RU2200569C1

RU2200569C1 - Complex of natural compounds of plant origin eliciting activity with regards to viral infections transferring by sexual way

Info

Publication number: RU2200569C1
Application number: RU2002104736A
Authority: RU
Inventors: В.А. Быков; С.А. Вичканова; Т.А. Сокольская; В.К. Колхир
Original assignee: Быков Валерий Алексеевич
Priority date: 2002-02-26
Filing date: 2002-02-26
Publication date: 2003-03-20

Abstract

FIELD: medicine, phytotherapy. SUBSTANCE: invention relates to agents prepared of medicinal plants and eliciting antiviral activity with regards to human immunodeficiency virus and pathogens of infections transferring by sexual way. Invention proposes agent comprising alpizarin, flakoside chelepin or chelepin D, eucalimine taken in the ratio = 1: 1: (2.0-3.0) : (0.4-0.5), respectively. Proposed components provide multiple pattern and polyfunctionality of complex for control of infections transferring by sexual way. EFFECT: valuable medicinal properties of complex. 3 tbl

Description

Изобретение относится к области медицины, а именно к разработке и поиску новых лекарственных средств на основе природных соединений растительного происхождения, активных в отношении вируса иммунодефицита, гепатита, а также других возбудителей инфекций, передаваемых половым путем. The invention relates to medicine, namely to the development and search for new drugs based on natural compounds of plant origin, active against the immunodeficiency virus, hepatitis, as well as other pathogens of sexually transmitted infections.

Проблема борьбы с все возрастающей угрозой распространения инфекций, передаваемых половым путем, в настоящее время весьма актуальна. Природные источники всегда представляли значительный интерес для создания лекарственных средств, в том числе для лечения различных инфекций, как наиболее доступные и эффективные. The problem of combating the ever-growing threat of the spread of sexually transmitted infections is currently very relevant. Natural sources have always been of considerable interest for the creation of medicines, including for the treatment of various infections, as the most affordable and effective.

К таким соединениям относятся алпизарин, флакозид, хелепин, хелепин Д, эвкалимин. Such compounds include alpizarin, flacoside, helepin, helepin D, eucalymin.

Алпизарин разрешен для медицинского применения у взрослых и детей для лечения острых и рецидивирующих форм простого герпеса генитальной и экстрагенитальной локализации, цитомегаловирусов, опоясывающего лишая и др. Алпизарин обладает противовирусными свойствами в отношении ВИЧ-инфекции, вирусов герпеса I и II типа, Varicella zoster. Алпизарин получают из травы копеечника альпийского и копеечника желтеющего. По химической структуре алпизарин является 2-с-β-Д-(глюкопиранозид)-1,3,6,7-тетраокси-ксантоном. (Машковский М. Д. "Лекарственные средств", т. 2, 1986 г, Гос. Реестр лекарственных средств, 2001 г., т.1). Алпизарин является малотоксичным веществом: LD₅₀ при внутрибрюшинном введении мышам составляет 13000-15900 мг/кг, не влияет на гематологические показатели, свертываемость крови, белковый и липидный обмен и антитоксическую функцию печени, не оказывает кардио- и нефротоксического действия.Alpizarin is approved for medical use in adults and children for the treatment of acute and recurrent forms of herpes simplex of genital and extragenital localization, cytomegaloviruses, herpes zoster, etc. Alpizarin has antiviral properties against HIV infection, herpes viruses type I and II, Varicella zoster. Alpizarin is obtained from the grass of Alpine penny and yellowing penny. By its chemical structure, alpizarin is 2-c-β-D- (glucopyranoside) -1,3,6,7-tetraoxy-xanton. (Mashkovsky M. D. "Medicines", vol. 2, 1986, State. Register of medicines, 2001, vol. 1). Alpizarin is a low-toxic substance: LD ₅₀ when administered intraperitoneally to mice is 13000-15900 mg / kg, does not affect hematological parameters, blood coagulation, protein and lipid metabolism and antitoxic function of the liver, does not have cardiac and nephrotoxic effects.

Противовирусные свойства алпизарина подтверждены патентами за рубежом (пат. Японии 1518445, пат. Великобритании 2108383, пат. ФРГ 31411970). The antiviral properties of alpizarin are confirmed by patents abroad (US Pat. Japan 1518445, US Pat. UK 2108383, US Pat. Germany 31411970).

Флакозид разрешен для медицинского применения у взрослых и детей как противовирусное средство при острых вирусных гепатитах А и В, первичных и рецидивирующих формах простого герпеса экстрагенитальной и генитальной локализации, опоясывающем лишае и других инфекций. Флакозид - это производное флавонов, получают из листьев бархата амурского (Машковский М.Д. "Лекарственные средства", т.2, 2000 г., Гос. Реестр лекарственных средств, 2001 г., т.1). Применение флакозида для лечения герпеса описано в авт. свид. СССР 491387. Flacoside is approved for medical use in adults and children as an antiviral agent for acute viral hepatitis A and B, primary and recurrent forms of herpes simplex extragenital and genital localization, herpes zoster and other infections. Flacoside is a derivative of flavones, obtained from the leaves of Amur velvet (Mashkovsky MD "Medicines", v.2, 2000, State. Register of medicines, 2001, v.1). The use of flacoside for the treatment of herpes is described in ed. testimonial. USSR 491387.

Хелепин и хелепин Д оказывают ингибирующий эффект на вирусы герпеса I и II типа, разрешены для применения у взрослых и детей при простом герпесе генитальной и экстрагенитальной локализации, опоясывающем герпесе и других вирусных инфекций. Представляют собой очищенные экстракты, содержащие в качестве биологически активных компонентов суммы флавоноидов (изоориентин, витоксин, изовитексин и др. ). Хелепин выделен из надземной части леспедеции копеечковой сем. Бобовых. Хелепин Д выделен из надземной части десмодиума канадского, сем. бобовых (Машковский Д.М. Лекарственные средства т.2, 2000 г. Новые лекарственные средства, М., 2000 г., Гос. Реестр, т.1, 2001 г.). Известно лекарственное средство на основе хелепина Д для лечения герпесвирусных и аденовирусных заболеваний глаз (пат. РФ 2120294). Helepin and helepin D have an inhibitory effect on herpes viruses of type I and II, are approved for use in adults and children with herpes simplex genital and extragenital localization, herpes zoster and other viral infections. They are purified extracts containing, as biologically active components, amounts of flavonoids (isoorientin, vitoxin, isovitexin, etc.). Helepin isolated from the aerial part of the lespedia of the penny sem. Legumes. Helepin D isolated from the aerial part of the Canadian desmodium, fam. legumes (Mashkovsky D.M. Medicines, vol. 2, 2000. New medicines, M., 2000, State Register, vol. 1, 2001). Known drug based on helepin D for the treatment of herpes virus and adenoviral eye diseases (US Pat. RF 2120294).

Эвкалимин разрешен для медицинского применения у взрослых и детей в качестве антибактериального и противовоспалительного средства, в том числе в гинекологии и урологии. Эвкалимин активен в отношениикандиды, бактерий, в том числе грамположительных. Эвкалимин сумма терпеноидных фенолальдегидов и тритерпеноидов, получаемая из листьев и побегов эвкалипта прутовидного. (Машковский М.Д. "Лекарственные средства", т.2, 2000 г., Гос. Реестр лекарственных средств, 2001 г., т.1, пат. РФ 2102977). Eucalymin is approved for medical use in adults and children as an antibacterial and anti-inflammatory agent, including gynecology and urology. Eucalymin is active against candida, bacteria, including gram-positive. Eucalymine is the sum of terpenoid phenolaldehydes and triterpenoids obtained from the leaves and shoots of eucalyptus pruniform. (Mashkovsky M.D. "Medicines", v.2, 2000, State. Register of medicines, 2001, v.1, pat. RF 2102977).

Наиболее близким техническим решением к заявляемому объекту является средство на основе алпизарина, обладающего действием против инфекционных агентов, передаваемых половым путем, таких как вирус иммунодефицита человека (ВИЧ-инфекция), цитомегаловирус (пат. РФ 2092177). The closest technical solution to the claimed object is an agent based on alpizarin, which has an effect against sexually transmitted infectious agents, such as human immunodeficiency virus (HIV infection), cytomegalovirus (US Pat. RF 2092177).

Цель данного изобретения - создание комплекса на основе природных соединений растительного происхождения, обладающего противовирусным и противоинфекционным действием, в том числе в отношении инфекций, передаваемых половым путем. The purpose of this invention is the creation of a complex based on natural compounds of plant origin with antiviral and anti-infectious effects, including against sexually transmitted infections.

Поставленная цель достигается за счет использования комплекса природных соединений растительного происхождения, включающего алпизарин, и дополнительно содержащего флакозид, хелепин или хелепин Д, эвкалимин, взятых соответственно в соотношении 1:1:(2,0-3,0):(0,4-0,5). This goal is achieved through the use of a complex of natural compounds of plant origin, including alpizarin, and additionally containing flacoside, helepin or helepin D, eucalymin, taken respectively in a ratio of 1: 1: (2.0-3.0) :( 0.4- 0.5).

Экспериментально установлено, что комплекс природных соединений на основе алпизарина, флакозида, хелепина или хелепина Д и эвкалимина, взятых соответственно в соотношении 1:1:(2,0-3,0):(0,4-0,5), наряду с известными свойствами противовирусным и противомикробным действиями активен в отношении вирусов гепатита, ВИЧ-инфекции, а также других возбудителей инфекций, включая трепонему и хламидию, передаваемых половым путем. It was experimentally established that a complex of natural compounds based on alpizarin, flacoside, helepin or helepin D and eucalymin taken respectively in a ratio of 1: 1: (2.0-3.0) :( 0.4-0.5), along with known antiviral and antimicrobial properties active against hepatitis viruses, HIV infection, as well as other pathogens, including treponema and chlamydia, sexually transmitted.

Все соединения, входящие в комплекс в заявляемых соотношениях, не вступают в химическое взаимодействие друг с другом, не образуют новых веществ, обладающих новыми биологически активными свойствами или токсическим действием. Полное сохранение химических структур компонентов, входящих в данный комплекс, подтверждено аналитическими методами контроля, а именно алпизарин, флакозид, эвкалинин, хелепин и хелепин Д определяли спектрофотометрическим методом с использованием стандарта. Все указанные методы контроля вошли в нормативные документы, включая фармацевтический стандарт предприятия (ФСП). All compounds included in the complex in the claimed proportions do not enter into chemical interaction with each other, do not form new substances with new biologically active properties or toxic effects. The complete preservation of the chemical structures of the components included in this complex was confirmed by analytical control methods, namely, alpizarin, flacoside, eucalinin, helepin and helepin D were determined spectrophotometrically using the standard. All these control methods are included in regulatory documents, including the pharmaceutical standard of the enterprise (FSP).

Сохранение в данном комплексе неизмененных химических структур компонентов приводит и к сохранению их биологической активности, указанной выше, присущей каждому компоненту, а именно противовирусной активности алпизарина (в отношении ВИЧ-инфекции, вируса герпеса и других вирусов) и флакозида (в отношении вируса гепатита А и В и других вирусов), хелепина и хелепина Д в отношении генитального герпеса и других вирусов, эвкалимина в отношении кандиды, хламидий, наличие противовосполительных свойств. The preservation in this complex of unchanged chemical structures of the components also leads to the preservation of their biological activity, indicated above, inherent in each component, namely the antiviral activity of alpizarin (with respect to HIV infection, herpes virus and other viruses) and flacoside (with respect to hepatitis A virus and B and other viruses), helepin and helepin D against genital herpes and other viruses, eucalymin against candida, chlamydia, the presence of anti-inflammatory properties.

Проведены также новые биологические исследования, подтверждающие сохранение в комплексе противоинфекционной активности, присущей одному или нескольким компонентам, а именно исследован трепонемоцидный эффект заявляемого комплекса и входящих в него компонентов в отношении Treponema pallidum (возбудитель сифилиса). Проведенные исследования также показали, что эффект, установленный хотя бы для одного из компонентов (или для нескольких компонентов) полностью сохраняется для всего комплекса. New biological studies have also been carried out, confirming that the complex has the anti-infectious activity inherent in one or more components, namely, the treponemocidal effect of the claimed complex and its constituents with respect to Treponema pallidum (syphilis pathogen) has been studied. Studies have also shown that the effect established for at least one of the components (or for several components) is fully preserved for the entire complex.

Пример 1. Изучение активности в отношении Treponema pallidum. Example 1. The study of activity against Treponema pallidum.

Проведены исследования влияния комплекса природных соединений растительного происхождения, состоящего из алпизарина, флакозида, хелепина или хелепина Д, и эвкалимина, взятых в соотношении 1:1:(2,0-3,0):(0,4-0,5), на бледную трепонему - возбудителя сифилиса. Наряду с комплексом испытывали каждый компонент в отдельности: алпизарин, флакозид, хелепин и хелепин Д, эвкалимин. The effect of a complex of natural compounds of plant origin, consisting of alpizarin, flacoside, helepin or helepin D, and eucalymin, taken in a ratio of 1: 1: (2.0-3.0) :( 0.4-0.5), was studied. on pale treponema - the causative agent of syphilis. Along with the complex, each component was tested separately: alpizarin, flacoside, helepin and helepin D, eucalymin.

Взвесь бледных трепонем получали из орхитов кролика на 7-й день после заражения кроликов сифилисом. Трепонемы наблюдали в темнопольном микроскопе окуляр 40, объектив х7. Взвесь бледных трепонем сохранялась в стерильном физиологическом растворе. Для опытов использовали взвесь с содержанием около 100 бледных трепонем в поле зрения. Растворы данных соединений готовили из расчета 20 мг вещества в одном мл жидкости: для водорастворимых соединений (хелепин, хелепин Д) 1 мл дистиллированной воды, для водонерастворимых (эвкалимин, флакозид, алпизарин) 5%-ный раствор этилового спирта + 0,9 мл дистиллированной воды. A suspension of pale treponemas was obtained from rabbit orchitis on the 7th day after infection of the rabbits with syphilis. Treponema was observed in a dark-field microscope, eyepiece 40, lens x7. A suspension of pale treponemas was maintained in sterile saline. For the experiments, a suspension with a content of about 100 pale treponemas in the field of view was used. Solutions of these compounds were prepared on the basis of 20 mg of the substance in one ml of liquid: for water-soluble compounds (helepin, helepin D) 1 ml of distilled water, for water-insoluble (eucalymin, flacoside, alpizarin) 5% ethyl alcohol solution + 0.9 ml distilled water.

Трепономоцидный эффект изучали методом прямого контакта в капле. Одну каплю (0,05 мл) каждого раствора помещали на предметное стекло, смешивали с равным объемом взвеси трепонем в изотоническом растворе хлористого натрия, накрывали покровным стеклом и тотчас просматривали под микроскопом. The treponomocidal effect was studied by direct contact in a drop method. One drop (0.05 ml) of each solution was placed on a glass slide, mixed with an equal volume of trepone suspension in an isotonic sodium chloride solution, covered with a coverslip and immediately examined under a microscope.

Результаты сведены в таблицу 1. The results are summarized in table 1.

Таким образом, комплекс проявил трепонемоцидный эффект и может быть рекомендован для создания лекарственных средств профилактического и лечебного действия. Thus, the complex showed treponemocidal effect and can be recommended for the creation of preventive and therapeutic drugs.

Пример 2. Изучение активности в отношении вируса гепатита в опытах in vitro. Example 2. The study of activity against hepatitis virus in experiments in vitro.

В эксперименте использовали культуру клеток AGMK (линия BS-С-1) и адаптированный к ней штамм вируса гепатита А НМ-175. Проведены серии экспериментов с учетом времени внесения объекта исследования (флакозид) по отношению к моменту заражения культуры клеток вирусом гепатита: до заражения, одновременно с заражением, после заражения вирусом. Во всех сериях опытов выявлено, что объект исследования подавлял размножение вируса гепатита А в культурах по сравнению с контролем. При учете результатов методом непрямой иммунофлюоресценции объект в концентрации 0,1 мг/мл вызывал ингибирование размножения ВГА на 30-35% при внесении в культуру клеток одновременно с заражением вирусом. При учете результатов иммуноферментным методом также установлено, что ингибирование размножения ВГА в концентрациях 1, 0,5 и 0,1 мг/мл происходило в тех же условиях опыта. Ни в одной из примененных концентраций токсического действия объекта исследования на клетки не наблюдали. Таким образом, показано противовирусное действие объекта исследования в отношении вируса гепатита человека. An AGMK cell culture (BS-C-1 line) and a hepatitis A virus strain HM-175 adapted to it were used in the experiment. A series of experiments was carried out taking into account the time of introducing the object of study (flacoside) in relation to the moment of infection of the cell culture with hepatitis virus: before infection, simultaneously with infection, after infection with the virus. In all series of experiments, it was revealed that the object of the study suppressed the reproduction of hepatitis A virus in cultures as compared with the control. When taking into account the results by indirect immunofluorescence, the object at a concentration of 0.1 mg / ml caused inhibition of HAV multiplication by 30-35% when introduced into the cell culture at the same time as the virus was infected. When taking the results into account by the enzyme-linked immunosorbent assay, it was also found that inhibition of HAV reproduction at concentrations of 1, 0.5, and 0.1 mg / ml occurred under the same experimental conditions. In none of the applied concentrations of the toxic effect of the test object on the cells was not observed. Thus, the antiviral effect of the object of study in relation to the human hepatitis virus is shown.

Пример 3. Изучение активности в отношении хламидий
Исследования проведены у 8 пациентов в возрасте 8-14 лет, находящихся на стационарном лечении. У всех пациентов был установлен диагноз дифференцированный серологически и культурально, "урогенитальный хламидиоз". Объект исследования суппозиторий с эвкалимином 0,03. Пациентам назначали в качестве монотерапии в лекарственной форме "Суппозиторий с эвкалимином 0,03" per rectum по 2 суппозитория 2 раза в сутки. Продолжительность лечения 10-11 суток. Отмечена хорошая переносимость объекта исследования, ни в одном случае не наблюдали общих токсических или местнораздражающих явлений. У всех пациентов наступило клиническое выздоровление, подтвержденное лабораторным анализом.Example 3. The study of activity against chlamydia
Studies were conducted in 8 patients aged 8-14 years who are in hospital. All patients were diagnosed with differentiated serologically and culturally, urogenital chlamydia. The object of study is a suppository with eucalymin 0.03. Patients were prescribed as a monotherapy in the dosage form "Suppository with eucalymin 0.03" per rectum, 2 suppositories 2 times a day. The duration of treatment is 10-11 days. Good tolerance of the object of study was noted, in no case did not observe general toxic or locally irritating phenomena. All patients experienced clinical recovery, confirmed by laboratory analysis.

Пример 4. Изучение активности в отношении ВИЧ-инфекции
В опытах использовали: вирус иммунодефицита человека 1 типа; штамм HTLV-III, продуцируемый клеточной линией Н9/IIIB; первично-трипсинизированную культуру Т-лимфоцитов человека Н9 и H9/IIIB, первичные культуры спленоцитов мышей линии C₅₇ BL/6; нелинейные белые мыши обоего пола; сыворотки больных СПИД (B.F. Vestergaard, Государственный институт сыворотки, Копенгаген, Дания).Example 4. The study of activity against HIV infection
In the experiments used: human immunodeficiency virus type 1; HTLV-III strain produced by the H9 / IIIB cell line; primary trypsinized culture of human T-lymphocytes H9 and H9 / IIIB, primary cultures of splenocytes from C ₅₇ BL / 6 mice; non-linear white mice of both sexes; serum of AIDS patients (BF Vestergaard, State Serum Institute, Copenhagen, Denmark).

Клетки Н9 заражали ВИЧ-1, подсевая живые клетки культуры Н9/IIIB. Объект исследования (алпизарин) вносили в культуру Н9 + Н9/IIIB непосредственно после заражения. Опыты сопровождали контролем культуры без объекта исследования и контролем токсичности доз объекта исследования для клеток Н9. H9 cells infected HIV-1 by inoculating live H9 / IIIB culture cells. The object of study (alpizarin) was introduced into the culture H9 + H9 / IIIB immediately after infection. The experiments were accompanied by control of the culture without the object of study and control of toxicity of doses of the object of study for H9 cells.

Уровень продукции ВИЧ-1 заражеными культурами оценивали:
- по количеству клеток (%), экспрессирующих вирусные антигены на мембранах, определяемому методом непрямой иммунофлуоресценции;
- по активности обратной транскриптазы ВИЧ-1 в супернатанте.The level of HIV-1 production by infected cultures was evaluated:
- by the number of cells (%) expressing viral antigens on the membranes, determined by the method of indirect immunofluorescence;
- by the activity of HIV-1 reverse transcriptase in the supernatant.

Влияние объекта исследования на экспрессию СД4-рецептора оценивали после 24-часовой инкубации объекта исследования с клетками Н9 методом проточной флуоцитометрии на лазерном сортере с использованием моноклональных антител, меченых ФНТЦ-ОКТ4 (в качестве контроля ОКТ8). The effect of the test object on the expression of the CD4 receptor was evaluated after 24-hour incubation of the test object with H9 cells by flow fluocytometry on a laser sorter using monoclonal antibodies labeled with FTC-OCT4 (as a control of OCT8).

Исследование эффективности объекта исследования проводили в опытах in vitro в смешанной культуре клеток Н9/IIIB и Н9. Смесь (1:1) клеток готовили непосредственно перед опытом и разливали по 2 мл в каждую лунку в 24-луночных планшетах фирмы "Coster". В лунки вносили объект исследования из расчета получить в лунках конечные концентрации 50 мкг/мл. Планшеты инкубировали при температуре 37 град. И 5% СО₂ в течение 7 суток. Жизнеспособность клеточных культур оценивали ежедневно с помощью инвертированного микроскопа. Результаты опыта учитывали на 7 сутки методом непрямой иммунофлуоресценции с использованием сыворотки больного СПИД в разведении 1:40.The study of the effectiveness of the object of study was carried out in experiments in vitro in a mixed culture of H9 / IIIB and H9 cells. A mixture (1: 1) of cells was prepared immediately before the experiment and poured into 2 ml in each well in Coster 24-well plates. The object of study was introduced into the wells in order to obtain final concentrations of 50 μg / ml in the wells. The plates were incubated at 37 degrees. And 5% CO ₂ for 7 days. Cell viability was assessed daily using an inverted microscope. The results of the experiment were taken into account on day 7 by indirect immunofluorescence using the serum of an AIDS patient in a 1:40 dilution.

В результате исследования установлено, что объект исследования в концентрации 50 мкг/мл ингибировал почти полностью вирусную продукцию в изученной системе клеток Н9/IIIB и Н9. Полученные данные свидетельствуют о способности предохранения алпизарином неинфицированных вирусов клеток Н9 от заражения их вирусом в условиях совместного культивирования с клетками Н9/IIIB. As a result of the study, it was found that the object of the study at a concentration of 50 μg / ml inhibited almost completely viral production in the studied system of H9 / IIIB and H9 cells. The data obtained indicate the ability of alpizarin to protect uninfected viruses from H9 cells from being infected by their virus under conditions of co-culture with H9 / IIIB cells.

Пример 5. Изучение активности в отношении вируса герпеса. Example 5. The study of activity against herpes virus.

Клинические исследования проведены на пациентах взрослого и детского возраста. Объекты исследования - хелепин и хелепин Д. Анализ полученных результатов представлен в таблице 2. Объекты исследования показали хорошую переносимость, отсутствие побочных явлений и высокую эффективность. Clinical studies have been conducted on adult and pediatric patients. The objects of study - helepin and helepin D. The analysis of the results is presented in table 2. The objects of the study showed good tolerance, the absence of side effects and high efficiency.

Во всех примерах опыты проводили в нескольких повторностях в заявляемых соотношениях. В примерах приведены усредненные результаты исследования. In all examples, the experiments were carried out in several repetitions in the claimed proportions. The examples show the average results of the study.

Таким образом, заявленный комплекс природных соединений растительного происхождения является перспективным для создания лекарственных средств профилактического и лечебного действия при ВИЧ-инфекции, сифилисе, хламидиозе, герпесе и гепатите. Thus, the claimed complex of natural compounds of plant origin is promising for the creation of drugs of prophylactic and therapeutic effects in HIV infection, syphilis, chlamydia, herpes and hepatitis.

Claims

A complex based on natural compounds of plant origin, which has an anti-infectious effect against sexually transmitted infections, including alpizarin, characterized in that the complex additionally contains flacoside helepin or helepin D, eucalymin, taken respectively in a ratio of 1: 1: (2.0- 3.0): (0.4-0.5).