RU2209040C1

RU2209040C1 - Multi-purpose method for obtaining material for gene-diagnostic investigation of vaginal microflora in large female groups

Info

Publication number: RU2209040C1
Application number: RU2002120061A
Authority: RU
Inventors: Н.А. Федоров; А.А. Ёлов; М.П. Гришаев; О.Н. Гришаева; С.В. Липатникова
Original assignee: Федоров Николай Алексеевич; Ёлов Андрей Александрович; Гришаев Михаил Петрович; Гришаева Ольга Николаевна; Липатникова Стелла Владимировна
Priority date: 2002-07-29
Filing date: 2002-07-29
Publication date: 2003-07-27

Abstract

FIELD: medicine, gynecology, obstetrics, epidemiology. SUBSTANCE: the suggested method deals with diagnostics urogenital infections to be applied for prophylactic, control and curative investigations in parturient women and other female groups. The method deals with sampling biological vaginal material to conduct gene-amplification assay of cellular DNA, moreover, such sampling is performed from hygienic tampon after vaginal contact for not less than 6 h and placed after that into hermetically sealed polymeric container with liquid conservant eliminating bacterial growth. At carrying out geneamplification assay tampon should be 4-5 times squeezed out in container for complete cellular removal. The present expenses-free technique helps to conduct screening of vaginal microflora in large female groups. EFFECT: higher efficiency. 1 cl, 2 dwg, 3 ex, 2 tbl

Description

Изобретение относится к области медицины, в частности к гинекологии, акушерству, диагностике и эпидемиологии урогенитальных инфекций, и может применяться для профилактических, контрольных и лечебных обследованиях рожениц и других групп женщин. The invention relates to medicine, in particular to gynecology, obstetrics, diagnosis and epidemiology of urogenital infections, and can be used for prophylactic, control and therapeutic examinations of women in labor and other groups of women.

С бактериальной микрофлорой влагалища женщин могут быть связаны не только воспалительные процессы урогенитальных и репродуктивных органов, но и так называемые внутриутробные и постнатальные инфекции новорожденных. Широкий ИФА- и NAT-скрининг в отношении вирусов, передающихся через кровь, уже является состоявшейся практикой во всем мире. Однако NAT-скринирование бактериальной микрофлоры и герпес-вирусов влагалищ женщин затруднен из-за отсутствия простых, стандартных и беззатратных способов получения материала для исследования. Not only inflammatory processes of urogenital and reproductive organs, but also so-called intrauterine and postnatal infections of newborns can be associated with the bacterial microflora of women’s vagina. Extensive ELISA and NAT screening for bloodborne viruses is already a common practice worldwide. However, NAT-screening of bacterial microflora and herpes viruses of women’s vaginas is difficult due to the lack of simple, standard and cost-free methods for obtaining material for research.

Известные методы забора материала, потенциально содержащего влагалищную микрофлору, состоят во взятии соскобов и мазков со слизистой (например, при помощи шпателей, специальных щеток и скарификаторов) в амбулаторных или больничных условиях (В. М. Лифшиц, В.И. Сидельникова. Медицинские лабораторные анализы. Справочник. М.: Триада-Х, 2000, с. 61-65). При этом эффективность генамплификационного обнаружения бактерий зависит от качества проведения процедуры взятия материала медперсоналом, что в свою очередь зависит также от состояния пациентки в момент обследования. В любом случае вероятным является недостаточный объем материала в соскобе или мазке, что может привести к ложно-отрицательным результатам при небольших степенях инфицирования; попытки же увеличить этот объем связаны с неоправданным усилением воздействия (в том числе и болевого) на обследуемых. Наконец, возможность скрининга влагалищной микрофлоры в больших группах женщин ограничена необходимостью личного прихода обследуемых в медицинские учреждения. Known methods for collecting material potentially containing vaginal microflora are taking scrapings and smears from the mucous membrane (for example, using spatulas, special brushes and scarifiers) on an outpatient or hospital basis (V. M. Lifshits, V. I. Sidelnikova. Medical laboratory analyzes.Handbook.M .: Triad-X, 2000, pp. 61-65). At the same time, the efficiency of gene-amplification detection of bacteria depends on the quality of the procedure for taking the material by the medical staff, which in turn also depends on the patient's condition at the time of the examination. In any case, an insufficient amount of material in the scraping or smear is likely, which can lead to false negative results with small degrees of infection; attempts to increase this volume are associated with an unjustified increase in the impact (including pain) on the subjects. Finally, the possibility of screening vaginal microflora in large groups of women is limited by the need for personal visits of patients to medical institutions.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ получения материала для генамплификационного исследования влагалищной микрофлоры путем взятия биологического материала в виде соскоба со слизистой влагалища (Madico G. et al. Diagnosis of Trichomonas vaginalis infection by PCR using vaginal swab samples. - Journal of Clinical Microboilogy 1998, v. 36, No. 11, p. 3205-3210). Метод также не позволяет иметь биологический материал для исследования в достаточном объеме и сложен по исполнению для профилактических обследований больших групп женщин. Closest to the proposed invention is a method of producing material for gene-amplification studies of vaginal microflora by taking biological material in the form of scraping from the vaginal mucosa (Madico G. et al. Diagnosis of Trichomonas vaginalis infection by PCR using vaginal swab samples. Journal of Clinical Microboilogy 1998, v. 36, No. 11, p. 3205-3210). The method also does not allow to have sufficient biological material for research and is difficult to implement for preventive examinations of large groups of women.

Целью изобретения является создание простой беззатратной методики взятия биологического материала для генамплификационного исследования влагалищной микрофлоры в достаточном объеме без усиления воздействия на обследуемого, а также возможности проведения скрининга влагалищной микрофлоры в больших группах женщин. The aim of the invention is to create a simple, cost-free method of taking biological material for gene-amplification studies of vaginal microflora in sufficient quantities without increasing the impact on the subject, as well as the possibility of screening vaginal microflora in large groups of women.

Поставленная цель достигается тем, что получение материала для генамплификационного исследования влагалищной микрофлоры проводят путем взятия биологического материала влагалища и проведение генамплификационного анализа клеточной ДНК, при этом взятие биологического материала осуществляют с гигиенического тампона, находящегося в контакте с влагалищем не менее 6 часов и помещенного после этого в герметический полимерный контейнер с жидким консервантом, содержащим 0,9% хлорид натрия и 0,05% азид натрия в воде. Причем при проведении генамплификационного анализа тампон отжимают в контейнере 4-5 раз. This goal is achieved in that the material for the gene-amplification study of the vaginal microflora is carried out by taking the biological material of the vagina and conducting the gene-amplification analysis of cellular DNA, while the biological material is taken from a hygienic tampon that has been in contact with the vagina for at least 6 hours and then placed in hermetic polymer container with a liquid preservative containing 0.9% sodium chloride and 0.05% sodium azide in water. Moreover, when conducting a gene-amplification analysis, the swab is squeezed in a container 4-5 times.

Способ осуществляется следующим образом. The method is as follows.

В полимерные одноразовые контейнеры объемом 20 мл с герметическими завинчивающимися крышками вносят по 10 мл стабилизирующего раствора, имеющего состав: 0,9% хлорида натрия и 0,05% азида натрия в воде. Такие контейнеры с указанным раствором рассылают для сбора проб. Использованный тампон, находящийся в контакте с влагалищем не менее 6 часов, помещают в такой контейнер и плотно завинчивают крышку. После этого флакон маркируют и отправляют на анализ. Пробы перевозят и хранят (накапливают) при обычных температурах без заморозки. Бактериальные клетки пригодны для генодиагностики даже после нескольких недель хранения в таких условиях. При проведении анализа в генодиагностической лаборатории тампон во флаконе 4-5 раз отжимают для полноты смыва клеток. При этом окраска пробы (от крови или выделений) с тампона смывается не полностью, что указывает на частичную сорбцию на нем возможных ингибиторов ПЦР. Далее отбирают 1-1,4 мл жидкой фазы в пробирку типа Эппендорф и центрифугируют 5 мин при 12000 g на настольной микроцентрифуге. Полученный осадок клеток, как правило, достаточно чист от слизи и других компонентов пробы, так что препарат ДНК для ПЦР может быть получен из него простым методом термического лизиса с сорбентом. In polymeric disposable containers with a volume of 20 ml with hermetic screw caps, 10 ml of a stabilizing solution having the composition: 0.9% sodium chloride and 0.05% sodium azide in water are added. Such containers with the indicated solution are dispatched to collect samples. The used tampon, which is in contact with the vagina for at least 6 hours, is placed in such a container and the cap is tightly screwed. After this, the bottle is marked and sent for analysis. Samples are transported and stored (accumulated) at ordinary temperatures without freezing. Bacterial cells are suitable for gene diagnostics even after several weeks of storage under such conditions. When conducting an analysis in the gene diagnostic laboratory, the swab in the vial is squeezed 4-5 times to completely flush the cells. In this case, the color of the sample (from blood or secretions) from the tampon is not completely washed off, which indicates a partial sorption of possible PCR inhibitors on it. Next, 1-1.4 ml of the liquid phase is taken into an Eppendorf type tube and centrifuged for 5 min at 12000 g in a tabletop microcentrifuge. The resulting cell pellet, as a rule, is sufficiently clean of mucus and other components of the sample, so that the DNA preparation for PCR can be obtained from it by a simple method of thermal lysis with a sorbent.

Применение таких влагалищных тампонов женщинами в настоящее время широко распространено и рекомендуется, оно полностью безопасно и не связано с болевыми ощущениями. В то же время тампон, находящийся в плотном контакте с обследуемой слизистой в течение длительного времени (несколько часов), собирает в себя выделения вместе с материалом для генодиагностического обследования (микрофлорой и отслоившимся эпителием) в количествах, существенно больших и стабильных, чем при обычных взятиях мазков и соскобов. А содержание затем тампона с собранным материалом в герметически закрытом пластиковом контейнере с жидким консервантом - 0,9% хлоридом натрия и 0,05% азидом натрия в физиологическом растворе прекращает рост бактерий, но хорошо сохраняет их в неразрушенном виде в течение длительного времени. Помещение использованного тампона в заранее приготовленный контейнер составляет всю операцию по взятию материала для генодиагностического обследования, которую можно проводить в любых условиях вне медицинского учреждения, в том числе и самой обследуемой женщиной. The use of such vaginal tampons by women is currently widespread and recommended, it is completely safe and not associated with pain. At the same time, the tampon, which is in close contact with the examined mucosa for a long time (several hours), collects the excretion together with the material for the genodiagnostic examination (microflora and exfoliated epithelium) in quantities significantly larger and more stable than with ordinary samples smears and scrapings. And then the content of the swab with the collected material in a hermetically sealed plastic container with a liquid preservative - 0.9% sodium chloride and 0.05% sodium azide in physiological saline stops the growth of bacteria, but keeps them intact for a long time. The placement of the used swab in a pre-prepared container constitutes the entire operation for taking material for a genodiagnostic examination, which can be carried out in any conditions outside the medical institution, including the woman being examined.

Пример 1. Сохранность бактериальных клеток в стабилизирующем растворе в условиях транспортировки и хранения проб. Example 1. The safety of bacterial cells in a stabilizing solution under conditions of transportation and storage of samples.

Для оценки такой сохранности были взяты клетки бледной трепонемы, которые быстро погибают и не культивируются in vitro. Эти клетки были добавлены в указанный раствор в концентрации 100 клеток в 1 мл. Полученная суспензия была проанализирована методом РНК-ПЦР на рибосомальную 16S РНК (по методике, описанной в патенте РФ 2164532), которая намного менее стабильна, чем ДНК до и после двух месяцев хранения при комнатной температуре. Приведенная на фиг. 1 электрофореграмма результата этого анализа показывает сохранность в этих условиях даже рибосомальной РНК. Другой наш эксперимент (Федоров Е.Н., Петухова И. И. , Суханов Ю.С., Елов А.А., Федоров Н.А. ПЦР-детекция ДНК и РНК Тгероnеmа pallidum в крови серопозитивных доноров. - Вестник службы крови России 2001, 3, с. 42-46) показал, что и в более агрессивной среде - цельной крови - рибосомальная РНК в составе бледной трепонемы стабильна 6 недель при 4^oС.To assess this preservation, pale treponema cells were taken, which quickly die and are not cultured in vitro. These cells were added to the indicated solution at a concentration of 100 cells in 1 ml. The resulting suspension was analyzed by RNA-PCR for ribosomal 16S RNA (according to the method described in RF patent 2164532), which is much less stable than DNA before and after two months of storage at room temperature. Referring to FIG. 1 electrophoregram of the result of this analysis shows the safety under these conditions, even ribosomal RNA. Our other experiment (Fedorov E.N., Petukhova I.I., Sukhanov Yu.S., Elov A.A., Fedorov N.A. PCR detection of DNA and RNA of Tgernem pallidum in the blood of seropositive donors. - Bulletin of the blood service Russia 2001, 3, pp. 42-46) showed that in a more aggressive environment - whole blood - the ribosomal RNA in the composition of pale treponema is stable for 6 weeks at 4 ^o C.

Пример 2. Анализ проб двух пациенток, полученных с использованием тампонов, на хламидии, микоплазму, уреаплазму и трихомонаду. Example 2. Analysis of samples of two patients obtained using tampons on chlamydia, mycoplasma, ureaplasma and trichomonas.

Пробы на тампонах обработаны по приведенной выше методике. Клеточный осадок был обработан термолизисом 15 мин при 95^oС в суспензии фосфоцеллюлозы (аналог обработки Insta Gene фирмы Bio-Rad), экстракт ДНК введен в ПЦР. Для определения возбудителей использованы амплификационные реагенты, изготовленные d cоответствии с патентом РФ 2164532. Из электрофореграммы на фиг.2 видно, что у обеих пациенток обнаружена уреаплазма, а у пациентки 2 - также и хламидия; микоплазма и трихомонада у них отсутствует. Ингибирования ПЦР, несмотря на самый простой метод обработки проб, не наблюдается. В целом при использовании тампонов, как показывает опыт, ингибирование ПЦР, требующее повтора с дополнительной промывкой осадка или использования более сложного выделения ДНК из клеток методом сорбции на силикагеле, наблюдается не чаще, чем при обычной работе с мазками и соскобами. Даже при такой простой обработке в полученном экстракте ПЦР на обычные урогенитальные возбудители проходит достаточно эффективно.Samples on tampons are processed according to the above procedure. The cell pellet was thermolysed for 15 min at 95 ^o C in a suspension of phosphocellulose (analogue of the Insta Gene treatment from Bio-Rad), the DNA extract was introduced into PCR. To determine the causative agents, amplification reagents made in accordance with RF patent 2164532 were used. It can be seen from the electrophoregram in figure 2 that ureaplasma was found in both patients, and chlamydia was also found in patient 2; mycoplasma and trichomonas are absent. Inhibition of PCR, despite the simplest method of processing samples, is not observed. In general, when using tampons, as shown by experience, inhibition of PCR, requiring repetition with additional washing of the precipitate or using a more complex extraction of DNA from cells by sorption on silica gel, is observed no more often than during normal work with smears and scrapings. Even with such a simple treatment in the obtained extract, PCR for ordinary urogenital pathogens is quite effective.

Пример 3. Параллельный анализ проб одних и тех же пациентов, взятых с помощью тампонов и обычных соскобов. Example 3. Parallel analysis of samples of the same patients taken with tampons and conventional scrapings.

По договоренности с рядом медицинских учреждений врачи-гинекологи наряду с соскобами брали у пациенток на анализ также и влагалищные тампоны (обычно "мини" фирм "Always", "Kou", "Ob"), находившиеся во влагалище 6-10 часов и подготовленные по приведенной выше инструкции. Тампоны и соскобы обрабатывались как в примере 2 и выше, на экстрактах ДНК проведена ПЦР на заказанные врачами инфекции. Результаты обследования 195 человек приведены в таблице 1. By agreement with a number of medical institutions, gynecologists, along with scrapings, also took vaginal tampons (usually “mini” firms “Always”, “Kou”, “Ob”) from the patients, which were in the vagina for 6-10 hours and prepared according to the above instructions. Tampons and scrapings were processed as in example 2 and above, and PCR was performed on DNA extracts for infections ordered by doctors. The survey results of 195 people are shown in table 1.

В работе был использован полуколичественный метод оценки результатов ПЦР-анализа по внутреннему стандарту. Для упрощения трактовки результатов во врачебной практике они были переведены в следующую систему оценки:
(+) - 50-500 копий геномов возбудителя на пробу.In the work, a semi-quantitative method was used to evaluate the results of PCR analysis according to an internal standard. To simplify the interpretation of the results in medical practice, they were transferred to the following evaluation system:
(+) - 50-500 copies of the pathogen genomes per sample.

(++) - 500-5000 копий геномов возбудителя на пробу. (++) - 500-5000 copies of the pathogen genomes per sample.

(+++) - 5000-50000 копий геномов возбудителя на пробу. (+++) - 5000-50000 copies of the pathogen genomes per sample.

(++++) - более 50000 копий геномов возбудителя на пробу. (++++) - more than 50,000 copies of the pathogen genomes per sample.

Сравнение положительных результатов по такому критерию для разных методов забора биоматериала приведено в таблице 2. Comparison of positive results by this criterion for different methods of biomaterial sampling are given in table 2.

Приведенные в примере 3 сопоставление анализов проб одних и тех же пациенток, полученных с помощью обычных соскобов и с использованием тампонов по приведенной выше методике, показал, что при использовании тампонов выявляемость инфекций повышается примерно в два раза и сигналы ПЦР становятся более интенсивными. Это подтверждает эффективность предложенного метода сбора проб влагалищной микрофлоры. The comparison of the analyzes of samples of the same patients, obtained using conventional scrapings and using tampons according to the above method, shown in Example 3, showed that with the use of tampons, the detection of infections increases approximately two times and PCR signals become more intense. This confirms the effectiveness of the proposed method for collecting samples of vaginal microflora.

Claims

1. A method of obtaining material for a gene-amplification study of vaginal microflora, including taking biological material of the vagina and conducting a gene-amplification analysis of cellular DNA, characterized in that the biological material is taken from a hygienic tampon in contact with the vagina for at least 6 hours and then placed in a hermetic a polymer container with a liquid preservative that stops the growth of bacteria, and during a gene-amplification analysis, the swab is squeezed in a container 4-5 times for complete flushing of cells.

2. The method according to claim 1, characterized in that as a liquid preservative in the container is placed a solution containing 0.9% sodium chloride and 0.05% sodium azide in water.