RU2210596C2 - Способ синтеза цефазолина - Google Patents
Способ синтеза цефазолина Download PDFInfo
- Publication number
- RU2210596C2 RU2210596C2 RU2000101428A RU2000101428A RU2210596C2 RU 2210596 C2 RU2210596 C2 RU 2210596C2 RU 2000101428 A RU2000101428 A RU 2000101428A RU 2000101428 A RU2000101428 A RU 2000101428A RU 2210596 C2 RU2210596 C2 RU 2210596C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cefazolin
- mmtd
- synthesis
- acc
- methyl
- Prior art date
Links
- 229960001139 cefazolin Drugs 0.000 title claims abstract description 60
- MLYYVTUWGNIJIB-BXKDBHETSA-N cefazolin Chemical compound S1C(C)=NN=C1SCC1=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)CN3N=NN=C3)[C@H]2SC1 MLYYVTUWGNIJIB-BXKDBHETSA-N 0.000 title claims abstract description 56
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims abstract description 32
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 25
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 claims abstract description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 11
- 230000010933 acylation Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 claims abstract description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 7
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims abstract description 5
- GRWAIJBHBCCLGS-UHFFFAOYSA-N 2-(tetrazol-1-yl)acetic acid Chemical class OC(=O)CN1C=NN=N1 GRWAIJBHBCCLGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 claims abstract description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 claims abstract description 3
- 238000004064 recycling Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims abstract 5
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 claims abstract 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 3
- -1 3-methylmercapto- (5-methyl-1,3,4-thiadiazolyl-2-yl) Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 2
- 108010093369 Multienzyme Complexes Proteins 0.000 claims 1
- 102000002568 Multienzyme Complexes Human genes 0.000 claims 1
- 241000218657 Picea Species 0.000 claims 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 5
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 abstract description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 abstract description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 abstract description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 abstract description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 abstract description 2
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 abstract description 2
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 abstract description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 abstract 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 abstract 1
- 229940066734 peptide hydrolases Drugs 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 17
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N Butanol Natural products CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 10
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 8
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 8
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 8
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 7
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 6
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 6
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 6
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 5
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 5
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 4
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 4
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 4
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Al]O[Al]=O TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFVGISIMTYGQHF-UHFFFAOYSA-N ammonium dihydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].OP(O)([O-])=O LFVGISIMTYGQHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 2
- KTUQUZJOVNIKNZ-UHFFFAOYSA-N butan-1-ol;hydrate Chemical compound O.CCCCO KTUQUZJOVNIKNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 238000013178 mathematical model Methods 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 241000186063 Arthrobacter Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010073038 Penicillin Amidase Proteins 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 238000010533 azeotropic distillation Methods 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L calcium sulfate Chemical class [Ca+2].[O-]S([O-])(=O)=O OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000011132 calcium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003245 coal Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000020176 deacylation Effects 0.000 description 1
- 238000005947 deacylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 1
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000012038 nucleophile Substances 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к производству цефазолина - полусинтетического антибиотика цефалоспоринового ряда. Способ заключается в ацилировании 3-метилмеркапто-(5-метил-1,3,4-тиадиазолил-2-ил)-7-аминоцефалоспорановой кислоты (ММТД-7-АЦК) эфирами тетразол-1-уксусной кислоты (ЭТЗУК) в водной среде в присутствии иммобилизованного фермента из E.coli с последующим фракционным осаждением ММТД-7-АЦК и цефазолина и рециклированием ММТД-7-АЦК. Ацилирование проводят при температуре 10-30oС в градиенте pH 7,8-6,2 с использованием исходной концентрации ММТД-7-АЦК 20-40 г/л и избытка ЭТЗУК (1,5-4): 1. В качестве биокатализатора используют иммобилизованный в полиакриламидный гель полиферментный комплекс пептидогидролаз E.coli штамма FU-99-S с преобладающим содержанием цефазолинсинтетазы, с активностью по синтезу цефазолина ≥ 300 мкмоль/•мин и соотношением активности по синтезу и гидролизу цефазолина более 8:1, в виде биомассы клеток продуцента цефазолинсинтетазы или фермента, выделенного из биомассы клеток. Использование способа позволяет повысить производительность и эффективность способа и качество целевого продукта. 4 з.п. ф-лы, 3 табл.
Description
Изобретение относится к области производства лекарственных препаратов, а именно к производству цефазолина - представителя группы эффективных полусинтетических цефалоспориновых антибиотиков.
Известны способы получения цефазолина анилированием 3-метилмеркапто-(5-метил-1,3,4-тиадиазолил-2-ил)-7-аминоцефалоспорановой кислоты (ММТД-7-АЦК) эфирами тетразол-1-уксусной кислоты (ЭТЗУК) с использованием в качестве биокатализаторов (БК) (ферментов из E.coli (см. авторское свидетельство СССР 1835827, 1990 [1] и авторское свидетельство СССР 1817473, 1990 [2]) и грибной культуры Arthrobacter viscosous sp. nov. (см. патент Японии 54-59397, 1979) [3].
Анализ известного способа [3] свидетельствует о том, что используемый в этом способе фермент не связан ковалентной связью с носителем, что приводит к вымыванию фермента в реакционную массу, а, следовательно, к потерям активности БК и загрязнению конечного продукта примесями белковой природы. Действительно, способ [3] предусматривает достаточно сложную схему очистки цефазолина: фильтрат после отделения БК пропускают через колонку с неионогенным сорбентом, затем элюат подвергают пленочной хроматографии на силикагеле, обрабатывают активированным углем и очищенный таким образом раствор упаривают для осаждения цефазолина. Недостатком этого способа является также проведение процесса при неоптимальных для синтеза цефазолина значениях pH 7,3-7,8.
Согласно способу [2] для извлечения цефазолина из реакционной массы также используют неионогенный сорбент в сочетании с анионитом. Реакцию синтеза цефазолина осуществляют в непрерывном режиме с отводом раствора из биореактора и рециркулированием его через систему последовательно соединенных колонок, заполненных сорбентами, насыщенными исходной ключевой аминокислотой (КА). Недостатком этого способа, помимо сложной схемы проведения процесса, является низкая производительность процесса, обусловленная нерациональным выбором исходных концентраций реагентов.
В качестве прототипа выбран способ [1], как наиболее технологичный и превышающий по эффективности другие известные способы. Учитывался также тот факт, что в нем используется фермент из того же семейства микроорганизмов, что и в заявляемом изобретении. Согласно способу-прототипу для ацилирования используют иммобилизованную пенициллинамидазу из E.coli (К.Ф.3.5.1.11) с соотношением активности по синтезу и гидролизу цефазолина 8:1. Степень биотрансформации ММТД-7-АЦК в цефазолин составляет 80-82%. После синтеза компоненты реакционной смеси разделяют фракционным осаждением, и ММТД-7-АЦК используют для повторного ацилирования. Степень использования КА 88%, что соответствует расходному коэффициенту 0,86 кг/кг цефазолина. Содержание основного вещества в продукте не менее 95%.
Этому способу присущи следующие недостатки:
- Низкая производительность процесса, обусловленная низкой исходной концентрацией ММТД-7-АЦК (6 г/л согласно примерам). Синтез начинают вести при неполном растворении КА при значении pH 6,2.
- Низкая производительность процесса, обусловленная низкой исходной концентрацией ММТД-7-АЦК (6 г/л согласно примерам). Синтез начинают вести при неполном растворении КА при значении pH 6,2.
- Использование БК с активностью по синтезу цефазолина 200±50 мкмоль/г•мин приводит к необходимости проведения реакции при температуре 40oС, что ведет к ухудшению качества продукта за счет гидролиза ММТД-7-АЦК и цефазолина по С3 связи.
Технической задачей, которую решает заявляемое изобретение, является увеличение производительности и общей эффективности процесса получения цефазолина, а также повышение качества конечного продукта.
Эта задача решается следующим образом. Ацилирование ММТД-7-АЦК осуществляют ЭТЗУК в водной среде в присутствии БК на основе либо иммобилизованных в полиакриламидный гель (ПААГ) клеток E.coli, штамм FU-99-S, либо полиферментного комплекса пептидогидролаз с преобладающим содержанием цефазолинсинтетазы, выделенного из этих клеток, модифицированного бифункциональным реагентом - глутаровым альдегидом, и иммобилизованного в ПААГ. Получают биокатализатор с активностью по синтезу цефазолина 360±60 мкмоль/г•мин (условия определения: 30oС, pH 7,5, [ММТД-7-АЦК]=0,075 М, [МЭТЗУК]=0,145 М). Густота суспензии БК в реакторе варьируется от 1 до 3,5% в зависимости от активности БК и температуры реакционной массы во время синтеза, выбираемой в диапазоне от 10 до 30oС. Начальная концентрация ММТД-7-АЦК 20-40 г/л, молярное соотношение ЭТЗУК и ММТД-7-АЦК (X) - (1,5÷4):1. Синтез цефазолина ведут в градиенте pH значений, начиная с pH, при котором обеспечивается растворение ММТД-7-АЦК (7,3-7,8 в зависимости от исходной концентрации КА и температуры процесса), и заканчивая при pH 6,0-6,3 (оптимальном для синтеза цефазолину). Уменьшение значения pH во время синтеза происходит благодаря выделению свободной кислоты - ТЗУК, образующейся при гидролизе ЭТЗУК. Однако при чрезмерном снижении pH реакционной массы возможно выпадение осадка ММТД-7-АЦК в процессе синтеза, что нежелательно. Следовательно, pH реакционной массы необходимо поддерживать на таком уровне, чтобы текущая концентрация ММТД-7-АЦК (Nτ) не превышала ее растворимости (s), то есть, чтобы соблюдалось соотношение Nτ/s≤1:
где К2 константа ионизации аминогруппы ММТД-7-АЦК; s± - растворимость ее цвиттерионной формы.
где К2 константа ионизации аминогруппы ММТД-7-АЦК; s± - растворимость ее цвиттерионной формы.
Расчет текущей концентрации ММТД-7-АЦК в каждый момент времени (τ) проводят с использованием уравнений (2-7) математической модели, разработанной на основе кинетической схемы синтеза цефазолина продукта (Р), согласно которой ЭТЗУК является субстратом (S), ацилирующим фермент, а ММТД-7-АЦК нуклеофилом (N), конкурирующим с водой на стадии деацилирования анцилфермента.
где V2 и V3 скорость ферментативного гидролиза и ферментативного синтеза цефазолина, соответственно.
a1=1+N/k12+P2/k11 (5)
a2=1+N/k12 (6)
a3=N/KN (7)
Здесь P2 - побочный продукт процесса, ТЗУК.
Значения констант, входящих в уравнения (2-7) и используемых для расчета зависимости pH время, приведены в таблице 1. Эти значения были определены итерационным методом при сравнении экспериментальных кривых синтеза цефазолина с расчетными кривыми, полученными с использованием уравнений математической модели и кинетических и равновесных констант, найденных в модельных экспериментах. На рисунках 1-3 представлены для примера результаты расчета градиента рН, степени превращения ММТД-7-АЦК и параметра Nτ/s для нескольких вариантов начальных концентраций реагентов при синтезе цефазолина. Как видно из рисунков 2 и 3, при использовании высокого избытка ацилирующего агента степень превращения ММТД-7-АЦК достигает 95-97%. Расходные коэффициенты сырья в кг на кг цефазолина составляют в этом случае 0,90-0,95 для ММТД-7-АЦК и 1,3-1,5 для ЭТЗУК (в расчете на ТЗУК). Регенерация ТЗУК, заключающаяся в переводе соли ТЗУК в органический растворитель - бутанол - путем азеотропной отгонки воды после удаления неорганических солей и частичного упаривания водного раствора, позволяет снизить расходный коэффициент ЭТЗУК до 0,50-0,55 кг/кг, однако процесс регенерации является достаточно трудоемким. Между тем, при использовании примерно 2-кратного избытка ацилирующего агента, регенерация ТЗУК не требуется: расходный коэффициент ЭТЗУК составляет около 0,9-1,0 кг ТЗУК на кг цефазолина. Что касается ММТД-7-АЦК, то, поскольку степень превращения ее в цефазолин при 2-кратном избытке ацилирующего агента составляет лишь 70-75%, для создания эффективной технологии необходима регенерация непрореагировавшей ММТД-7-АЦК, которую осуществляют простым осаждением ее в изоэлектрической точке. Расходный коэффициент ММТД-7-АЦК составляет при этом около 0,8. Проведенные расчеты показывают, что вариант процесса с 2-кратным избытком ацилирующего агента является наиболее предпочтительным.
Помимо этого, для выбранного избытка ЭТЗУК существует также предпочтительный интервал концентраций ММТД-7-АЦК (25-30 г/л), при котором расчетный градиент pH от 7,3 до 6,2 достигается самопроизвольно. В других случаях рН реакционной массы поддерживают путем добавления раствора аммиака в автоматическом режиме с использованием компьютерного контроля. Управляющим параметром при этом является pH реакционной смеси, расчет которого проводят по уравнению 1. По окончании биотрансформации БК отделяют фильтрованием и используют повторно и следующем цикле синтеза цефазолина. Реакционную смесь подкисляют до рН 4,2-4,3, отделяют ММТД-7-АЦК фильтрацией, пасту промывают и используют для повторного ацилирования.
Фильтрат после отделения ММТД-7-АЦК или сразу после отделения БК (при варианте технологии с большим избытком ЭТЗУК без регенерации КА) обрабатывают окисью алюминия для удаления окрашенных примесей и осаждают цефазолин подкислением раствора до pH 1,4-1,5. При необходимости из маточного раствора после отделения цефазолина регенерируют ТЗУК, как описано ниже.
Общая степень утилизации ММТД-7-АЦК составляет 90-95%, что соответствует расходному коэффициенту 0,85-0,80 кг/кг цефазолина. Расходный коэффициент ЭТЗУК варьирует от 0,5 до 1,4. Содержание основного вещества в целевом продукте более 97%. Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Готовят раствор ММТД-7-АЦК с концентрацией 20-40 г/л в 0,3 М фосфатно-аммиачном буфере (ФАБ), рН 7,5-8,0, при температуре 10-30oС. После этого к раствору ММТД-7-АЦК добавляют навеску ЭТЗУК из расчета молярного соотношения субстрата и КА (1,5÷4):1. Объем раствора доводят до расчетного добавлением 0,3 М фосфатно-аммиачного буфера, рН 7,5-8,0 и устанавливают начальное значение рН раствора в диапазоне 7,3-7,8.
Синтез цефазолина проводят в термостатируемом реакторе с фильтрующим днищем, снабженным лопастной мешалкой с переменной частотой вращения и системой автоматического поддержания градиента рН значений по заданной программе. В реактор загружают навеску влажного БК с активностью по синтезу цефазолина ≥ 300 мкмоль/г•мин из расчета от 10 до 35 г/л (в зависимости от выбранной температуры процесса) и раствор исходных реагентов. Реакционную массу инкубируют при перемешивании и автоматическом поддержании градиента рН в интервале (7,3-7,8)-(6,2-6,4) с помощью 2М раствора аммиака в течение 45-60 мин. Реакционную массу отделяют от БК фильтрованием, охлаждают до 5oС, подкисляют серной кислотой до pH 4,2 и осаждают непрореагировавшую ММТД-7-АЦК в течение часа. Осадок отделяют фильтрованием, промывают небольшим объемом воды, тщательно отжимают и используют в следующем цикле синтеза цефазолина. При варианте с регенерацией ТЗУК стадию регенерации КА опускают. В маточный раствор после отделения ММТД-7-АЦК (или сразу после отделения БК) добавляют 1-2% в/о окиси алюминия, суспензию перемешивают в течение 30-40 минут и отработанный сорбент отделяют фильтрованием. Фильтрат подкисляют до рН 1,4-1,5 и осаждают цефазолин. После часовой выдержки суспензии при перемешивании и охлаждении кристаллический осадок цефазолина отделяют фильтрованием, промывают холодной водой и сушат в вакууме при 30oС в течение 12 часов. Содержание основного вещества в целевом продукте более 97%. Для регенерации ТЗУК маточный раствор после отделения цефазолина нейтрализуют путем добавления порошка CaO или Ca(ОН)2 и образовавшийся осадок сульфатов кальция удаляют фильтрованием. Далее раствор концентрируют в 5-7 раз упариванием в вакууме, концентрат обрабатывают активированным углем (2% в/о) для осветления, добавляют к нему бутанол из расчета 4 объема на 1 объем водного концентрата и отгоняют азеотропную смесь на роторном испарителе при остаточном давлении не менее 10 мм рт.ст. и температуре бани 40-45oС. Упарку ведут до полной отгонки воды: для этого необходимо отогнать не менее 4/5 объема водно-бутанольной смеси. По окончании отгонки суспензию солей ТЗУК в бутаноле охлаждают до 5oС и фильтруют под вакуумом. Пасту промывают, сушат и полученный после этерификации ЭТЗУК используют вновь для синтеза цефазолина. Расходный коэффициент ТЗУК с учетом регенерации составляет 0,5-0,55 кг/кг цефазолина.
Преимущества (отличительные признаки) предлагаемого способа:
1. Значительно повышенная по сравнению с известными способами [1], [2], [3] производительность и общая эффективность процесса получения цефазолина, достигаемая за счет высокой исходной концентрации ММТД-7-АЦК, что стало возможным благодаря организации процесса синтеза с градиентом pH значений.
1. Значительно повышенная по сравнению с известными способами [1], [2], [3] производительность и общая эффективность процесса получения цефазолина, достигаемая за счет высокой исходной концентрации ММТД-7-АЦК, что стало возможным благодаря организации процесса синтеза с градиентом pH значений.
2. Возможность создания высоко эффективных БК не только на основе фермента, но и на основе клеток за счет использования высокоактивного штамма - продуцента специфичного фермента. В свою очередь это позволяет снизить температуру процесса вплоть до 10oС, не увеличивая время реакции и густоту суспензии БК. Проведение процесса в более мягких условиях приводит к улучшению качества продукта.
3. Возможность удаления окрашенных примесей за счет введения дополнительной стадии очистки раствора цефазолина окисью алюминия приводит к улучшению качества продукта.
Способ иллюстрируется следующими практическими примерами.
Пример 1. (25 г/л КА, Х=2)
Готовят раствор субстратов. 10,29 г (29,90 ммоля) ММТД-7-АЦК растворяют в 350 мл 0,3М ФАБ, рН 7,5 при температуре 30oС, поддерживая рН раствора на уровне не менее 7,3 путем добавления 2 М раствора аммиака. После этого к раствору ММТД-7-АЦК добавляют 8,70 г (61,26 ммоля) метилового ЭТЗУК (МЭТЗУК) и объем раствора доводят 0,3 М ФАБ, рН 7,5 до 400 мл.
Готовят раствор субстратов. 10,29 г (29,90 ммоля) ММТД-7-АЦК растворяют в 350 мл 0,3М ФАБ, рН 7,5 при температуре 30oС, поддерживая рН раствора на уровне не менее 7,3 путем добавления 2 М раствора аммиака. После этого к раствору ММТД-7-АЦК добавляют 8,70 г (61,26 ммоля) метилового ЭТЗУК (МЭТЗУК) и объем раствора доводят 0,3 М ФАБ, рН 7,5 до 400 мл.
В реактор загружают 4,0 г влажного БК с активностью по синтезу цефазолина 360 мкмоль/г•мин и раствор исходных реагентов. Реакционную массу инкубируют при температуре 30oС при перемешивании в течение 50 мин. pH реакционной массы самопроизвольно снижается и достигает в конце процесса значения 6,3. Реакционную массу отделяют от БК фильтрованием, охлаждают до 5oС, подкисляют соляной кислотой до рН 4,2 и осаждают непрореагировавшую ММТД-7-АЦК в течение часа. Осадок отделяют фильтрованием, промывают 20 мл воды, тщательно отжимают и используют в следующем цикле синтеза цефазолина. Получают 13,50 г влажной пасты с содержанием ММТД-7-АЦК 21,3% и цефазолина 1,2%. В маточный раствор после отделения ММТД-7-АЦК добавляют 8 г (2% в/о) окиси алюминия, суспензию перемешивают в течение 30-40 минут и отработанный сорбент отделяют фильтрованием. Фильтрат подкисляют до рН 1,4-1,5 раствором серной кислоты (1: 1) и осаждают цефазолин. После часовой выдержки суспензии при перемешивании и охлаждении кристаллический осадок цефазолина отделяют фильтрованием, промывают 30 мл холодной водой и сушат в вакууме при 30oС в течение 12 часов. Получают 8,98 г (19,78 ммолей) цефазолина. Содержание основного вещества в целевом продукте 98,1%. Расходные коэффициенты ММТД-7-АЦК и ТЗУК составляют соответственно 0,828 и 0,874 кг/кг цефазолина.
Примеры 2 и 3.
Получение цефазолина осуществляют аналогично примеру 1, за исключением того, что используют этиловый и пропиловый эфиры ТЗУК (ЭЭТЗУК и ПЭТЗУК, соответственно). Температура 30oС, навеска БК - 4,0 г. Результаты представлены в таблице 2.
Примеры 4-7.
Растворы субстратов объемом 400 мл готовят аналогично описанию в примере 1, за исключением того, что используют 0,3 М ФАБ, pH 7,5-8,0 и pH исходного раствора устанавливают в диапазоне от 7,3 до 7,8.
В реактор загружают соответствующую навеску влажного БК и раствор исходных реагентов. Реакционную массу инкубируют при заданной температуре и перемешивании в течение 50-60 мин, поддерживая значение рН реакционной массы в соответствии с рассчитанным градиентом путем добавления раствора аммиака в автоматическом режиме. По окончании синтеза проводят фракционное осаждение компонентов, как это описано в примере 1. В примере 6 стадию осаждения ММТД-7-АЦК опускают. В примерах 5-7 проводят регенерацию ТЗУК из маточного раствора после отделения кристаллического осадка цефазолина. К маточному раствору объемом 420 мл добавляют при перемешивании 13,9 г CaO (содержание основного вещества 94%) до достижения pH суспензии около 7,5. Образовавшийся осадок CaSO4 отделяют фильтрованием в вакууме и тщательно промывают, суспендируя его в 50 мл воды. Промывку присоединяет к фильтрату. Объединенный фильтрат объемом 430 мл упаривают на роторном испарителе при остаточном давлении 10 мм рт.ст. и температуре бани 45oС до 70 мл. Водную суспензию неорганических солей отфильтровывают, промывают водой, 3 раза по 5 мл, промывку присоединяют к концентрату ТЗУК. К объединенному концентрату объемом 80 мл добавляют 1,6 г активированного угля и суспензию перемешивают в течение 20 минут. Уголь отфильтровывают, промывают 10 мл воды, тщательно отжимают. К осветленному водному концентрату ТЗУК объемом 85 мл добавляют 340 мл бутанола и азеотропную смесь отгоняют на роторном испарителе при остаточном давлении 10 мм рт.ст. и температуре бани 45oС. Упарку ведут до полной отгонки воды. Отгон водно-бутанольной смеси объемом 350 мл делят в делительной воронке: воду выбрасывают, а бутанол-отгон используют повторно. Кубовый остаток бутанольную суспензию солей ТЗУК объемом 70 мл охлаждают до 5oС и фильтруют под вакуумом. Осадок солей промывают свежим бутанолом, 2 раза по 5 мл, отжимают и сушат в вакуум-сушильном шкафу. Получают порошок, содержащий около 60% ТЗУК и 40% неорганических солей. Выход ТЗУК при регенерации около 95% от содержания ее в маточном растворе после отделения цефазолина. Продукт используют для синтеза МЭТЗУК с выходом 88-90%. Результаты экспериментов представлены в таблице 3.
Claims (5)
1. Способ получения цефазолина ацилированием 3-метилмеркапто-(5-метил-1,3,4-тиадиазолил-2-ил)-7-аминоцефалоспорановой кислоты (ММТД-7-АЦК) эфирами тетразол-1-уксусной кислоты (ЭТЗУК) в водной среде в присутствии иммобилизованного фермента из E. coli с последующим фракционным осаждением ММТД-7-АЦК и цефазолина и рециклированием ММТД-7-АЦК, отличающийся тем, что ацилирование проводят при температуре 10-30oС в градиенте рН 7,8-6,2, с использованием исходной концентрации ММТД-7-АЦК 20-40 г/л, молярного избытка ЭТЗУК (1,5-4): 1 и иммобилизованного в полиакриламидный гель (ПААГ) полиферментного комплекса пептидогидролаз E. coli штамма FU-99-S с преобладающим содержанием цефазолинсинтетазы, с активностью по синтезу цефазолина ≥ 300 мкмоль/г•мин и соотношением активности по синтезу и гидролизу цефазолина более 8: 1.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ацилирование проводят предпочтительно в градиенте рН 7,3-6,2, устанавливающемся самопроизвольно, с использованием исходной концентрации ММТД-7-АЦК 25-30 г/л и избытка ЭТЗУК (1,9-2,4): 1.
3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что в качестве ацилирующего агента предпочтительно используют метиловый ЭТЗУК.
4. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что в качестве биокатализатора используют иммобилизованную в ПААГ биомассу клеток продуцента цефазолинсинтетазы.
5. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что в качестве биокатализатора используют иммобилизованную в ПААГ цефазолинсинтегазу, выделенную из биомассы клеток.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2000101428A RU2210596C2 (ru) | 2000-01-21 | 2000-01-21 | Способ синтеза цефазолина |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2000101428A RU2210596C2 (ru) | 2000-01-21 | 2000-01-21 | Способ синтеза цефазолина |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2000101428A RU2000101428A (ru) | 2002-08-27 |
| RU2210596C2 true RU2210596C2 (ru) | 2003-08-20 |
Family
ID=29245152
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2000101428A RU2210596C2 (ru) | 2000-01-21 | 2000-01-21 | Способ синтеза цефазолина |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2210596C2 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117402176A (zh) * | 2022-07-08 | 2024-01-16 | 国药集团威奇达药业有限公司 | 一种头孢唑林酸的结晶方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3954745A (en) * | 1974-09-12 | 1976-05-04 | Eli Lilly And Company | Process for preparing cefazolin |
| US5387679A (en) * | 1991-07-15 | 1995-02-07 | Antibioticos S.P.A. | Process for the preparation of cephalosporins intermediates |
-
2000
- 2000-01-21 RU RU2000101428A patent/RU2210596C2/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3954745A (en) * | 1974-09-12 | 1976-05-04 | Eli Lilly And Company | Process for preparing cefazolin |
| US5387679A (en) * | 1991-07-15 | 1995-02-07 | Antibioticos S.P.A. | Process for the preparation of cephalosporins intermediates |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117402176A (zh) * | 2022-07-08 | 2024-01-16 | 国药集团威奇达药业有限公司 | 一种头孢唑林酸的结晶方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5532148A (en) | Process for producing of citric acid and monovalent citrate salts | |
| JP2664648B2 (ja) | Ｌ−アスパラギン酸の製造方法 | |
| CA2672714A1 (en) | Method for obtaining crystals of a basic amino acid hydrochloride | |
| CN111549015A (zh) | 一种利用色谱技术分离去除核酸酶液中桔霉素的工艺 | |
| CN102154429A (zh) | 一步酶法制备7-氨基头孢烷酸 | |
| RU2210596C2 (ru) | Способ синтеза цефазолина | |
| CA1215069A (en) | Method of isolating l-trytophan | |
| US5177005A (en) | Method for maintaining immobilized glucose isomerase activity during continuous isomerization of glucose to fructose | |
| SU469266A3 (ru) | Способ плучени 7-амино-дезацетоксицефалоспорановой кислоты | |
| AU2019216084B2 (en) | Method for preparing natural L-cysteine hydrochloride hydrate crystals by continuous chromatography | |
| CN109232610B (zh) | 一种头孢尼西二苄基乙二胺盐的精制方法 | |
| CN112301067B (zh) | 一种制备2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸的绿色环保工艺 | |
| JPS6066981A (ja) | 不溶化ペニシリンアミダ−ゼおよびその製法 | |
| CN1272445C (zh) | 利用吸附剂纯化头孢菌素c肉汤的方法 | |
| JPS60145095A (ja) | 固定化微生物によるキシリト−ルの製造法 | |
| CN117384222B (zh) | 一种从发酵液中分离纯化核苷酸的方法 | |
| JP3647065B2 (ja) | 光学活性アラニンの製造方法 | |
| CN121002191A (zh) | L-瓜氨酸的制备方法及装置 | |
| JPH0833493A (ja) | Ｌ−アスパラギン酸の製造方法 | |
| JP2872178B2 (ja) | Ｌ−アスパラギン酸の製造方法 | |
| JP2716525B2 (ja) | Ｌ―セリンの分離方法 | |
| CN100334221C (zh) | 一种直接法细胞酶反应生产丙烯酰胺水溶液的方法 | |
| JPH06296499A (ja) | 固定化酵素もしくは固定化微生物による光学活性インドリン−２−カルボン酸の製造方法 | |
| CN106350566A (zh) | 一种合成硫酸头孢喹肟的酶法工艺 | |
| JPH0733358B2 (ja) | 固定化生体触媒を用いたアミド結晶の製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20100122 |