RU2209435C1 - Antigen-specific method for detecting immune protein complexes of macroglobulins group with immunoglobulin g in biological liquids - Google Patents
Antigen-specific method for detecting immune protein complexes of macroglobulins group with immunoglobulin g in biological liquids Download PDFInfo
- Publication number
- RU2209435C1 RU2209435C1 RU2002109525/14A RU2002109525A RU2209435C1 RU 2209435 C1 RU2209435 C1 RU 2209435C1 RU 2002109525/14 A RU2002109525/14 A RU 2002109525/14A RU 2002109525 A RU2002109525 A RU 2002109525A RU 2209435 C1 RU2209435 C1 RU 2209435C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- complexes
- concentration
- antibodies
- autoantibodies
- immunoglobulin
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims 2
- 108010091934 Macroglobulins Proteins 0.000 title abstract description 5
- 102000018721 Macroglobulins Human genes 0.000 title abstract description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 title abstract 2
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 title description 3
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 title description 3
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 title 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 25
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 25
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 16
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims abstract description 13
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 6
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 claims abstract description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims abstract description 3
- 229940098197 human immunoglobulin g Drugs 0.000 claims abstract 2
- 239000010755 BS 2869 Class G Substances 0.000 claims description 27
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 27
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 27
- 108030001694 Pappalysin-1 Proteins 0.000 claims description 11
- 102000005819 Pregnancy-Associated Plasma Protein-A Human genes 0.000 claims description 11
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 claims description 10
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 5
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 5
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims description 5
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 5
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims description 5
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 3
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 claims description 3
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 claims description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 abstract description 4
- 239000008101 lactose Substances 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 abstract 1
- 108010015078 Pregnancy-Associated alpha 2-Macroglobulins Proteins 0.000 description 11
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 6
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 6
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 5
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 5
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 5
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 5
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 5
- 201000011461 pre-eclampsia Diseases 0.000 description 5
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 4
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 239000011545 carbonate/bicarbonate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 2
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 102100033312 Alpha-2-macroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000237852 Mollusca Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 230000023852 carbohydrate metabolic process Effects 0.000 description 1
- 235000021256 carbohydrate metabolism Nutrition 0.000 description 1
- 208000020450 carbohydrate metabolism disease Diseases 0.000 description 1
- 230000035606 childbirth Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к лабораторной диагностике, к серологическим методам исследования, а именно к иммунологии. The invention relates to laboratory diagnostics, to serological research methods, namely to immunology.
Белки семейства макроглобулинов, а именно альфа-2-макроглобулин (МГ), ассоциированный с беременностью протеин - А (РАРР-А) и ассоциированный с беременностью альфа-2-гликопротеин (PAG) имеют очень древнее происхождение, присутствуют фактически у всех представителей животного мира (от моллюсков до человека) и являются основными регуляторами функций, осуществляемых в жидких средах организма. Широко известна способность макроглобулинов ингибировать все известные типы протеиназ. Иммуномодуляторные способности белков семейства макроглобулинов и их комплексов с протеиназами и цитокинами также являются общепризнанным фактом. Однако комплексы белков данного семейства с другими иммунорегуляторными белками, в частности с иммуноглобулинами, в крови и других биологических жидкостях, колебания их концентрации при различных физиологических и патологических процессах до сих пор остаются не изученными. Proteins of the macroglobulin family, namely alpha-2-macroglobulin (MG), protein-A associated with pregnancy - A (PAPP-A) and pregnancy-associated alpha-2-glycoprotein (PAG) are of very ancient origin, are present in almost all representatives of the animal world (from mollusks to humans) and are the main regulators of the functions carried out in body fluids. The ability of macroglobulins to inhibit all known types of proteinases is widely known. The immunomodulatory abilities of the proteins of the macroglobulin family and their complexes with proteinases and cytokines are also a recognized fact. However, the complexes of proteins of this family with other immunoregulatory proteins, in particular with immunoglobulins, in blood and other biological fluids, fluctuations in their concentration during various physiological and pathological processes are still not studied.
Аналогом предлагаемого метода является способ количественного определения аутоантител к липопротеидам низкой плотности (ЛПНП) в сыворотке крови (патент РФ 2137134 от 15.04.97 г., Опубл. БИ 25, стр.513, 10.03.99 "Способ количественного определения аутоантител к липопротеидам низкой плотности в сыворотке крови."). Однако в этом способе в качестве связывающего агента используются ЛПНП, выделенные из большого числа доноров и очищенные от циркулирующих иммунных комплексов. An analogue of the proposed method is a method for the quantitative determination of autoantibodies to low density lipoproteins (LDL) in blood serum (RF patent 2137134 from 04.15.97, Publ. BI 25, p. 513, 10.03.99 "Method for the quantitative determination of autoantibodies to low density lipoproteins in blood serum. "). However, in this method, LDL isolated from a large number of donors and purified from circulating immune complexes is used as a binding agent.
Данный подход требует очень больших затрат исходного сырья вследствие потерь в процессе очистки. Кроме того, в случае промышленного использования методики возникнет необходимость введения внутренних стандартов, так как в каждом случае количество и физиологические характеристики доноров, а следовательно, и конечный состав полученных фракций ЛПНП будет различным. This approach requires very high costs of raw materials due to losses in the cleaning process. In addition, in the case of industrial use of the method, it will become necessary to introduce internal standards, since in each case the number and physiological characteristics of donors, and therefore the final composition of the obtained LDL fractions, will be different.
Наиболее близким к заявленному является способ количественного определения циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) при помощи иммуноферментного анализа (Константинова Н.А. "Иммунные комплексы и повреждение тканей". - М.: Медицина 1996, с.233-234). В данном способе в качестве связывающего агента (первичных антител) используются мышиные моноклональные антитела против Сlq, в качестве образца - сыворотка крови человека, в качестве буфера для разведения - забуференный физиологический раствор рН 7,4 с 150 мМ NaCl и 0,05% неионного детергента Твина-20 (ЗФР-Т). Реакция проявляется коньюгатом моноклональных анти-Fc-IgG с пероксидазой хрена. В качестве калибратора используют агрегированный при тепловой обработке IgG. Closest to the claimed is a method for the quantitative determination of circulating immune complexes (CEC) using enzyme-linked immunosorbent assay (Konstantinova N.A. "Immune complexes and tissue damage." - M .: Medicine 1996, s.233-234). In this method, murine monoclonal antibodies against Clq are used as a binding agent (primary antibodies), human blood serum is used as a sample, and buffered saline pH 7.4 with 150 mM NaCl and 0.05% non-ionic detergent is used as a dilution buffer Tween-20 (ZFR-T). The reaction is manifested by a conjugate of monoclonal anti-Fc-IgG with horseradish peroxidase. As a calibrator, IgG aggregated during heat treatment is used.
Однако использование моноклональных антител при определении комплексов белков семейства макроглобулинов с иммуноглобулинами, даже с иммуноглобулинами наиболее распространенного в биологических жидкостях класса G, неприемлемо вследствие исходно низкой концентрации данных комплексов. Моноклональные антитела способны распознавать только определенный центр связывания (эпитоп) на поверхности молекулы белка, вследствие чего незначительно повышается специфичность, но значительно снижается чувствительность тест-системы. Кроме того, тепловая агрегация контрольных образцов плохо поддается стандартизации вследствие спонтанного образования агрегатов различных размеров. К тому же, достаточно высокая гликозилированность молекул белков семейства макроглобулинов может спровоцировать завышение полученных результатов вследствие выявления неспецифических комплексов макроглобулинов с противоуглеводными антителами. However, the use of monoclonal antibodies in the determination of complexes of proteins of the macroglobulin family with immunoglobulins, even with immunoglobulins most common in biological fluids of class G, is unacceptable due to the initially low concentration of these complexes. Monoclonal antibodies are able to recognize only a specific binding center (epitope) on the surface of a protein molecule, as a result of which specificity is slightly increased, but the sensitivity of the test system is significantly reduced. In addition, the thermal aggregation of control samples is difficult to standardize due to the spontaneous formation of aggregates of various sizes. In addition, a sufficiently high glycosylation of molecules of proteins of the macroglobulin family can provoke an overestimation of the results obtained due to the identification of nonspecific complexes of macroglobulins with anti-carbohydrate antibodies.
Задача изобретения - создание высокоточного, дифференциального и достаточно эффективного способа определения концентрации комплексов белок семейства макроглобулинов - антитело, - аутоантитело или - противоуглеводное антитело в биологических жидкостях. The objective of the invention is the creation of a highly accurate, differential and sufficiently effective method for determining the concentration of complexes of proteins of the macroglobulin family of antibodies - antibodies, autoantibodies or - anti-carbohydrate antibodies in biological fluids.
Поставленная задача достигается тем, что для определения общей концентрации иммунных комплексов при выполнении иммуноферментного анализа в качестве первичных антител берут аффинно-очищенные поликлональные кроличьи антитела против белка семейства макроглобулинов, а именно МГ, PAG или РАРР-А, образцы разводят стандартным 0,1М фосфатным буфером рН 7,4 с 150 мМ NaCl, содержащим 0,05% Твина-20 (ЗФР-Т), иммуные комплексы проявляют коньюгатом поликлональных кроличьих антител к Fc фрагментам иммуноглобулина класса G с пероксидазой хрена. Для построения калибровки в качестве первичных антител используются кроличьи поликлональные антитела к иммуноглобулину класса G, в качестве калибратора - высокоочищенный нативный иммуноглобулин класса G, реакция проявляется коньюгатом кроличьих поликлональных антител к Fc фрагменту иммуноглобулина класса G с пероксидазой хрена. The task is achieved in that in order to determine the total concentration of immune complexes when performing an enzyme-linked immunosorbent assay, affinity-purified polyclonal rabbit antibodies against a protein of the macroglobulin family, namely MG, PAG or PAPP-A, are taken as primary antibodies, the samples are diluted with standard 0.1 M phosphate buffer pH 7.4 with 150 mM NaCl containing 0.05% Tween-20 (PBS-T), the immune complexes exhibit a conjugate of polyclonal rabbit antibodies to Fc immunoglobulin class G fragments with horseradish peroxidase. To build the calibration, rabbit polyclonal antibodies to class G immunoglobulin are used as primary antibodies, highly purified native class G immunoglobulin is used as a calibrator, the reaction is manifested by a conjugate of rabbit polyclonal antibodies to the Fc fragment of class G immunoglobulin with horseradish peroxidase.
Для определения аутоантител при помощи иммуноферментного анализа в качестве первичных антител берут аффинно-очищенные поликлональные кроличьи антитела против белка семейства макроглобулинов, а именно МГ, PAG или РАРР-А, в буфер для разведения образцов (ЗФР-Т) вводят сахара, а именно 0,1 М лактозу и 0,5 М глюкозу, иммунокомплексы проявляют коньюгатом поликлональных кроличьих антител к Fc фрагментам иммуноглобулина класса G с пероксидазой хрена. Для построения калибровки в качестве первичных антител используются кроличьи поликлональные антитела к иммуноглобулину класса G, в качестве калибратора - высокоочищенный нативный иммуноглобулин класса G, реакция проявляется коньюгатом кроличьих поликлональных антител к Fc фрагменту иммуноглобулина класса G с пероксидазой хрена. To determine the autoantibodies by enzyme immunoassay, the affinity-purified polyclonal rabbit antibodies against the protein of the macroglobulin family, namely MG, PAG or PAPP-A, are taken as primary antibodies, sugars, namely 0, are used as primary antibodies. 1 M lactose and 0.5 M glucose, immunocomplexes exhibit a conjugate of polyclonal rabbit antibodies to Fc fragments of class G immunoglobulin with horseradish peroxidase. To build the calibration, rabbit polyclonal antibodies to class G immunoglobulin are used as primary antibodies, highly purified native class G immunoglobulin is used as a calibrator, the reaction is manifested by a conjugate of rabbit polyclonal antibodies to the Fc fragment of class G immunoglobulin with horseradish peroxidase.
Концентрацию противоуглеводных антител определяют, вычисляя разницу между общей концентрацией иммунных комплексов и концентрацией аутоантител. The concentration of anti-carbohydrate antibodies is determined by calculating the difference between the total concentration of immune complexes and the concentration of autoantibodies.
Новизна способа:
1) Использование в качестве первичных антител аффинно-очищенных поликлональных кроличьих антител против белка семейства макроглобулинов, а именно: МГ, PAG или РАРР-А.The novelty of the method:
1) The use of affinity-purified polyclonal rabbit antibodies against a protein of the macroglobulin family as primary antibodies, namely: MG, PAG or PAPP-A.
2) Использование смеси сахаров, а именно: 0,1 М лактозы и 0,5 М маннозы, добавляемой в буфер (ЗФР-Т) для разведения образцов биологических жидкостей при определении комплексов с ауто-антителами. 2) The use of a mixture of sugars, namely: 0.1 M lactose and 0.5 M mannose added to the buffer (PBS-T) to dilute samples of biological fluids in the determination of complexes with auto-antibodies.
3) Использование для построения калибровочной кривой высокоочищенного нативного иммуноглобулина человека класса G в качестве калибратора. 3) Use for constructing a calibration curve of highly purified native human immunoglobulin class G as a calibrator.
4) Вычисление концентрации комплексов с противоуглеводными антителами путем вычитания концентрации комплексов с ауто-антителами из общей концентрации иммунокомплексов с иммуноглобулином класса G. 4) Calculation of the concentration of complexes with anti-carbohydrate antibodies by subtracting the concentration of complexes with auto-antibodies from the total concentration of immunocomplexes with class G immunoglobulin.
Использование поликлональных антител в качестве первичных обусловлено крайне низкой концентрацией комплексов белков семейства макроглобулинов с иммуноглобулином класса G в предварительно исследованных образцах биологических жидкостей. Использование смеси антител с сайтами связывания к различным эпитопам на поверхности макроглобулина позволяет обеспечить наиболее полное связывание определяемых иммунных комплексов. The use of polyclonal antibodies as primary is due to the extremely low concentration of complexes of proteins of the macroglobulin family with class G immunoglobulin in previously studied samples of biological fluids. The use of a mixture of antibodies with binding sites to various epitopes on the surface of macroglobulin allows for the most complete binding of the determined immune complexes.
Учитывая достаточно высокую гликозилированность молекул белков семейства макроглобулинов, определение только общей концентрации иммунных комплексов не всегда корректно, так как при ряде патологий степень гликозилированности может меняться. Добавление смеси сахаров в буфер для разведения позволяет исключить противоуглеводные антитела за счет конкурентного вытеснения и определить, таким образом, истинную концентрацию иммунных комплексов белков семейства макроглобулинов с аутоантителами. Given the rather high glycosylation of molecules of proteins of the macroglobulin family, the determination of only the total concentration of immune complexes is not always correct, since with a number of pathologies the degree of glycosylation can vary. Adding a mixture of sugars to the dilution buffer eliminates anti-carbohydrate antibodies due to competitive displacement and thus determines the true concentration of immune complexes of proteins of the macroglobulin family with autoantibodies.
Использование нативного иммуноглобулина класса G в качестве калибратора позволяет повысить точность тест-системы, так как в отличие от агрегированного при тепловой обработке белка нативные высокоочищенные препараты IgG имеют одинаковую молекулярную массу и, следовательно, лучше поддаются стандартизации. The use of a native class G immunoglobulin as a calibrator can improve the accuracy of the test system, since, unlike the aggregated protein during heat treatment, native highly purified IgG preparations have the same molecular weight and, therefore, are better able to standardize.
Определение сначала общей суммы иммунокомплексов с иммуноглобулином класса G, а затем концентрации комплексов с аутоантителами позволяет оценить соотношение ауто- и противоуглеводных антител в различных биологических жидкостях. First, the determination of the total amount of immunocomplexes with class G immunoglobulin, and then the concentration of complexes with autoantibodies, allows us to estimate the ratio of auto- and anti-carbohydrate antibodies in various biological fluids.
Предлагаемый способ осуществляют следующим образом. The proposed method is as follows.
Для определения общей концентрации комплексов иммуноглобулина класса G с каким-либо из белков семейства макроглобулинов при помощи иммуноферментного анализа афинно-очищенные поликлональные кроличьи антитела к макроглобулину (МГ, PAG или РАРР-А) разводятся карбонат-бикарбонатным буфером рН 9,6 до концентрации 10 мкг в мл и вносятся на полистироловый планшет по 200 мкл в каждую лунку. Планшет оставляют на 16 ч при 4oС. Затем планшет несколько раз промывают 0,1 М фосфатным буфером рН 7,4 с 150 мМ NaCl, содержащим 0,05% Твина-20 (ЗФР-Т). Для исключения неспецифических реакций свободный полистирол (без присоединившихся антител) покрывается 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в 0,1 М фосфатном буфере рН 7,4 с 150 мМ NaCl. Раствор БСА вносится по 200 мкл в каждую лунку и инкубируется 1ч при комнатной температуре. Образцы разводятся в ЗФР-Т, соотношения буфера и образца подбираются для каждого типа образца индивидуально вследствие различной концентрации иммунных комплексов в различных биологических жидкостях. Разведенные образцы вносятся на планшет по 200 мкл в каждую лунку. В качестве калибратора используется высокоочищенный нативный человеческий иммуноглобулин класса G. Его разведения готовятся в ЗФР-Т. Мы рекомендуем использовать 7-точечную калибровку со ступенчатым разведением. Кроме того, необходимо оставить несколько свободных лунок в качестве фона (в них вносится только 200 мкл ЗФР-Т), а также, при серийном использовании метода, несколько лунок, куда вносится один и тот же образец на каждый планшет из серии для стандартизации результатов. Планшет ставится в термостат (37oС) на 45-60 мин, после чего вновь промывается ЗФР-Т 3-4 раза. Коньюгат к иммуноглобулинам разводится ЗФР-Т (степень разведения подбирается индивидуально, в зависимости от качества используемого коньюгата), вносится по 200 мкл в каждую лунку, инкубируется 45-60 мин при 37oС и вновь промывается ЗФР-Т. Субстрат для пероксидазы готовится непосредственно перед внесением и вносится в лунки по 150 мкл в каждую. Реакция развивается 10-30 мин в зависимости от качества коньюгата и характеризуется появлением желтой окраски различной интенсивности в лунках, содержащих калибровку и образцы. Затем реакция останавливается внесением 50 мкл 2 н. серной кислоты (Н2SO4) в каждую лунку.To determine the total concentration of complexes of class G immunoglobulin with any of the proteins of the macroglobulin family by means of an enzyme immunoassay, affinity-purified polyclonal rabbit antibodies to macroglobulin (MG, PAG or PAPP-A) are diluted with carbonate-bicarbonate buffer pH 9.6 to a concentration of 10 μg in ml and added onto a polystyrene plate 200 ál in each well. The tablet is left for 16 hours at 4 ° C. Then the tablet is washed several times with 0.1 M phosphate buffer pH 7.4 with 150 mM NaCl containing 0.05% Tween-20 (PBS-T). To exclude non-specific reactions, free polystyrene (without adherent antibodies) is coated with 1% bovine serum albumin (BSA) in 0.1 M phosphate buffer pH 7.4 with 150 mM NaCl. A BSA solution was added 200 μl to each well and incubated for 1 h at room temperature. Samples are diluted in PBS-T, buffer and sample ratios are selected for each type of sample individually due to different concentrations of immune complexes in various biological fluids. Diluted samples are placed on a plate of 200 μl in each well. A highly purified native human immunoglobulin of class G is used as a calibrator. Its dilutions are prepared in PBS-T. We recommend using a 7-point calibration with step dilution. In addition, it is necessary to leave several free holes as a background (only 200 μl of PBS-T is added to them), and also, using the serial method, several wells where the same sample is applied to each plate from the series to standardize the results. The tablet is placed in a thermostat (37 o C) for 45-60 minutes, after which it is washed again with PBS-T 3-4 times. Conjugate to immunoglobulins is diluted with PBS-T (the degree of dilution is selected individually, depending on the quality of the conjugate used), 200 μl is added to each well, incubated for 45-60 minutes at 37 ° C and again washed with PBS-T. The substrate for peroxidase is prepared immediately before application and is added to the wells of 150 μl each. The reaction develops for 10-30 minutes depending on the quality of the conjugate and is characterized by the appearance of a yellow color of varying intensity in the wells containing calibration and samples. Then the reaction is stopped by adding 50 μl of 2 N. sulfuric acid (H 2 SO 4 ) in each well.
Для определения концентрации иммунных комплексов белков семейства макроглобулинов с аутоантителами при помощи иммуноферментного анализа афинно-очищенные поликлональные кроличьи антитела к макроглобулину (МГ, PAG, или РАРР-А) разводятся карбонат-бикарбонатным буфером рН 9,6 до концентрации 10 мкг в мл и вносятся на полистироловый планшет по 200 мкл в каждую лунку. Планшет оставляют на 16 ч при 4oС. Затем планшет несколько раз промывают 0,1 М фосфатным буфером рН 7,4 с 150 мМ NaCl, содержащим 0,05% Твина-20 (ЗФР-Т). Для исключения неспецифических реакций свободный полистирол (без присоединившихся антител) покрывается 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в 0,1 М фосфатном буфере рН 7,4 с 150 мМ NaCl. Раствор БСА вносится по 200 мкл в каждую лунку и инкубируется 1 ч при комнатной температуре. Образцы разводятся в ЗФР-Т, содержащем 0,5 М маннозы и 0,1 М лактозы, для конкурентного исключения противоуглеводных антител. Соотношения буфера и образца подбираются для каждого типа образца индивидуально вследствие различной концентрации иммунных комплексов в различных биологических жидкостях. Разведенные образцы вносятся на планшет по 200 мкл в каждую лунку. В качестве калибратора используется высокоочищенный нативный человеческий иммуноглобулин класса G. Его разведения готовятся в ЗФР-Т. Мы рекомендуем использовать 7-точечную калибровку со ступенчатым разведением. Кроме того, необходимо оставить несколько свободных лунок в качестве фона (в них вносится только 200 мкл ЗФР-Т), а также, при серийном использовании метода, несколько лунок, куда вносится один и тот же образец на каждый планшет из серии для стандартизации результатов. Планшет ставится в термостат (37oС) на 45-60 мин, после чего вновь промывается ЗФР-Т 3-4 раза. Коньюгат к иммуноглобулинам разводится ЗФР-Т (степень разведения подбирается индивидуально, в зависимости от качества используемого коньюгата), вносится по 200 мкл в каждую лунку, инкубируется 45-60 мин при 37oС и вновь промывается ЗФР-Т. Субстрат для пероксидазы готовится непосредственно перед внесением и вносится в лунки по 150 мкл в каждую. Реакция развивается 10-30 мин в зависимости от качества коньюгата и характеризуется появлением желтой окраски различной интенсивности в лунках, содержащих калибровку и образцы. Затем реакция останавливается внесением 50 мкл 2 н. серной кислоты (H2SO4) в каждую лунку.To determine the concentration of immune complexes of proteins of the macroglobulin family with autoantibodies using an enzyme-linked immunosorbent assay, affinity-purified polyclonal rabbit antibodies to macroglobulin (MG, PAG, or PAPP-A) are diluted with pH 9.6 carbonate-bicarbonate buffer to a concentration of 10 μg in ml and applied to 200 μl polystyrene plate per well. The tablet is left for 16 hours at 4 ° C. Then the tablet is washed several times with 0.1 M phosphate buffer pH 7.4 with 150 mM NaCl containing 0.05% Tween-20 (PBS-T). To exclude non-specific reactions, free polystyrene (without adherent antibodies) is coated with 1% bovine serum albumin (BSA) in 0.1 M phosphate buffer pH 7.4 with 150 mM NaCl. A BSA solution was added 200 μl to each well and incubated for 1 h at room temperature. Samples are diluted in PBS-T containing 0.5 M mannose and 0.1 M lactose to competitively exclude anti-carbohydrate antibodies. The buffer and sample ratios are selected individually for each type of sample due to different concentrations of immune complexes in various biological fluids. Diluted samples are placed on a plate of 200 μl in each well. A highly purified native human immunoglobulin of class G is used as a calibrator. Its dilutions are prepared in PBS-T. We recommend using a 7-point calibration with step dilution. In addition, it is necessary to leave several free holes as a background (only 200 μl of PBS-T is added to them), and also, using the serial method, several wells where the same sample is applied to each plate from the series to standardize the results. The tablet is placed in a thermostat (37 o C) for 45-60 minutes, after which it is washed again with PBS-T 3-4 times. The conjugate for immunoglobulins is diluted with PBS-T (the degree of dilution is selected individually, depending on the quality of the conjugate used), 200 μl is added to each well, incubated for 45-60 minutes at 37 ° C and again washed with PBS-T. The substrate for peroxidase is prepared immediately before application and is added to the wells of 150 μl each. The reaction develops for 10-30 minutes depending on the quality of the conjugate and is characterized by the appearance of a yellow color of varying intensity in the wells containing calibration and samples. Then the reaction is stopped by adding 50 μl of 2 N. sulfuric acid (H 2 SO 4 ) in each well.
Замер оптической плотности, построение калибровочного графика и конечный расчет концентрации комплексов производится по стандартной технологии для иммуноферментного анализа. Концентрацию противоуглеводных антител вычисляют по разности общей концентрации иммунных комплексов и комплексов с аутоантителами. The measurement of optical density, the construction of a calibration graph and the final calculation of the concentration of complexes is carried out according to standard technology for enzyme-linked immunosorbent assay. The concentration of anti-carbohydrate antibodies is calculated by the difference in the total concentration of immune complexes and complexes with autoantibodies.
Примеры. Examples.
Пример 1: Исследована сыворотка крови здоровой небеременной женщины по предложенной методике на общее содержание МГ-IgG; PAG-IgG и PAPP-A-IgG, а также комплексов МГ-IgG; PAG-IgG с ауто- и противоуглеводными антителами. Общая концентрация комплексов МГ-IgG -0,059 мкг/мл, концентрация аутоантител - 0,043 мкг/мл, противоуглеводных антител - 0,016 мкг/мл. Общая концентрация комплексов PAG-IgG -0,039 мкг/мл, концентрация аутоантител - 0,031 мкг/мл, противоуглеводных антител - 0,008 мкг/мл. Общая концентрация комплексов PAPP-A-IgG -5,71 мкг/мл, аутоантител - 5,71 мкг/мл, противоуглеводные антитела не обнаружены. Таким образом, определены нормальные значения концентраций комплексов белков семейства макроглобулинов с иммуноглобулином класса G в сыворотке крови для здоровых женщин. Example 1: The blood serum of a healthy non-pregnant woman was studied according to the proposed method for the total content of MG-IgG; PAG-IgG and PAPP-A-IgG, as well as complexes of MG-IgG; PAG-IgG with auto- and anti-carbohydrate antibodies. The total concentration of MG-IgG complexes is 0.059 μg / ml, the concentration of autoantibodies is 0.043 μg / ml, and anti-carbohydrate antibodies are 0.016 μg / ml. The total concentration of PAG-IgG complexes is -0.039 μg / ml, the concentration of autoantibodies is 0.031 μg / ml, and anti-carbohydrate antibodies are 0.008 μg / ml. The total concentration of PAPP-A-IgG complexes is 5.71 μg / ml, autoantibodies - 5.71 μg / ml, no anti-carbohydrate antibodies were detected. Thus, normal concentrations of protein complexes of the macroglobulin family with class G immunoglobulin in blood serum were determined for healthy women.
Пример 2: Исследована сыворотка крови здорового мужчины по предложенной методике на общее содержание МГ-IgG, а также комплексов МГ-IgG с ауто- и противоуглеводными антителами. Общая концентрация комплексов МГ-IgG - 0,060 мкг/мл, концентрация аутоантител - 0,051 мкг/мл, противоуглеводных антител - 0,009 мкг/мл. Концентрация комплексов иммуноглобулина класса G с PAG и РАРР-А не изучалась вследствие крайне низкой концентрации данных белков в сыворотке крови мужчин. Таким образом, определены нормальные значения концентрации комплексов МГ с иммуноглобулином класса G в сыворотке крови для здоровых мужчин. Example 2: The blood serum of a healthy man was studied according to the proposed method for the total content of MG-IgG, as well as complexes of MG-IgG with auto- and anti-carbohydrate antibodies. The total concentration of MG-IgG complexes is 0.060 μg / ml, the concentration of autoantibodies is 0.051 μg / ml, and anti-carbohydrate antibodies are 0.009 μg / ml. The concentration of complexes of class G immunoglobulin with PAG and PAPP-A has not been studied due to the extremely low concentration of these proteins in the blood serum of men. Thus, normal values of the concentration of MG complexes with class G immunoglobulin in blood serum were determined for healthy men.
Пример 3: Исследована амниотическая жидкость женщины в III триместре физиологически протекающей беременности (образец взят во время родов) по предложенной методике на содержание общего количества МГ-IgG; PAG-IgG и PAPP-A-IgG. Содержание комплексов МГ-IgG - 0,019 мкг/мл. Комплексы PAG-IgG не обнаружены. Общая концентрация комплексов РАРР-А-IgG-0,053 мкг/мл. Example 3: Investigated the amniotic fluid of a woman in the III trimester of a physiologically ongoing pregnancy (sample taken during childbirth) according to the proposed method for the content of the total amount of MG-IgG; PAG-IgG and PAPP-A-IgG. The content of MG-IgG complexes is 0.019 μg / ml. PAG-IgG complexes were not detected. The total concentration of PAPP-A-IgG-0.053 μg / ml complexes.
Пример 4: Исследовано молоко женщины в послеродовом периоде по предложенной методике на наличие общего количества иммунных комплексов МГ-IgG; PAG-IgG РАРР-А-IgG. Полученная концентрация РАРР-А - 0,036 мкг/мл. Комплексы МГ-IgG, PAG-IgG не обнаружены. Example 4: A woman’s milk was examined in the postpartum period according to the proposed method for the presence of the total number of MG-IgG immune complexes; PAG-IgG PAPP-A-IgG. The resulting concentration of PAPP-A is 0.036 μg / ml. Complexes MG-IgG, PAG-IgG not detected.
Пример 5: Исследованы образцы сыворотки крови женщины с физиологически протекающей беременностью в I, II и в III триместре (в динамике) по предложенной методике на наличие иммунных комплексов МГ-IgG, PAPP-A-IgG и PAG-IgG. Концентрация комплексов МГ-IgG в I триместре - 0,132 мкг/мл, во II триместре - 0,156 мкг/мл, и в III триместре - 0,168 мкг/мл. Концентрация комплексов PAG-IgG в I триместре - 0,040 мкг/мл, во II триместре - 0,056 мкг/мл, и в III триместре - 0,078 мкг/мл. Концентрация комплексов PAPP-A-IgG в I триместре - 5,94 мкг/мл, во II триместре - 4,86 мкг/мл, и в III триместре - 3,68 мкг/мл. Таким образом, определены нормальные значения концентраций комплексов белков семейства макроглобулинов с иммуноглобулином класса G в сыворотке крови для здоровых женщин с физиологически протекающей беременностью в I-III триместре (в динамике). Example 5: Blood serum samples of a woman with a physiologically ongoing pregnancy in I, II and III trimester (in dynamics) were studied according to the proposed method for the presence of immune complexes MG-IgG, PAPP-A-IgG and PAG-IgG. The concentration of MG-IgG complexes in the first trimester is 0.132 μg / ml, in the second trimester - 0.156 μg / ml, and in the third trimester - 0.168 μg / ml. The concentration of PAG-IgG complexes in the first trimester is 0.040 μg / ml, in the second trimester - 0.056 μg / ml, and in the third trimester - 0.078 μg / ml. The concentration of PAPP-A-IgG complexes in the first trimester is 5.94 μg / ml, in the second trimester - 4.86 μg / ml, and in the third trimester - 3.68 μg / ml. Thus, the normal concentrations of protein complexes of the macroglobulin family with class G immunoglobulin in blood serum were determined for healthy women with a physiologically ongoing pregnancy in the I-III trimester (in dynamics).
Пример 6: Исследованы образцы сыворотки крови беременной женщины в III триместре с верифицированным диагнозом - тяжелый гестоз, по предложенной методике на наличие иммунных комплексов МГ-IgG. Концентрация комплексов MT-IgG - 0,078 мкг/мл. Таким образом, показано, что концентрация комплексов МГ-IgG при гестозе значительно ниже, чем при физиологически протекающей беременности. Example 6: We studied blood serum samples of a pregnant woman in the III trimester with a verified diagnosis of severe gestosis, according to the proposed method for the presence of MG-IgG immune complexes. The concentration of MT-IgG complexes is 0.078 μg / ml. Thus, it was shown that the concentration of MG-IgG complexes during gestosis is significantly lower than during physiologically ongoing pregnancy.
Предложенный метод позволяет изучить общую концентрацию комплексов белков семейства макроглобулинов, а именно МГ PAG или РАРР-А с иммуноглобулинами класса G, а также концентрацию комплексов вышеперечисленных белков с аутоантителами класса G и противоуглеводными антителами данного класса. Использование высокоочищенного нативного иммуноглобулина класса G в качестве калибратора позволяет значительно повысить точность и, как следствие, эффективность предложенной методики. Введение сахаров в буфер для разведения образцов позволяет определить истинную концентрацию иммунных комплексов макроглобулинов с аутоантителами. Параллельное исследование как общей концентрации иммунных комплексов МГ, PAG или РАРР-А с IgG, так и комплексов с аутоантителами позволяет провести дифференцированную оценку соотношения иммунных комплексов с аутоантителами и противоуглеводными антителами в различных образцах биологических жидкостей, что может иметь особое значение при изучении патологий углеводного обмена или аутоиммунных заболеваний. The proposed method allows us to study the total concentration of complexes of proteins of the macroglobulin family, namely, MG PAG or PAPP-A with class G immunoglobulins, as well as the concentration of complexes of the above proteins with class G autoantibodies and anti-carbohydrate antibodies of this class. The use of highly purified native class G immunoglobulin as a calibrator can significantly improve the accuracy and, as a result, the effectiveness of the proposed method. The introduction of sugars into the sample dilution buffer allows one to determine the true concentration of immune complexes of macroglobulins with autoantibodies. A parallel study of both the total concentration of immune complexes of MG, PAG or PAPP-A with IgG, and complexes with autoantibodies allows a differentiated assessment of the ratio of immune complexes with autoantibodies and anti-carbohydrate antibodies in various samples of biological fluids, which may be of particular importance in studying pathologies of carbohydrate metabolism or autoimmune diseases.
Данная методика внедрена в Центральной научно-исследовательской лаборатории Новокузнецкого ГИДУВа. Проверка тест-системы на специфичность не выявила перекрестных реакций с наиболее широко распространенными аффинантами к белкам семейства макроглобулинов. При проверке воспроизводимости результатов коэффициент вариации не превышал 10%. Обследовано 100 практически здоровых людей различного пола и возраста, 50 женщин с физиологически протекающей беременностью и 45 женщин с диагнозом гестоз различной степени тяжести. Чувствительность метода при дифференцированной диагностике гестоза легкой степени тяжести достигала 73,7%, при дифференцированной диагностике тяжелого гестоза - 61,1%. This technique has been implemented in the Central Research Laboratory of the Novokuznetsk GIDUV. Testing the test system for specificity did not reveal cross-reactions with the most widespread affinants for proteins of the macroglobulin family. When checking the reproducibility of the results, the coefficient of variation did not exceed 10%. 100 practically healthy people of different sex and age, 50 women with physiologically ongoing pregnancy and 45 women with a diagnosis of gestosis of varying severity were examined. The sensitivity of the method with differentiated diagnosis of gestosis of mild severity reached 73.7%, with the differentiated diagnosis of severe gestosis - 61.1%.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2002109525/14A RU2209435C1 (en) | 2002-04-11 | 2002-04-11 | Antigen-specific method for detecting immune protein complexes of macroglobulins group with immunoglobulin g in biological liquids |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2002109525/14A RU2209435C1 (en) | 2002-04-11 | 2002-04-11 | Antigen-specific method for detecting immune protein complexes of macroglobulins group with immunoglobulin g in biological liquids |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2209435C1 true RU2209435C1 (en) | 2003-07-27 |
| RU2002109525A RU2002109525A (en) | 2003-11-27 |
Family
ID=29211804
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2002109525/14A RU2209435C1 (en) | 2002-04-11 | 2002-04-11 | Antigen-specific method for detecting immune protein complexes of macroglobulins group with immunoglobulin g in biological liquids |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2209435C1 (en) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2137134C1 (en) * | 1997-04-15 | 1999-09-10 | Учебно-научный центр Медицинского центра при Правительстве Российской Федерации | Method of quantitative determination of autoantibodies to blood serum low density lipoproteins |
-
2002
- 2002-04-11 RU RU2002109525/14A patent/RU2209435C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2137134C1 (en) * | 1997-04-15 | 1999-09-10 | Учебно-научный центр Медицинского центра при Правительстве Российской Федерации | Method of quantitative determination of autoantibodies to blood serum low density lipoproteins |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| КОНСТАНТИНОВА Н.А. Иммунные комплексы и повреждения тканей. - М.: Медицина, 1996, с. 233-234. AMIN M et al. "Correlation between tissue transglutameminase antibodies... . Clin. Chem. Act. 1999, v. 282, p. 219-225. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20240103018A1 (en) | Galectin-3 immunoassay | |
| Njemini et al. | Comparison of two ELISAs for the determination of Hsp70 in serum | |
| JP6639392B2 (en) | Method for selective measurement of placental growth factor 2 | |
| US5484707A (en) | Assay for free secretory component and methods for monitoring organ rejection | |
| NO159820B (en) | PROCEDURE FOR DETERMINING ANTI-ANTIBODY REACTIONS. | |
| JP4523587B2 (en) | Method for distinguishing between type A and type B acute aortic dissection and acute myocardial infarction and kit for differentiation | |
| Imafuku et al. | Reactivity of agalactosyl IgG with rheumatoid factor | |
| US20100081149A1 (en) | Novel oxidized ldl complex and method for detection thereof | |
| RU2209435C1 (en) | Antigen-specific method for detecting immune protein complexes of macroglobulins group with immunoglobulin g in biological liquids | |
| Sandoval et al. | Detection of antibodies against avian antigens in bronchoalveolar lavage from patients with pigeon breeder's disease: Usefulness of enzyme‐linked immunosorbent assay and enzyme immunotransfer blotting | |
| Tsugawa et al. | An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for guanosine 3′, 5′-cyclic monophosphate (cGMP) in human plasma and urine using monoclonal antibody | |
| JP2000193662A (en) | Urine cystatin C measuring reagent, diagnostic method and kit | |
| TW202415952A (en) | Device, biomarker group for predicting, assessing or diagnosing preeclampsia risk and use thereof in preparing device for assessing preeclampsia risk | |
| EP1596198A1 (en) | Method of measuring oxidized ldl-crp complex and measrurement kit | |
| RU2659211C2 (en) | Method for measuring the concentration of circulating modified low-density lipoproteins in human blood serum | |
| EP4621411A1 (en) | Method for detecting sialylated ige | |
| RU2180117C1 (en) | Method of estimation of sensitization to chemical compounds | |
| RU2780565C2 (en) | Method for determination of members of family of s100 calcium-binding proteins by means of immunoturbidimetry | |
| JP4753366B2 (en) | % CDT quantification method | |
| RU2623879C2 (en) | Method for circulating desialylated low density lipoproteids content estimation | |
| US20110014638A1 (en) | Soluble fas in acute coronary syndromes diagnosis | |
| Khaddach et al. | Quantitation of venom Antigens from Moroccan vipers in serum by using an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) toward improving health vigilance systems | |
| US8911956B2 (en) | Methods of use for an immunoassay detecting fragment Ba | |
| RU2478960C2 (en) | Method for prediction of onset of gestosis in pregnant women | |
| Nam | Estimation of fibrinogen-fibrin related antigen by continuous flow analysis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20040412 |