доменом белка А стафилококка, определяют электрофоретическим методом. По данным денситометрии полос рекомбинантного белка его выход составляет 20-30%. Электрофоретическая чистота белка составляет около 95%.
Анализ специфической активности рекомбинантного белка проводят на хориоаллантоисной оболочке (ХАО) куриного эмбриона [11, 12] по нижеследующей методике с использованием 7-9-суточных куриных эмбрионов с нормальным развитием плода.
В опыт берут не менее 7 куриных эмбрионов на точку. Исследуют параллельно не менее двух разведений препарата рекомбинантного ангиогенина и два контроля. В условиях соблюдения стерильности исследуемые образцы по 10 мкл наносят на фильтры Миллипор (диаметр диска 10 мм). Диски подсушивают под лампой в ламинаре. В стерильных условиях фильтры с импрегнированными образцами исследуемых препаратов апплицируют на ХАО. Все яйца, используемые в опыте, подписывают и помещают в термостат с температурой 37oС для дальнейшего инкубирования.
Результаты учитывают через 72-80 часов после имплантации фильтра с нанесенным образцом препарата рекомбинантного ангиогенина на ХАО. Предварительно яйца с куриными эмбрионами анализируют в овоскопе, отбраковывая погибшие. Яйца с живыми куриными эмбрионами вскрывают и производят визуальное исследование сосудистой сети хориоаллантоисной оболочки как к прилежащей к имплантированному диску фильтра, так и пристеночной (прилегающей к скорлупе). Затем извлекают участок хориоаллантоисной оболочки из-под диска фильтра и помещают для фиксации в раствор формалина на 5-7 минут. Фиксированные участки ХАО помещают под лупу (или микроскоп) и производят подсчет сосудов. Берут среднюю величину от результатов измерения плотности сосудов на 7 эмбрионах для каждого образца и сравнивают со степенью васкуляризации хориоаллантоисной оболочки в контрольных образцах. Положительным считают результат, при котором средняя величина плотности сосудов в опыте превышает таковую в контроле в 2 и более раза.
В таблице приведены результаты анализа ангиогенной активности химерного белка на ХАО развивающегося куриного эмбриона.
Анализ таблицы показывает, что специфическая активность исследуемых образцов положительна, поскольку средняя величина плотности сосудов в опыте превышают таковую в контроле в 2 и более раза [13].
Пример 6. Данные по применению химерного белка ангиогенина в медицине
Химерный белок ангиогенина, полученный из клеточной биомассы E.coli BL 21 (DE3) pZZSA в соответствии с примером 4, используют, например, в мазевой форме на основе геля полиэтиленоксида.
Химерный белок ангиогенина, полученный из клеточной биомассы E.coli BL 21 (DE3) pZZSA в соответствии с примером 4, используют, например, в мазевой форме на основе геля полиэтиленоксида.
Выявленные показания к применению заболеваний и повреждений кожи различной этиологии:
- при ожогах (отморожениях) различной степени тяжести гель с ангиогенином эффективен как средство первой помощи, а также в процессе лечения и реабилитации;
- при травматических повреждениях кожного покрова в виде порезов, ссадин, трещин, пролежней;
- при заболеваниях, связанных с нарушением кровообращения, трофических язвах, при варикозном расширении вен, облитерирующем эндартериите сосудов нижних конечностей;
- при кожных болезнях (склеродермия, псориаз, неинфекционные дерматиты, алопеция).
- при ожогах (отморожениях) различной степени тяжести гель с ангиогенином эффективен как средство первой помощи, а также в процессе лечения и реабилитации;
- при травматических повреждениях кожного покрова в виде порезов, ссадин, трещин, пролежней;
- при заболеваниях, связанных с нарушением кровообращения, трофических язвах, при варикозном расширении вен, облитерирующем эндартериите сосудов нижних конечностей;
- при кожных болезнях (склеродермия, псориаз, неинфекционные дерматиты, алопеция).
Гель с использованием аппликатора наносят тонким слоем на поврежденную поверхность через 6-12 часов и далее по мере заживления раны раз в сутки до полного восстановления дефекта кожи.
Длительные экспериментальные исследования показывают, что мазь обладает специфическим заживляющим действием, способствующим быстрому восстановлению эпителиального покрова без образования рубцов, улучшает кровообращение в области повреждения тканей за счет восстановления капиллярной сети и стимулирует местный иммунитет. Гель образует защитную пленку на ожоговой, либо раневой поверхности, что значительно снижает вероятность инфекционных осложнений, снижает отечность и болевые ощущения.
Источники информации
1. Мертвецов Н.П.//Известия Академии наук. Сер. химическая, - 1996, т. 21, 12, с.2837-2846.
1. Мертвецов Н.П.//Известия Академии наук. Сер. химическая, - 1996, т. 21, 12, с.2837-2846.
2. Мертвецов Н.П., Стефанович Л.Е. //Ангиогенин и механизм ангиогенеза. - Новосибирск: Наука, Сибирское предприятие, РАН, 1997.
3. Коваленко С.П., Лисняк И.А., Мертвецов Н.П.//Биоорган. химия. - 1989, т. 15, с.492-498.
4. Нетесова Н.А., Петров B.C., Чешенко Н.В., Чикаев Н.А., Малыгин Э.Г., Мертвецов Н.П.//Биоорган. химия. - 1995, т.21, - с.608-611.
5. Никонова А.А., Серегин С.В., Чикаев Н.А., Мишин В.П., Бабкина И.Н., Мертвецов Н.П.//Биоорган. химия. - 1996, т.22, - с.891-893.
6. Shapiro R. , Harper J.W., Fox E.A., Jasen H.W., Hein F. Uhlman E. //Anal. Biochem. - 1988, v. 175, - p.450-451.
7. Hsiung H.M. Maune N.A., Becker G.W. //Biotechnol. - 1986, v.4, - p. 991-995.
8. Studier et al. //Meth. Enzimol. - 1990, v.185, - p.60-89.
9. Кислых В. И. , Рамазанов Ю.А., Майстренко В.Ф., Мертвецов Н.П. Биотехнология, 2000, 4, с.72-79.
10. Маниатис Т. , Фрич Э., Сэмбрук Дж. //Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Пер. с англ., М., 1984.
11. Laemmly U.K. //Nature. 1970. - v. 227, - р.680-685.
12. Klasburn M., Knighton D., Folkman J.//Cancer Research. - 1976, v.36, - p.110-114.
13. Fett J.W., Strudom D.J., Lobb R.R., Alderman E.M.// Biochemistry. - 1985, v. 24, p.5480-5486.
14. Shapiro R., Strudom D.J., Olson K.A., Vallee B.L.//Biochemistry. - 1987, v.26, - p.5141-5146.
15. Шестенко О.И., Никонов С.Д., Мертвецов Н.П. Ангиогенин и его роль в ангиогенезе //Молек. биология, 2001, т.35, 3, с.1-23 (349-371).
Claims (1)
1. Химерная плазмида рZZSA для экспрессии химерного белка ангиогенина, имеющая размер 6192 п.о. и молекулярную массу 3814 кДа и характеризующаяся тем, что состоит из Hind III/XbaI фрагмента плазмиды рЕТ-21а-d(+) и синтетического химерного гена, представляющего собой ген ангионенина (Ang), слитый с нуклеотидной последовательностью, кодирующей IgG - связывающий домен белка А стафилококка (Spa), - и включает ранний промотор фага Т7, ген бета-лактамазы (bla), определяющий устойчивость к ампициллину, ген lacI, репрессирующий экспрессию до индукции IPTG, уникальные сайты рестрикции: ЕсоRI-192 п.о., ХbaI-276 п.о., BglII-342 п.о., Sph-539 п.о., ЕсоNI-599 п.о.
Штамм Escherichia coli BL21(DE3)/pZZSA (Коллекция микроорганизмов Межрегионального центра коррекции микроценоза человека, коллекционный номер МЦКМ В-127) - продуцент рекомбинантного химерного белка ангиогенина человека.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2002102856/13A RU2221043C2 (ru) | 2002-01-31 | 2002-01-31 | ХИМЕРНАЯ ПЛАЗМИДА pZZSA ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ ХИМЕРНОГО БЕЛКА АНГИОГЕНИНА И ШТАММ Escherichia coli BL 21(DE3) pZZSA - ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ХИМЕРНОГО БЕЛКА АНГИОГЕНИНА ЧЕЛОВЕКА |
| US10/502,554 US20050148061A1 (en) | 2002-01-31 | 2003-01-30 | Hybrid plasmid pzzsa coding the synthesis of angiogenis of angiogenin protein and escherichia coli bl21(des) pzzsa strain as the the superoducer of the recombinant chimeric protein of human angiogenin |
| PCT/RU2003/000049 WO2003064660A1 (fr) | 2002-01-31 | 2003-01-30 | Plasmide hybride pzzsa codant la synthese de la proteine chimere d'angiogenine et souche d'escherichia coli bl21 (des) pzzsa comme super-producteur de la proteine chimere angiogenique chez l'humain |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2002102856/13A RU2221043C2 (ru) | 2002-01-31 | 2002-01-31 | ХИМЕРНАЯ ПЛАЗМИДА pZZSA ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ ХИМЕРНОГО БЕЛКА АНГИОГЕНИНА И ШТАММ Escherichia coli BL 21(DE3) pZZSA - ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ХИМЕРНОГО БЕЛКА АНГИОГЕНИНА ЧЕЛОВЕКА |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2002102856A RU2002102856A (ru) | 2003-09-10 |
| RU2221043C2 true RU2221043C2 (ru) | 2004-01-10 |
Family
ID=27656548
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2002102856/13A RU2221043C2 (ru) | 2002-01-31 | 2002-01-31 | ХИМЕРНАЯ ПЛАЗМИДА pZZSA ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ ХИМЕРНОГО БЕЛКА АНГИОГЕНИНА И ШТАММ Escherichia coli BL 21(DE3) pZZSA - ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ХИМЕРНОГО БЕЛКА АНГИОГЕНИНА ЧЕЛОВЕКА |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20050148061A1 (ru) |
| RU (1) | RU2221043C2 (ru) |
| WO (1) | WO2003064660A1 (ru) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20130243728A9 (en) * | 2009-11-18 | 2013-09-19 | Agriculture Victoria Services Pty Ltd | Recombinant microorganisms |
| RU2512527C2 (ru) * | 2012-07-10 | 2014-04-10 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Центр Вихревых Технологий" | ИСКУССТВЕННЫЙ ГЕН, КОДИРУЮЩИЙ ХИМЕРНЫЙ БЕЛОК АНГИОГЕНИНА ЧЕЛОВЕКА, ХИМЕРНАЯ ПЛАЗМИДА pJZZ-A, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ ЭКСПРЕССИЮ ГЕНА ХИМЕРНОГО БЕЛКА АНГИОГЕНИНА ЧЕЛОВЕКА В Escherichia coli И ШТАММ Escherichia coli BL21(DE3)/pJZZ-A-ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ХИМЕРНОГО БЕЛКА АНГИОГЕНИНА ЧЕЛОВЕКА |
| RU2658758C1 (ru) * | 2017-10-02 | 2018-06-22 | ООО "Лаборатория Ангиофарм" | Рекомбинантная плазмида для экспрессии в дрожжах Pichia pastoris гена химерного белка ангиогенина человека и штамм дрожжей Pichia pastoris - продуцент рекомбинантного химерного белка ангиогенина человека |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4721672A (en) * | 1985-08-28 | 1988-01-26 | President And Fellows Of Harvard College | CDNA and gene for human angiogenin (angiogenesis factor) and methods of expression |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4229531A (en) * | 1978-12-29 | 1980-10-21 | Monsanto Company | Production of tumor angiogenesis factor by cell culture |
| US5643757A (en) * | 1994-03-21 | 1997-07-01 | American Cyanamid Company | High yield production of human apolipoprotein A1 in E. coli. |
-
2002
- 2002-01-31 RU RU2002102856/13A patent/RU2221043C2/ru not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-01-30 WO PCT/RU2003/000049 patent/WO2003064660A1/ru not_active Ceased
- 2003-01-30 US US10/502,554 patent/US20050148061A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4721672A (en) * | 1985-08-28 | 1988-01-26 | President And Fellows Of Harvard College | CDNA and gene for human angiogenin (angiogenesis factor) and methods of expression |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| МЕРТВЕЦОВ Н.П. Известия Академии наук. Серия химическая. № 12, с. 2837-2845, 1996. HUHN M. et. al. Cancer Res. 61(24), р.8737-8742, 2001. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20050148061A1 (en) | 2005-07-07 |
| WO2003064660A1 (fr) | 2003-08-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH08500730A (ja) | 内毒素結合タンパク質の調製のための方法 | |
| CN118910074B (zh) | 一种可低温自组装且长效耐热稳定的重组人源化胶原蛋白及其制备方法与应用 | |
| CN113880941B (zh) | 重组人源IxIII胶原蛋白、表达菌株及其应用 | |
| CN116987176A (zh) | 一种重组ⅲ型人源化胶原蛋白及其应用 | |
| CN117801096B (zh) | 一种水溶性重组人ⅹⅶ型胶原蛋白及其制备方法和应用 | |
| RU2221043C2 (ru) | ХИМЕРНАЯ ПЛАЗМИДА pZZSA ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ ХИМЕРНОГО БЕЛКА АНГИОГЕНИНА И ШТАММ Escherichia coli BL 21(DE3) pZZSA - ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ХИМЕРНОГО БЕЛКА АНГИОГЕНИНА ЧЕЛОВЕКА | |
| CN111423516B (zh) | 一种蛋白及其在创口修复及抑菌中的应用 | |
| CN118206636A (zh) | 一种vi型重组胶原蛋白及其制备工艺和用途 | |
| CN119219761B (zh) | 促进血管形成的重组人iii型胶原蛋白及其制备方法与应用 | |
| Yari et al. | Molecular cloning, expression and purification of recombinant soluble mouse endostatin as an anti-angiogenic protein in Escherichia coli | |
| RU2583307C2 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pET22b(+)/slurp-2, КОДИРУЮЩАЯ БЕЛОК SLURP-2, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli BL21(DE3) pET22b(+)/slurp-2- ПРОДУЦЕНТ БЕЛКА SLURP-2 ЧЕЛОВЕКА | |
| RU2453602C2 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pЕТ22b(+)/SLURP-1, КОДИРУЮЩАЯ БЕЛОК SLURP-1, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli BL21(DE3)/pET22b(+)/SLURP-1-ПРОДУЦЕНТ БЕЛКА SLURP-1 ЧЕЛОВЕКА | |
| CN117466992A (zh) | 一种纤连蛋白突变体及其制备和应用 | |
| RU2512527C2 (ru) | ИСКУССТВЕННЫЙ ГЕН, КОДИРУЮЩИЙ ХИМЕРНЫЙ БЕЛОК АНГИОГЕНИНА ЧЕЛОВЕКА, ХИМЕРНАЯ ПЛАЗМИДА pJZZ-A, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ ЭКСПРЕССИЮ ГЕНА ХИМЕРНОГО БЕЛКА АНГИОГЕНИНА ЧЕЛОВЕКА В Escherichia coli И ШТАММ Escherichia coli BL21(DE3)/pJZZ-A-ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ХИМЕРНОГО БЕЛКА АНГИОГЕНИНА ЧЕЛОВЕКА | |
| RU2741778C1 (ru) | Рекомбинантный белок для ускорения миграции клеток кожи | |
| RU2231545C1 (ru) | Штамм дрожжей pichia pastoris ps105(pbig)-продуцент внутриклеточного иммунного интерферона быка, рекомбинантная плазмидная днк pbig, обеспечивающая биосинтез внутриклеточного иммунного интерферона быка и способ конструирования рекомбинантной плазмидной днк pbig | |
| RU2708556C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная ДНК p280_2GM, кодирующая полипептид со свойствами гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека, штамм E.COLI SG 20050/ p280_2GM - продуцент полипептида со свойствами гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека и способ получения указанного полипептида | |
| RU2811427C1 (ru) | Способ получения рекомбинантного человеческого глиального фибриллярного кислого белка и используемый в нём штамм-продуцент | |
| CN120118913B (zh) | 一种编码人防御素的核酸分子及制备人防御素方法和应用 | |
| RU2787531C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА PET32a-TNF-Thy, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ СИНТЕЗ ГИБРИДНОГО БЕЛКА α-ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ - ТИМОЗИН АЛЬФА 1, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI BL21(DE3)/PET32A-THF-Thy - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА TNF-Thy И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНОГО БЕЛКА TNF-Thy | |
| CN119978110B (zh) | 一种具有透皮效果的重组17型胶原蛋白及其制备方法和应用 | |
| RU2271392C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pFGM17, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД ГРАНУЛОЦИТАРНО-МАКРОФАГАЛЬНОГО КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩЕГО ФАКТОРА ЧЕЛОВЕКА, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli BL21(DE3)/pFGM17 - ПРОДУЦЕНТ ПОЛИПЕПТИДА ГРАНУЛОЦИТАРНО-МАКРОФАГАЛЬНОГО КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩЕГО ФАКТОРА ЧЕЛОВЕКА | |
| CN119775394B (zh) | 一种具有增强皮肤再生能力的重组胶原蛋白、其制备方法及其应用 | |
| CN103382481B (zh) | 人源基质细胞衍生因子1α的表达载体、构建方法及应用 | |
| CN115850493B (zh) | 一种二价纳米抗体Cablivi的分离纯化方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20140201 |