RU2213973C2 - СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИБИОТИКОВ, СОДЕРЖАЩИХ β-ЛАКТАМНЫЙ ЦИКЛ, В ЖИДКОСТИ БИОЛОГИЧЕСКОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ И АНАЛИТИЧЕСКИЙ НАБОР ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ - Google Patents
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИБИОТИКОВ, СОДЕРЖАЩИХ β-ЛАКТАМНЫЙ ЦИКЛ, В ЖИДКОСТИ БИОЛОГИЧЕСКОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ И АНАЛИТИЧЕСКИЙ НАБОР ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ Download PDFInfo
- Publication number
- RU2213973C2 RU2213973C2 RU2001102261/13A RU2001102261A RU2213973C2 RU 2213973 C2 RU2213973 C2 RU 2213973C2 RU 2001102261/13 A RU2001102261/13 A RU 2001102261/13A RU 2001102261 A RU2001102261 A RU 2001102261A RU 2213973 C2 RU2213973 C2 RU 2213973C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antibiotics
- antibiotic
- lactam
- stage
- agent
- Prior art date
Links
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 title claims abstract description 85
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 title claims abstract description 77
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 54
- 150000003952 β-lactams Chemical class 0.000 title claims abstract description 28
- 239000007788 liquid Substances 0.000 title claims abstract description 13
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 54
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims abstract description 45
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 31
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 13
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 claims abstract description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 46
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 40
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 22
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 21
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 15
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 15
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 claims description 12
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 12
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 claims description 9
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 7
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 claims description 6
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 claims description 6
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 claims description 6
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 claims description 6
- 239000008187 granular material Substances 0.000 claims description 6
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 4
- 125000003460 beta-lactamyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 3
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical compound [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 2
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000011669 selenium Substances 0.000 claims description 2
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 claims description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 claims 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 claims 1
- 229910052714 tellurium Inorganic materials 0.000 claims 1
- PORWMNRCUJJQNO-UHFFFAOYSA-N tellurium atom Chemical compound [Te] PORWMNRCUJJQNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 12
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 60
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 54
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 54
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 54
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 38
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 29
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 17
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 17
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 17
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- 229960005229 ceftiofur Drugs 0.000 description 16
- ZBHXIWJRIFEVQY-IHMPYVIRSA-N ceftiofur Chemical compound S([C@@H]1[C@@H](C(N1C=1C(O)=O)=O)NC(=O)\C(=N/OC)C=2N=C(N)SC=2)CC=1CSC(=O)C1=CC=CO1 ZBHXIWJRIFEVQY-IHMPYVIRSA-N 0.000 description 16
- LQOLIRLGBULYKD-JKIFEVAISA-N cloxacillin Chemical compound N([C@@H]1C(N2[C@H](C(C)(C)S[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)C1=C(C)ON=C1C1=CC=CC=C1Cl LQOLIRLGBULYKD-JKIFEVAISA-N 0.000 description 15
- 229960003326 cloxacillin Drugs 0.000 description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 15
- UQLLWWBDSUHNEB-CZUORRHYSA-N Cefaprin Chemical compound N([C@H]1[C@@H]2N(C1=O)C(=C(CS2)COC(=O)C)C(O)=O)C(=O)CSC1=CC=NC=C1 UQLLWWBDSUHNEB-CZUORRHYSA-N 0.000 description 13
- 229960004350 cefapirin Drugs 0.000 description 13
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 12
- LSQZJLSUYDQPKJ-NJBDSQKTSA-N amoxicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=C(O)C=C1 LSQZJLSUYDQPKJ-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 12
- 229960003022 amoxicillin Drugs 0.000 description 12
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 12
- LSQZJLSUYDQPKJ-UHFFFAOYSA-N p-Hydroxyampicillin Natural products O=C1N2C(C(O)=O)C(C)(C)SC2C1NC(=O)C(N)C1=CC=C(O)C=C1 LSQZJLSUYDQPKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- HOKIDJSKDBPKTQ-GLXFQSAKSA-N cephalosporin C Chemical compound S1CC(COC(=O)C)=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)CCC[C@@H](N)C(O)=O)[C@@H]12 HOKIDJSKDBPKTQ-GLXFQSAKSA-N 0.000 description 11
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 11
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 10
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 9
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 9
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 7
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 6
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- -1 urine Substances 0.000 description 6
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 5
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 5
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 5
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 5
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- LHNIIDJCEODSHA-OQRUQETBSA-N (6r,7r)-3-[(e)-2-(2,4-dinitrophenyl)ethenyl]-8-oxo-7-[(2-thiophen-2-ylacetyl)amino]-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylic acid Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SCC(=C(N2C1=O)C(=O)O)\C=C\C=1C(=CC(=CC=1)[N+]([O-])=O)[N+]([O-])=O)C(=O)CC1=CC=CS1 LHNIIDJCEODSHA-OQRUQETBSA-N 0.000 description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 4
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 4
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- YFAGHNZHGGCZAX-JKIFEVAISA-N dicloxacillin Chemical compound N([C@@H]1C(N2[C@H](C(C)(C)S[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)C1=C(C)ON=C1C1=C(Cl)C=CC=C1Cl YFAGHNZHGGCZAX-JKIFEVAISA-N 0.000 description 4
- 229960001585 dicloxacillin Drugs 0.000 description 4
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical compound OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- UWYHMGVUTGAWSP-JKIFEVAISA-N oxacillin Chemical compound N([C@@H]1C(N2[C@H](C(C)(C)S[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)C1=C(C)ON=C1C1=CC=CC=C1 UWYHMGVUTGAWSP-JKIFEVAISA-N 0.000 description 4
- 229960001019 oxacillin Drugs 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 3
- 229960001139 cefazolin Drugs 0.000 description 3
- MLYYVTUWGNIJIB-BXKDBHETSA-N cefazolin Chemical compound S1C(C)=NN=C1SCC1=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)CN3N=NN=C3)[C@H]2SC1 MLYYVTUWGNIJIB-BXKDBHETSA-N 0.000 description 3
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- GPXLMGHLHQJAGZ-JTDSTZFVSA-N nafcillin Chemical compound C1=CC=CC2=C(C(=O)N[C@@H]3C(N4[C@H](C(C)(C)S[C@@H]43)C(O)=O)=O)C(OCC)=CC=C21 GPXLMGHLHQJAGZ-JTDSTZFVSA-N 0.000 description 3
- 229960000515 nafcillin Drugs 0.000 description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101001061518 Homo sapiens RNA-binding protein FUS Proteins 0.000 description 2
- 101000659267 Homo sapiens Tumor suppressor candidate 2 Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012901 Milli-Q water Substances 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100028469 RNA-binding protein FUS Human genes 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000012984 antibiotic solution Substances 0.000 description 2
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- UQGFMSUEHSUPRD-UHFFFAOYSA-N disodium;3,7-dioxido-2,4,6,8,9-pentaoxa-1,3,5,7-tetraborabicyclo[3.3.1]nonane Chemical compound [Na+].[Na+].O1B([O-])OB2OB([O-])OB1O2 UQGFMSUEHSUPRD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N hexanoic acid Chemical compound CCCCCC(O)=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 2
- 239000012948 isocyanate Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 2
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 2
- 239000004328 sodium tetraborate Substances 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000012536 storage buffer Substances 0.000 description 2
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 2
- ATGUDZODTABURZ-UHFFFAOYSA-N thiolan-2-ylideneazanium;chloride Chemical compound Cl.N=C1CCCS1 ATGUDZODTABURZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- NQIBQILAMKZKFE-UHFFFAOYSA-N 2-(5-bromo-2-fluorophenyl)-3-fluoropyridine Chemical compound FC1=CC=C(Br)C=C1C1=NC=CC=C1F NQIBQILAMKZKFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HSHGZXNAXBPPDL-HZGVNTEJSA-N 7beta-aminocephalosporanic acid Chemical compound S1CC(COC(=O)C)=C(C([O-])=O)N2C(=O)[C@@H]([NH3+])[C@@H]12 HSHGZXNAXBPPDL-HZGVNTEJSA-N 0.000 description 1
- 241000187362 Actinomadura Species 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- WZPBZJONDBGPKJ-UHFFFAOYSA-N Antibiotic SQ 26917 Natural products O=C1N(S(O)(=O)=O)C(C)C1NC(=O)C(=NOC(C)(C)C(O)=O)C1=CSC(N)=N1 WZPBZJONDBGPKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101100064718 Borrelia bavariensis (strain ATCC BAA-2496 / DSM 23469 / PBi) fusA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101100209555 Caenorhabditis elegans vha-17 gene Proteins 0.000 description 1
- DEFJQIDDEAULHB-QWWZWVQMSA-N D-alanyl-D-alanine Chemical group C[C@@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C)C([O-])=O DEFJQIDDEAULHB-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 1
- 102000030899 Serine-Type D-Ala-D-Ala Carboxypeptidase Human genes 0.000 description 1
- 108010004832 Serine-Type D-Ala-D-Ala Carboxypeptidase Proteins 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 230000001745 anti-biotin effect Effects 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- WZPBZJONDBGPKJ-VEHQQRBSSA-N aztreonam Chemical compound O=C1N(S([O-])(=O)=O)[C@@H](C)[C@@H]1NC(=O)C(=N/OC(C)(C)C(O)=O)\C1=CSC([NH3+])=N1 WZPBZJONDBGPKJ-VEHQQRBSSA-N 0.000 description 1
- 229960003644 aztreonam Drugs 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 1
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 108010059877 carboxy-terminal domain phosphatase Proteins 0.000 description 1
- FUBBGQLTSCSAON-PBFPGSCMSA-N cefaloglycin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@@H]3N(C2=O)C(=C(CS3)COC(=O)C)C(O)=O)=CC=CC=C1 FUBBGQLTSCSAON-PBFPGSCMSA-N 0.000 description 1
- 229950004030 cefaloglycin Drugs 0.000 description 1
- CZTQZXZIADLWOZ-CRAIPNDOSA-N cefaloridine Chemical compound O=C([C@@H](NC(=O)CC=1SC=CC=1)[C@H]1SC2)N1C(C(=O)[O-])=C2C[N+]1=CC=CC=C1 CZTQZXZIADLWOZ-CRAIPNDOSA-N 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003245 coal Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000002274 desiccant Substances 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical class O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000576 food coloring agent Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 239000002923 metal particle Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 238000013048 microbiological method Methods 0.000 description 1
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 235000019371 penicillin G benzathine Nutrition 0.000 description 1
- NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N phloretic acid Chemical compound OC(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 235000013618 yogurt Nutrition 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/11—Automated chemical analysis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Изобретение относится к методам анализа биологических жидкостей. Способ включает стадии: а) контактирование конкретного объема указанной биологической жидкости с некоторым количеством распознающего агента и термостатирование образующейся смеси в условиях, при которых образуется комплекс антибиотиков, возможно присутствующих в указанной биологической жидкости, с распознающим агентом, б) контактирование смеси, образующейся на стадии (а), с, по меньшей мере, одним эталонным антибиотиком, иммобилизованным на подложке, в условиях образования комплекса эталонного антибиотика с тем количеством распознающего агента, которое не прореагировало на стадии (а), и в) определение количества распознающего агента, фиксированного на подложке. Количество антибиотика определяют по количеству распознающего агента. Распознающий агент содержит рецептор, чувствительный к антибиотикам с β-лактамным циклом, полученный из Bacillus licheniformis. Аналитический набор для определения антибиотиков содержит распознающий агент, чувствительный к антибиотикам, содержащим β-лактамный цикл, полученный из Bacillus licheniformis, и эталонный антибиотик, иммобилизированный на подложке. Изобретение позволяет сократить и упростить методику анализа, а также повысить чувствительность определения широкого спектра антибиотиков. 2 с. и 11 з.п. ф-лы, 1 ил., 4 табл.
Description
Изобретение относится к новым, быстрым и чувствительным способам определения антибиотиков, содержащих β-лактамный цикл, в биологической жидкости, использующим рецептор, восприимчивый к антибиотикам Bacillus licheniformis. содержащим β-лактамный цикл. Изобретение также относится к наборам для осуществления этих способов.
В настоящее время антибиотики очень широко используются не только в качестве терапевтических агентов при лечении инфекционных заболеваний, вызываемых бактериями, но также в качестве агентов для хранения пищевых продуктов и в качестве пищевых добавок, стимулирующих рост животных. Следовательно, все более ощущается необходимость в определении антибиотиков в сложных жидкостях биологического происхождения, таких как молоко, моча, кровь, сыворотка, слюна, мясные экстракты, ферментационные растворы или забуференные водные среды.
Примером являются молочные продукты, так как хорошо известно применение антибиотиков для лечения некоторых инфекционных заболеваний молочного крупного рогатого скота.
Однако по очевидным медицинским причинам молоко, употребляемое в пищу человеком, в принципе не должно содержать никаких следов антибиотиков. Более того, концентрация пенициллина 0,005 ед./мл или менее может оказывать вредное воздействие при производстве молочных продуктов, таких как сыр, йогурт и т.д.
Можно представить несколько ситуаций. В первом случае, например при определении наличия антибиотиков на ферме, перед тем как перенести в фургон, предпочтение должно быть отдано чрезвычайно быстрому (менее 5 минут) и простому тесту. Также можно представить себе применение такого быстрого теста, когда, например, применявшийся для лечения антибиотик известен и когда, кроме того, этот тест позволяет определить данный антибиотик в количествах, соответствующих национальному (федеральному) стандарту. Во втором случае, когда акцент делается не на скорость, важно определять большинство, если не все антибиотики в количествах, соответствующих национальным стандартам (эталонам).
Причиной этого является тот факт, что законы в некоторых странах требуют строго конкретных стандартов качества. Например, власти США требуют, чтобы концентрация следующих шести антибиотиков в молоке не превышала совершенно конкретных величин: пенициллин 5 ч. на млрд; ампициллин 10 ч. на млрд; амоксициллин 10 ч. на млрд; клоксациллин 10 ч. на млрд; цефапирин 20 ч. на млрд; цефтиофур 50 ч. на млрд. В Европейском Союзе приняты следующие стандарты качества: пенициллин 4 ч. на млрд; амоксициллин 4 ч. на млрд; ампициллин 4 ч. на млрд; клоксациллин 30 ч. на млрд; диклоксациллин 30 ч. на млрд; оксациллин 30 ч. на млрд; цефапирин 10 ч. на млрд; цефтиофур 100 ч. на млрд; цефхинон 20 ч. на млрд; нафциллин 30 ч. на млрд; цефазолин 50 ч. на млрд.
Следовательно, было бы полезно найти тест, который бы позволял определять большинство антибиотиков. Кроме того, можно полагать, что в молочной промышленности в отсутствие теста, которому присущи все свойства - скорость, чувствительность и простота - полезен тест, который дает возможность наилучшим образом сочетать эти три параметра, даже если он неполностью им отвечает.
Для определения антибиотиков, содержащих β-лактамный цикл, в жидкости биологического происхождения уже предлагались различные виды анализов.
Эти анализы обычно используют методы определения, которые применяют распознающий агент (рецептор или антитело), который специфически распознает антибиотик или аналог этого антибиотика, и вещество-метку (радиоактивный элемент, фермент, флуоресцирующий агент), причем эти агенты в дальнейшем называются реагентами-детекторами (детекторами). В зависимости от выбранных элементов используемый метод называется радиоиммунанализ (RIA), радиорецепторный анализ (RRA), иммуноферментный анализ (EIA) и т.д. В основном эти анализы используют минимальное сочетание двух вышеуказанных элементов (детекторов), которое позволяет получать результат, величина которого есть показатель количества имеющегося аналита.
Следует отметить, что в зависимости от выбранного метода определения агент-метка может связываться либо с распознающим агентом, либо с антибиотиком или с аналогом антибиотика в условиях его распознавания распознающим агентом. Имеются способы, в которых распознающий агент, или антибиотик, или аналог антибиотика изначально содержит метку (например, меченый радиоактивным изотопом аналит).
В случае молочных продуктов многократно описанные анализы с целью определения аналита относятся к определению антибиотиков.
Патент США 4239852 описывает микробиологический способ определения антибиотиков, содержащих β-лактамный цикл, в молоке. Согласно этому способу пробу молока сначала термостатируют в присутствии частей клеток микроорганизма с высокой чувствительностью к антибиотикам Bacillus stearothermophilus. а затем в присутствии антибиотика с меткой ("меченого") - радиоактивным элементом или ферментом. Термостатирование осуществляют в условиях, которые позволяют антибиотикам, если они присутствуют в пробе, и меченому антибиотику связываться с частями клеток.
После термостатирования части клеток отделяют от смеси и затем промывают. Затем определяют количество меченого антибиотика, связанного с частями клеток, и сравнивают с эталоном. Количество меченого антибиотика, связанного с частями клеток, обратно пропорционально концентрации антибиотика, присутствующего в анализируемой пробе молока.
Этот способ требует исключительной осторожности, особенно на стадии отделения частей клеток от смеси. Кроме того, в своем наиболее чувствительном варианте, который позволяет определять до 0,01 ед./мл и даже до 0,001 ед./мл пенициллина G в молоке, этот способ использует антибиотик, меченый радиоактивным элементом (14С или 125I). В этом случае определение количества антибиотика, возможно присутствующего в молоке, требует специальной аппаратуры, например такой, как сцинтилляционный счетчик. Кроме того, работа с радиоактивными продуктами даже в очень малых количествах для человека, проводящего анализ, неполностью свободна от риска.
В Европейской патентной заявке 593112 описан другой способ, позволяющий определять антибиотики в молоке. Этот способ использует белок, выделенный из чувствительного к антибиотику микроорганизма, такого как Bacillus stearothermophilus. Этот белок дополнительно метят ферментом, таким как пероксидаза. Анализ проводят следующим образом: пробу молока термостатируют в пробирке в присутствии меченого белка; после термостатирования молоко переносят во вторую пробирку, на стенках которой иммобилизован заданный антибиотик; проводят второе термостатирование и затем содержимое пробирки удаляют; стенки этой второй пробирки трижды смывают промывным раствором, который тоже сливают, а затем остатки из второй пробирки переносят на лист промокательной бумаги; затем во вторую пробирку добавляют окрашивающее вещество, ее снова термостатируют, потом добавляют раствор, замедляющий проявление красителя; окрашивание в пробирке сравнивают с окрашиванием стандартного образца антибиотика в параллельно проводимом идентичном тесте. Количество меченого белка, иммобилизованного па подложке и, следовательно, интенсивность окрашивания обратно пропорциональна количеству антибиотика в анализируемой пробе молока.
Согласно Примеру 1 этой патентной заявки этот тест позволяет обнаруживать пенициллин G вплоть до концентраций порядка 5 ч. на млрд и позволяет обнаруживать амоксициллин (5 ч. на млрд), ампициллин (10 ч. на млрд), цефапирин (5 ч. на млрд) и цефтиофур (5 ч. на млрд). Этот тест не дает возможность обнаруживать пенициллин, амоксициллин и ампициллин в количествах, отвечающих Европейским нормам, и, с другой стороны, этот тест достаточно сложен; он неполностью соответствует искомым в контексте данного изобретения критериям чувствительности и простоты.
Однако проведение анализа очень утомительно, особенно если его выполняет неквалифицированный персонал. И действительно, этот анализ содержит множество стадий, включая стадии переноса жидкости и остатков из одной емкости в другую и несколько стадий промывания. Если учитывать число и характер требующихся для проведения этого анализа стадий, получение надежного результата очень зависит от экспериментальной эрудиции исполнителя.
Кроме того, для расшифровки (объяснения) результата требуется параллельное проведение двух анализов, что удваивает и дополнительно усложняет операцию.
Описаны также другие ферментативные способы, которые позволяют определять низкие концентрации антибиотиков в молоке (J.M. Frere et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 18(4), 506-510 (1980) и Европейские патенты ЕР 85667 и ЕР 468946), они основаны на применении специфического фермента, а именно растворимой внеклеточной D-аланил-D-аланинкарбоксипептидазы, продуцируемой Actinomadura R39 (далее называемой "фермент R39"). Фермент R39 обладает специфической активностью, гидролизуя D-аланил-D-аланин-группы различных пептидов, и также способен гидролизовать некоторые тиоэфиры.
Кроме того, фермент R39 реагирует с антибиотиками, содержащими β-лактамный цикл, очень быстро образуя неактивный и практически необратимый комплекс фермент-антибиотик.
В большинстве последних вариантов этого теста (ЕР 468946) заранее установленный объем образца для исследования термостатирутот с заранее установленным количеством фермента R39 в условиях, позволяющих β-лактамсодержащему антибиотику, возможно присутствующему в образце, реагировать с ферментом с образованием неактивного и практически необратимого эквимолекулярного комплекса фермент-антибиотик.
Затем заранее определенное количество тиоэфирного субстрата термостатируют с продуктом, полученным на первой стадии, в условиях, позволяющих гидролизовать субстрат с помощью остатка фермента R39, не образовавшего комплекс с антибиотиком при первом термостатировании. Количество образовавшейся при этом меркаптоалкановой кислоты определяют затем колориметрическим методом с помощью реагента, способного вызывать окрашивание при реакции со свободной группой SH меркаптоалкановой кислоты. Интенсивность окрашивания сравнивают с эталоном, полученным ранее с помощью образцов, содержащих известные количества антибиотиков. Количественное определение можно проводить с помощью спектрофотометра; при анализе молока может возникнуть необходимость в предварительном осветлении образца.
Согласно вариантам воплощения способа в патенте ЕР 468946 этот процесс позволяет определить в молоке 10 ч. на млрд пенициллина G при термостатировании в целом в течение 5 минут и около 2,5 ч на млрд пенициллина G при термостатировании в целом в течение 15 минут.
Учитывая критерии скорости, простоты и чувствительность, требующиеся от способов обнаружения антибиотиков в пищевых продуктах. Заявитель поставил себе целью поиск новых, более эффективных способов обнаружения антибиотиков в жидкости биологического происхождения. В частности, Заявитель поставил целью поиск методов обнаружения в одном тесте большинства антибиотиков, содержание которых котролируется властями в Европе и США. Кроме того, изучаемые методы должны давать возможность получать этот результат с помощью ограниченного числа стадий, проводимых предпочтительно неквалифицированным персоналом. Заявитель также исследовал способы достижения этих целей в течение более короткого времени термостатирования, чем в существующих способах.
Заявитель недавно открыл новые способы обнаружения антибиотиков, содержащих b-лактамный цикл, в биологической жидкости, которые позволяют достичь этих целей заслуживающим внимание образом.
Таким образом, данное изобретение относится к новым способам обнаружения антибиотиков, содержащих β-лактамный цикл, в жидкости биологического происхождения, включающим следующие стадии:
а) приведение определенного объема указанной биологической жидкости в контакт с некоторым количеством распознающего агента и термостатирование полученной при этом смеси в условиях, в которых возможно комплексообразование антибиотиков, которые могут присутствовать в указанной биологической жидкости, с распознающим агентом,
б) приведение смеси, полученной на стадии (а), в контакт с, по меньшей мере, одним эталонным антибиотиком, иммобилизованным на подложке, в условиях, которые делают возможным образование комплекса эталонного антибиотика с тем количеством распознающего агента, которое не прореагировало на стадии (а), и
в) определение количества распознающего агента, связанного с подложкой, характеризующееся тем, что распознающий агент представляет собой рецептор, чувствительный к антибиотикам, содержащим β-лактамное кольцо, полученный из Bacillus lichеniformis.
а) приведение определенного объема указанной биологической жидкости в контакт с некоторым количеством распознающего агента и термостатирование полученной при этом смеси в условиях, в которых возможно комплексообразование антибиотиков, которые могут присутствовать в указанной биологической жидкости, с распознающим агентом,
б) приведение смеси, полученной на стадии (а), в контакт с, по меньшей мере, одним эталонным антибиотиком, иммобилизованным на подложке, в условиях, которые делают возможным образование комплекса эталонного антибиотика с тем количеством распознающего агента, которое не прореагировало на стадии (а), и
в) определение количества распознающего агента, связанного с подложкой, характеризующееся тем, что распознающий агент представляет собой рецептор, чувствительный к антибиотикам, содержащим β-лактамное кольцо, полученный из Bacillus lichеniformis.
Фигура 1 иллюстрирует подложку, которую можно использовать согласно данному изобретению, в виде устройства для термостатирования (анализа), содержащего твердую подложку (1), к которой прикреплены мембраны (2), (3) и (4). На фигуре 1а представлен вид спереди, а на фигуре 1в дан продольный разрез устройства для термостатирования.
Необычное осуществление способа по данному изобретению основано на использовании специфического распознающего агента, который представляет собой рецептор, чувствительный к антибиотикам, имеющим β-лактамный цикл, полученный из Bacillus licheniformis. т.е. белок B1aR, выделение и аминокислотная (пептидная) последовательность которого описаны в статье Y. Zhu et al., J. Bacteriol., 1137-1141, (1990), или BlaR-CTD-полипептид, представляющий собой карбоксильную концевую область BlaR, выделение и аминокислотная (пептидная) последовательность которого описаны в В. Joris et a1., FEMS Microbiology Letters, 107-114, (1990).
Применение рецепторов BlaR и B1aR-CTD по данному изобретению для обнаружения антибиотиков, содержащих β-лактамные циклы, имеет заметное преимущество перед используемыми до настоящего времени распознающими агентами. Это объясняется тем, что рецепторы BlaR и BlaR-CTD способны очень быстро образовывать комплексы с очень большим числом молекул антибиотиков и делать это за более короткое время термостатирования, чем требуется для известных распознающих агентов, таких, например, как рецепторы, полученные из Bacillus stearothermophilus.
В качестве примеров антибиотиков, которые можно определять в соответствии со способами по данному изобретению, можно указать следующие антибиотики: бензилпенициллин (или пенициллин G), ампициллин, амоксициллин, карбенициллин, метилциллин, клоксациллин, 6-АРА, монолактам, азтреонам, мециллинам, цефалексин, цефалоглицин, цефалоридин, нитроцефин, цефатоксим, цефуороксим, цефтиофур, цефапирин, 7-АСА. Более конкретно, способы по данному изобретению позволяют обнаруживать все антибиотики, контролируемые властями США и Европы, вплоть до допустимого уровня.
Способы по данному изобретению позволяют обнаруживать антибиотики, содержащие β-лактамный цикл, в жидкостях биологического происхождения, таких как молоко, моча, кровь, сыворотка, слюна, мясные экстракты, ферментационные жидкости или забуференные водные среды.
В соответствии с предпочтительным вариантом способа по изобретению распознающий агент применяют в форме, объединяющей его с меткой. Эта метка может иметь различную природу. Метка может быть в виде частиц, как, например, коллоидные частицы металлов (платины, золота, серебра и т.д.), коллоидные частицы селена, угля, серы или же коллоидные частицы окрашенных синтетических латексов. Метка также может быть флуоресцентным веществом, таким как активированный флуоресцеин (выпускаемый Boeringher-Mannheim Biochemica), флуоресцеинизоцианат, родамин-тетраметилизоцианат или любое другое флуоресцентное вещество, известное опытному специалисту. Метка также может быть ферментной, например, β-лактамаза, пероксидаза, фосфатаза и т.д. В этом случае рецепторы B1aR и B1aR-CTD химически или генетически связаны с этой ферментной меткой, образуя слитый белок.
Распознающий агент может соединяться с меткой обычными способами, известными опытным специалистам в данной области техники. Распознающий агент может либо непосредственно соединяться с меткой, либо с образованием промежуточного комплекса. Связь между распознающим агентом и меткой может возникать в различные периоды в ходе осуществления способа по изобретению. Согласно первому варианту способа связь между распознающим агентом и меткой возникает перед тем, как распознающий агент вступает в контакт с анализируемой биологической жидкостью. Согласно другим вариантам способа по изобретению связь между распознающим агентом и меткой может образовываться во время или после того, как распознающий агент вступает в контакт с образцом биологической жидкости. Предпочтительно, когда мочение распознающего агента происходит до того, как распознающий агент вступает в контакт с анализируемым образцом.
Первая стадия (а) способа по изобретению заключается в приведении в контакт заранее установленного объема биологической жидкости с некоторым количеством распознающего агента и термостатировании полученной смеси в условиях, в которых возможно образование комплекса между антибиотиками, возможно присутствующими в биологической жидкости, и распознающим агентом.
Биологическую жидкость (жидкость биологического происхождения) термостатируют с рецептором B1aR или B1aR-CTD в интервале температур от 4 до 60oС. Предпочтительно, чтобы температура была 47oС. Повышение температуры термостатирования уменьшает его продолжительность, и наоборот. Таким образом, всегда возможно уменьшить продолжительность процесса, повышая температуру.
На второй стадии (б) способа по данному изобретению смесь, полученную на стадии (а), приводят в контакт с, по меньшей мере, одним перечисленным антибиотиком, иммобилизованным на подложке.
Подложки, которые можно применять по данному изобретению, могут быть совершенно различными. Это могут быть твердые подложки, такие как трубки, пластины или стержни, покрытые препаратом указанных антибиотиков. Это может быть аналитическое устройство в виде твердой подложки (пластины), к которой прикреплены мембраны, причем в определенной зоне для детектирования (обнаружения) помещены одно или более улавливающих веществ. Это могут быть подложки в виде магнитных или немагнитных гранул (агароза, полистирол и т.д. ), способных образовывать гель и на которых иммобилизуется указанный антибиотик.
Один из перечисленных антибиотиков может иммобилизовываться на подложке хорошо известными специалистам в данной области техники способами, например ковалентной или нековалентной абсорбцией на подложке, при необходимости с помощью спейсера.
Согласно конкретному варианту способа по изобретению стадии (а) и (б) можно проводить одновременно.
Стадия (в) способа по данному изобретению заключается в определении количества рецепторов, закрепленных на подложке, на которой иммобилизован один из перечисленных антибиотиков. Способ, применяемый для этого определения, непосредственно связан с видом используемой метки. Если метка является ферментом, стадия определения включает реакцию, специфическую для фермента, которая дает, например, данное окрашивание. Если метка является флуоресцентным веществом, определение осуществляют, просто измеряя флуоресценцию подложки. В случае металлических частиц или окрашенных латексов наличие рецепторов, закрепленных на подложке, видно по окрашиванию, интенсивность которого прямо пропорциональна числу рецепторов, закрепленных на подложке. Вне зависимости от вида используемой метки интенсивность определяемого сигнала обратно пропорциональна количеству антибиотика в исследуемом образце.
Данное изобретение также относится к наборам для термостатирования (анализа), предназначенным для определения антибиотиков в жидкости биологического происхождения, содержащим, по меньшей мере, один распознающий агент, который включает рецептор, чувствительный к антибиотикам с β-лактамным циклом в молекуле, полученным из Bacillus licheniformis, и, по меньшей мере, один перечисленный антибиотик, иммобилизованный на подложке.
Следующие примеры иллюстрируют различные аспекты и способы осуществления данного изобретения, не ограничивая, однако, его объем.
ПРИМЕР 1. Определение антибиотиков, содержащих β-лактамный цикл, в молоке.
Данный пример иллюстрирует определение в молоке антибиотиков, содержащих β-лактамиый цикл, которые контролируются органами здравоохранения. В тесте, описанном в данном примере, используют рецептор B1aR-CTD, нанесенный на золотые шарики (гранулы), служащие метками, и подложку в виде аналитического устройства, представляющего собой твердую пластину (подложку), к которой прикреплены мембраны.
1.1. Нанесение BlaR-CTD на золотые гранулы (шарики)
1.1.1. Биотинилирование BlaR-CTD
Берут 3,79 мл раствора распознающего агента BlaR-CTD с концентрацией 6,6 мг/мл в натрий-фосфатном буфере, 20 мМ рН 7. Затем к этому раствору BlaR-CTD добавляют 41,71 мл бикарбонатного буфера (0,1 М бикарбоната натрия, рН 9) и 2 мл раствора эфира N-гидроксисукцинимида и 6-(биотинамидо)капроновой кислоты, также содержащего 2,23 мг/мл бикарбонатного буфера. Этот раствор осторожно перемешивают с помощью мешалки LABINCO для пробирок, имеющей ось вращения (выпускаемой VEL, Бельгия), со скоростью 2 оборота/мин в течение 2 часов при комнатной температуре и в темноте. 2,5 мл раствора буфера Tris, 1 М рН 8, термостатируют с реакционной смесью в тех же условиях в течение 30 минут. Полученный таким образом раствор подвергают диализу против буфера HNM (Hepes 100 мМ, рН 8, NаCl 100 мМ, MgCl2 50 мМ) в течение 24 часов.
1.1.1. Биотинилирование BlaR-CTD
Берут 3,79 мл раствора распознающего агента BlaR-CTD с концентрацией 6,6 мг/мл в натрий-фосфатном буфере, 20 мМ рН 7. Затем к этому раствору BlaR-CTD добавляют 41,71 мл бикарбонатного буфера (0,1 М бикарбоната натрия, рН 9) и 2 мл раствора эфира N-гидроксисукцинимида и 6-(биотинамидо)капроновой кислоты, также содержащего 2,23 мг/мл бикарбонатного буфера. Этот раствор осторожно перемешивают с помощью мешалки LABINCO для пробирок, имеющей ось вращения (выпускаемой VEL, Бельгия), со скоростью 2 оборота/мин в течение 2 часов при комнатной температуре и в темноте. 2,5 мл раствора буфера Tris, 1 М рН 8, термостатируют с реакционной смесью в тех же условиях в течение 30 минут. Полученный таким образом раствор подвергают диализу против буфера HNM (Hepes 100 мМ, рН 8, NаCl 100 мМ, MgCl2 50 мМ) в течение 24 часов.
Таким способом получают биотинилированный раствор BlaR-CTD, который разбавляют буфером HNM-BSA (Hepes 500 мМ, рН 8, NаCl 500 мМ, MgCL2 250 мМ, BSA - альбумин бычьей сыворотки - 10 мг/мл) до концентрации 250 мг биотинилированного BlaR-CTD на мл буфера. Этот раствор хранят при -20oС.
1.1.2. Агент для мечения (метка)
В качестве метки применяют частицы золота с диаметром 40 нм, на которые нанесено (осадок) антитело козы против биотина в виде суспензий в 2 мМ водном растворе тетрабората натрия, рН 7,2, стабилизированных 0,1% азида натрия (выпускается British Biocell (Ret. GAB40)). Оптическая плотность таких суспензий при 520 нм равна примерно 10, а концентрация белка составляет около 24 мг/мл.
В качестве метки применяют частицы золота с диаметром 40 нм, на которые нанесено (осадок) антитело козы против биотина в виде суспензий в 2 мМ водном растворе тетрабората натрия, рН 7,2, стабилизированных 0,1% азида натрия (выпускается British Biocell (Ret. GAB40)). Оптическая плотность таких суспензий при 520 нм равна примерно 10, а концентрация белка составляет около 24 мг/мл.
1.1.3. Нанесение (введение) биотинилированного BlaR-CTD на частицы золота
Раствор биотинилированного BlaR-CTD, приготовленный в Примере 3.1.1, разбавляют в 114,7 раз буфером НNM-BSA (Hepes 500 мМ, рН 8, NaCl 500 мМ, MgC2 250 мМ, BSA 10 мг/мл). При комнатной температуре смешивают 22,5 объемных частей этого разбавленного биотинилированного раствора BlaR-CTD, 7,5 объемных частей буфера НNM-BSA, 9,27 объемных частей суспензии частиц золота, применяемых для мечения биотинилированного BlaR-CTD, и 6 объемных частей указанной суспензии частиц золота (см. ниже Пример 3.1.4).
Раствор биотинилированного BlaR-CTD, приготовленный в Примере 3.1.1, разбавляют в 114,7 раз буфером НNM-BSA (Hepes 500 мМ, рН 8, NaCl 500 мМ, MgC2 250 мМ, BSA 10 мг/мл). При комнатной температуре смешивают 22,5 объемных частей этого разбавленного биотинилированного раствора BlaR-CTD, 7,5 объемных частей буфера НNM-BSA, 9,27 объемных частей суспензии частиц золота, применяемых для мечения биотинилированного BlaR-CTD, и 6 объемных частей указанной суспензии частиц золота (см. ниже Пример 3.1.4).
1.1.4. Отдельный эталон
В данном тесте используется отдельный эталон, дающий полосу, интенсивность которой позволяет быстро количественно определить антибиотик в образце.
В данном тесте используется отдельный эталон, дающий полосу, интенсивность которой позволяет быстро количественно определить антибиотик в образце.
Для этой цели используют частицы золота размером 40 нм, на которых осаждено антитело козы к кроличьему иммуноглобулину. Такие частицы выпускает British Biocell (Ref. GAB40) в виде суспензий в 2 мМ водном растворе тетрабората натрия с рН 7,2, стабилизированных 0,1% азида натрия. Оптическая плотность этих суспензий при 520 нМ равна, примерно, 3, а концентрация белка около 6 мг/мл.
1.2. Аналитическое устройство
Аналитическое устройство представляет собой твердую панель (1), которая имеет первый и второй конец, к которым прикреплены последовательно, начиная с первого конца,
- мембрана (2) для очистки анализируемой жидкости,
- мембрана (3), на которой иммобилизованы два улавливающие вещества (нужный антибиотик и вещество, способное связывать независимый (отдельный) эталон), и
- абсорбирующая мембрана (4).
Аналитическое устройство представляет собой твердую панель (1), которая имеет первый и второй конец, к которым прикреплены последовательно, начиная с первого конца,
- мембрана (2) для очистки анализируемой жидкости,
- мембрана (3), на которой иммобилизованы два улавливающие вещества (нужный антибиотик и вещество, способное связывать независимый (отдельный) эталон), и
- абсорбирующая мембрана (4).
1.2.1. Сборка аналитических устройств
Прежде всего с помощью ламинатора типа ламинатора Clamshell (выпускаемого BioDot, Inc.) собирают пластины (карты) размером 300•76,2 мм следующим образом.
Прежде всего с помощью ламинатора типа ламинатора Clamshell (выпускаемого BioDot, Inc.) собирают пластины (карты) размером 300•76,2 мм следующим образом.
Отрезают пластиковую прямоугольную подложку типа АrСаrе 8565 (выпускаемую Adhesive Research) размером 300•76,2 мм (твердая подложка (1)). Затем прямоугольную мембрану Leukosorb LK4 (выпускается Pall Gelman Sciences) размером 300•20 мм (мембрана (2)), прямоугольную мембрану Hi-Flow SX (выпускаемую Millipore) размером 300•25 мм (мембрана (3)), прямоугольник 3 мм-вой целлюлозной мембраны размером 300•40 мм (мембрана (4)).
Затем мембраны (2) и (4), затем (3) помещают в определенном положении нижней полуформы ламинатора. Твердую пластину (1), покрытую адгезивом, в свою очередь помещают на верхнюю половину (формы) аппарата адгезивом наружу. Мембраны, помещенные на нижнюю полуформу, приводят в контакт с липкой подложкой, закрывая ламинатор; мембраны удерживаются точно на месте за счет откачивания воздуха вакуум-насосом. Когда вакуум убирают, извлекают панель, которая состоит из твердой подложки (1) с закрепленными на ней мембранами (2), (3) и (4).
Затем осуществляют осаждение на мембране (3) следующих растворов: проксимальная (ближняя) сторона: первое улавливающее вещество; полоса No. 1; дистальная (дальняя) сторона: второе улавливающее вещество; полоса No. 2. Эти улавливающие вещества осаждают с помощью "Распределителя" типа X-Y Platform Biojet Quanti-3000 от Bio Dot Inc.
Осажденные растворы мгновенно упаривают, помещая всю пластину на одну минуту в сильный ток горячего воздуха при 60oС.
Панели (пластины), полученные в результате сборки, разрезают на полосы с помощью ротационного устройства (выпускаемого BioDot, Kinematic или Akzo). Крайние полосы убирают, остальные полосы готовы к употреблению.
На чертеже показано такое аналитическое устройство.
Для хранения аналитические устройства помещают в светонепроницаемый, герметически запаянный контейнер в присутствии осушителя (Silgelac, France).
1.2.2. Первое улавливающее вещество. Эталонный антибиотик.
8 мл раствора, содержащего 213 мг человеческого гамма-глобулина (G4386, Sigma) и 8,6 мг гидрохлорида 2-иминотиолана (Aldrich, 33056-6) в натрийкарбонатном буфере (100 мМ, рН 9) термостатируют при 25oС одни час.
Кроме того, 20 мл раствора, содержащего 119,8 мг цефалоспорина С и 54 мг 4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилата сульфосукцинимидила (sSMCC, 22322 Pierce) в натрийкарбонатном буфере (100 мМ, рН 9) термостатируют при 25oС в течение одного часа.
Затем смешивают два вышеприготовленных раствора. рН образовавшегося раствора доводят до 7,1, добавляя 3 мл Na2H2PO4 500 мМ и раствор термостатируют при 25oС в течение двух часов. Смесь, полученную после термостатнрования, трижды подвергают диализу против 1 литра натрийфосфатного буфера (10 мМ, рН 7,5). Образовавшийся раствор фильтруют через фильтр 0,22 мм, затем делят на аликвоты и замораживают при -20oС до момента использования.
В момент использования аликвоты размораживают и перед осаждением на мембране к ним добавляют пищевой краситель так, чтобы показывать в любой момент точное положение осадка и характер отпечатка.
Первое улавливающее вещество позволяет фиксировать B1aR-CTD, прикрепленный к золотым частицам, присутствующий в избыточном количестве по сравнению с имеющимся в образце антибиотиком.
1.2.3. Второе улавливающее вещество. Вещество, способное фиксировать независимый эталон.
Для второго улавливающего вещества используют раствор кроличьего иммуноглобулина (Sigma I 5006) с концентрацией иммуноглобулина 0,5 мг/мл в 10 мМ натрийфосфатном буфере, рН 7,5, с 5 мг/мл человеческого гамма-глобулина. Это второе улавливающее вещество останавливает эталон по мере того, как жидкость движется по аналитическому устройству.
1.3. Определение антибиотиков в молоке
1.3.1. 3-х минутный тест - быстрый тест
Готовят 7 проб свежего молока, содержащего соответственно 0; 1; 2; 3; 4; 5 и 6 частей на миллиард пенициллина G. Затем каждый из этих растворов анализируют следующим образом.
1.3.1. 3-х минутный тест - быстрый тест
Готовят 7 проб свежего молока, содержащего соответственно 0; 1; 2; 3; 4; 5 и 6 частей на миллиард пенициллина G. Затем каждый из этих растворов анализируют следующим образом.
Берут аликвоту пробы молока - 200 мкл - и 45,27 мкл раствора, приготовленного в Примере 1.1.3, и помещают в стеклянную колбу. Эту смесь термостатируют 1 минуту при 47oС. Берут аналитическое устройство и помещают вертикально в стеклянной колбе так, чтобы первый конец аналитического устройства контактировал со смесью, а второй конец опирался о стенку стеклянной колбы. Смесь оставляют мигрировать по аналитическому устройству, термостатируя систему в течение 2 минут при 47oС.
В Таблице 1 суммируются результаты, полученные для 7 испытуемых образцов. Величину интенсивности в пределах от 0 до 10 относят к определенным полосам, причем 10 обозначает самую интенсивную полосу, а 0 относится к наименее интенсивной полосе. По этой шкале величина 6 относится к полосе эталона. Интенсивность сигнала, наблюдаемого на 1 полосе (линии), обратно пропорциональна количеству пенициллина G в образце.
В этом примере, когда интенсивность первой полосы меньше интенсивности второй полосы, анализ (тест) считается положительным. Результаты, приведенные в Таблице 1, показывают, что этот тест позволяет обнаруживать менее 4 ч. на млрд пенициллина G в образце молока за 3 минуты.
В тех же условиях проводили также анализы других антибиотиков, содержащих b-лактамный цикл. Этот анализ, проводимый в течение 3 минут, позволяет определять содержание амоксициллина до 5 ч. на млрд, клоксациллина - до менее 10) ч. на млрд, диклоксациллина - до менее 20 ч. на млрд, оксациллина - до менее 20 ч. на млрд и цефапирина - до менее 20 ч. на млрд в пробе молока.
1.3.2. 5-минутный тест
Готовят 6 проб свежего молока, содержащих соответственно 0; 2; 4; 6; 8 и 10 ч. на миллиард клоксациллина. Каждый из этих растворов затем анализируют следующим образом.
Готовят 6 проб свежего молока, содержащих соответственно 0; 2; 4; 6; 8 и 10 ч. на миллиард клоксациллина. Каждый из этих растворов затем анализируют следующим образом.
Берут аликвоту пробы молока - 200 мкл - и 45,27 мкл раствора, приготовленного в Примере 1.1.3, и помещают в стеклянную колбу. Эту смесь термостатируют 3 минуты при 47oС. Аналитическое устройство помещают вертикально в стеклянной колбе так, чтобы первый конец аналитического устройства контактировал со смесью, а второй конец опирался о стенку стеклянной колбы. Смесь оставляют подниматься (мигрировать) по аналитическому прибору, при этом всю систему термостатируют в течение 2 минут при 47oС.
В Таблице 2, внизу, суммированы результаты, полученные для 6 анализируемых образцов. Величины интенсивности в интервале от 0 до 10 относятся к определяемой полосе, при этом 10 относится к наиболее интенсивной полосе, а 0 относится к наименее интенсивной полосе. По этой шкале величина 6 относится к полосе эталона. Интенсивность сигнала, наблюдаемого на 1 полосе (линии), обратно пропорциональна количеству клоксациллина в образце.
В этом примере, когда интенсивность первой полосы меньше интенсивности второй полосы, тест считается положительным. Результаты, приведенные в Таблице 2, показывают, что этот тест позволяет определять менее 4 ч. на млрд клоксациллина в молоке за 5 минут.
В тех же условиях проводили также анализы других антибиотиков, содержащих β-лактамный цикл. Этот анализ, проводящийся в течение 5 минут, позволяет определять до 3 ч. на млрд пенициллина G, до 4 ч. на млрд амоксициллина, до 8 ч. на млрд диклоксациллина, до 8 ч. на млрд оксациллина, до 16 ч. на млрд цефапирина, до 100 ч. на млрд цефтиофура, менее 20 ч. на млрд цефхинона, до 20 ч. на млрд нафциллина и до 60 ч. на млрд цефазолина в пробе молока.
Этот тест особенно пригоден в качестве сортировочного теста при разгрузке молочных фургонов в бункеры.
1.3.3. 9-минутный тест
Готовят 6 проб свежего молока, содержащих соответственно 0; 4; 6; 8; 10 и 12 ч. па миллиард цефапирина. Каждый из этих растворов затем анализируют следующим образом.
Готовят 6 проб свежего молока, содержащих соответственно 0; 4; 6; 8; 10 и 12 ч. па миллиард цефапирина. Каждый из этих растворов затем анализируют следующим образом.
Берут аликвоту - 200 мкл пробы молока и 45,27 мкл раствора, приготовленного в Примере 1.1.3, и помещают в стеклянную колбу. Эту смесь термостатируют 7 минут при 47oС. Аналитическое устройство помещают вертикально в стеклянной колбе так, чтобы первый конец аналитического устройства контактировал со смесью, а второй конец опирался о стенку стеклянной колбы. Смесь оставляют мигрировать по аналитическому устройству, при этом систему термостатируют в течение 2 минут при 47oС.
В Таблице 3 суммированы результаты, полученные для 6 испытуемых образцов. Значения интенсивности в интервале от 0 до 10 относятся к определяемым полосам, причем 10 относится к наиболее интенсивной полосе, а 0 относится к наименее интенсивной полосе. По этой шкале значение 6 относится к полосе эталона. Интенсивность сигнала, относящегося к первой полосе, обратно пропорциональна количеству цефапирина в образце.
В этом примере, если первая полоса имеет интенсивность, меньшую чем интенсивность второй полосы, анализ считается положительным. Результаты, приведенные в Таблице 3, показывают, что этот тест позволяет определять до 6 ч. на млрд цефапирина в пробе молока за 9 минут.
В тех же условиях проводили тесты других антибиотиков, содержащих β-лактамный цикл. Этот 9-минутный тест позволяет обнаруживать до 3 ч. на млрд пенициллина G, до 4 ч. на млрд амоксициллина, до 4 ч. на млрд ампициллина, до 4 ч. на млрд клоксациллина, менее 8 ч. на млрд диклоксациллина, менее 8 ч. на млрд оксациллина, до 80 ч. на млрд цефтиофура, менее 20 ч. на млрд цефхинона, менее 20 ч. на млрд нафциллина и менее 45 ч. на млрд цефазолина в пробе молока.
Таким образом, этот проводимый за 9 минут тест позволяет обнаруживать все антибиотики, контролируемые Европейскими правительственными органами, вплоть до официальных норм, установленных этими органами.
1.3.4. 20-минутный тест
Готовят 6 проб свежего молока, содержащих соответственно 0; 20; 30; 40; 50 и 60 ч. на миллиард цефтиофура. Каждый из этих растворов затем анализируют следующим образом.
Готовят 6 проб свежего молока, содержащих соответственно 0; 20; 30; 40; 50 и 60 ч. на миллиард цефтиофура. Каждый из этих растворов затем анализируют следующим образом.
Аликвоту - 200 мкл пробы молока и 45,27 мкл раствора, приготовленного в Примере 1.1.3, помещают в стеклянную колбу. Эту смесь термостатируют 18 минут при 47oС. Аналитическое устройство помещают вертикально в стеклянной колбе так, чтобы первый конец устройства соприкасался со смесью, а второй конец опирался о стенку стеклянной колбы. Смесь оставляют подниматься по аналитическому устройству, при этом систему термостатируют в течение 2 минут при 47oС.
В таблице 4 суммированы результаты, полученные для 6 испытуемых образцов. Величины интенсивности в интервале от 0 до 10 относятся к определяемым полосам, причем значение 10 относится к наиболее интенсивной полосе, а 0 относится к наименее интенсивной полосе. По этой шкале значение 6 относится к полосе эталона. Интенсивность сигнала, относящегося к первой полосе, обратно пропорциональна количеству цефтиофура в образце.
В этом примере, если интенсивность первой полосы ниже интенсивности второй полосы, тест считается положительным. Результаты, представленные в Таблице 4, показывают, что этот тест позволяет обнаруживать цефтиофур в пробе молока в количествах до 30 ч. на млрд за 20 минут.
Этот 20-минутный тест позволяет, таким образом, обнаруживать в единственном тесте, все антибиотики, контролируемые в настоящее время властями США и Европы, вплоть до официальных норм, утвержденных ими.
ПРИМЕР 2. Определение 6 антибиотиков в молоке
Этот пример иллюстрирует обнаружение в молоке 6 антибиотиков, содержащих β-лактамный цикл, которые контролируются федеральными органами США. Тест, описанный в этом примере, использует рецептор B1aR-CTD в виде слитого белка с β-лактамазой и подложку в виде магнитных шариков (гранул).
Этот пример иллюстрирует обнаружение в молоке 6 антибиотиков, содержащих β-лактамный цикл, которые контролируются федеральными органами США. Тест, описанный в этом примере, использует рецептор B1aR-CTD в виде слитого белка с β-лактамазой и подложку в виде магнитных шариков (гранул).
2.1. Слитый белок BlaR-CTD-β-лактамаза
Слитый белок BlaR-CTD-b-лактамаза получают генетическим связыванием рецептора BlaR-CTD (В. Joris et al., FEMS Microbiology Letters, 107-114, (1990) с Zn b-лактамазой из Bacillus cereus (M. Hussain et al., 1985, J. Bact., 164:1, 223-229, 1985).
Слитый белок BlaR-CTD-b-лактамаза получают генетическим связыванием рецептора BlaR-CTD (В. Joris et al., FEMS Microbiology Letters, 107-114, (1990) с Zn b-лактамазой из Bacillus cereus (M. Hussain et al., 1985, J. Bact., 164:1, 223-229, 1985).
Связывание осуществляют следующим образом.
2.1.1. Конструкция плазмиды: осуществляют связывание 1/1 между генами BlaR-CTD-полипептида и b-лактамазой: ген, кодирующий β-лактамазу, вводят в фазе и за геном BlaR-CTD. Плазмида, образованная слиянием генов, проявляет устойчивость к канамицину. Слитый белок называется далее Fus 1.
2.1.2. Продуцирование
Штамм: плазмиду, несущую слитые гены, вводят в Е. Coli. Клоны с рекомбинантной плазмидой отбирают на LB + Km (50 мкг/мл).
Штамм: плазмиду, несущую слитые гены, вводят в Е. Coli. Клоны с рекомбинантной плазмидой отбирают на LB + Km (50 мкг/мл).
Отбор: мечение клеточного экстракта радиоактивным антибиотиком с последующим электрофорезом на денатурирующем полиакриламидном геле показывает, что большая часть белка продуцируется в виде слитого белка с молекулярной массой около 50000. Однако при посттрансляционном расщеплении, по-видимому, очень малый процент (2%) этих молекул диссоциирует на две отдельные активности (активные формы).
Культивирование: 500 мл среды LB + Km (50 мкг/мл) инокулируют, используя рекомбинантные клетки, хранящиеся при -70oС. "Прекультуру" термостатируют при 37oС и перемешивают в течение ночи при 225 об/мин. 18 литров среды LB + Km (50 мкг/мл) инокулируют с помощью 500 мл этой культуры, оптическая плотность которой при 600 нм составляет 4. 18-литровая культура готова, когда оптическая плотность достигает значения 6.
2.1.3. Экстракция: сразу же после прекращения культивирования клетки отфильтровывают и центрифугируют. Надосадочную жидкость клеточного осадка, лизированного в дезинтеграторе, сохраняют. Она содержит слитый белок FUS1.
2.1.4. Очистка:
- Используемые буферы:
Буфер А: 20 мМ рН 8 Tris, 10% этиленгликоля, 50 мкм DTT;
Буфер В: буфер А + 1 М NaCl.
- Используемые буферы:
Буфер А: 20 мМ рН 8 Tris, 10% этиленгликоля, 50 мкм DTT;
Буфер В: буфер А + 1 М NaCl.
Слитый белок частично очищают ионной хроматографией и на молекулярных ситах. После осаждения экстракта и промывания на колонке QSFF (Pharmacia, Upsala) буфером А, FUS1 элюируют линейным градиентом буфера В. Затем активные фракции (±0,25 М NaCl) объединяют и осаждают на молекулярных ситах G-100 (Pharmacia, Upsala); их элюируют буфером А. Среднюю специфическую активность выделенной порции оценивают в 30%.
2.1.5. Ингибирование b-лактамазы: слитый белок (9/10 объема) термостатируют с 50 мМ EDTA (1/10 объема) в течение 45 минут при 37oС. Ингибирование проверяют, используя нитроцефин в 10 мМ какодилатном буфере рН 6,0. В присутствии или в отсутствие Zn сигнал должен быть соответственно положительным или отрицательным. После ингибирования эффективная концентрация, измеренная, исходя из активности β-лактамазы, составляет 7,74 пмол/мкл.
2.2. Твердая подложка: магнитные гранулы (шарики) - цефалоспорин С (эталонный антибиотик).
Используют частицы BioMag (выпускаемые DRG Instrument GmbH, Marburg, Germany под маркой AM 4100 В), NН2-концы которых активированы глутаральдегидом следующим образом:
- один объем исходного раствора частиц BioMag 4100 промывают 4 раза 5-ю объемами 0,01 М рН 6,0 пиридинового буфера. Частицы в 2,5 объемах глутаральдегида в 5% пиридиновом буфере перемешивают при вращении в течение 3 часов при комнатной температуре. Затем их 10 раз промывают 2-мя объемами 0,01 М рН 7 буфера Kpi. Затем частицы снова суспендируют в 1 объеме 0,1 М цефалоспорина С в буфере Kpi и перемешивают при вращении в течение ночи при +4oС. Заключительное отмывание проводят до полного исчезновения цефалоспорина С из 0,1 М буфера Kpi рН 7.
- один объем исходного раствора частиц BioMag 4100 промывают 4 раза 5-ю объемами 0,01 М рН 6,0 пиридинового буфера. Частицы в 2,5 объемах глутаральдегида в 5% пиридиновом буфере перемешивают при вращении в течение 3 часов при комнатной температуре. Затем их 10 раз промывают 2-мя объемами 0,01 М рН 7 буфера Kpi. Затем частицы снова суспендируют в 1 объеме 0,1 М цефалоспорина С в буфере Kpi и перемешивают при вращении в течение ночи при +4oС. Заключительное отмывание проводят до полного исчезновения цефалоспорина С из 0,1 М буфера Kpi рН 7.
2.3. Определение в молоке 6 антибиотиков: пенициллина G, ампициллина, амоксициллина, клоксациллина, цефапирина и цефтиофура.
2.3.1. Используемые растворы:
- раствор 1:700 пикомолей слитого белка, лиофилизированного в 100 мМ, pН 8, Tris, 1 мг/мл BSA, 50 мМ EDTA, 50 мкм DTT, снова гидратируют 5 мл Milli-Q воды; для измерения требуется 50 мкл этого раствора.
- раствор 1:700 пикомолей слитого белка, лиофилизированного в 100 мМ, pН 8, Tris, 1 мг/мл BSA, 50 мМ EDTA, 50 мкм DTT, снова гидратируют 5 мл Milli-Q воды; для измерения требуется 50 мкл этого раствора.
- раствор 2: 2 мл частиц BioMag-цефалоспорин С, приготовленных в Примере 1.2, в 100% изопропаноле; для измерения требуется 20 мкл.
- раствор 3: 10 мМ, рН 6, какодилатного буфера, 1 М NаCl, лиофилизированный и регидратированный Milli-Q водой.
- раствор 4: 400 мл 10 мМ нитроцефина в ДМФА разбавляют до 40 мл раствором 3; для определения требуется 400 мкл.
2.3.2. Способ определения:
50 мкл раствора 1 в 500 мл проб разбавленного молока термостатируют при 47oС в течение 2 минут. 20 мкл раствора 2 суспендируют в молоке, которое снова термостатируют 2 минуты при 47oС. Парамагнитные частицы притягиваются к стенкам контейнера, когда надосадочную жидкость удаляют из пробирки. Частицы дважды промывают раствором 3, осуществляя тот же процесс с магнитом. Под конец 400 мкл раствора 4 термостатируют 3 минуты при 47oС в присутствии частиц. Затем измеряют поглощение оставшегося раствора при 482 нм относительно раствора нитроцефина.
50 мкл раствора 1 в 500 мл проб разбавленного молока термостатируют при 47oС в течение 2 минут. 20 мкл раствора 2 суспендируют в молоке, которое снова термостатируют 2 минуты при 47oС. Парамагнитные частицы притягиваются к стенкам контейнера, когда надосадочную жидкость удаляют из пробирки. Частицы дважды промывают раствором 3, осуществляя тот же процесс с магнитом. Под конец 400 мкл раствора 4 термостатируют 3 минуты при 47oС в присутствии частиц. Затем измеряют поглощение оставшегося раствора при 482 нм относительно раствора нитроцефина.
Этот способ позволяет определять 6 антибиотиков, для которых имеются нормы США, в концентрациях ниже установленных стандартов, т.е. 5 ч. на млрд пенициллина, 10 ч. на млрд ампициллина, 10 ч. на млрд амоксициллина, 10 ч. на млрд клоксациллина, 20 ч. на млрд цефапирина и 50 ч. на млрд цефтиофура.
ПРИМЕР 3. Определение 3 антибиотиков (пенициллина G, клоксациллина, цефтиофура) в молоке.
Данный пример иллюстрирует определение в молоке 3 антибиотиков, содержащих β-лактамный цикл, которые контролируются органами здравоохранения. Тест, описанный в этом примере, использует рецептор B1aR-CTD в виде двух слитых белков соответственно со щелочной фосфатазой и пероксидазой и подложку в виде микропланшета.
3.1. Слитый белок BlaR-CTD-щелочная фосфатаза.
Слитый белок BlaR-CTD-щелочная фосфатаза получают, химически связывая рецептор B1aR-CTD (В. Joris et al., FEMS Microbiology Letters, 107-114, (1990)) и активированную щелочную фосфатазу, выпускаемую Boehringer-Mannheim Biochemica под номером 1464752.
Связывание проводят следующим образом.
3.1.1. Конъюгация: осуществляют диализ B1aR-CTD и щелочной фосфатазы в 100 мМ буфера карбонат/бикарбонат натрия при рН 9,8. 15 наномолей B1aR-CTD термостатируют в присутствии 100 мкл активированной щелочной фосфатазы (20 мг/мл) в течение 2 часов при 25oС.
3.1.2. Прекращение реакции: добавляют 40 мкл 2 мМ раствора триэтаноламина, рН 8, а затем 50 мкл 200 мМ раствора натрийборгидрида. Смесь 30 минут термостатируют при +4oС. Затем добавляют 25 мкл 2 мМ раствора триэтаноламина, рН 8, после чего смесь снова термостатируют 2 часа при +4oС.
3.1.3. Стабилизация связывания: добавляют 10 мкл 1 М раствора глицина, рН 7,0.
3.1.4. Перенос в буфер для хранения: 8 часов трижды проводят диализ реакционной смеси (около 300 мкл) против 0,5 литра 50 мМ буфера триэтаноламина, рМ 7,6, 150 мМ NаCl, 1 мМ MgCl2, 0,5 мМ ZnCl2, 10 мМ глицина при +4oС.
3.1.5. Конечный титр: конечный титр связывания составляет 50 пмолей активного B1aR-CTD на мкл раствора.
3.2. Слитый белок BlaR-CTD-пероксидаза.
Слитый белок BlaR-CTD-пероксидаза получают, химически связывая рецептор BlaR-CTD (В. Joris et al., FEMS Microbiology Letters, 107-114, (1990)) и активированную пероксидазу, выпускаемую Boehringer-Mannheim Biochemica под индексом 1428861.
Связывание осуществляют следующим образом:
3.2.1. Конъюгация: диализ BlaR-CTD и пероксидазы проводят в 100 мМ буфере карбонат/бикарбонат натрия, рН 9,8. 40 наномолей BlaR-CTD термостатируют в присутствии 100 мкл активированной пероксидазы (16 мг/мл) в течение 2 часов при 25oС.
3.2.1. Конъюгация: диализ BlaR-CTD и пероксидазы проводят в 100 мМ буфере карбонат/бикарбонат натрия, рН 9,8. 40 наномолей BlaR-CTD термостатируют в присутствии 100 мкл активированной пероксидазы (16 мг/мл) в течение 2 часов при 25oС.
3.2.2. Прекращение реакции: добавляют 40 мкл 2 мМ раствора триэтаноламина, рН 8, затем 50 мкл 200 мМ раствора натрийборгидрида. Смесь термостатируют 30 минут при +4oС. Затем добавляют 25 мкл 2 мМ раствора триэтаноламина, рН 8, после чего смесь снова термостатируют 2 часа при +4oС.
3.2.3. Стабилизация связывания: добавляют 10 мкл 1 М раствора глицина, рН 7.
3.2.4. Перенос в буфер для хранения: проводят трижды 8 часов диализ реакционной смеси (около 400 мкл) против 0,5 литра 10 мМ калийфосфатного буфера, рН 7,5, 200 мМ NaCl, 10 мМ глицина при +4oС.
3.2.5. Конечный титр: конечный титр связывания составляет около 100 пмолей активного BlaR-CTD на мкл раствора.
3.3. Твердая подложка: микропланшет-цефалоспорин С.
3.3.1. Приготовление эталонного раствора антибиотика.
8 мл раствора, содержащего 213 мг человеческого гамма-глобулина (G4386, Sigma) и 8,6 мг гидрохлорида 2-иминотиолана (Aldrich, 33056-6) в натрийкарбонатном буфере (100 мМ, рН 9) термостатируют один час при 25oС.
Отдельно 20 мл раствора, содержащего 119,8 мг цефалоспорина С и 54 мг 4-(N-малеимидометил)циклогексан-1- карбоксилата сульфосукцинимидила (sSMCC, 22322 Pierce) в натрийкарбонатном буфере (100 мМ, рН 9) термостатируют один час при 25oС.
Затем смешивают два вышеприготовленных раствора. рН полученного раствора доводят до 7,1, добавляя 3 мл 500 мМ Na2H2PO4, и смесь термостатируют 2 часа при 25oС. Смесь после термостатирования трижды подвергают диализу против 1 литра патрийфосфатного буфера (10 мМ, рН 7,5). Полученный раствор фильтруют через фильтр 0,22 мкм.
3.3.2. Покрытие микропланшетов эталонным антибиотиком.
Используют микропланшеты из полистирола марки NUNK (Immuno Plate: типа Maxisorp) или марки GREINER (microlon 600, индекс 705071) с высокой адсорбционной способностью по отношению к белку. Кюветы микропланшетов промывают 150 мМ РВS-буфером, рН 7,2. Затем аликвоту раствора, приготовленного в Примере 3.3.1, термостатируют 24 часа при 4oС в кюветах. После термостатирования кюветы отмывают трижды 150 мМ буфером PBS, рН 7,2, 0,1% Tween-20. Затем пробирку насыщают в течение двух часов при 20oС 150 мМ PBS-буфером для насыщения, рН 7,2, 5% BSA. После трехкратного отмывания буфером для промывки пробирки сушат и хранят при 4oС в сухом месте.
Для кювет, предназначенных для распознающего агента BlaR-CTD-щелочная фосфатаза, в качестве буфера для промывки используют 1 М диэтаноламин, рН 9,8, 0,5 мМ MgCl2; в качестве буфера для промывки кювет, предназначенных для распознающего агента BlaR-CTD-пероксидаза, используют 50 мМ фосфат калия, pН 5.
3.4. Определение трех антибиотиков в молоке.
1,4 пикомоля меченого распознающего агента термостатируют в присутствии 100 мкл разбавленного молока в течение 5 минут при 47oС. Молоко пипеткой переносят в кювету, предварительно обработанную, как указано в Примере 2.3. Затем молоко термостатируют 2 минуты при 47oС. После удаления молока два раза промывают буфером для промывки (см. Пример 2.3.2.), 300 мкл буфера, содержащего субстрат для обнаружения (проявляющий субстрат), термостатируют 2 минуты в кювете (проявляющий субстрат для распознающего агента BlaR-CTD-пероксидаза: 50 мМ фосфат калия, рН 5, 9,1 мМ ABTS, 0,002% Н2О2; проявляющий субстрат для распознающего агента BlaR-CTD-щелочная фосфатаза: 1 М диэтаноламин, рН 9,8, 0,5 мМ MgCl2, 10 мМ 4-NPP). Затем планшет помещают в автоматический спектрофотометр для планшетов ELISA, устанавливая длину волны 405 нм.
Этот тест позволяет определять наличие трех антибиотиков - пенициллина G, клоксациллина и цефтиофура - в контрольных пороговых концентрациях, требуемых федеральными властями США (пенициллин G - 5 ч. на млрд, клоксациллин - 10 ч. на млрд и цефтиофур - 50 ч. на млрд).
ПРИМЕР 4. Определение в молоке 6 антибиотиков: пенициллина G, ампициллина, амоксициллина, клоксациллина, цефапирина и цефтиофура.
Этот пример иллюстрирует обнаружение в молоке б антибиотиков, содержащих β-лактамный цикл, которые контролируются федеральными органами США, вплоть до норм, установленных этими органами в настоящее время. Тест, описанный в этом примере, использует рецептор BlaR-CTD в форме слитого белка со щелочной фосфатазой или пероксидазой, а подложку в виде пробирки с покрытием.
4.1. Слитый белок BlaR-CTD-щелочная фосфатаза.
См. Пример 3.1.
4.2. Твердая подложка: пробирка с нанесенным на нее эталонным антибиотиком.
В этом примере используют пробирки из полистирола марки NUNK (типа Maxisorp) с высокой адсорбирующей способностью по отношению к белку, которые обрабатывают раствором эталонного антибиотика, как указано в Примере 3.3.2.
4.3. Определение 6 антибиотиков в молоке.
7 пикомолей распознающего агента термостатируют в присутствии 500 мкл молока в течение 5 минут при 47oС в пробирке Эппендорфа. Затем молоко пипеткой переносят в пробирку, обработанную, как описано в Примере 3.2. Затем молоко термостатируют 2 минуты при 47oС. После удаления молока пробирку дважды отмывают 1 мл 1М буфера диэтаноламина, рН 9,8, 0,5 мМ MgCl2. Затем добавляют 500 мкл буфера, содержащего 1 М диэтаноламина, рН 9,8, 0,5 мМ MgCl2, 10 мМ 4-NРР-проявляющего субстрата и субстрат термостатируют 2 минуты при 47oС. Поглощение надосадочной жидкости определяют с помощью спектрофотометра при длине волны 405 нм.
Этот способ позволяет определять 6 антибиотиков в количествах, соответствующих нормам, установленным федеральными властями США: пенициллин G в количествах менее 5 ч. на млрд; ампициллин в количествах менее 10 ч. на млрд; амоксициллин в количествах менее 10 ч. на млрд; клоксациллин в количествах менее 10 ч. на млрд; цефапирин в количествах менее 20 ч. на млрд; цефтиофур в количествах менее 50 ч. на млрд.
Claims (13)
1. Способ определения антибиотиков, содержащих β-лактамный цикл, в жидкости биологического происхождения, включающий следующие стадии: а) приведение определенного объема указанной жидкости биологического происхождения в контакт с некоторым количеством распознающего агента и термостатирование полученной при этом смеси в условиях, в которых возможно комплексообразование антибиотиков, которые могут присутствовать в указанной биологической жидкости, с распознающим агентом, б) приведение смеси, полученной на стадии (а), в контакт с, по меньшей мере, одним эталонным антибиотиком, иммобилизованным на подложке, в условиях, которые делают возможным образование комплекса эталонного антибиотика с тем количеством распознающего агента, которое не прореагировало на стадии (а), и в) определение количества распознающего агента, связанного с подложкой, по которому судят о количестве антибиотика в исследуемой жидкости, отличающийся тем, что распознающий агент представляет собой рецептор, чувствительный к антибиотикам, содержащим β-лактамное кольцо, полученный из Bacillus licheniformis.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что рецептор, чувствительный к антибиотикам, содержащим β-лактамный цикл, представляет собой B1aR или рецептор B1aR-CTD.
3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что рецептор, чувствительный к антибиотикам, содержащим β-лактамный цикл, связывается меткой, выбранной из металлических коллоидных частиц, коллоидных частиц селена, углерода, серы или теллура и коллоидных частиц окрашенных синтетических латексов.
4. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что рецептор, чувствительный к антибиотикам, содержащим β-лактамный цикл, связывается меткой, выбранной из флуоресцирующих веществ.
5. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что рецептор, чувствительный к антибиотикам, содержащим β-лактамный цикл, связывается меткой, выбранной из ферментов, таких как щелочная фосфатаза, пероксидазы или β-лактамазы.
6. Способ по п.5, отличающийся тем, что рецептор, чувствительный к антибиотикам, связывается меткой-ферментом химически или генетически.
7. Способ по любому из пп.3-6, отличающийся тем, что рецептор, чувствительный к антибиотикам, содержащим β-лактамный цикл, связывается меткой перед стадией (а).
8. Способ по любому из пп.3-6, отличающийся тем, что рецептор, чувствительный к антибиотикам, содержащим β-лактамный цикл, связывается меткой во время или после стадии (а).
9. Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что стадии (а) и (б) проводят одновременно.
10. Способ по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что подложку, применяемую на стадии (б), выбирают из пробирок, планшетов или стержней с нанесенным на их поверхность эталонным антибиотиком.
11. Способ по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что подложка, применяемая на стадии (б), представляет собой аналитическое устройство, состоящее из твердой панели (1), имеющей первый и второй конец, к которой прикреплены последовательно, начиная с первого конца, мембрана (2) для очистки анализируемой жидкости, мембрана (3), на которой иммобилизовано одно или более улавливающих веществ, и поглощающая мембрана (4).
12. Способ по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что подложка, применяемая на стадии (б), состоит из множества магнитных или немагнитных гранул (шариков).
13. Аналитический набор для определения антибиотиков в жидкости биологического происхождения способом по любому из пп.1-12, содержащий, по меньшей мере, один распознающий агент, чувствительный к антибиотикам, содержащим β-лактамный цикл, полученный из Bacillus licheniformis, и, по меньшей мере, один эталонный антибиотик, иммобилизованный на подложке.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BE9800485A BE1012049A6 (fr) | 1998-06-25 | 1998-06-25 | Procede pour la determination d'antibiotique a noyau beta-lactame dans un liquide biologique. |
| BE98/00,485 | 1998-06-25 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2001102261A RU2001102261A (ru) | 2003-03-10 |
| RU2213973C2 true RU2213973C2 (ru) | 2003-10-10 |
Family
ID=3891319
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2001102261/13A RU2213973C2 (ru) | 1998-06-25 | 1999-03-30 | СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИБИОТИКОВ, СОДЕРЖАЩИХ β-ЛАКТАМНЫЙ ЦИКЛ, В ЖИДКОСТИ БИОЛОГИЧЕСКОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ И АНАЛИТИЧЕСКИЙ НАБОР ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6524804B2 (ru) |
| EP (1) | EP1082451B1 (ru) |
| JP (1) | JP4426103B2 (ru) |
| KR (1) | KR100577700B1 (ru) |
| CN (1) | CN1145029C (ru) |
| AR (1) | AR018821A1 (ru) |
| AT (1) | ATE331808T1 (ru) |
| AU (1) | AU737906B2 (ru) |
| BE (1) | BE1012049A6 (ru) |
| BR (1) | BR9911500B1 (ru) |
| CA (1) | CA2335734C (ru) |
| CZ (1) | CZ298192B6 (ru) |
| DE (1) | DE69932161T2 (ru) |
| DK (1) | DK1082451T3 (ru) |
| ES (1) | ES2268860T3 (ru) |
| IL (1) | IL140258A (ru) |
| NO (1) | NO20006574L (ru) |
| NZ (1) | NZ508965A (ru) |
| PL (1) | PL195495B1 (ru) |
| PT (1) | PT1082451E (ru) |
| RU (1) | RU2213973C2 (ru) |
| TR (1) | TR200003833T2 (ru) |
| WO (1) | WO1999067416A2 (ru) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2379686C2 (ru) * | 2007-12-17 | 2010-01-20 | Федеральное агентство по высокотехнологичной медицинской помощи Федеральное государственное учреждение "Уральский научно-исследовательский институт дерматовенерологии и иммунопатологии" (ФГУ УрНИИДВиИ Росмедтехнологий) | Способ определения концентрации препаратов бензилпенициллина в биологических жидкостях |
| RU2406086C2 (ru) * | 2008-06-30 | 2010-12-10 | Михаил Тимофеевич Александров | Способ выбора предпочтительного антимикробного препарата |
| RU2517618C2 (ru) * | 2008-07-10 | 2014-05-27 | Такаунт Икзэкт Лтд. | Способ и система для определения количества культивируемых клеток |
| RU2524624C2 (ru) * | 2010-01-29 | 2014-07-27 | Тарту Юликоол (Юниверсити Оф Тарту) | Система реального времени, способ калибровки системы и одновременное обнаружение остатков антибиотиков и их концентраций в молоке |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8481334B1 (en) | 2001-11-06 | 2013-07-09 | Charm Sciences, Inc. | Method of attaching a ligand to a solid support |
| EP1712914A1 (fr) * | 2005-04-14 | 2006-10-18 | Unisensor S.A. | Procédé in vitro pour la detection et l'identification simultanées d'antibiotiques de classes differentes et trousse de diagnostic correspondante |
| PL385415A1 (pl) * | 2008-06-11 | 2009-12-21 | Marek Ciesielski | Sposób wykrywania bakteriooporności, zestaw diagnostyczny oraz zastosowanie oznaczania obecności leku i/lub produktów jego rozpadu |
| GB0914001D0 (en) * | 2009-08-11 | 2009-09-16 | Benson Jennifer M | Biodegradable pregnancy test |
| CN102192980B (zh) * | 2010-03-08 | 2014-04-09 | 苏州浩欧博生物医药有限公司 | 非金属胶体粒子免疫分析方法 |
| WO2013037885A1 (en) * | 2011-09-16 | 2013-03-21 | Dsm Ip Assets B.V. | Immunoassay for detecting antibiotics |
| WO2013037886A1 (en) * | 2011-09-16 | 2013-03-21 | Dsm Ip Assets B.V. | Immunoassay for detecting antibiotics |
| WO2013037888A1 (en) * | 2011-09-16 | 2013-03-21 | Dsm Ip Assets B.V. | Immunoassay for detecting antibiotics |
| US9689021B2 (en) * | 2011-10-14 | 2017-06-27 | Université de Liège | Method for measuring beta-lactam antibiotics |
| ES2738690T3 (es) * | 2015-11-20 | 2020-01-24 | Centrient Pharmaceuticals Netherlands B V | Ensayo para determinar antibióticos en residuos |
| WO2018125271A1 (en) | 2016-12-28 | 2018-07-05 | Neogen Corporation | Fluid retainer cartridge assembly and method for utilizing the same |
| USD834721S1 (en) | 2017-03-03 | 2018-11-27 | Neogen Corporation | Assay cartridge |
| JP6987593B2 (ja) * | 2017-10-16 | 2022-01-05 | 株式会社ニップン | 変異体受容体タンパク質 |
| JP7206645B2 (ja) * | 2018-06-08 | 2023-01-18 | 株式会社島津製作所 | 流体デバイスの製造方法および流体デバイス |
| CN111830015B (zh) * | 2019-04-18 | 2022-12-09 | 中国农业科学院农产品加工研究所 | 一种定量检测抗生素的方法 |
| CN110241056A (zh) * | 2019-07-19 | 2019-09-17 | 石河子大学 | 一种芽孢杆菌、利用该芽孢杆菌进行抗生素残留检测的方法及其应用 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4239852A (en) * | 1978-06-12 | 1980-12-16 | Penicillin Assays, Inc. | Antibiotic detection method |
| US4762782A (en) | 1985-05-16 | 1988-08-09 | Micromol Corporation | Assay for Beta-lactam antibiotics |
| US5028535A (en) * | 1989-01-10 | 1991-07-02 | Biosite Diagnostics, Inc. | Threshold ligand-receptor assay |
| US5434053A (en) * | 1992-10-06 | 1995-07-18 | Gist-Brocades N.V. | Detection of antibiotics |
| WO1999004267A2 (en) * | 1997-07-16 | 1999-01-28 | Charm Sciences, Inc. | Test device and method for detecting an analyte in a sample |
| US5985675A (en) * | 1997-12-31 | 1999-11-16 | Charm Sciences, Inc. | Test device for detection of an analyte |
| BR9812876B1 (pt) * | 1997-10-07 | 2011-09-06 | estojo de ensaio para detectar a presença de antibióticos contendo um anel de ß-lactama em um produto de laticìnio lìquido, e, método de detecção de antibióticos num produto de laticìnio lìquido. |
-
1998
- 1998-06-25 BE BE9800485A patent/BE1012049A6/fr not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-03-26 US US09/276,923 patent/US6524804B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-03-30 BR BRPI9911500-0A patent/BR9911500B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1999-03-30 PT PT99919158T patent/PT1082451E/pt unknown
- 1999-03-30 RU RU2001102261/13A patent/RU2213973C2/ru active
- 1999-03-30 AU AU37032/99A patent/AU737906B2/en not_active Ceased
- 1999-03-30 CA CA002335734A patent/CA2335734C/fr not_active Expired - Lifetime
- 1999-03-30 TR TR2000/03833T patent/TR200003833T2/xx unknown
- 1999-03-30 CN CNB998094056A patent/CN1145029C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1999-03-30 KR KR1020007014639A patent/KR100577700B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1999-03-30 AT AT99919158T patent/ATE331808T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-03-30 WO PCT/EP1999/002166 patent/WO1999067416A2/fr not_active Ceased
- 1999-03-30 NZ NZ508965A patent/NZ508965A/xx not_active IP Right Cessation
- 1999-03-30 EP EP99919158A patent/EP1082451B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1999-03-30 DE DE69932161T patent/DE69932161T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-03-30 ES ES99919158T patent/ES2268860T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-03-30 IL IL14025899A patent/IL140258A/xx not_active IP Right Cessation
- 1999-03-30 DK DK99919158T patent/DK1082451T3/da active
- 1999-03-30 CZ CZ20004790A patent/CZ298192B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1999-03-30 JP JP2000556056A patent/JP4426103B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1999-03-30 PL PL99345396A patent/PL195495B1/pl unknown
- 1999-03-31 AR ARP990101468A patent/AR018821A1/es active IP Right Grant
-
2000
- 2000-12-21 NO NO20006574A patent/NO20006574L/no not_active Application Discontinuation
-
2002
- 2002-06-14 US US10/170,343 patent/US8106155B2/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| YING FANG ZHU ET. AL, Identification of BlaR, the signal transducer for β-Lactamase Production in Bacillus licheniformis, as a Penicillin - Binding Protein with strong Homology to the OXA - 2β - Lactamase (Clats D) of Salmonella typhimurium, Journal of Bacteriology, Feb., 1990, v.172, № 2, р.1137-1141. B. JORIS ET. AL, Expression in Escherichia coli of the carboxy terminal domain of the BLAR sensory-transducer protein of Bacillus lichemiformis as a water - Soluble Mr 26000 penicilin - binding protein, FEMS Microbiology Letters 70, 1990, р.107-114. * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2379686C2 (ru) * | 2007-12-17 | 2010-01-20 | Федеральное агентство по высокотехнологичной медицинской помощи Федеральное государственное учреждение "Уральский научно-исследовательский институт дерматовенерологии и иммунопатологии" (ФГУ УрНИИДВиИ Росмедтехнологий) | Способ определения концентрации препаратов бензилпенициллина в биологических жидкостях |
| RU2406086C2 (ru) * | 2008-06-30 | 2010-12-10 | Михаил Тимофеевич Александров | Способ выбора предпочтительного антимикробного препарата |
| RU2517618C2 (ru) * | 2008-07-10 | 2014-05-27 | Такаунт Икзэкт Лтд. | Способ и система для определения количества культивируемых клеток |
| RU2524624C2 (ru) * | 2010-01-29 | 2014-07-27 | Тарту Юликоол (Юниверсити Оф Тарту) | Система реального времени, способ калибровки системы и одновременное обнаружение остатков антибиотиков и их концентраций в молоке |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2213973C2 (ru) | СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИБИОТИКОВ, СОДЕРЖАЩИХ β-ЛАКТАМНЫЙ ЦИКЛ, В ЖИДКОСТИ БИОЛОГИЧЕСКОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ И АНАЛИТИЧЕСКИЙ НАБОР ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ | |
| US5641634A (en) | Electronically-indexed solid-phase assay for biomolecules | |
| RU2206093C2 (ru) | Аналитическое устройство для определения аналитов в жидких молочных продуктах, способ определения наличия аналитов в жидком молочном продукте, способ изготовления аналитического устройства и аналитический набор | |
| CN202916286U (zh) | 一种定量检测降钙素原pct的胶乳增强免疫比浊试剂盒 | |
| CN101165491A (zh) | 以金磁微粒为载体检测抗双链dna抗体的方法 | |
| CN113461782B (zh) | 孔雀石绿的抗原模拟表位、制备方法及其应用 | |
| CN114895025B (zh) | 一种检测抗粘着斑蛋白-IgG抗体的试剂盒 | |
| Gotoh et al. | Immuno-FET sensor | |
| CA2047742A1 (en) | Method and diagnostic test kit for detection of anti-cardiolipin | |
| WO2004057301A2 (en) | Isolation and confirmation of analytes from test devices | |
| EP1200826B1 (en) | Internally referenced immunoassay and test device | |
| MXPA00012583A (en) | METHOD FOR DETERMINING ANTIBIOTICS WITH&bgr;-LACTAM CORE IN A BIOLOGICAL FLUID | |
| JP3768165B2 (ja) | 抗カルパスタチン抗体の測定法及び測定キット | |
| WO2022226842A1 (zh) | 用于检测样品中的分析物的方法和试剂盒 | |
| EP1382966A1 (en) | Microvolume detecting method and device | |
| CN117192112A (zh) | 一种监测免疫检测采样质量的方法 | |
| CN108872571B (zh) | 一种基于硫磺素t的免疫分析方法 | |
| CA1172164A (en) | Detection of lactam ring antibiotic in milk by enzyme immunoassay | |
| MXPA00003325A (en) | Testing device for determining analytes in a liquid dairy product | |
| RAYEV et al. | Design and Application of Multi-Purpose Test System using Non-Enzymatic Diagnostic Sets for Non-Instrumental Assay of Specific Antibodies |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| RH4A | Copy of patent granted that was duplicated for the russian federation |
Effective date: 20070130 |
|
| PC4A | Invention patent assignment |
Effective date: 20070220 |