RU2203951C1 - Способ выявления fusobacterium necrophorum в гнездовой полимеразной цепной реакции - Google Patents
Способ выявления fusobacterium necrophorum в гнездовой полимеразной цепной реакции Download PDFInfo
- Publication number
- RU2203951C1 RU2203951C1 RU2001133577/13A RU2001133577A RU2203951C1 RU 2203951 C1 RU2203951 C1 RU 2203951C1 RU 2001133577/13 A RU2001133577/13 A RU 2001133577/13A RU 2001133577 A RU2001133577 A RU 2001133577A RU 2203951 C1 RU2203951 C1 RU 2203951C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- synthesis
- pcr
- dna
- fusobacterium necrophorum
- fragment
- Prior art date
Links
- 241000605952 Fusobacterium necrophorum Species 0.000 title claims abstract description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims abstract description 23
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 16
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 12
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 claims abstract description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims abstract description 5
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 5
- SNBCLPGEMZEWLU-QXFUBDJGSA-N 2-chloro-n-[[(2r,3s,5r)-3-hydroxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl]acetamide Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CNC(=O)CCl)[C@@H](O)C1 SNBCLPGEMZEWLU-QXFUBDJGSA-N 0.000 claims description 3
- CNNSWSHYGANWBM-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-2,3-dimethylquinoxaline Chemical compound C1=C(Cl)C=C2N=C(C)C(C)=NC2=C1 CNNSWSHYGANWBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 3
- 241000287531 Psittacidae Species 0.000 claims 1
- 241000605975 Fusobacterium varium Species 0.000 abstract description 9
- 244000005706 microflora Species 0.000 abstract description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 4
- 230000003902 lesion Effects 0.000 abstract description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 2
- 241000282849 Ruminantia Species 0.000 abstract 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 3
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 3
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 3
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 101710136739 Teichoic acid poly(glycerol phosphate) polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102220515656 Zinc finger protein Helios_T23D_mutation Human genes 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005097 23S Ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 1
- 108091023242 Internal transcribed spacer Proteins 0.000 description 1
- 241001430197 Mollicutes Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 description 1
- 241000208474 Protea Species 0.000 description 1
- 241000588769 Proteus <enterobacteria> Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 241000295644 Staphylococcaceae Species 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 108700022455 aminokrovin Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000003771 laboratory diagnosis Methods 0.000 description 1
- 229940057995 liquid paraffin Drugs 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к генетической инженерии животных, и может быть использовано в ветеринарной микробиологии для выявления возбудителя некробактериоза жвачных животных Fusobacterium necrophorum и дифференциации его от атипичных форм Fusobacterium pseudonecrophorum и другой микрофлоры. Способ включает синтез наружных 1 5'- AGT ATC TGA TTT ТСТ ACG СС-3', 2 5' - CAG ААТ СТА АТА TTG ТАС АС-3' и внутренних 01 5' - CAT GTA GAT GTC ATT GCG-3', 02 5' - ATT TCA AGA GTC CTT CCG-3' олигонуклеотидных праймеров, синтез комплиментарной ДНК на матрице хромосомной ДНК, затем синтез наружного и затем внутреннего фрагментов. Амплификацию синтезированной ДНК осуществляют методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) и анализируют размер продуктов полимеразной цепной реакции. Предложенный способ обладает высокими специфичностью и чувствительностью и позволяет дифференцировать Fusobacterium necrophorum, выделенную из очагов поражения, от атипичных форм и сопутствующей микрофлоры. 1 табл.
Description
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к генетической инженерии животных, и может быть использовано в ветеринарной микробиологии и биопромышленности для выявления заболевания сельскохозяйственных животных. До настоящего времени основным способом диагностики некробактериоза крупного и мелкого рогатого скота является бактериологическое исследование (микроскопия мазка, посев на питательные среды, биопроба на лабораторных животных) [Методические указания по лабораторной диагностике некробактериоза. - М., 1987].
Этот метод диагностики имеет свои минусы. Так, из очагов поражения, наряду с Fusobacterium necrophorum, обладающих вирулентностью, выделяют атипичные формы Fusobacterium pseudonecrophorum, которые никогда не вызывают заболевание, а по морфологическим и биохимическим признакам очень схожи, а также сопутствующую микрофлору, такую как стафилококки, стрептококки, микрококки, картофельная, кишечная палочки и другие микроорганизмы, поэтому выделить чистую культуру достаточно сложно. Лабораторные животные (кролики, белые мыши), наряду с возбудителем некробактериоза, также чувствительны и к сопутствующей микрофлоре. В целом на установление диагноза затрачивается 12-16 суток, а в случае значительного обсеменения биологических образцов вульгарной микрофлорой срок диагностики увеличивается на 6-10 дней и при этом снижается достоверность диагноза. Наиболее близким решением, принятым за прототип, является способ выявления Fusobacterium necrophorum, основанный на полимеразной цепной реакции (ПЦР), включающий выделение хромосомной ДНК из инфицированных тканей, амплифицирование с помощью Taq-полимеразы ДНК в присутствии двух специфичных для F. necrophorum праймеров, обнаружение амплифицированного фрагмента ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле (Electrophoretic mobility anomalies associated with PCR amplification of the intergenic spacer region between 16S and 23S ribosomal RNA genes of Fusobacterium necrophorum. SK.Narayanan, TG.Nagaraja, MM.Chengappa, GC.Stewart//J.Microbiol.Methods.-2001 (aug).-v.46.-.N2.-p.l65-169; Unexpected Cross-Reaction with Fusobacterium necrophorum in a PCR for Detection of Mycoplasmas: J.S.Jenson, B. Bruun, B. Gahrn-Hansen//J.Clin.Micob.-1999 (Маrt).-V.37.- 3.-Р.828-829).
К недостаткам данного способа можно отнести то, что он не позволяет обнаруживать значительную часть вирулентных штаммов возбудителя Fusobacterium necrophorum, циркулирующих среди животных, так как используется только одна пара праймеров. Технической задачей нашего изобретения является повышение специфичности, чувствительности и возможности дифференцировать от F. pseudonecrophorum и другой грамотрицательной микрофлоры, присутствующей в очагах поражения. Сущность изобретения заключается в том, что на первом этапе выбираются и синтезируются олигонуклеотидные праймеры, комплементарные области наибольшего сходства геномов различных штаммов F. necrophorum, обладающих вирулентностью и имеющих отличия от нуклеотидных последовательностей ДНК других сопутствующих микроорганизмов. Затем проводится амплификация хромосомной ДНК методом полимеразной цепной реакции с использованием вышеупомянутых праймеров. Для повышения чувствительности синтезируются внутренние (вложенные, гнездовые) праймеры и с ними и продуктом первой амплификации проводится вторая полимеразная цепная реакция.
Способ осуществляется следующим образом.
Выбираются и синтезируются две олигонуклеотидные пары праймеров, например: наружные 1 5'- AGT ATC TGA ТТГ ТСТ ACG СС-3' и 2- 5' CAG ААТ СТА АТA TTG ТАС АС-3' и внутренние 01 5'- CAT GTA GAT GTC ATT GCG-3' и 02 5'- АТТ ТСА AGA GTC CTT CCG-3.
Праймеры выбираются в области хромосомной ДНК, характерной для вирулентных штаммов F. necrophorum и отсутствующей в F. pseudonecrophorum и сопутствующей микрофлоре, такой как стафилококки, стрептококки, микрококки, картофельная, кишечная палочки. Праймер 1 используют для синтеза первой цепи комплементарной хромосомной ДНК F. necrophorum, праймер 2 - для синтеза второй цепи кДНК с помощью фермента Tag-полимеразы. Затем оба праймера используют для амплификации выбранного участка хромосомной ДНК в полимеразной цепной реакции. Далее для повышения чувствительности проводят реамплификацию, где праймер 01 используют для синтеза первой цепи комплементарной ДНК фрагмента синтезированного с помощью праймеров 1 и 2, а праймер 02 - для синтеза второй цепи внутреннего фрагмента с помощью фермента Tag-полимеразы. Затем оба праймера используют для амплификации внутреннего фрагмента.
Существенным отличием заявляемого способа от известного прототипа является то, что в качестве праймеров используются нуклеотидные последовательности, одинаковые для большинства вирулентных штаммов F. necrophorum и отличающиеся от последовательностей F. pseudonecrophorum, кишечной, сенной палочек, стафило-, стрептококков, протея и другой сопутствующей микрофлоры. Таким образом, заявляемый способ соответствует критерию "новизна". Новые признаки технического решения по совокупности признаков обеспечивают достижение цели изобретения: выявляется большее число штаммов F. necrophorum и осуществляется их дифференциация. Следовательно, можно считать заявляемое техническое решение соответствующим критерию "изобретательный уровень".
Технической задачей изобретения является повышение специфичности и возможность дифференцировать F. necrophorom от F. pseudonecrophorum и других микроорганизмов без снижения чувствительности способа выявления.
Поставленная цель достигается выбором и синтезом двух паролигонуклеотидных праймеров: наружных 1 5'- AGT ATC TGA TTTTCT ACG СС-3' и 2 5'- CAG AAT СТА АТА TTG ТАС АС-3', синтезирующих фрагмент в 546 нп. и внутренних 01 5'- САТ GTA GAT GTC ATT GCG-3' и 02 5'- ATT TCA AGA GTC CTT CCG-3', синтезирующих фрагмент внутри первого в 187 нп. Праймеры были выбраны в общей области для геномов вирулентных штаммов F. necrophorum, но отличающейся с нуклеотидными последовательностями хромосомной ДНК F. pseudonecrophorum и сопутствующей микрофлоры. Первую пару праймеров использовали для синтеза и амплификации большего участка генома бактерии в полимеразной цепной реакции, проведя 29 циклов при следующем режиме: денатурация при 95oС в течение 0,8 мин, гибридизация при 56oС в течение 0,8 мин и синтез при 73oС в течение 1 мин и один цикл (досинтез) при 73oС в течение 4 мин. Вторую пару для синтеза меньшего фрагмента, структурно входящего в больший, и его амплификацию в полимеразной цепной реакции в режиме: денатурация при 95oС в течение 0,8 мин, гибридизацию - при 48oС в течение 0,8 мин, синтеза - при 73oС в течение 1 мин, всего 29 циклов плюс 1 цикл досинтеза при 73oС в течение 4 мин. О положительном результате анализа судили по размеру синтезированного фрагмента кДНК, мигрирующего в 0,8% геле агарозы.
Существенным отличием заявляемого способа от известного прототипа является то, что в качестве праймеров используются нуклеотидные последовательности, одинаковые для большинства вирулентных штаммов F. necrophorum и имеющих наибольшие отличия от последовательностей ДНК F. pseudonecrophorum и других микроорганизмов.
Сущность технического решения раскрыта в примерах конкретного осуществления способа.
Пример. Операция 1. Выделение возбудителя из патологического материала. Образец патологического материала 500-600 мкг растирают в ступке со стеклянным порошком (100-200 мкг) и добавляют 1000 мкл 0,9% NaCl, перемешивают и центрифугируют 8000 об/мин 8 мин на центрифуге T23D в угловом роторе. Надосадочную жидкость отбрасывают, а осадок ресуспендируют в 500 мкл ТЕ-буфера и переносят в другую пробирку объемом на 2 мл.
Операция 2. Выделение возбудителя из патологического материала. Делают суспензию 1: 10 образца патологического материала с МПБ или 0,9% NaCl, осуществляют посев в МПБ с добавлением 10% аминокровина, культивируют в термостате при 37oС в течение 1 суток. 10 мл суточной культуры центрифугируют на центрифуге T23D в угловом роторе при 8000 об/мин в течение 8 минут. Надосадочную жидкость отбрасывают, а осадок ресуспендируют в 500 мкл ТЕ-буфера и переносят в другую пробирку объемом на 2 мл.
Операция 3. В пробирку после операции 1 или 2 добавляют 150 мкл лизоцима (20 мг/мл), перемешивают и помещают на лед на 25 мин. Затем добавляют 65 мкл 10% SDS и 100 мкл проназы (20 мг/мл), перемешивают и выдерживают при +55oС 15-18 часов. Далее прибавляют равный объем смеси фенол/хлороформ/изоамиловый спирт (25: 25:0,5), плавно пипетируют и центрифугируют 10 минут при 14 тыс. об/мин. Водную фазу переносят в другую пробирку и приливают к ней 1/2 объема смеси хлороформ: изоамиловый спирт (25:0,5), центрифугируют и водную фазу переносят в другую пробирку. К водной фазе прибавляют 1/10 объема 3 М ацетата натрия рН 4,8 и 2 объема этанола и помещают на 23 часа на 20oС. Центрифугируют 15 мин при 14 тыс. об/мин на центрифуге MPW 310, осадок промывают 70% этанолом, высушивают при наклонном положении пробирки при +56oС в течение 30-35 мин, растворяют в 20-30 мкл стерильной бидистиллированной воды или ТЕ-буфере рН 8,0.
Операция 4. Полимеразная цепная реакция. 1 мкл раствора, содержащего хромосомную ДНК F. necrophorum, добавляют к 24 мкл раствора, содержащего 67 мМ трис-HCl, рН 8,8; 15 мМ (NH)SO, 3 мМ MgCL, 0,01% TWeen-20; 0,2 мМ каждого из четырех дезокситрифосфатов, 2 единицы Taq-полимеразы и по 200 нг праймеров 1 и 2. Поверх реакционной смеси наслаивают 30 мкл вазелинового масла. ПЦР состоит из 29 циклов: 95oС в течение 0,8 мин, 56oС в течение 0,8 мин, 73oС в течение 1 мин и завершающего синтеза при 73oС в течение 4 мин.
Операция 5. Определение размера продуктов ПЦР. 12,5 мкл раствора продуктов полимеразной цепной реакции смешивают с 3 мкл раствора, содержащего 50%-ный глицерин и бромфеноловый синий, и наносят в "карман" 0,8%-ного агарозного геля. Маркер молекулярной массы состоит из продуктов расщепления ДНК плазмиды pUC18 рестрикционной эндонуклеазой Alul. Анализ считают положительным, если продукт ПЦР соответствует ожидаемому размеру фрагмента в 546 нуклеотидных пар. В случае отсутствия расчетного фрагмента проводится операция 6.
Операция 6. При отсутствии расчетного фрагмента в 546 нп. забираем 1-2 мкл реакционной смеси и проводим реамплификацию со второй парой праймеров 01- 02. Состав реакционной смеси и режим амплификации описан в пункте 3, необходимо только снизить температуру гибридизации праймера с матрицей с 56 до 48oС. Анализ считают положительным, если продукт ПЦР соответствует ожидаемому размеру фрагмента в 187 нуклеотидные пары.
Результаты проведенных экспериментов показывают, что положительные анализы продуктов ПЦР получают только тогда, когда в качестве матрицы используют ДНК возбудителя некробактериоза. Анализы были отрицательными, когда использовали ДНК F. pseudonecrophorum и других бактерий (стафилококк, стрептококк, кишечная, сенная палочки, протей). Чувствительность предлагаемого способа выявления хромосомной ДНК F. necrophorum достаточно высока и составляет 1 пг (см. таблицу).
Claims (1)
- Способ выявления Fusobacterium necrophorum в гнездовой полимеразной цепной реакции (ПЦР), включающий синтез олигонуклеотидных праймеров, синтез комплементарной ДНК на матрице хромосомной ДНК и амплификацию синтезированной комплементарной ДНК методом ПЦР с использованием олигонуклеотидных праймеров с последующим анализом размера продуктов ПЦР, отличающийся тем, что синтезируют две пары олигонуклеотидных праймеров - наружные 1 и 2 для синтеза фрагмента ДНК в 546 нуклеотидные пары и внутренние (гнездовые) 01 и 02 для синтеза фрагмента в 187 нуклеотидные пары, имеющие следующие нуклеотидные последовательности:
1 5'-AGT АТС TGA TTT ТСТ ACG СС-3';
2 5' -CAG ААТ СТА АТА TTG ТАС АС-3';
01 5'-CAT GTA GAT GTC ATT GCG-3';
02 5'-ATT TCA AGA GTC CTT CCG-3';
и выявляют Fusobacterium necrophorum, если продукт ПЦР соответствует размеру фрагмента в 546 или 187 нуклеотидные пары.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2001133577/13A RU2203951C1 (ru) | 2001-12-10 | 2001-12-10 | Способ выявления fusobacterium necrophorum в гнездовой полимеразной цепной реакции |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2001133577/13A RU2203951C1 (ru) | 2001-12-10 | 2001-12-10 | Способ выявления fusobacterium necrophorum в гнездовой полимеразной цепной реакции |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2203951C1 true RU2203951C1 (ru) | 2003-05-10 |
Family
ID=20254693
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2001133577/13A RU2203951C1 (ru) | 2001-12-10 | 2001-12-10 | Способ выявления fusobacterium necrophorum в гнездовой полимеразной цепной реакции |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2203951C1 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2294374C2 (ru) * | 2004-08-03 | 2007-02-27 | Государственное Научное Учреждение Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО РАСХН (ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН) | Способ определения наличия в пробе патогенного подвида fusobacterium necrophorum subspecies necrophorum с помощью полимеразной цепной реакции |
| RU2347806C2 (ru) * | 2007-01-18 | 2009-02-27 | Государственное научное учреждение Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО РАСХН (ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН), | Штамм бактерий fusobacterium necrophorum subspecies necrophorum для изготовления диагностических и профилактических препаратов против некробактериоза животных |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU97119187A (ru) * | 1995-04-26 | 1999-10-27 | Дзе Юниверсити оф Бритиш Колумбия | Олигонуклеотидный праймер, способ идентификации вида организма, геномный полинуклеотидный локус, набор для выделения днк-мишени |
| JP2001046063A (ja) * | 1999-08-10 | 2001-02-20 | Yakult Bio-Science Foundation | ユーバクテリウム属及びフソバクテリウム・バリウムグループ細菌用プライマー |
-
2001
- 2001-12-10 RU RU2001133577/13A patent/RU2203951C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU97119187A (ru) * | 1995-04-26 | 1999-10-27 | Дзе Юниверсити оф Бритиш Колумбия | Олигонуклеотидный праймер, способ идентификации вида организма, геномный полинуклеотидный локус, набор для выделения днк-мишени |
| JP2001046063A (ja) * | 1999-08-10 | 2001-02-20 | Yakult Bio-Science Foundation | ユーバクテリウム属及びフソバクテリウム・バリウムグループ細菌用プライマー |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2294374C2 (ru) * | 2004-08-03 | 2007-02-27 | Государственное Научное Учреждение Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО РАСХН (ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН) | Способ определения наличия в пробе патогенного подвида fusobacterium necrophorum subspecies necrophorum с помощью полимеразной цепной реакции |
| RU2347806C2 (ru) * | 2007-01-18 | 2009-02-27 | Государственное научное учреждение Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО РАСХН (ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН), | Штамм бактерий fusobacterium necrophorum subspecies necrophorum для изготовления диагностических и профилактических препаратов против некробактериоза животных |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Baily et al. | Detection of Brucella melitensis and Brucella abortus by DNA amplification | |
| AU2003303307B2 (en) | Assay and compositions for detection of bacillus anthracis nucleic acid | |
| Casañas et al. | Specificity of a polymerase chain reaction assay of a target sequence on the 31-kilodalton Brucella antigen DNA used to diagnose human brucellosis | |
| EP1012328A2 (en) | Dna-sequence-based diagnosis of mastitis from a milk sample | |
| ES2399054T3 (es) | Métodos para simplificar ácidos nucleicos microbianos mediante modificación química de citosinas | |
| Buogo et al. | Diagnosis of Clostridium perfringens type C enteritis in pigs using a DNA amplification technique (PCR) | |
| Bedir et al. | Simultaneous detection and differentiation of pathogenic and nonpathogenic Leptospira spp. by multiplex real-time PCR (TaqMan) assay | |
| Chotar et al. | Development of specific and rapid detection of bacterial pathogens in dairy products by PCR | |
| US7381547B2 (en) | Methods and compositions to detect bacteria using multiplex PCR | |
| KR20120117098A (ko) | 마이코플라즈마 하이오뉴모니에를 검출하기 위한 프라이머, 상기 프라이머를 이용한 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 검출키트 및 방법, 및 상기 프라이머를 이용한 돼지 유행성 폐렴 진단키트 및 방법 | |
| JP2012508564A (ja) | ブラキスピラ・ヒオディセンテリアのワクチン株 | |
| RU2203951C1 (ru) | Способ выявления fusobacterium necrophorum в гнездовой полимеразной цепной реакции | |
| Jin et al. | Microarray analysis of Escherichia coli O157: H7 | |
| Ibrahim et al. | Specific detection of Coxiella burnetii through partial amplification of 23S rDNA | |
| EP0963444A1 (en) | Nucleic acid assay for the detection and differentiation of three chlamydia species | |
| CN100412207C (zh) | 一种动物源细菌磺胺类药物耐药基因多重pcr检测技术 | |
| Kędrak-Jabłońska et al. | Evaluation of real-time PCR based on SYBR Green I fluorescent dye for detection of Bacillus anthracis strains in biological samples | |
| Ibrahim et al. | Detection of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis using nested polymerase chain reaction (nPCR). | |
| RU2289627C2 (ru) | СПОСОБ И НАБОР ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ДНК БАКТЕРИИ ЗАБОЛЕВАНИЯ ЛАЙМСКОГО БОРРЕЛИОЗА-Borrelia burgdorferi | |
| RU2158306C2 (ru) | Способ выявления вируса вирусной диареи (болезни слизистых оболочек) крупного рогатого скота с помощью специфических олигонуклеотидных праймеров в полимеразной цепной реакции | |
| JP2005110545A (ja) | 呼吸器感染症起因菌の迅速検出法およびそのキット | |
| KR20100114971A (ko) | ＯｍｐＡ 유전자를 이용한 호흡기검체로부터 클라미도필라 뉴모니아, 클라미도필라 시타키의 동시확인을 위한 듀플렉스 ＰＣＲ 기법 및 이를 위한 ＰＣＲ 프라이머 | |
| JP4534294B2 (ja) | ベロ毒素遺伝子検出のためのオリゴヌクレオチド及びそれを用いたベロ毒素遺伝子の検出方法 | |
| Abdel-Salam | Direct PCR assay for detection of Neisseria meningitidis in human cerebrospinal fluid | |
| JP2003061665A (ja) | 芽胞形成菌の検出方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20091211 |