RU2297451C2 - Способ размножения кроветворных стволовых клеток - Google Patents
Способ размножения кроветворных стволовых клеток Download PDFInfo
- Publication number
- RU2297451C2 RU2297451C2 RU2004113375/13A RU2004113375A RU2297451C2 RU 2297451 C2 RU2297451 C2 RU 2297451C2 RU 2004113375/13 A RU2004113375/13 A RU 2004113375/13A RU 2004113375 A RU2004113375 A RU 2004113375A RU 2297451 C2 RU2297451 C2 RU 2297451C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- hematopoietic stem
- stem cells
- csf
- lin
- Prior art date
Links
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 74
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 97
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims abstract description 61
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims abstract description 61
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 102000003815 Interleukin-11 Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 108090000177 Interleukin-11 Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 229940074383 interleukin-11 Drugs 0.000 claims abstract description 17
- 102000036693 Thrombopoietin Human genes 0.000 claims abstract description 16
- 108010041111 Thrombopoietin Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 claims abstract description 16
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 8
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims abstract description 3
- 102000016548 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-1 Human genes 0.000 claims abstract 4
- 108010053096 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-1 Proteins 0.000 claims abstract 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 5
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 10
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 15
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 13
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 13
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 11
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 8
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 7
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 7
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 7
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101000851018 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor receptor 1 Proteins 0.000 description 5
- 102100033178 Vascular endothelial growth factor receptor 1 Human genes 0.000 description 5
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 5
- 210000003677 hemocyte Anatomy 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 5
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 5
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 4
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 4
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 4
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011779 Ly5.1 mouse Methods 0.000 description 4
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011134 hematopoietic stem cell transplantation Methods 0.000 description 4
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 4
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 4
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 101100289995 Caenorhabditis elegans mac-1 gene Proteins 0.000 description 3
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 3
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 3
- 102000000646 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 3
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 3
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 3
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 3
- 108010058398 Macrophage Colony-Stimulating Factor Receptor Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 3
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 229940076264 interleukin-3 Drugs 0.000 description 3
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 3
- YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 7-aminoactinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=C(N)C=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 0.000 description 2
- 108700012813 7-aminoactinomycin D Proteins 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 2
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 2
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100021866 Hepatocyte growth factor Human genes 0.000 description 2
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 2
- 102000014429 Insulin-like growth factor Human genes 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 2
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 2
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 108700014844 flt3 ligand Proteins 0.000 description 2
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 2
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 2
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 229910000028 potassium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000015497 potassium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 239000011736 potassium bicarbonate Substances 0.000 description 2
- TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M potassium hydrogencarbonate Chemical compound [K+].OC([O-])=O TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000725101 Clea Species 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 1
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 1
- 101001046686 Homo sapiens Integrin alpha-M Proteins 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 102100022338 Integrin alpha-M Human genes 0.000 description 1
- 101100335081 Mus musculus Flt3 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108010014608 Proto-Oncogene Proteins c-kit Proteins 0.000 description 1
- 102000016971 Proto-Oncogene Proteins c-kit Human genes 0.000 description 1
- 102100020718 Receptor-type tyrosine-protein kinase FLT3 Human genes 0.000 description 1
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 1
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- 108010003374 fms-Like Tyrosine Kinase 3 Proteins 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 208000016245 inborn errors of metabolism Diseases 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000003887 myelocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000011476 stem cell transplantation Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- JLYXXMFPNIAWKQ-UHFFFAOYSA-N γ Benzene hexachloride Chemical compound ClC1C(Cl)C(Cl)C(Cl)C(Cl)C1Cl JLYXXMFPNIAWKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/22—Colony stimulating factors (G-CSF, GM-CSF)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно, к выделению кроветворных стволовых клеток, и может быть использовано для трансплантации. Полученные из костного мозга Lin-отрицательные или слабоположительные клетки культивируют в присутствии макрофагального колониестимулирующего фактора (M-CSF) в концентрации приблизительно от 5 до 20 нг/мл, вместе с композицией цитокинов, включающей фактор стволовых клеток (SCF), интерлейкин-11 (IL-11) и лиганд fms-подобную тирозинкиназу (FLT) или тромбоцитопоэтин (ТРО). При этом цитокины используют в следующем весовом соотношении: 1-4 M-CSF:20 SCF:20 IL-11:20 (FLT или ТРО). Изобретение позволяет направленно размножить кроветворные стволовые клетки при культивировании популяции Lin-отрицательных или слабоположительных клеток, полученных из костного мозга. 4 н.п. ф-лы, 1 табл., 3 ил.
Description
Область техники
Настоящее изобретение относится к способу размножения кроветворных стволовых клеток с макрофагальным колониестимулирующим фактором (M-CSF). Изобретение, в частности, относится к способу культивирования Lin-отрицательных или слабоположительных клеток в присутствии M-CSF, к размножению кроветворных стволовых клеток путем культивирования Lin-отрицательных или слабоположительных клеток в присутствии M-CSF, к популяциям кроветворных стволовых клеток, полученных по указанному способу размножения, к набору, который используют для культивирования Lin-отрицательных или слабоположительных клеток, содержащих M-CSF, и к средству, которое используют для размножения кроветворных стволовых клеток, содержащих M-CSF.
Предпосылки изобретения
Кроветворными стволовыми клетками называют клетки, которые обладают как способностью продуцировать все гемоциты, такие как эритроциты, лейкоциты, тромбоциты, Т- и В-лимфоциты (полипотентность), так и способностью самообновлять самих себя (способность к самообновлению). При трансплантации костного мозга кроветворные стволовые клетки играют основную роль в пересаженном костном мозге, а потому трансплантацию костного мозга можно иными словами назвать трансплантацией кроветворных стволовых клеток. В настоящее время трансплантация костного мозга является радикальным методом лечения многих трудноизлечимых заболеваний, таких как различные заболевания крови, рак, иммунодефицит, врожденное расстройство обмена веществ. Однако при таких трансплантациях общие антигены лейкоцитов человека (HLA-антигены) донора должны быть такими же, что и у реципиента, и дефицит доноров в настоящее время вызывает беспокойство общественности.
Периферическую кровь часто используют в настоящее время в качестве источника кроветворных стволовых клеток вместо костного мозга. Лишь небольшое количество CD34-положительных клеток, в том числе кроветворных стволовых клеток, может содержаться в периферической крови здорового человека, однако большое количество таких клеток может быть мобилизовано в периферическую кровь из костного мозга этого человека в том случае, если ему постоянно вводят гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF). С помощью сепаратора компонентов крови на этой стадии из периферической крови можно собрать большое количество периферических кроветворных стволовых клеток/предшественников кроветворных клеток, которые могут быть использованы при трансплантации. Однако при этом необходимо решить некоторые проблемы, которые касаются эффективности мобилизации кроветворных стволовых клеток в периферическую кровь и безопасности донора.
В качестве другого источника кроветворных стволовых клеток для трансплантации стволовых клеток пуповинной крови можно использовать пуповинную кровь. Однако поскольку количество кроветворных стволовых клеток в пуповинной крови мало, то подобную трансплантацию стволовых клеток пуповинной крови проводят только детям.
Из рассмотренных предпосылок понятно, что необходима методика размножения кроветворных стволовых клеток ex vivo, и с этой целью к настоящему времени были опробованы многочисленные способы. Например, имеются сообщения, касающиеся размножения кроветворных стволовых клеток, в которых приводятся результаты культивирования клеток в присутствии цитокинов, таких как фактор стволовых клеток (SCF), интерлейкин-3 (IL-3), интерлейкин-6 (IL-6), интерлейкин-11 (IL-11), G-CSF, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), лиганд (FL) fms-подобной тирозинкиназы-3 (Flt-3), тромбоцитопоэтин (TPO). Предшественники кроветворных клеток и дифференцированные из них клетки могут значительно размножиться, если их культивируют совместно с такими цитокинами или другими факторами роста, однако степень размножения кроветворных стволовых клеток, культивированных указанным путем, возрастает лишь в несколько раз и не является достаточной (Miller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 13648-13653, 1997; Matsunaga et al., Blood, 92, 452-461, 1998; Bryder et al., Blood, 96, 1748-1755, 2000). Предшественники кроветворных клеток в общем случае определяют как клетки, которые обладают колониеобразующей способностью в условиях in vitro. Но поскольку они не самообновляются и не обладают способностью продуцировать клетки крови в течение длительного времени, предшественники кроветворных клеток бесполезны в качестве источника гемоцитов для трансплантации.
Далее, была опробована методика размножения кроветворных стволовых клеток при совместном культивировании с клетками стромы костного мозга, однако она также позволяет увеличить объем клеток лишь в несколько раз (Moore et al., Blood, 89, 4337-4347, 1997).
С другой стороны, если цитокин, фактор роста и т.п. могли бы непосредственно вводиться в живые организмы с целью значительно увеличить в них объем кроветворных стволовых клеток, то тогда, например, в качестве источника для трансплантации могла бы использоваться пуповинная или аналогичная кровь, которая содержит лишь небольшое количество кроветворных стволовых клеток. Однако никто еще не сообщал об успешном проведении подобных экспериментов.
Целью настоящего изобретения является применение в клинических условиях кроветворных стволовых клеток, которые размножают в условиях ex vivo путем увеличения уровня размножения кроветворных стволовых клеток с помощью цитокинов или факторов роста в условиях ex vivo, что до настоящего времени оказывалось неэффективным. Еще одной целью настоящего изобретения является размножение кроветворных стволовых клеток in vivo путем прямого введения цитокина в живой организм.
Описание изобретения
В результате интенсивных исследований, которые проводились для решения указанных выше проблем, авторы настоящего изобретения обнаружили, что когда клетки, которые являются отрицательными или слабоположительными в отношении маркера линии дифференцировки (Lin) и которые могут содержать кроветворные стволовые клетки, активируют с помощью макрофагального колониестимулирующего фактора (M-CSF) или другого цитокина, то уровень размножения кроветворных стволовых клеток может быть увеличен, что и составляет суть настоящего изобретения.
Таким образом, изобретение относится к способу культивирования Lin-отрицательных или слабоположительных клеток в присутствии макрофагального колониестимулирующего фактора (M-CSF).
Изобретение также относится к способу размножения кроветворных стволовых клеток путем культивирования Lin-отрицательных или слабоположительных клеток в присутствии макрофагального колониестимулирующего фактора (M-CSF).
Далее, изобретение относится к популяциям кроветворных стволовых клеток, полученных указанным выше способом размножения.
Кроме того, изобретение относится к набору, который используют для культивирования Lin-отрицательных или слабоположительных клеток и который содержит макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF).
Наконец, изобретение относится к агенту для усиления размножения кроветворных стволовых клеток, содержащему макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF).
Путь осуществления изобретения
Способ культивирования и способ размножения согласно изобретению отличаются тем, что Lin-отрицательные или слабоположительные клетки культивируют в присутствии M-CSF. Авторы настоящего изобретения культивировали Lin-отрицательные или слабоположительные клетки в присутствии M-CSF с целью изучения того, смогут ли или не смогут кроветворные стволовые клетки размножаться. В результате было обнаружено, что клеточная культура в присутствии M-CSF приводит к значительному размножению кроветворных клеток по сравнению с клеточной культурой в отсутствие M-CSF. Таким образом, способ культивирования согласно настоящему изобретению применим для размножения кроветворных стволовых клеток. Далее, популяция кроветворных стволовых клеток, которую размножали способом согласно изобретению, может использоваться в качестве источника для трансплантации кроветворных стволовых клеток.
Lin-отрицательные или слабоположительные клетки предпочтительно отбирают с помощью маркера клеточной поверхности, который служит в качестве показателя для Lin. Lin означает "маркер линии (направления) дифференцировки" и включает в себя, например, маркер эритроцитов, Ter119; маркер гранулоцитов, Gr-1; маркер Mac-1 моноцитарных макрофагов (CD11b) и Т-клеточный маркер Ly1. Известно, что кроветворные стволовые клетки содержатся в Lin-отрицательных или слабоположительных фракциях.
Lin-отрицательные или слабоположительные клетки можно собрать путем обработки суспензии отдельных клеток из клеток костного мозга с помощью содержащих метку антител, которые распознают Lin, и путем отделения содержащих метку клеток с помощью клеточного сортера, такого как проточный цитофлуориметр. Что касается клеток мыши, то, например, клетки, обработанные с помощью StemSepTM (StemCell Technologies Inc.), которые содержат смесь антител для приготовления предшественников кроветворных клеток, широко используются для Lin-отрицательных или слабоположительных клеток. В приведенном ниже примере клетки, обработанные с помощью StemSepTM, составляют около 0,5% от количества необработанных клеток.
Полученные указанным способом клетки культивируют в присутствии M-CSF, для чего условия культивирования, включая среду, период культивирования и планшет специально не оговариваются, однако предпочтительно их выбирают таким образом, чтобы клетки могли хорошо сохраняться в выбранных условиях. Так, в приведенном далее примере полученные Lin-отрицательные или слабоположительные клетки высевают в 6-луночные микропланшеты для выращивания культур тканей (Iwaki) в количестве 4×104 клеток на лунку и культивируют в течение 6 дней в среде RPMI 1640 (Gibco-BRL), содержащей 5% сыворотки плода коровы и 10 мкг/мл гентамицина (Sigma), в присутствии 5% CO2 при температуре 37°С. Однако изобретение не ограничивается этим примером.
M-CSF может быть, например, получен от компании Pepro Tech Inc., однако его можно получить обычными методами генной инженерии путем введения гена, кодирующего M-CSF, в подходящий вектор экспрессии белка. Не существует специальных ограничений на использование M-CSF согласно изобретению. Желательно выбирать M-CSF в соответствии с образцами клеток животного, которые используют при осуществлении настоящего изобретения, однако в приемлемом интервале реакционной способности можно использовать и M-CSF, полученный от любых других видов.
Более предпочтительно, в культивируемые клетки добавляют подходящий цитокин или фактор роста. Добавляемым цитокином или фактором роста являются такие цитокины или факторы роста, для которых известно, что они эффективны для сохранения, активирования роста и инициирования дифференцировки кроветворных стволовых клеток (Miller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 13648-13653, 1997; Matsunaga et al., Blood, 92, 452-461, 1998; Bryder et al., Blood, 96, 1748-1755, 2000), такие как SCF, IL-3, IL-6, IL-11, G-CSF, GM-CSF, FLT, TPO, фактор ингибирования лейкемии (LIF), основной фактор роста фибробластов (основной FGF), фактор роста гепатоцитов (HGF), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), инсулиноподобный фактор роста (IGF), однако изобретение ими не ограничивается.
Как указано выше, кроветворными стволовыми клетками являются такие клетки, которые обладают не только способностью продуцировать все гемоциты (полипотентность), но и способностью самообновлять самих себя (способность к самообновлению). Следовательно, для выяснения того, можно ли размножить кроветворные стволовые клетки, предпочтителен метод, который позволяет подтвердить обе указанные способности клеток. Например, когда используют клетки мыши, то это можно подтвердить с помощью продолжительного анализа репопуляции. Такой метод будет подробно рассмотрен в примере. Если коротко, то клетки, содержащие кроветворные стволовые клетки, трансплантируют животному и затем за животным наблюдают на предмет того, смогут ли клетки крови, продуцированные из стволовых клеток, существовать в крови животного в течение длительного времени. В настоящее время это наиболее надежный метод количественного определения кроветворных стволовых клеток (Harrison et al., Exp. Hematol., 21, 206-219, 1993).
В том случае, если используют клетки человека, можно применить метод, в котором в качестве животных для имплантации используют NOD/SCID (не страдающих ожирением, но пораженных тяжелым комбинированным иммунодефицитом) мышей или NOD/SCID мышей с β2-микроглобулиновой недостаточностью (Larochelle et al., Nat. Med., 2, 1329-1337, 1996; Kollet et al., Blood., 95, 3102-3105, 2000).
Количество M-CSF, которое необходимо добавить в среду с клеточной культурой, предпочтительно составляет от 0,1 до 100 нг/мл или около того, более предпочтительно - от 1 до 50 нг/мл или около того, наиболее предпочтительно - от 5 до 20 нг/мл или около того. Способность к размножению кроветворных стволовых клеток исследовали путем добавления к среде 0, 1, 10 или 100 нг/мл M-CSF, и в итоге было обнаружено, что при добавлении M-CSF в количестве 10 нг/мл он значительно способствовал размножению клеток, однако добавление M-CSF в количестве 100 нг/мл скорее замедляло, чем способствовало размножению клеток. Можно предположить, что для размножения кроветворных стволовых клеток существует оптимальная концентрация M-CSF.
Далее клетки, выделенные из Lin-отрицательных или слабоположительных клеток методом положительной селекции с помощью c-набора и Sca-1, которые известны как маркеры кроветворных стволовых клеток, не проявляют способности к размножению при обработке с помощью M-CSF. В Lin-отрицательных или слабоположительных клетках кроветворные стволовые клетки обнаруживаются во фракции клеток (c-fms)-отрицательной в отношении рецептора M-CSF. Из этого можно заключить, что M-CSF не оказывает прямого воздействия на кроветворные стволовые клетки, а скорее воздействие M-CSF на размножение кроветворных стволовых клеток является опосредованным другими клетками, такими как (c-fms)-положительные клетки, или неким фактором, полученным из клеток.
В изобретении далее предлагается набор, содержащий M-CSF для культивирования Lin-отрицательных или слабоположительных клеток. Культуральный набор содержит M-CSF вместе с подходящим цитокином, среду и т.д., а потому подходит для ex vivo выращивания Lin-отрицательных или слабоположительных клеток.
Далее, поскольку, как указано ранее, M-CSF усиливает размножение клеток, которые сдержат кроветворные стволовые клетки, он может быть использован в качестве агента для усиления размножения кроветворных стволовых клеток. Агент для усиления размножения кроветворных стволовых клеток, содержащий M-CSF, может помимо M-CSF, включать подходящие цитокины и факторы роста. Если клеточная культура, в которую добавлен подобный агент для усиления размножения кроветворных стволовых клеток, обеспечивает эффективное ex vivo размножение кроветворных стволовых клеток, то клетки, размноженные из небольшого количества костного мозга в условиях ex vivo, или периферической крови или пуповинной крови могут быть использованы в качестве источника кроветворных стволовых клеток. Более того, если in vivo прямое введение M-CSF стимулирует значительное in vivo размножение кроветворных стволовых клеток, то даже небольшого количества кроветворных стволовых клеток будет достаточно для трансплантации, а если это так, то метод трансплантации пуповинной крови может быть применен не только для детей, но и для взрослых людей.
Краткое описание чертежей
На Фиг.1 показаны графики проточной цитометрии для популяции клеток, полученных из костного мозга мыши, в которые с помощью StemSepTM вводят метку смеси анти-Lin-антител. График "до обработки на колонке" показывает анализируемые результаты для популяции клеток, которые не проходили обработку на колонке MACS LS+; а график "после обработки на колонке" показывает анализируемые результаты для популяции клеток, которые проходили обработку на колонке. Очевидно, что обработка с помощью StemSepTM дает маркер дифференцировки Lin-отрицательных или слабоположительных клеток.
На фиг.2 показана активность M-CSF по усилению размножения клеток. Здесь столбец "процент донорных клеток" указывает в периферической крови мышей линии Ly5.2 пропорцию клеток, полученных из клеток мыши линии Ly5.1, для которых полученные из клеток мыши линии Ly5.1 Lin-отрицательные или слабоположительные клетки обрабатывают различными типами цитокинов, затем трансплантируют мышам линии Ly5.2, получившим смертельную дозу радиации, вместе с клетками, полученными от мышей линии Ly5.2, и периферическую кровь мышей линии Ly5.2 анализируют через 6 месяцев после трансплантации. "Свежий" означает, что обработка цитокином не проводилась; "SCF+IL-11+FLT" означает клеточную культуру с SCF, IL-11 и лигандом Flt-3 вместе с M-CSF; и "SCF+IL-11+TPO" означает клеточную культуру с SCF, IL-11 и TPO вместе с M-CSF.
На фиг.3 показана экспрессия различных маркеров дифференцировки лейкоцитов периферической крови мыши, для которой Lin-отрицательные или слабоположительные клетки культивировали с SCF, IL-11 и лигандом Flt-3 вместе с 10 нг/мл M-CSF, полученные клетки трансплантировали мышам, и периферическую кровь мыши анализировали через 6 месяцев после трансплантации. Если коротко, то лейкоциты периферической крови окрашивают различными биотинилированными антителами маркера дифференцировки и стрептоавидином, меченным фикоэритрином, затем дважды окрашивают противомышиным антителом линии Ly5.1, меченным флуоресцеинизотиоцианата (FITC), и затем анализируют методом проточной цитометрии. На чертеже по вертикальной оси показана интенсивность экспрессии маркера дифференцировки, Mac-1, Gr-1, B220 или CD3e; а по горизонтальной оси показана интенсивность экспрессии Ly5.1 (полученного из трансплантированных клеток).
Наилучший вариант осуществления изобретения
Изобретение описывается подробно со ссылкой на следующие примеры, которыми, тем не менее, изобретение не ограничивается.
Пример
Отбор клеток костного мозга
Клетки костного мозга отбирают из бедра и большеберцовой кости мыши линии C57BL/6J-Ly5.1 (Jackson Laboratories), суспендируют в сбалансированном солевом растворе Хенкса (Gibco-BRL) (далее обозначен как HBSS), который содержит 5% сыворотки плода коровы (FBS, Immunobiological Laboratory), и превращают в суспензию взвешенных клеток с помощью шприца емкостью 1 мл, снабженного иглой размера 22. Для удаления клеточных агрегатов суспензию фильтруют через нейлоновый фильтр с размером пор 40 мкм. Клетки отмывают центрифугированием в течение 5 мин со скоростью 1100 об/мин и вновь суспендируют в растворе HBSS, получая суспензию отдельных взвешенных клеток костного мозга.
Приготовление Lin-отрицательных или слабоположительных клеток
Используя StemSepTM (StemCell Technologies Inc.) для получения предшественников кроветворных клеток мыши, в соответствии с описанием к набору, получают дифференцировочный антиген-отирицательные или слабоположительные (Lin<слабоположительные) клетки. Сначала к суспензии отдельных клеток добавляют смесь биотинилированных антител против дифференцировочных антигентов и дают им возможность прореагировать при охлаждении льдом в течение 20 мин, затем промывают, используя HBSS, и центрифугируют в течение 5 мин со скоростью 1100 об/мин. Клетки вновь суспендируют в HBSS и для связывания биотинилированных антител добавляют к полученной суспензии смесь тетрамерных комплексов антител и дают им прореагировать при охлаждении льдом в течение 40 мин, затем добавляют магнитный коллоид и реакцию продолжают еще в течение 40 мин. Суспензию клеток пропускают через колонку MACS LS+(Miltenyi Biotec.), чтобы адсорбировать меченые клетки, и отбирают клетки, не содержащие метку. К части собранных клеток добавляют стрептавидин, меченный фикоэритрином (Pharmingen), и анализируют с помощью проточного цитофлуориметра EPICS-XL (Beckman Coulter). Как показано на фиг.1, собранные клетки представляют собой Lin<слабоположительные примитивные клеточные популяции.
Культура
Полученные указанным образом Lin<слабоположительные клетки высевают в 6-луночный микропланшет для выращивания клеточных культур (Iwaki) в количестве 4×104 клеток на лунку и культивируют в среде RPMI 1640 (Gibco-BRL), содержащей 5% FBS и 10 мкг/мл гентамицина (Sigma) в присутствии 5% CO2 при температуре 37°С. В качестве цитокина, который будет добавлен в культуру, используют SCF, IL-11, FLT и TPO, и их концентрация составляет 100 нг/мл. К полученной смеси добавляют M-CSF, с целью подтвердить производимый им эффект, и его конечная концентрация составляет 1, 10 или 100 нг/мл. Все использованные цитокины были получены от компании Pepro Tech. Inc.
Трансплантация выращенных клеток в мышь
После культивирования в течение 6 дней в присутствии цитокинов клетки отбирают из планшета с помощью пипетки. Клетки суспендируют в HBSS, к ним добавляют 106 свежих клеток костного мозга, полученных от мышей линии C57BL/6J-Ly5.2 (Nippon Clea), и центрифугируют в течение 5 мин со скоростью 1100 об/мин. Наконец, клетки суспендируют в 400 мкл 1 мМ раствора HBSS, содержащего HEPES, и трансплантируют через хвостовую вену мышам линии C57BL/6J-Ly5.2, получившим смертельную дозу радиации (800 рентген).
Определение лейкоцитов, продуцированных трансплантированными клетками
Через шесть месяцев после трансплантации из кончика хвоста каждой мыши отбирают около 25 мкл периферической крови через покрытый гепарином капилляр и немедленно суспендируют в 500 мкл фосфатного буфера (PBS(-); Gibco-BRL), содержащего 10 ед./мл гепарина. Супернатант удаляют центрифугированием в течение 5 мин со скоростью 1100 об/мин и клетки суспендируют в 500 мкл HBSS. Затем добавляют 10 мкл FITC-меченного антимышиного Ly5.1 (Pharmingen), который предварительно разбавляют в 10 раз с помощью PBS(-), и дают прореагировать в темноте при охлаждении льдом в течение 30 мин. Клетки отделяют центрифугированием в течение 5 мин со скоростью 1100 об/мин и затем суспендируют при комнатной температуре в 500 мкл раствора для гемолиза, содержащего 155 мМ хлорида аммония (NH4Cl), 10 мМ бикарбоната калия (KHCO3) и 0,1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Обработку гемолизом повторяют дважды. Клетки промывают, используя HBSS, и отделяют центрифугированием в течение 5 мин со скоростью 1100 об/мин, суспендируют в HBSS, содержащем 2 мкг/мл 7-аминоактиномицина D, 0,2% бычьего сывороточного альбумина, 0,05% азида натрия и 0,02% этилендиаминтетрауксусной кислоты, а затем анализируют с помощью проточного цитофлуориметра EPICS-XL.
Как показано на фиг.2, пропорция лейкоцитов, полученных из трансплантированных клеток, увеличилась в зависимости от концентрации M-CSF. Это может отражать возросшую в течение периода инкубации способность кроветворных стволовых клеток к самообновлению. Однако при бульших концентрациях M-CSF наблюдается супрессивное воздействие на способность к самообновлению, и становится понятным, что действие M-CSF на самообновление кроветворных стволовых клеток строго контролируется его концентрацией (фиг.2).
Полученные результаты оценивают количественно, как указано в таблице. Активность реконструкции костного мозга (единица репопуляции, RU), равная 106 клеток костного мозга, принята за единицу. На основе расчетной формулы, приведенной в таблице, сравнивают активности кроветворных стволовых клеток до и после культивирования с цитокинами по отношению к единице репопуляции (RU). Поскольку при прибавлении 10 нг/мл M-CSF единица репопуляции возрастает более чем в два раза, это экспериментально подтверждает, что M-CSF применим для размножения кроветворных стволовых клеток.
Если кроветворные стволовые клетки могут быть размножены в большей степени, как это показано выше, то может оказаться возможным сократить количество стволовых клеток, которое необходимо собрать для трансплантации кроветворных стволовых клеток. Благодаря наблюдаемому эффекту настоящее изобретение полезно с точки зрения обеспечения безопасности доноров.
| Таблица Влияние M-CSF на размножение кроветворных стволовых клеток |
|||
| % Ly5.1 | RU | Степень увеличения размножения | |
| Без обработки | 18,4±2,3 | 0,23 | 1,0 |
| SCF+IL-11+FLT | 27,2±1,1 | 0,37 | 1,6 |
| SCF+IL-11+FLT+M-CSF | 45,5±2,9 | 0,83 | 3,6 |
| SCF+IL-11+TPO | 31,2±9,8 | 0,45 | 2,0 |
| SCF+IL-11+TPO+M-CSF | 52,2±6,1 | 1,09 | 4,7 |
| RU=%Ly5.1/(100-%Ly5.1) | |||
Определение дифференцировочного антигена на лейкоцитах, полученных из трансплантированных клеток
Через шесть месяцев после трансплантации из кончика хвоста каждой мыши отбирают около 100 мкл периферической крови через покрытый гепарином капилляр и немедленно суспендируют в 2 мл фосфатного буфера (PBS(-); Gibco-BRL), содержащего 10 ед./мл гепарина, а затем разделяют на 4 части для окрашивания антигеном. Клетки промывают и суспендируют в 500 мкл HBSS, добавляют к ним биотинилированные антимышиные Mac-1, антимышиные Gr-1, антимышиные B220 или антимышиные CD3e (перечень линий мышей от компании Pharmingen), по 2 мкл на пробирку, в качестве антител против дифференцировочного антигена и реакцию антител проводят в течение 20 мин при охлаждении льдом. По окончании реакции клетки дважды промывают, используя HBSS, и вновь суспендируют в 500 мкл HBSS. Затем добавляют 0,5 мкл стрептавидина, меченного фикоэритрином (Pharmingen), и 1 мкл FITC-меченного антимышиного Ly5.1 (Pharmingen) и дают прореагировать в темноте при охлаждении льдом в течение 20 мин. Клетки отделяют центрифугированием в течение 5 мин со скоростью 1100 об/мин и затем суспендируют при комнатной температуре в 500 мкл раствора для гемолиза, содержащего 155 мМ хлорида аммония (NH4Cl), 10 мМ бикарбоната калия (KHCO3) и 0,1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты. Обработку гемолизом повторяют дважды. Клетки промывают, используя HBSS, отделяют центрифугированием в течение 5 мин со скоростью 1100 об/мин, суспендируют в HBSS, содержащем 2 мкг/мл 7-аминоактиномицина D, 0,2% бычьего сывороточного альбумина, 0,05% азида натрия и 0,02% этилендиаминтетрауксусной кислоты, и затем анализируют с помощью проточного цитофлуориметра EPICS-XL.
Как уже указывалось выше, кроветворные стволовые клетки обладают как способностью к самообновлению, так и способностью к дифференцировке в гемоциты всех типов. Если бы кроветворных стволовых клеток не было, гемоциты, полученные из трансплантированных клеток, исчезли бы приблизительно через 3 месяца после трансплантации клеток. Как показано на фиг.3, клетки, полученные из трансплантированных клеток (клеток, полученных из костного мозга мышей линии Ly5.1), которые экспрессируют дифференцировочный антиген миелоцитов и лимфоцитов, были обнаружены у подвергнутых трансплантации мышей через 6 месяцев после трансплантации. Это подтверждает тот факт, что трансплантированные популяции клеток содержали кроветворные стволовые клетки (фиг.3).
Хотя изобретение было детально описано со ссылкой на конкретный пример его осуществления, специалисту в данной области должно быть понятно, что в изобретение могут быть внесены различные изменения и модификации, которые не приводят к отступлению от сути или выходу за рамки настоящего изобретения.
Настоящая патентная заявка основана на заявке на патент Японии, поданной 30 октября 2001 года (номер заявки 2001-331940), содержание которой включено в данное описание в качестве ссылки.
Промышленное использование
Способ культивирования, способ размножения популяции кроветворных стволовых клеток, полученных указанными способами, набор для культивирования и агент для усиления размножения согласно изобретению позволяют осуществить размножение кроветворных стволовых клеток в условиях ex vivo и применимы для трансплантации кроветворных стволовых клеток. Далее, прямое введение агента для размножения позволяет провести трансплантацию клеток с уменьшенным количеством кроветворных стволовых клеток.
Claims (4)
1. Способ размножения кроветворных стволовых клеток путем культивирования полученных из костного мозга Lin-отрицательных или слабоположительных клеток в присутствии макрофагального колониестимулирующего фактора (M-CSF) в концентрации приблизительно от 5 до 20 нг/мл, вместе с композицией цитокинов, состоящей из SCF (фактор стволовых клеток), IL-11 (интерлейкин-11) и FLT (лиганд fms-подобная тирозинкиназа) или ТРО (тромбоцитопоэтин), при этом указанные цитокины используют в весовом соотношении 1-4 (M-CSF):20 (SCF):20 (IL-11):20 (FLT или ТРО).
2. Популяция кроветворных стволовых клеток из костного мозга, полученная способом по п.1, в качестве источника для трансплантации кроветворных стволовых клеток.
3. Композиция для усиления размножения кроветворных стволовых клеток в полученных из костного мозга Lin-отрицательных или слабоположительных клеток, содержащая цитокины M-CSF:SCF:IL-11:(FLT или ТРО) в весовом соотношении 1-4:20:20:20.
4. Набор для размножения кроветворных стволовых клеток в полученных из костного мозга Lin-отрицательных или слабоположительных клеток, содержащий цитокины M-CSF:SCF:IL-11:(FLT или ТРО) в весовом соотношении 1-4:20:20:20.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001-331940 | 2001-10-30 | ||
| JP2001331940 | 2001-10-30 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2004113375A RU2004113375A (ru) | 2005-03-27 |
| RU2297451C2 true RU2297451C2 (ru) | 2007-04-20 |
Family
ID=19147435
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2004113375/13A RU2297451C2 (ru) | 2001-10-30 | 2002-10-30 | Способ размножения кроветворных стволовых клеток |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20040248295A1 (ru) |
| EP (1) | EP1445311A4 (ru) |
| JP (1) | JPWO2003038077A1 (ru) |
| KR (1) | KR20050042046A (ru) |
| CN (1) | CN1606615A (ru) |
| CA (1) | CA2465001A1 (ru) |
| NO (1) | NO20041737L (ru) |
| RU (1) | RU2297451C2 (ru) |
| WO (1) | WO2003038077A1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2410116C2 (ru) * | 2007-09-13 | 2011-01-27 | Олег Ильич Эпштейн | Лекарственное средство для стимуляции продукции стволовых клеток в костном мозге |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL162648A0 (en) * | 2001-12-21 | 2005-11-20 | Mount Sinai Hospital Corp | Cellular compositions and methods of making and using them |
| WO2006006948A2 (en) * | 2002-11-14 | 2006-01-19 | Dharmacon, Inc. | METHODS AND COMPOSITIONS FOR SELECTING siRNA OF IMPROVED FUNCTIONALITY |
| EP1756267A2 (en) | 2004-05-14 | 2007-02-28 | Becton, Dickinson and Company | Stem cell populations and methods of use |
| CA2579292A1 (en) * | 2004-09-03 | 2006-03-23 | The Scripps Research Institute | Isolated lineage negative hematopoietic stem cells and methods of treatment therewith |
| WO2008073748A1 (en) * | 2006-12-08 | 2008-06-19 | University Of Rochester | Expansion of hematopoietic stem cells |
| US20110158955A1 (en) * | 2008-03-11 | 2011-06-30 | Yoshimoto Katsura | Method for producing cells having characteristic of hematopoietic stem cells/progenitor cells |
| US8554579B2 (en) | 2008-10-13 | 2013-10-08 | Fht, Inc. | Management, reporting and benchmarking of medication preparation |
| EP3779876B1 (en) | 2012-10-26 | 2025-06-18 | Baxter Corporation Englewood | Improved image acquisition for medical dose preparation system |
| EP2911641B1 (en) | 2012-10-26 | 2018-10-17 | Baxter Corporation Englewood | Improved work station for medical dose preparation system |
| KR101350144B1 (ko) | 2013-05-03 | 2014-01-10 | 재단법인 통합의료진흥원 | 팔물탕 추출물을 포함하는 골수유래 줄기세포 증식 촉진용 조성물 |
| US11107574B2 (en) | 2014-09-30 | 2021-08-31 | Baxter Corporation Englewood | Management of medication preparation with formulary management |
| EP3779858B1 (en) | 2014-10-24 | 2023-08-09 | Baxter Corporation Englewood | Automated exchange of healthcare information for fulfillment of medication doses |
| AU2015358483A1 (en) | 2014-12-05 | 2017-06-15 | Baxter Corporation Englewood | Dose preparation data analytics |
| CA2978455A1 (en) | 2015-03-03 | 2016-09-09 | Baxter Corporation Englewood | Pharmacy workflow management with integrated alerts |
| CN105713870A (zh) * | 2016-03-04 | 2016-06-29 | 佰通生物技术(苏州)有限公司 | 一种基于集落刺激因子1对干细胞的活化方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2164240C2 (ru) * | 1990-12-17 | 2001-03-20 | Риджентс оф дзе Юниверсити оф Мичиган | Способ культивирования, фибробласт, способ отделения клеток |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0953354A4 (en) * | 1996-08-13 | 2002-10-23 | Fujisawa Pharmaceutical Co | HEMATOPOIETIC STEM CELLS PROLIFERING ACTIVE SUBSTANCES |
-
2002
- 2002-10-30 RU RU2004113375/13A patent/RU2297451C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2002-10-30 EP EP02802244A patent/EP1445311A4/en not_active Withdrawn
- 2002-10-30 JP JP2003540342A patent/JPWO2003038077A1/ja active Pending
- 2002-10-30 CN CNA028256204A patent/CN1606615A/zh active Pending
- 2002-10-30 CA CA002465001A patent/CA2465001A1/en not_active Abandoned
- 2002-10-30 KR KR1020047006624A patent/KR20050042046A/ko not_active Withdrawn
- 2002-10-30 WO PCT/JP2002/011317 patent/WO2003038077A1/ja not_active Ceased
- 2002-10-30 US US10/493,890 patent/US20040248295A1/en not_active Abandoned
-
2004
- 2004-04-28 NO NO20041737A patent/NO20041737L/no not_active Application Discontinuation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2164240C2 (ru) * | 1990-12-17 | 2001-03-20 | Риджентс оф дзе Юниверсити оф Мичиган | Способ культивирования, фибробласт, способ отделения клеток |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| TANAKA-DOUZONO M. et al. Detection of murine adult bone marrow stromainitiating cells in Lin(-)c-fms(+)c-kit(low)VCAM-1(+) cells. J. Cell. Physiol. 2001, v.189, n.1. p.45-53. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2410116C2 (ru) * | 2007-09-13 | 2011-01-27 | Олег Ильич Эпштейн | Лекарственное средство для стимуляции продукции стволовых клеток в костном мозге |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1445311A4 (en) | 2005-01-12 |
| JPWO2003038077A1 (ja) | 2005-02-24 |
| EP1445311A1 (en) | 2004-08-11 |
| US20040248295A1 (en) | 2004-12-09 |
| CN1606615A (zh) | 2005-04-13 |
| RU2004113375A (ru) | 2005-03-27 |
| WO2003038077A1 (fr) | 2003-05-08 |
| NO20041737L (no) | 2004-07-30 |
| KR20050042046A (ko) | 2005-05-04 |
| CA2465001A1 (en) | 2003-05-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2297451C2 (ru) | Способ размножения кроветворных стволовых клеток | |
| US8481315B2 (en) | Methods of expanding myeloid cell populations and uses thereof | |
| Ehring et al. | Expansion of HPCs from cord blood in a novel 3D matrix | |
| US7919316B2 (en) | Hematopoietic stem cell identification and isolation | |
| Issarachai et al. | Cells with hemopoietic potential residing in muscle are itinerant bone marrow–derived cells | |
| US20070134794A1 (en) | Strategies for the identification and isolation of cancer stem cells and non-cancerous stem cells | |
| JP2006525013A (ja) | 血液幹細胞の数の増幅のための装置および方法 | |
| RU2757818C2 (ru) | Способы и композиции для трансплантации стволовых клеток | |
| CN114075547A (zh) | 扩增造血干细胞的方法及其组合物 | |
| JP2007511219A5 (ru) | ||
| WO2008056963A1 (en) | Method for proliferating stem cells with leptin | |
| Dumont et al. | Medium conditioned with mesenchymal stromal cell–derived osteoblasts improves the expansion and engraftment properties of cord blood progenitors | |
| TWI757709B (zh) | 含有nk細胞之細胞集團之製造方法 | |
| US20080095746A1 (en) | Process For Producing Hematopoietic Stem Cells Or Vascular Endothelial Precursor Cells | |
| Herrera et al. | Early‐acting cytokine‐driven ex vivo expansion of mobilized peripheral blood CD34+ cells generates post‐mitotic offspring with preserved engraftment ability in non‐obese diabetic/severe combined immunodeficient mice | |
| Ogawa et al. | In vitro expansion of hematopoietic stem cells | |
| US20060084170A1 (en) | Cytokine-free growth and maintenance of progenitor cells | |
| JPWO2004005496A1 (ja) | 臍帯血、骨髄、末梢血等に含まれる新規な未分化幹細胞集団 | |
| JP2006067858A (ja) | 共培養による造血幹細胞の増幅方法 | |
| HK1073131A (en) | Method of amplyfying hematopoietic stem cells | |
| Grušanović | Identification and characterization of novel regulators of hematopoietic stem cell function | |
| Horwitz | Sources of human and murine hematopoietic stem cells | |
| JP2004201574A (ja) | 造血幹細胞活性化マーカー | |
| Muench et al. | In vitro development of megakaryocytes and platelets | |
| Engelhardt et al. | Progenitor cell expansion-Hematopoietic recovery of ex vivo perfusion culture expanded bone marrow and unexpanded peripheral blood progenitors after myeloablative chemotherapy |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20081031 |