RU2294923C2 - Новое противогрибковое соединение 2-(3,4-диметил-2,5-дигидро-1h-пиррол-2-ил)-1-метилэтила пентаноат - Google Patents
Новое противогрибковое соединение 2-(3,4-диметил-2,5-дигидро-1h-пиррол-2-ил)-1-метилэтила пентаноат Download PDFInfo
- Publication number
- RU2294923C2 RU2294923C2 RU2003107051/04A RU2003107051A RU2294923C2 RU 2294923 C2 RU2294923 C2 RU 2294923C2 RU 2003107051/04 A RU2003107051/04 A RU 2003107051/04A RU 2003107051 A RU2003107051 A RU 2003107051A RU 2294923 C2 RU2294923 C2 RU 2294923C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- compound
- antifungal
- chloroform
- cytotoxicity
- dihydro
- Prior art date
Links
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 title claims abstract description 78
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 title claims abstract description 52
- -1 compound 2-(3,4-dimethyl-2,5-dihydro-1h-pyrrole-2-yl)-1-methylethyl pentanoate Chemical class 0.000 title claims abstract description 25
- WVKNDJSJSSMXDJ-UHFFFAOYSA-N 2-(3,4-dimethyl-2,5-dihydro-1H-pyrrol-2-yl)-1-methylethyl pentanoate Natural products CCCCC(=O)OC(C)CC1NCC(C)=C1C WVKNDJSJSSMXDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 12
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 144
- 240000007175 Datura inoxia Species 0.000 claims abstract description 14
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 10
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 3
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 56
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical group OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 54
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 32
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 30
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical group CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 25
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 claims description 25
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 claims description 17
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 claims description 17
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 claims description 17
- 230000037396 body weight Effects 0.000 claims description 16
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 claims description 15
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 claims description 15
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 14
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000002036 chloroform fraction Substances 0.000 claims description 11
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 11
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 10
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N diethylamine Chemical compound CCNCC HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 9
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 claims description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 7
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 claims description 7
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 claims description 6
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 claims description 6
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 5
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 claims description 5
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 claims description 5
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 claims description 5
- 238000004566 IR spectroscopy Methods 0.000 claims description 4
- 150000001338 aliphatic hydrocarbons Chemical class 0.000 claims description 4
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims description 4
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims description 4
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 claims description 4
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 3
- 238000005100 correlation spectroscopy Methods 0.000 claims description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 claims description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000004992 fast atom bombardment mass spectroscopy Methods 0.000 claims description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 2
- 239000002674 ointment Substances 0.000 claims description 2
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 claims description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 2
- 239000006188 syrup Substances 0.000 claims description 2
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000003826 tablet Substances 0.000 claims description 2
- 238000010170 biological method Methods 0.000 claims 1
- 150000002391 heterocyclic compounds Chemical class 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 17
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 11
- 239000000417 fungicide Substances 0.000 abstract 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 39
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 32
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 23
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 23
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 22
- NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-N valeric acid Chemical compound CCCCC(O)=O NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 241001225321 Aspergillus fumigatus Species 0.000 description 15
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 13
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 13
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 13
- 230000004763 spore germination Effects 0.000 description 13
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 12
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 11
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 10
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 9
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 9
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 8
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 8
- 239000000401 methanolic extract Substances 0.000 description 8
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 8
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 8
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 8
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 7
- 230000009471 action Effects 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 7
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 7
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 6
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 239000012449 sabouraud dextrose agar Substances 0.000 description 6
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 6
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 6
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 5
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 5
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 5
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 5
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 5
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 5
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 230000000855 fungicidal effect Effects 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 4
- 238000012746 preparative thin layer chromatography Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 4
- 241000228197 Aspergillus flavus Species 0.000 description 3
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 3
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 3
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 3
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 3
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 3
- 150000004291 polyenes Chemical class 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RSEBUVRVKCANEP-UHFFFAOYSA-N 2-pyrroline Chemical group C1CC=CN1 RSEBUVRVKCANEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000002909 Aspergillosis Diseases 0.000 description 2
- 208000036641 Aspergillus infections Diseases 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 2
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 2
- 241000208292 Solanaceae Species 0.000 description 2
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 2
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 2
- 150000003851 azoles Chemical class 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 2
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 description 2
- 239000002035 hexane extract Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 201000009085 invasive aspergillosis Diseases 0.000 description 2
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 2
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 2
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 2
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- XMAYWYJOQHXEEK-OZXSUGGESA-N (2R,4S)-ketoconazole Chemical compound C1CN(C(=O)C)CCN1C(C=C1)=CC=C1OC[C@@H]1O[C@@](CN2C=NC=C2)(C=2C(=CC(Cl)=CC=2)Cl)OC1 XMAYWYJOQHXEEK-OZXSUGGESA-N 0.000 description 1
- FUFLCEKSBBHCMO-UHFFFAOYSA-N 11-dehydrocorticosterone Natural products O=C1CCC2(C)C3C(=O)CC(C)(C(CC4)C(=O)CO)C4C3CCC2=C1 FUFLCEKSBBHCMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000228257 Aspergillus sp. Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010051597 Cerebral aspergillosis Diseases 0.000 description 1
- MFYSYFVPBJMHGN-ZPOLXVRWSA-N Cortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3C(=O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MFYSYFVPBJMHGN-ZPOLXVRWSA-N 0.000 description 1
- MFYSYFVPBJMHGN-UHFFFAOYSA-N Cortisone Natural products O=C1CCC2(C)C3C(=O)CC(C)(C(CC4)(O)C(=O)CO)C4C3CCC2=C1 MFYSYFVPBJMHGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ITRJWOMZKQRYTA-RFZYENFJSA-N Cortisone acetate Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@@](C(=O)COC(=O)C)(O)[C@@]1(C)CC2=O ITRJWOMZKQRYTA-RFZYENFJSA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 241000228402 Histoplasma Species 0.000 description 1
- 208000001953 Hypotension Diseases 0.000 description 1
- 231100000002 MTT assay Toxicity 0.000 description 1
- 238000000134 MTT assay Methods 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 206010062237 Renal impairment Diseases 0.000 description 1
- 206010038687 Respiratory distress Diseases 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 1
- 150000003797 alkaloid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000012458 antifungal assay Methods 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- 150000007980 azole derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000005889 cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- XMLNCADGRIEXPK-KUMOIWDRSA-M chembl2146143 Chemical class [Br-].O([C@H]1C[C@H]2CC[C@@H](C1)[N+]2(C)C)C(=O)C(CO)C1=CC=CC=C1 XMLNCADGRIEXPK-KUMOIWDRSA-M 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000000973 chemotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002026 chloroform extract Substances 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 229960004544 cortisone Drugs 0.000 description 1
- 229960003290 cortisone acetate Drugs 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 239000003145 cytotoxic factor Substances 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 231100000371 dose-limiting toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000002143 fast-atom bombardment mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- RFHAOTPXVQNOHP-UHFFFAOYSA-N fluconazole Chemical compound C1=NC=NN1CC(C=1C(=CC(F)=CC=1)F)(O)CN1C=NC=N1 RFHAOTPXVQNOHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004884 fluconazole Drugs 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 210000004051 gastric juice Anatomy 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 239000011491 glass wool Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 150000008282 halocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002044 hexane fraction Substances 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- AKPUJVVHYUHGKY-UHFFFAOYSA-N hydron;propan-2-ol;chloride Chemical compound Cl.CC(C)O AKPUJVVHYUHGKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002218 hypoglycaemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036543 hypotension Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 229960004125 ketoconazole Drugs 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Chemical class 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000003808 methanol extraction Methods 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000988 nystatin Drugs 0.000 description 1
- VQOXZBDYSJBXMA-NQTDYLQESA-N nystatin A1 Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/CC/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 VQOXZBDYSJBXMA-NQTDYLQESA-N 0.000 description 1
- JRZJOMJEPLMPRA-UHFFFAOYSA-N olefin Natural products CCCCCCCC=C JRZJOMJEPLMPRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 235000017807 phytochemicals Nutrition 0.000 description 1
- 229930000223 plant secondary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 231100000857 poor renal function Toxicity 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 238000004544 sputter deposition Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- XLRPYZSEQKXZAA-OCAPTIKFSA-N tropane Chemical group C1CC[C@H]2CC[C@@H]1N2C XLRPYZSEQKXZAA-OCAPTIKFSA-N 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Изобретение относится к новому противогрибковому соединению 2-(3,4-диметил-2,5-дигидро-1Н-пиррол-2-ил)-1-метилэтила пентаноату формулы I
которое получают из растения Datura metel. Соединение проявляет противогрибковую активность, что позволяет использовать его в фармацевтической композиции. 3 н. и 13 з.п. ф-лы, 13 ил., 3 табл.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к новому противогрибковому соединению 2-(3,4-диметил-2,5-дигидро-1Н-пиррол-2-ил)-1-метилэтила пентаноату формулы (I). Более конкретно, изобретение относится к новому противогрибковому соединению, выделенному из растения Datura metel.
Основная цель настоящего изобретения состоит в создании нового соединения для разработки новых лекарственных средств лечения заболеваний, вызванных действием патогенных грибков.
Описание уровня техники
В течение нескольких последних десятилетий отмечается рост заболеваемости и смертности от грибковых инфекций (Saral R., 1991, Rev. Inf. Dis., 13, 487-492, Koll B.S and Brown A.E., 1993, Clin. Inf. Dis., 17, S-322-S-326). Все в большей степени признается, что инфекции, индуцируемые указанными разновидностями, представляют угрозу общественному здравоохранению. В организме человека с ослабленной иммунной системой инфекции, вызываемые действием Aspergillus, Candida, Histoplasma и др., становятся инвазивными и распространяются от первичного очага инфекции в другие части организма, включающие кишки, почки, мозг и т.п. Сообщается, что инвазивный аспергиллез является причиной смертности в 55% случаев (Denning D.W. and Stevens D.A., 1990, Rev. Inf. Dis., 12, 1147-1201). Несмотря на соответствующее химиотерапевтическое лечение, смертность реципиентов, перенесших трансплантацию костного мозга, от инфицирования Aspergillus достигает 80% (Meyer J.D., 1990, Semin. Oncol., 17 (suppl. 6) 10-13). Церебральный аспергиллез дает симптомы острого менингита и всегда имеет фатальные последствия. Вид Candida относится к коменсальным микроорганизмам слизистых поверхностей кожи человека. Однако в организме человека с ослабленной иммунной системой Candida способна прогрессировать, превращаясь при благоприятных условиях в потенциальный патоген. Эта разновидность может передаваться путем контакта другим пациентам с ослабленной иммунной системой в виде нозокомиального патогена.
В связи со сказанным выше, для предотвращения необратимого поражения, важно диагностировать и начинать лечение рассматриваемых грибковых инфекций на ранней стадии заболевания. В литературе описано применение некоторых соединений, принадлежащих к азолам, полиенам и другим группам химических веществ, для лечения микозов. Однако все указанные вещества имеют ограничения, касающиеся их применения.
Полиены относятся к давно известным и наиболее часто назначаемым противогрибковым агентам. Амфотерицин В является важным полиеновым лекарственным средством, обладающим широким спектром противогрибковой активности, однако его применение в терапии часто связано с таким побочным действием, как тяжелые лихорадочные состояния, жар, рвота, гипотензия с угрозой жизни и расстройство дыхания. Амфотерицин В вызывает нарушение функции почек (Allende M.C., Lee J.W., Francis P., Garrett K., Dollenberg H., Berenguer J., Lyman C.A., Pizzo P.A. and Walsh T.J. 1994, Antimicrob. Agents and Chemother. 38, 518-522) и возможность его внутривенного применения крайне ограничена (Stevens D.A. and Lee J.Y., 1997, Arch. Int. Med., 57, 1857-1862). Помимо наличия побочных эффектов, сообщается о резистентности некоторых видов грибков к амфотерицину В (Gokhale P.C., Kshirsagar N.A. and Pandya S.K., 1993, Current Science 65(6), 448-454, Forthergill A.W. and McGough D.A., 1995, Clin. Microbiol. Procedure Handbook, In vitro susceptibility Testing of Yeast, 5.15.1-5.15.15).
Другим важным лекарственным средством является нистатин, однако, развитие резистентности и токсичность, ограничивающая дозу, снижают полезное действие этого препарата (Forthergill A.W. and McGough A.W.,1995, Clin. Microbiol. Procedure Handbook, In Vitro susceptibility Testing of Yeasts 5.15.1-5.15.15).
Создание таких новых противогрибковых препаратов, как кетоконазол, флюконазол и итраконозол, позволило надеяться, что эти лекарственные средства окажутся полезными для профилактики и лечения грибковых инфекций. Однако эти надежды не оправдались из-за токсического действия на печень, гипогликемической природы таких препаратов и развития устойчивых грибковых штаммов (Denning D.W., Tucker R.M., Hanson L.H., Hamilton J.R. and Stevens D.A., 1989, Arch. Int. Med., 149, 2301-2308). Сообщается о том, что азолы уменьшают секрецию желудочного сока и вследствие этого понижают всасываемость как самого лекарства, так и других важных биомолекул. Эти эффекты могут столь сильно понижать уровень содержания глюкозы, что возникает угроза жизни. Также имеются сообщения о резистентности некоторых грибков к действию производных азола (Forthergill A.W. and McGough A.W., 1995, Clin. Microbiol. Procedure Handbook, In Vitro susceptibility Testing of Yeasts 5.15.1-5.15.14).
Выпускаемые в настоящее время противогрибковые лекарственные средства не обладают достаточно широким спектром действия и, соответственно, недостаточно эффективны в отношении различных грибков, включая вид Aspergilli. Эти лекарственные средства по своей природе обладают токсичным или иммуносупрессорным действием. Имеются также сообщения о том, что у грибков развивается устойчивость к действию большинства доступных лекарственных препаратов.
Из сказанного выше следует, что необходима разработка новых противогрибковых лекарственных средств, которым не присущи перечисленные выше недостатки. Новизна настоящего изобретения состоит в разработке способа выделения и идентификации нового противогрибкового лидирующего соединения из Datura metel, во много раз менее цитотоксичного, чем такие стандартные противогрибковые лекарства, как амфотерицин В.
Цель изобретения
Основная цель настоящего изобретения заключается в разработке нового противогрибкового соединения 2-(3,4-диметил-2,5-дигидро-1Н-пиррол-2-ил)-1'-метилэтила пентаноата с целью создания новых лекарственных средств против патогенных грибков.
Другая цель настоящего изобретения состоит в разработке способа выделения нового противогрибкового соединения 2-(3,4-диметил-2,5-дигидро-1Н-пиррол-2-ил)-1'-метилэтила пентаноата из Datura metel.
Еще одна цель настоящего изобретения заключается в разработке способа тестирования нового соединения, 2-(3,4-диметил-2,5-дигидро-1Н-пиррол-2-ил)-1'-метилэтила пентаноата, на противогрибковую активность.
Другая цель изобретения состоит в разработке способов применения нового соединения, 2-(3,4-диметил-2,5-дигидро-1Н-пиррол-2-ил)-1'-метилэтила пентаноата, в качестве противогрибкового агента.
Еще одна цель настоящего изобретения состоит в создании нового противогрибкового соединения, 2-(3,4-диметил-2,5-дигидро-1Н-пиррол-2-ил)-1'-метилэтила пентаноата, которое в 57,8 раз менее цитотоксично, чем такой стандартный противогрибковый препарат, как амфотерицин В.
Краткое изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к новому противогрибковому соединению, 2-(3,4-диметил-2,5-дигидро-1Н-пиррол-2-ил)-1'-метилэтила пентаноату, имеющему приведенную ниже формулу (I).
Это соединение обладает противогрибковыми свойствами и в несколько раз менее цитотоксично, чем стандартные противогрибковые лекарственные средства. Рассматриваемое соединение может применяться для борьбы с системными и поверхностными грибковыми инфекционными заболеваниями людей, оказывая при этом минимальное токсическое действие. Такое соединение выделено из легкодоступного растения Datura metel.
Краткое описание чертежей
Фиг.1: фотография пластины с результатами ТСХ активных колоночных субфракций и очищенного соединения.
Фиг.2: профиль ВЭЖХ соединения, очищенного методом ТСХ.
Фиг.3: Фотография результатов ТСХ соединения, очищенного методом ВЭЖХ.
Фиг.4: профиль ВЭЖХ очищенного соединения.
Фиг.5: ингибирование роста А. fumigatus действием очищенного соединения.
Фиг.6: график, отражающий процент ингибирования прорастания спор при действии соединения на вид Aspergillus.
Фиг.7: УФ-спектр соединения.
Фиг.8: ИК-спектр соединения.
Фиг.9: масс-спектр соединения.
Фиг.10: ЯМР-спектр соединения.
Фиг.11: COSY-спектр соединения.
Фиг.12: процент цитотоксичности соединения.
Фиг.13: Доза, требующаяся для защиты 50% животных (ED50) после лечения РС-1.
Подробное описание изобретения
В соответствии с настоящим изобретением представлено новое противогрибковое соединение 2-(3,4-диметил-2,5-дигидро-1Н-пиррол-2-ил)-1'-метилэтила пентаноат формулы I:
В соответствии с одним из воплощений изобретения идентификацию активного противогрибкового соединения осуществляли такими известными аналитическими методами, как ТСХ, окрашивание реагентами, специфическими в отношении определенных групп, УФ, ИК, масс и ЯМР спектроскопия, а также с помощью таких биологических анализов, как анализ на противогрибковую активность и анализ на цитотоксичность.
В соответствии с другим воплощением настоящего изобретения новое противогрибковое соединение 2-(3,4-диметил-2,5-дигидро-1Н-пиррол-2-ил)-1'-метилэтила пентаноат представляет собой гетероциклический алкалоид, о чем свидетельствуют данные окрашивания реагентами, специфическими в отношении определенных групп, с использованием реагента Драгендорфа, имеющий следующие характеристики:
значение Rf в анализе методом ТСХ, равное 0,22 (фиг.3),
максимумы поглощения в УФ-спектре при длинах волн 300 нм и 206 нм (фиг.7),
ИК-спектр νmax: 3434 (NH), 3024, 1711 (сложный эфир), 1646 (С=С), 1524, 1426, 1230, 938, 760 см-1 (фиг.8).
+ve FABMS: m/z 239 [M]+ (C14H25O2N) (16,3), 212 (13,2), 174 (16,2), 122 (34,2), 102 (96,4), 58 (100) и 57 (19,2) (фиг.9).
1Н ЯМР (CDCl3):δ 4,15 (1Н, м, С1'-H), 3,75 (1Н, м, С2-Н), 3,17 (2Н, дд, J=7,44 Гц, 7,44 Гц, C5-Нa и C5-Hb), 2,31 (1H, т, J=6,48 Гц, C2"-Ha), 1,95 (1H, м, C2"-Hb), 1,62 (6H, шир., C6-CH3 и C7-CH3), 1,42 (1H, д, J=6,96 Гц, C2'-Ha), 1,35 (1H, д, J=7,28 Гц, C2'-Hb), 1,25 (7H, шир., C1'-CH3, C3"-Ha, C3-Hb, C4"-Ha и C4"-Hb), 0,87 (3H, т, J=5,96 Гц, C5"-CH3) и COSY спектр (фиг.11).
Минимальная ингибирующая концентрация (МИК) указанного нового противогрибкового соединения составляет 5,0 мкг/диск согласно данным анализа диффузии на диске (фиг.5) и 87,5 мкг/мл по данным ингибирования прорастания спор (фиг.6), соответственно.
Цитотоксичная доза для 50% клеток (СТ50) указанного противогрибкового соединения составляет 889,2 мкг/мл (фиг.12).
ED50 указанного противогрибкового соединения составляет 167,0 мг/кг веса тела (фиг.13).
Эффективная противогрибковая доза рассматриваемого вещества составляет 100-400 мг/кг веса тела (таблица 3).
В соответствии с другим воплощением новое противогрибковое соединение в 57,8 раз менее цитотоксично, чем стандартные противогрибковые лекарственные препараты.
Согласно еще одному воплощению предусматривается способ лечения, в котором доза 2-(3,4-диметил-2,5-дигидро-1Н-пиррол-2-ил)-1-метилэтила пентаноата, эффективная для выживания 50% (ED50) указанных объектов, составляет 167,0 мг/кг веса тела (фиг.13).
В соответствии с другим воплощением защитная in vivo эффективная доза противогрибкового соединения, 2-(3,4-диметил-2,5-дигидро-1Н-пиррол-2-ил)-1'-метилэтила пентаноата, для указанного объекта составляет 100-400 мг/кг веса тела (таблица 3).
Другое воплощение настоящего изобретения предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую приемлемое количество указанного выше 2-(3,4-диметил-2,5-дигидро-1Н-пиррол-2-ил)-1'-метилэтила пентаноата, а также фармацевтически приемлемые добавки и адъюванты.
В соответствии с другим воплощением приемлемые добавки выбирают из группы пищевых добавок, представляющих собой фармацевтически приемлемый носитель.
Согласно еще одному воплощению новое противогрибковое соединение можно применять в виде таблеток, капсул, сиропа, порошка, геля, мази и путем инъекции.
Еще одно воплощение изобретения предусматривает фармацевтически приемлемую композицию, содержащую эффективное количество нового соединения с концентрацией в интервале 100-400 мг/мл.
В соответствии с другим воплощением предусматривается способ лечения грибковых инфекций у указанного объекта, включающий стадии введения эффективного количества 2-(3,4-диметил-2,5-дигидро-1Н-пиррол-2-ил)-1'-метилэтила пентаноата пероральным, назальным, внутривенным, внутрибрюшинным, внутримышечным и другими путями.
В другом воплощении эффективная доза 2-(3,4-диметил-2,5-дигидро-1Н-пиррол-2-ил)-1'-метилэтила пентаноата может составлять 100-400 мг/кг веса тела.
Еще одно воплощение изобретения относится к способу выделения нового противогрибкового соединения, 2-(3,4-диметил-2,5-дигидро-1Н-пиррол-2-ил)-1'-метилэтила пентаноата, из растения, Datura metel, включающему (i) экстракцию измельченного в порошок растения Datura metel органическим растворителем при температуре в интервале 15-45°С, (ii) удаление растворителя с образованием остатка, (iii) экстракцию остатка со стадии (ii) алифатическим углеводородным растворителем с последующей экстракцией хлороформом, (iv) удаление хлороформа из хлороформной фракции со стадии (iii), (v) скрининг остатка со стадии (iv), полученного из хлороформной фракции, на противогрибковую активность, (vi) выделение и очистку нового противогрибкового соединения из активной фунгицидной хлороформной фракции с использованием традиционных методов хроматографии и (vii) анализ указанного очищенного соединения на противогрибковую активность и цитотоксичность.
Еще одно воплощение настоящего изобретения отличается тем, что растворитель, используемый для экстракции, выбирают из группы, состоящей из спиртового растворителя, кетонного растворителя и/или галогенированного углеводорода.
В соответствии с другим воплощением изобретения, растворитель для экстракции предпочтительно выбирать из группы, состоящей из метанола, этанола, ацетона и хлороформа.
Другое воплощение изобретение отличается тем, что используемый алифатический углеводородный растворитель выбирают из гексана, петролейного эфира.
Согласно еще одному воплощению соединение очищают методом колоночной или тонкослойной хроматографии (ТСХ), а также высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
В соответствии с еще одним воплощением изобретения очистку нового соединения можно проводить методом тонкослойной хроматографии с использованием систем растворителей, выбранных из смеси хлороформ : ацетон : диэтиламин (5,0:4,0:1,0), хлороформ : метанол : диэтиламин (8,5:1,5:0,1) и хлороформ : метанол : муравьиная кислота (8,0:2,0:0,1) или различных комбинаций из указанных выше органических растворителей.
В соответствии с другим воплощением изобретения очистку нового соединения можно проводить методом ВЭЖХ с использованием системы растворителей, состоящей из ацетонитрила и воды в соотношении 70:30 и хроматографической колонки RP-8 с обращенной фазой.
Согласно другому воплощению изобретения идентификацию активного противогрибкового соединения проводят такими известными аналитическими методами, как ТСХ, групповое окрашивание, УФ-, ИК-, масс- и ядерно-магнитная резонансная спектроскопия, а также с помощью таких биологических анализов, как анализ на противогрибковую активность и цитотоксичность.
В соответствии с другим воплощением изобретения предусматривается способ тестирования нового соединения, 2-(3,4-диметил-2,5-дигидро-1Н-пиррол-2-ил)-1'-метилэтила пентаноата, на противогрибковую активность.
Согласно другому воплощению настоящего изобретения тест на фунгицидную активность может проводиться после каждой стадии очистки с помощью таких известных способов, как разбавление в микробульоне (MD), диффузия на диске (DD) ингибирование прорастания спор (SGI).
Очистка соединения
Настоящее изобретение предусматривает новое противогрибковое соединение, 2-(3,4-диметил-2,5-дигидро-1Н-пиррол-2-ил)-1'-метилэтила пентаноат, и способ его выделения. Главным образом, изобретение относится к выделению нового противогрибкового соединения из природных источников.
(i) Приготовление метанольного экстракта
Растительный материал Datura metel (Solanaceae) собирали в течение месяца в период апреля/мая вблизи железнодорожной станции Kishanganj, Delhi, India. Достоверность идентификации растительного материала подтверждена в Hamdard College of Pharmacy, New Delhi, где хранится контрольный образец. Свежесобранный растительный материал, находящийся в хорошо проветриваемой упаковке, сушили в тени. Высушенный материал измельчали в порошок и экстрагировали метанолом. Все экстракты, полученные в ходе четырех циклов экстракции метанолом, сливали и выпаривали досуха при пониженном давлении и температуре 45°С в роторном испарителе Rotavapor R-114 (Buchi), соединенном с водяной баней Waterbath B-480 (Buchi). Полученный остаток хранили при 4°С до применения. Метанольный экстракт исследовали на наличие противогрибковой активности против вида Aspergillus. Экстракт с противогрибковой активностью подвергали дополнительному фракционированию с целью выделения активного противогрибкового компонента.
(ii) Фракционирование метанольного экстракта Datura metel
Компоненты сырого метанольного препарата фракционировали по модифицированному способу Harbourne (Harbourne J.B., 1997, Phytochemical Methods, Chapman and Hall, London, pp.1-5). Метанольный экстракт последовательно экстрагировали гексаном, хлороформом и ацетоном. Вначале метанольный экстракт четырежды экстрагировали гексаном. Все четыре гексановых экстракта сливали и растворитель выпаривали с помощью Rotavapor R-114 (Buchi). Сухие фракции собирали и хранили при 4°С до последующего применения. Остаток после экстракции гексаном подвергали ступенчатой четырехкратной экстракции хлороформом и ацетоном с получением хлороформной и ацетоновой фракций. Оставшийся материал растворяли в метаноле. Растворители выпаривали и собирали сухие фракции. Все фракции соответствующим образом помечали и исследовали их противогрибковую активность по отношению к патогенным микроорганизмам Aspergillus. Было установлено, что хлороформная фракция обладает активностью, в связи с чем ее дополнительно субфракционировали методами колоночной и тонкослойной хроматографии.
(iii) Колоночная хроматография
Хлороформную фракцию субфракционировали методом модифицированной колоночной хроматографии на колонке с силикагелем. Силикагель суспендировали в гексане и помещали в колонку размером 1,25×35 см. Готовили суспензию хлороформного экстракта и пропускали ее через предварительно уравновешенную силикагелевую (60-120 мкм) колонку. Компоненты хлороформной фракции элюировали 100 мл хлороформа с объемной скоростью 1,0 мл/мин, затем смесями хлороформ : метанол с содержанием компонентов в интервале 100:0-0:100. Все субфракции анализировали методом ТСХ. Субфракции с аналогичным профилем значений Rf сливали и сушили в вакууме. Каждую субфракцию тестировали на противогрибковую активность с использованием патогенных штаммов Aspergilli. Субфракции с противогрибковым потенциалом дополнительно подвергали очистке методом тонкослойной хроматографии с целью идентификации и выделения чистого активного компонента.
(iv) Тонкослойная хроматография (ТСХ)
Активные противогрибковые фракции с колонки наносили пятнами на пластины с силикагелем (E. Merck Cat №1.05554, F254) и проводили обработку методом ТСХ, используя три различные системы из следующих растворителей, хлороформ : ацетон : диэтиламин (5,0:4,0:1,0), хлороформ : метанол : диэтиламин (8,5:1,5:0,1) и хлороформ : метанол : муравьиная кислота (8,0:2,0:0,1). Полосы на пластинах подвергали УФ-визуализации при длине волны 254 и 366 нм, проводя распыление хлорпалатината, реагента Драгендорфа и иода. Компоненты различных полос соскабливали и исследовали на противогрибковую активность. Для получения интересующего активного соединения использовали метод препаративной ТСХ.
(v) Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)
Чистоту соединения РС-1, полученного методом препаративной ТСХ, анализировали методом ВЭЖХ с использованием колонки RP-8 (Merck). Обработку методом ВЭЖХ с обращенной фазой проводили изократно с использованием системы растворителей из 70 частей ацетонитрила и 30 частей воды. Перед загрузкой испытуемые образцы пропускали через пористую мембрану. 5,0 мкл 0,22 мкм фильтрованного образца загружали в предварительно уравновешенную ВЭЖХ колонку при комнатной температуре. Объемная скорость составляла 1,0 мл/мин.
Идентификация
(i) Определение структуры
Идентификацию полученного соединения осуществляли с использованием таких различных методов, как идентификация по классу с помощью химических методов, дериватизация соединения, определение температуры плавления очищенного соединения, с помощью УФ-спектров (фиг.7), ИК-спектров (фиг.8), масс-спектров (фиг.9), спектра ЯМР (фиг.10) и COSY (фиг.11). Подробности, касающиеся спектральных данных нового соединения, приведены выше.
Анализ на противогрибковую активность
Противогрибковую активность таких различных препаратов, как неочищенное соединение, метанольный экстракт, субфракции и очищенное соединение, исследовали методом разведения в микробульоне, диффузии на диске и с помощью анализа на ингибирование прорастания спор с применением патогенных грибковых штаммов.
(i) Патоген
Патогенные штаммы грибков получали из Микологического департамента Vallabhbhai Patel Chest Institute, Delhi. Все штаммы выращивали на Sabouraud декстрозном агаре при 37°С. Собирали конидиевую форму указанных культур и ее суспендировали в Sabouraud мальтозном бульоне. Число конидий подсчитывали с помощью гемоцитометра, и их численность поддерживали в соответствии с экспериментальными потребностями.
(ii) Анализ разведением в микробульоне
Фунгицидную чувствительность грибков к действию различных фракций очищенного компонента анализировали методом разведения в микробульоне (Forthergill A.W. and McGough A.W. 1995, Clin. Microbiol. Procedure Handbook. In vitro susceptibility Testing of Yeast, 5.15.1-5.15.15). Грибковые споры собирали с 96-часовых культур и их количество поддерживали на уровне 1×106 на 1 мл. Sabouraud декстрозную среду растворяли в дважды дистиллированной воде и в течение 15 минут обрабатывали в автоклаве при давлении 10 фунт/дюйм2. В лунки микропланшета для анализа клеточных культур добавляли по 90 мкл среды. Различные концентрации экстракта, фракций или очищенного соединения готовили в дублированных лунках, после чего их инокулировали 10 мкл споровой суспензии. Планшеты инкубировали при 37°С и через 48 часов подвергали макроскопическому исследованию для определения роста грибкового мицелия. Активность обозначали индексом -ve, если наблюдался рост, и индексом +ve, если среда оказывалась чистой без каких-либо признаков грибкового роста.
(iii) Анализ методом диффузии на диске
Тест диффузией на диске проводили на стерилизованных облучением чашках Петри диаметром 10 см (Tarsons) в соответствии со способом, описанным в Indian Pharmacopoeia (Indian Pharmacopoeia, 1996, Appendix 9, p. A101-A110). Sabouraud декстрозную агаровую среду растворяли в бидистилированной воде и помещали на 15 минут в автоклав под давлением 10 фунт/дюйм2. Раствор охлаждали до 45°С и в каждую чашку Петри помещали по 20,0 мл раствора. В Sabouraud мальтозном бульоне готовили конидиальную суспензию, 1,0 мл которой содержал 1х106 конидий, и полученный препарат выкладывали на поверхность агаровой пластины. Стерильные диски диаметром 5,0 мм из ватмановской фильтровальной бумаги пропитывали различными концентрациями образца. Такие диски помещали на поверхность агаровых пластин, инокулированных грибковыми спорами. Пластины инкубировали при 37°С и через 48 часов исследовали зону ингибирования, если она имелась, вокруг диска. Диаметр зоны ингибирования измеряли с помощью масштабной линейки. Концентрацию, обеспечивающую зону ингибирования диаметром 6,0 мм, считали минимальной ингибирующей концентрацией. В качестве стандартного контрольного лекарственного препарата в анализе использовали амфотерицин В. Также использовали дополнительный контрольный диск без тестируемого образца, но пропитанный эквивалентным количеством растворителя. Тест для определения активности различных испытуемых препаратов повторяли 3-5 раз.
(iv) Построение стандартной кривой
Стандартную кривую строили в соответствии со способом, описанным в Indian Pharmacopoeia (Indian Pharmacopoeia, 1996, Appendix 9, p. A101-A110).
(v) Анализ на ингибирование прорастания спор
Модифицированный анализ на ингибирование прорастания спор проводили по ранее описанной методике (Sureder P. and Janaiah C., 1987, Ind. J. Expt. Biol., 25, 233-234). Различные виды грибков выращивали в течение 96 часов на пластинах с Sabouraud десктрозным агаром при 37°С. С пластин собирали образовавшиеся конидии и готовили их гомогенную суспензию в Sabouraud декстрозном бульоне. Подсчитывали число конидий и их численность устанавливали равной 1×104 на 1 мл. Стандартный лекарственный препарат амфотерицин В и испытуемые образцы вначале растворяли в минимальном количестве диметилсульфоксида (ДМСО) и затем разбавляли Sabouraud декстрозной средой. Различные концентрации испытуемых образцов в 90 мкл культуральной среды готовили методом двойного разбавления в 96-луночных плоскодонных микрокультуральных планшетах (Nunc). Для каждой концентрации использовали по три лунки микропланшета. После этого каждую лунку инокулировали 10 мкл споровой суспензии, содержащей 100±5 спор. Пластины инкубировали в течение 10 часов при 37°С и прорастание спор исследовали с помощью инверсионного микроскопа (Nickon Diphot). Подсчитывали число проросших и непроросших спор. Процент ингибирования прорастания спор (PSGI) рассчитывали с использованием следующей формулы:
Оценка in vitro токсичности
In vitro токсичность активного соединения исследовали с применением МТТ анализа, используя RAW клетки (Mossman T., 1983, J. Immunol. Methods, 65, 55-63).
Клеточная культура
Исходную культуру RAW клеток получали от National Facility for Cell and Tissue Culture, Pune. Клетки выдерживали при 37°С в RPMI-1640 среде, дополненной глутамином (2,3 мг/л), фетальной телячьей сывороткой (10% об/об) и гентамицином (50,0 мг/л), в углекислотном инкубаторе Nuair IR Autoflow с водным охлаждением.
Приготовление образца
Исходный раствор соединения получали путем растворения 2,5 мг очищенного соединения в минимальном количестве ДМСО с последующим разбавлением двукратным количеством дистиллированной воды, доводя систему до конечного объема 1,0 мл. Анализ на цитотоксичность проводили с использованием различных концентраций в интервале 1250,0-19,5 мкг/мл.
Анализ на клеточную цитотоксичность
Клетки собирали в фазе лог-роста при выливании системы из колбы. Гомогенную суспензию клеток готовили в 2,0 мл культуральной среды. Число клеток в суспензии подсчитывали с использованием гемоцитометра и клеточную суспензию разбавляли таким образом, чтобы оставить 5×107 жизнеспособных клеток на 1 мл. Жизнеспособность клеток проверяли с помощью теста на эксклюзию с трипаном голубым. Анализ на цитотоксичность проводили в 96-луночных плоскодонных планшетах для культивирования ткани (Nunc Nunclon). Каждую лунку засевали 5×106 клеток в 100,0 мкл объема. Планшет инкубировали при 37°С в течение 8 часов в атмосфере, содержащей 5% СО2 (об/об). Проводили микроскопическое изучение лунок на предмет образования монослоя клеток. К монослою клеток добавляли различные концентрации в интервале от 1250,0 мкг/мл до 19,5 мкг/мл соединения РС-1 (метелатропиниловый эфир). В +ve контрольных лунках использовали известный цитотоксичный белок, полученный из A.fumigatus. В другой серии лунок в качестве другого +ve токсичного материала использовали ZnSO4 (8,0 мг/л). В отрицательных контрольных лунках применяли эквивалентное количество растворителя. Для каждой концентрации испытуемого соединения использовали по две лунки. Планшеты инкубировали в течение ночи при 37°С в инкубаторе, содержащем 5% СО2 (об/об). Среду вместе со всплывшими мертвыми клетками выливали из лунок, переворачивая планшет. В результате в лунках оставались лишь живые клетки, прилипшие к поверхности планшета. Эти клетки окрашивали 40,0 мкл 2,5% красителя МТТ. После добавления в лунки красителя планшет выдерживали в течение 1 часа при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО2. Планшет для культивации ткани вынимали из инкубатора и весь краситель удаляли аспирацией. Окрашивались лишь живые клетки. Клетки подвергали лизису путем добавления в лунки 100,0 мкл смеси изопропанол-HCl. После проведения лизиса планшеты прочитывали при длине волны 540 нм с использованием планшет-ридера (Spectra Max 190, Molecular Device).
Интерпретация результатов
Токсичность соединения выражали в процентах к токсичности в - ve контрольном образце. Процент цитотоксичности рассчитывали с использованием формулы, приведенной ниже:
In vivo эффективность РС-1
In vivo эффективность соединения против заражения A.fumigatus изучали на мышах разновидности Balb/C обоих полов в возрасте 6-8 недель весом 15-20 г. Мышиная модель аспергиллеза, описанная Dixon с сотр. (1989), использовалась для исследования действия соединения на in vivo заражение A.fumigatus.
Животные содержались в клетках с микробарьерами со стерильной подстилкой в условиях предоставления ad libitum воды и пищи. Мышей подразделяли на 6 групп, каждая из которых включала по 8-10 животных. Мышей экспериментально инфицировали A.fumigatus. За три дня до инфицирования конидиями мышам делали подкожные инъекции 3 доз (250,0 мг/кг/день) ацетата кортизона в 400,0 мкл PBS. В день инфицирования каждой мыши назально вводили по одной капле конидиальной суспензии. У животных в такой модели развивался инвазивный аспергиллез, и все инфицированные животные погибали в течение 4-6 дней.
Приготовление инокулята для A.fumigatus в опытах по экспериментальному заражению мышей.
Изолят A.fumigatus (190/96) выращивали в течение 4 дней на планшетах с Sabouraud декстрозным агаром при 37°С. Конидии собирали с культуральных планшетов с использованием PBS (pH 7,2), содержащего 0,05% Tween 80 (Sigma Chemicals), и полученные суспензии фильтровали через стерильную стекловату. Конидии переводили в осадок путем центрифугирования со скоростью 2000 об/мин и ресуспендировали в PBS, pH 7,2. Определяли численность конидий и поддерживали их концентрацию 1×108 конидий/мл. Жизнеспособность конидий определяли высеванием разбавлений суспензий на Sabouraud декстрозном агаре.
Очищенное соединение (метелатропиниловый эфир), выделенный из D. metel, перорально применяли с концентрацией 0,0, 25,0, 50,0, 100,0, 200,0 и 400,0 мг/кг веса тела на мышах, экспериментально инфицированных A.fumigatus.
Лечение
Дозирование 6 различным группам животных (обработанных кортизоном и зараженных) испытуемыго соединения начинали через 30 минут после заражения конидиями A.fumigatus.
Группа I: мыши получали перорально 7 доз по 25,0 мг/кг/день испытуемого соединения.
Группа II: животные, инфицированные конидиями A.fumigatus, в течение 7 дней получали перорально по 50 мг/кг/день испытуемого соединения.
Группа III: животные этой группы получали 7 пероральных дозировок соединения по 100,0 мг/кг/день каждая.
Группа IV: в этой группе животные получали 7 пероральных доз испытуемого соединения (200 мг/кг/день).
Группа V: животные этой группы получали 7 пероральных доз по 400 мг/кг/день в течение 7 дней.
Группа VI: животные этой группы использовались в качестве контрольных и получали перорально 7 доз растворителя, содержащего 400 мкл PBS.
Выживаемость
Животных содержали в соответствующим образом отмеченных клетках и внимательно следили за их весовыми потерями и смертностью. Подсчитывали выживаемость за 10 дней и определяли грибковую нагрузку на выживших особях (Clemons and Stevens, 1994). Среди животных, получивших дозы 25,0, 50,0, 100,0, 200,0 и 400,0 мг/кг веса тела, к 10-му дню выжили, соответственно, 1 из 10 (10%), 1 из 8 (12,5%), 3 из 9 (33,3%), 4 из 9 (44,4%) и 8 из 10 (80%) животных.
Количественное определение колониеобразующих единиц
Животные находились под постоянным наблюдением и к 10 дню испытания умерщвляли умирающих и выживших животных. На умерших мышах производили аутопсию с целью изъятия внутренних органов для количественного определения колониеобразующих единиц (CFU). Легкие, печень и почки мышей удаляли в асептических условиях, помещали в стерильный PBS (pH 7,2) и гомогенизировали с помощью тефлонового пестика со ступкой. Значения CFU для испытуемых животных определяли высеванием 10-кратных разбавлений гомогенатов внутренних органов на Sabouraud декстрозном агаре, содержащем 0,05% тритона Х-100. Тритон Х-100 ограничивает размер колоний и существенно облегчает их подсчет (Frosco, 1992). После инкубации в течение 48 часов при 37°С полученные колонии подсчитывали и результаты выражали числом CFU в расчете на орган.
Длительность выживания и значение CFU, указывающее на грибковую нагрузку на различные органы, использовались для оценки защитной эффективности испытуемого соединения in vivo.
Следующие ниже примеры представлены для иллюстрации настоящего изобретения и не ограничивают его область.
Пример 1
Экстракция и фракционирование
Воздушные части растения Datura metel (Solanaceae) собирали в апреле в течение месяца на территории, близлежащей к городу Дели, Индия. В Hamdard College of Pharmacy, New Delhi, зарегистрирована аутентичность идентификации растительного материала и там хранится его контрольный образец. Свежесобранный растительный материал, помещенный в хорошо проветриваемую упаковку, сушили в тени. 400 г высушенного материала измельчали в порошок и экстрагировали в каждом цикле 500 мл метанола. Все экстракты, полученные после четырех циклов экстракции, сливали и выпаривали досуха при пониженном давлении. Остаток в количестве 25 г хранили при 4°С до использования.
Метанольный экстракт последовательно экстрагировали гексаном, хлороформом и ацетоном. Вначале метанольный экстракт четырежды экстрагировали гексаном. Все четыре гексановых экстракта сливали и выпаривали растворитель. Сухую гексановую фракцию собирали и хранили при 4°С до дальнейшего использования. Остаток после экстракции гексаном по 4 раза экстрагировали хлороформом и ацетоном с получением хлороформной и ацетоновой фракций, соответственно. Окончательный остаток растворяли в метаноле. Высушенные фракции исследовали на противогрибковую активность. Фракции, не ингибирующие рост Aspergillus до концентраций 1500 мкг/мл и 50 мкг/диск, соответственно, в ингибировании прорастания пор и анализе диффузии на диске, считались неактивными. Было установлено, что хлороформная фракция Datura metel проявляет активность, поскольку концентрация в 1250 мкг/мл ингибирует прорастание 100% спор согласно анализу на ингибирование прорастания спор, а концентрация в 25 мкг/диск приводит к образованию значимой зоны ингибирования активности. В связи с этим рассматриваемую фракцию использовали в дальнейших исследованиях для идентификации и очистки активного компонента, с использованием различных хроматографических методов.
Пример 2
Очистка активного соединения
Хлороформную фракцию подвергали субфракционированию с помощью модифицированной колоночной хроматографии, как описано выше. Указанные выше фракции анализировали методом ТСХ и образцы, дающие аналогичные пятна, объединяли и сушили в вакууме с получением субфракций. Всего было получено 15 субфракций. Каждую из полученных субфракций тестировали на противогрибковую активность с использованием патогенных штаммов Aspergillus. Субфракции под номерами 10 и 11 демонстрировали потенциальную противогрибковую активность, и их дополнительно подвергали очистке методом препаративной тонкослойной хроматографии с целью выделения чистого активного компонента.
Для проведения ТСХ использовали силикагелевые пластины (каталожный номер 1.05554, F254), приобретенные у Merck. Активные фракции, полученные методом колоночной хроматографии, наносили пятнами на пластины и подвергали обработке тремя различными системами растворителей: хлороформ : ацетон : диэтиламин (5,0:4,0:1,0), хлороформ : метанол : диэтиламин (8,5:1,5:0,1) и хлороформ : метанол : муравьиная кислота (8,0: 2,0:0,1). Полосы на пластинах визуализировали с помощью УФ-облучения с длиной волны 254 нм и 366 нм и опрыскиванием хлорпалатинатом, реагентом Драгендорфа и иодом. Компоненты в трех различных основных полосах, которые расщеплялись под воздействием системы растворителей хлороформ : метанол : муравьиная кислота (8,0:2,0:0,1) (фиг.1) и имели значения Rf 0,14, 0,22 и 0,37, соответственно, соскабливали с пластины и исследовали их противогрибковую активность. Соединение, обладающее эффективностью по отношению к Aspergillus, восстанавливали с полосы с Rf 0,22. Это соединение очищали повторной обработкой методом ТСХ и тестировали на его противогрибковую активность. Активное соединение дает положительную реакцию с реагентом Драгендорфа, что свидетельствует о его алкалоидной природе.
Чистоту соединения, полученного после препаративной ТСХ, анализировали методом ВЭЖХ с использованием колонки RP-8 (Merck). ВЭЖХ с обращенной фазой проводили изократно с системой растворителей ацетонитрил : вода (70:30). Перед загрузкой в хроматографическую колонку образцы пропускали через мембрану с размером пор 0,22 мкм. В предварительно уравновешенную колонку при комнатной температуре загружали 5,0 мкл образца. Скорость потока поддерживали 1,0 мл/мин. Профиль ВЭЖХ соединения, очищенного методом ТСХ, содержит два пика (I и II) со временами удерживания 1,91 мин и 2,71 мин, соответственно (фиг.2). Два аналогичных пика со временами удерживания 1,88 мин и 2,84 мин, соответственно, присутствуют в хроматограмме ВЭЖХ активной субфракции, полученной после колоночной хроматографии. Активная колоночная субфракция содержит пять основных пиков, соответствующих временам удерживания 1,31, 1,88, 2,84, 3,82 и 4,35 минут, соответственно. Дополнительную очистку частично очищенных соединений проводили методом ТСХ с заменой системы растворителей. Система растворителей, содержащая хлороформ : метанол : диэтиламин (8,5:1,5:0,1), разделяет смесь активных соединений с Rf 0,42 (фиг.3). Время удерживания соединения согласно ВЭЖХ составляет примерно 1,9 минут, и это соединение в различных опытах имеет чистоту 97-100% (фиг.4). Время удерживания не меняется как при хроматографическом разделении активной субфракции, так и ее очищенной формы.
Пример 3
Противогрибковая активность чистого соединения по данным анализа разведения в микробульоне
Противогрибковое воздействие очищенного соединения на грибки анализировали методом разведения в микробульоне. Различные концентрации очищенного соединения в интервале 21,87-350 мкг/мл готовили в двух параллельных лунках методом двукратного разбавления. Методика теста описана выше. Противогрибковая активность соединения представлена данными таблицы 1. Установлено, что соединение характеризуется значением MIC 87,5 мкг/мл. При такой концентрации испытуемого соединения в лунках не наблюдается роста ни одной из трех разновидностей Aspergillus.
| Таблица 1 Активность соединения против Aspergillus sp. через 48 часов |
|||
| Концентрация соединения (мкг/мл) | A.fumigatus | A.niger | A.flavus |
| 350,00 | + | + | + |
| 175,00 | + | + | + |
| 87,50 | + | + | + |
| 43,75 | - | - | - |
| 21,87 | - | - | - |
Пример 4
Противогрибковая активность соединения по данным анализа диффузии на диске
Тест на диффузию на диске проводили по методике, описанной в разделе, касающемся подробностей изобретения. Амфотерицин В в количестве 1,25 мкг/диск использовали в анализе в качестве положительного контрольного стандартного лекарства. В качестве отрицательного контроля в анализе использовали дополнительные диски, пропитанные эквивалентным количеством растворителя (фиг.5). Значение MIC испытуемого соединения составило 5 мкг/диск, поскольку такая концентрация приводит к образованию зоны ингибирования со средним диаметром 6,25, 6,15 и 6,4 мм, в опытах с использованием A.fumigatus, A.flavus и A.niger, соответственно (таблица 2).
| Таблица 2 Противогрибковая активность соединения по данным анализа диффузии на диске |
|||
| Концентрация соединения (мкг/диск) | Диаметр зоны ингибирования (мм) | ||
| A.fumigatus | A.flavus | A.niger | |
| 20,00 | 9,25 | 9,00 | 9,40 |
| 10,00 | 8,50 | 8,10 | 8,60 |
| 5,0 | 6,25 | 6,15 | 6,40 |
| 2,5 | -- | -- | -- |
| Растворитель(контроль) | -- | -- | -- |
Пример 5
Сравнение противогрибковой активности соединения с амфотерицином В
Мощность соединения определяли с помощью стандартной кривой, построенной с использованием данных по действию стандартного лекарственного средства амфотерицина В на A.fumigatus. Построение стандартной кривой производили по способу, принятому в Indian Pharmacopoeia. Определяли скорректированные значения диаметра зоны ингибирования, а также низшие и высшие значения. Полученные значения использовали для построения полулогарифмической стандартной кривой. По известным значениям зоны ингибирования, полученным для испытуемого соединения с использованием стандартной кривой, находили соответствующие дозы для этого соединения, обеспечивающие эффект, эквивалентный действию амфотерицина В (фиг.6).
Концентрация испытуемого соединения в 10 мкг/диск обеспечивала диаметр зоны ингибирования, эквивалентный применению 2,67 мкг амфотерицина В. Этот результат свидетельствует о том, что рассматриваемое соединение в 3,74 раза уступает амфотерицину В по мощности действия, но более важным обстоятельством является то, что это соединение является новым, передовым лекарственным средством.
Пример 6
Противогрибковая активность чистого соединения в анализе на ингибирование прорастания спор
Для оценки активности испытуемого соединения проводили анализ на ингибирование прорастания спор. Методом двойного разбавления в 90 мкл культуральной среды готовили различные концентрации соединения в интервале 21,875-700 мкг/мл. Лунки инокулировали 10 мкл споровой суспензии и инкубировали в течение 10 часов при 37°С. Подсчитывали число проросших и непроросших спор и рассчитывали процент ингибирования прорастания спор (PSGI). Процент прорастания спор понижался с увеличением дозы испытуемого соединения. Значение MIC для испытуемого соединения составило 87,5 мкг/мл (фиг.7).
Пример 7
Клеточная цитотоксичность
In vitro клеточную цитотоксичность соединения РС-1 изучали путем инкубации RAW клеток в присутствии различных концентраций РС-1 и измерения степени цитотоксичности с использованием описанного выше MTT анализа. Соединение с концентрацией до 312,5 мкг/мл совершенно нетоксично в отношении клеток. Более высокие дозировки соединения проявляют различное токсическое действие. При концентрации соединения 1250,0 мкг/мл испытуемое соединение проявляет токсичность в отношении 75,95% клеток. Из построенного графика зависимости процента цитотоксичности от логарифма концентрации испытуемого соединения может быть определена его концентрация, цитотоксичная для 50% клеток (СТ50). Найденное значение СТ50 составило 889,2 мкг/мл (фиг.12).
Пример 8
Определение структуры соединения
В результате совместного рассмотрения всех спектральных характеристик и данных химического анализа соединения авторы провели идентификацию соединения.
(i) Данные УФ-спектроскопии
Уф-спектр соединения РС-1, названного метелатропиниловым эфиром, имеет два максимума поглощения, 0,250 и 1,676 при длинах волн 300 и 206 нм, соответственно. Отчетливый максимум при длине волны в 206 нм может быть приписан наличию сложноэфирной группы. λmax для кетона соответствует 208 нм или несколько выше. Следовательно, наличие максимума при 206 нм предполагает присутствие в РС-1 сложноэфирной группы.
(ii) Данные ИК-спектроскопии
В ИК-спектре присутствуют полосы поглощения аминогруппы (3434 см-1), сложноэфирной группы (1711, 1230 см-1) и ненасыщенного фрагмента при 1646 см-1 (фиг.8).
(iii) Данные масс-спектрометрии
Согласно FAB масс-спектру испытуемое соединение имеет молекулярную массу 239,2 при интенсивности пика 20%. Расчет по интенсивности пика при m/z 239,2 (20) в масс-спектре позволил установить, что молекула РС-1 содержит 13,8 (=14) углеродных атомов (Furniss et al, 1989; Kemp, 1991). Данные химического анализа и масс-спектр соединения РС-1 указывают на наличие в его молекуле, по крайней мере, одного атома азота и двух атомов кислорода. На основании полученных данных соединению РС-1 может быть приписана химическая формула С14Н25О2N. Правило для азота также подтверждает наличие одного атома азота в молекуле. Молекулярная масса, соответствующая приведенной химической формуле, составляет 239,188, что естественно подтверждается данными масс-спектра. В масс-спектре соединения наблюдается базовый пик при m/z 58, возникающий за счет расщепления С1-С2 и ОС-О, что предполагает вторичную природу тропанового кольца. Значительный ионный пик при m/z 102 отвечает образованию фрагмента пентановой кислоты (С5Н10О2 +). Расщепление связи С1'-С2' приводит к образованию ионного пика с m/z 57 (C4H9 +) (фиг.9).
(iv) Данные ЯМР-спектроскопии
В спектре 1Н-ЯМР наблюдаются мультиплеты с δ 4,15 и 3,75, которые могут быть приписаны протонам -СН-О- и -N-CH, соответственно. Двойной дублет с δ 3,17 может быть приписан протонам -N-CH. Триплет с δ 3,17 может быть приписан протонам -N-CH 2. Триплет с δ 2,31 и мультиплет с δ 1,95, с одним протоном каждый, приписаны протонам -С-СН 2. Широкий сигнал от шести протонов с δ 1,62 отнесен к протонам группы -СН3, присоединенным к положениям 3 и 4 дигидропиррольного кольца. Два дублета с одним протоном каждый с δ 1,35 и 1,42 приписаны -СН 2 протону, присоединенному к положению 2 дигидропиррольного кольца. Широкий сигнал от семи протонов отнесен к 2х-СН 2 (протон цепочки пентановой кислоты, -СН 3 (три протона) группы -СО-СН-СН 3, а триплет с δ 0,87 с тремя протонами отнесен к терминальной -СН3 группе пентановой кислоты. Отсутствие сигнала с δ 4,15 предполагает наличие в молекуле тетразамещенной олефиновой связи. О наличии метильной группы, связанной с эндо-атомом азота, свидетельствует отсутствие какого-либо сигнала в области между δ 2,0 и δ 3,0 в 1H ЯМР-спектре. В спектре 1Н-1Н 2D COSY установлена корреляция между водородными атомами дигидропиррольного кольца (фиг.11).
На основании полученных результатов структура исследуемой молекулы была идентифицирована как 2-(3,4-диметил-2,5-дигидро-1Н-пиррол-2-ил)-1'-метилэтила пентаноат.
Молекула соединения РС-1, идентифицированная как 2-(3,4-диметил-2,5-дигидро-1Н-пиррол-2-ил)-1'-метилэтила пентаноат, представляет собой новое производное тропина, причем впервые сообщается о присутствии такой молекулы в растительном или синтетическом источнике. Рассматриваемое вещество представляет собой новое противогрибковое соединение, используемое в качестве основного начала для разработки новых фунгицидных лекарственных средств. Сообщается о том, что значение СТ50 для амфотерицина B и его липосомных производных (отобранные лекарственные препараты) составляет 4,0-64,0 мкг/мл (Zager R.A., 2000, Am. J. Kidney Dis., 2, 238). Величина СТ50 для нового соединения составляет 889,2 мкг/мл, что указывает на во много раз меньшую цитотоксичность рассматриваемого соединения по сравнению с амфотерицином В.
Пример 9
Эффективность в экспериментах in vivo
Мышей разновидности Balb/C обоих полов в возрасте 6-8 недель весом 15-20 г содержали в клетках с микробарьерами со стерильной подстилкой, животным предоставлялась вода и пища ad libitum. Животных подразделяли на 6 групп, в каждой из которых находилось по 8-10 мышей. Эффективность РС-1 против аспергиллеза исследовали с использованием пяти различных дозировок. Различные дозы испытуемого соединения применяли перорально на животных, предварительно зараженных 2×107 спор A.fumigatus, и следили за выживаемостью животных, обработанных рассматриваемым соединением. Среди животных, получивших дозы 25,0, 50,0, 100,0, 200,0 и 400,0 мг/кг веса тела, к 10-му дню выжили, соответственно, 1 из 10 (10%), 1 из 8 (12,5%), 3 из 9 (33,3%), 4 из 9 (44,4%) и 8 из 10 (80%) животных.
Процент выживаемости обработанных животных повышался с увеличением дозы, что свидетельствует о том, что защитная эффективность зависит от количества применяемой дозы. В полулогарифмических координатах строили зависимость процентного значения выживаемости от логарифма дозы соединения РС-1 и из полученной зависимости определяли эффективную дозу, требующуюся для обеспечения защиты 50% животных (ED50). Значение ED50 для соединения РС-1 составляет 167,0 мг/кг веса тела (фиг.13).
Пример 10
Количественное определение колониеобразующих единиц
Животные находились под постоянным наблюдением, к 10 дню испытания умерщвляли умирающих и выживших животных. На умерших мышах производили аутопсию с целью изъятия внутренних органов для количественного определения колониеобразующих единиц (CFU). Легкие, печень и почки мышей удаляли в асептических условиях, помещали в стерильный PBS (pH 7,2) и гомогенизировали с помощью тефлонового пестика со ступкой. Значения CFU для испытуемых животных определяли высеванием 10-кратных разбавлений гомогенатов внутренних органов на Sabouraud декстрозном агаре, содержащем 0,05% тритона Х-100. Тритон Х-100 ограничивает размер колоний и существенно облегчает их подсчет (Frosco, 1992). После инкубации в течение 48 часов при 37°С полученные колонии подсчитывали и результаты выражали числом CFU в расчете на орган.
Длительность выживания и значение CFU, указывающее на грибковую нагрузку на различные органы, использовались для оценки защитной in vivo эффективности 2-(3,4-диметил-2,5-дигидро-1Н-пиррол-2-ил)-1-метилэтила пентаноата.
Определяли грибковое заражение органов животных, умерших или находящихся в предсмертном состоянии в ходе исследования, или выживших к 10-му дню исследования. Легкие, печень и почки животных извлекали, гомогенизировали и гомогенаты использовали для культивации патогена на пластинах с Saboraud декстрозным агаром. Подсчитывали число грибковых колоний и их количество выражали отношением колониеобразующих единиц/орган. В таблице 3 приведены количества CFU для различных органов.
Дозы в 25,0 и 50,0 мг/кг веса тела не оказывали никакого влияния на число CFU в легочных тканях. Однако защитный эффект наблюдался у животных, получивших более высокие дозировки. Доза РС-1 в 400 мг/кг веса тела значительно уменьшала число колоний по сравнению с контрольными значениями. Различие оказалось статистически значимым (р<0,001). Установлено, что печень наименее поражена грибками и что соединение оказывает незначительное влияние на количество CFU в печени. Почки оказались более подверженными инфицированию, поскольку наивысшие количества CFU были зафиксированы в почках контрольных животных и тех, что получили дозы испытуемого соединения в 25,0 или 50,0 мг/кг веса тела. Однако значительное уменьшение количества CFU наблюдалось у тех животных, которые получили 100-400 мг/кг веса тела очищенного противогрибкового соединения, 2-(3,4-диметил-2,5-дигидро-1Н-пиррол-2-ил)-1-метилэтила пентаноата (таблица 3).
| Таблица 3 | ||||
| Группы | Доза (мг/кг веса тела) | CFU/органы (среднее +SD) | ||
| Легкие | Печень | Почки | ||
| I | 25,0 | 907,5+246,09 | 255,0+72,45 | 1402,5+350,09 |
| II | 50,0 | 900,0+230,29 | 290,6+135,58 | 1040,5+441,78 |
| III | 100,0 | 650,1+171,85 | 216,7+108,97 | 733,3+394,69 |
| IV | 200,0 | 525,0+251,56 | 225,0+91,85 | 683,3+352,67 |
| V | 400,0 | 180,0+127,75 | 165,0+117,84 | 225,0+157,39 |
| Контроль | 0,0 | 877,5+276,25 | 307,5+159,88 | 1440,0+439,89 |
Основные преимущества настоящего изобретения
(i) Настоящее изобретение предусматривает новое противогрибковое соединение.
(ii) Новое соединение может применяться для создания новых лекарственных средств для лечения различных грибковых заболеваний у людей.
(iii) Изобретение также предусматривает способ выделения, очистки и идентификации нового противогрибкового соединения из растения Datura metel.
(iv) Новое соединение обладает меньшей токсичностью, чем коммерчески доступные противогрибковые лекарственные средства.
Claims (16)
1. Противогрибковое соединение 2-(3,4-диметил-2,5-дигидро-1Н-пиррол-2-ил)-1-метилэтила пентаноат формулы I
2. Противогрибковое соединение по п.1, в котором указанное гетероциклическое соединение характеризуют такими известными аналитическими методами, как ТСХ, окрашивание реагентами, специфическими в отношении определенных групп, УФ, инфракрасная, масс и ЯМР спектроскопия, а также такими биологическими методами, как анализ на противогрибковую активность и цитотоксичность, и такое соединение имеет следующие характеристики:
а) значение Rf 0,22 согласно ТСХ, как показано на фиг.3,
b) максимумы поглощения при длинах волн 300 нм и 206 нм в УФ-спектре, представленном на фиг.7,
c) ИК-спектр νmax: 3434 (NH), 3024, 1711 (сложный эфир), 1646 (С=С), 1524, 1426, 1230, 938, 760 см-1, как показано на фиг.8,
d) +ve FABMS m/z: 239[M]+ (C14H25O2N) (16,3), 212 (13,2), 174 (16,2), 122 (34,2), 102 (96,4), 58 (100) и 57 (19,2), как показано на фиг. 9, и
е) 1Н ЯМР (CDCl3): δ 4,15 (1Н, м, С1'-H), 3,75 (1Н, м, С2-Н), 3,17 (2Н, дд, J=7,44 Гц, 7,44 Гц, C5-Нa и C5-Нa и C5-Hb), 2,31 (1H, т, J=6,48 Гц, C2"-Ha), 1,95 (1H, м, C2"-Hb), 1,62 (6H, шир., C6-CH3 и C7-CH3), 1,42 (1H, д, J=6,96 Гц, C2'-Ha), 1,35 (1H, д, J=7,28 Гц, C2'-Hb), 1,25 (7H, шир., C1'-CH3, C3"-Hb,, C4"-Ha и C4"-Hb), 0,87 (3H, т, J=5,96 Гц, C5"-CH3) и спектр COSY, показанный на фиг. 11.
3. Соединение по п.1, в котором значение CT50 (т.е. цитотоксичная доза для 50% клеток) для указанного противогрибкового соединения составляет 889,2 мкг/мл, как показано на фиг. 12.
4. Соединение по п.1, в котором значение ED50 для указанного противогрибкового соединения составляет 167,0 мг/кг веса тела, как показано на фиг.13.
5. Соединение по п.1, в котором цитотоксичность указанного соединения в 57,8 раз ниже цитотоксичности стандартного противогрибкового лекарственного средства, представляющего собой амфотерицин В.
6. Соединение по п.1, используемое в качестве противогрибкового средства.
7. Фармацевтическая композиция, обладающая противогрибковой активностью, содержащая эффективное количество 2-(3,4-диметил-2,5-дигидро-1Н-пиррол-2-ил)-1-метилэтила пентаноата и фармацевтически приемлемые добавки и адъюванты.
8. Композиция по п.7, в которой эффективная доза нового противогрибкового соединения составляет 100-400 мг/кг веса тела.
9. Композиция по п.7, которую можно применять перорально, внутрибрюшинно.
10. Композиция по п.7, которую вводят в форме таблеток, капсул, сиропа, порошка, мази и инъекции.
11. Композиция по п.7, цитотоксичность которой в 57,8 раз ниже цитотоксичности стандартного противогрибкового средства, представляющего собой амфотерицин В.
12. Способ выделения противогрибкового соединения, заявленного в п.1, включающий стадии:
(i) последовательной экстракции порошкообразного растительного материала Datura metel органическим растворителем при температуре в интервале 15-45°С, где органический растворитель выбирают из метанола, этанола, ацетона и хлороформа,
(ii) удаления растворителя для получения остатка,
(iii) экстракции остатка, полученного на стадии (ii), алифатическим углеводородным растворителем с последующей экстракцией хлороформом, где алифатический углеводородный растворитель выбирают из гексана и петролейного эфира,
(iv) удаления хлороформа из хлороформных фракций,
(v) скрининга полученного выше остатка из хлороформных фракций на противогрибковую активность,
(vi) отделения противогрибковых фракций и очистки нового противогрибкового соединения из активных противогрибковых хлороформных фракций с помощью традиционных хроматографических методов с получением соединения формулы I.
13. Способ по п.12, в котором очистку соединения на стадии (ii) проводят с помощью колоночной или тонкослойной хроматографии (ТСХ), а также высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
14. Способ по п.12, в котором очистку нового соединения на стадии (vi) проводят методом тонкослойной хроматографии с использованием систем растворителей, выбранных из смесей хлороформ: ацетон: диэтиламин (5,0:4,0:1,0), хлороформ: метанол: диэтиламин (8,5:1,5:0,1) и хлороформ: метанол: муравьиная кислота (8,0:2,0:0,1) или различных комбинаций указанных выше растворителей.
15. Способ по п.12, в котором на стадии (vi) очистку нового соединения осуществляют методом ВЭЖХ с использованием системы растворителей из ацетонитрила и воды в соотношении 70:30 и колонки RP-8 с обращенной фазой.
16. Способ по п.12, в котором чистое соединение, полученное на стадии (vi), обладает противогрибковой активностью.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2003107051/04A RU2294923C2 (ru) | 2002-03-25 | 2002-03-25 | Новое противогрибковое соединение 2-(3,4-диметил-2,5-дигидро-1h-пиррол-2-ил)-1-метилэтила пентаноат |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2003107051/04A RU2294923C2 (ru) | 2002-03-25 | 2002-03-25 | Новое противогрибковое соединение 2-(3,4-диметил-2,5-дигидро-1h-пиррол-2-ил)-1-метилэтила пентаноат |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2003107051A RU2003107051A (ru) | 2004-09-20 |
| RU2294923C2 true RU2294923C2 (ru) | 2007-03-10 |
Family
ID=37992619
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2003107051/04A RU2294923C2 (ru) | 2002-03-25 | 2002-03-25 | Новое противогрибковое соединение 2-(3,4-диметил-2,5-дигидро-1h-пиррол-2-ил)-1-метилэтила пентаноат |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2294923C2 (ru) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1573813A1 (ru) * | 1988-10-17 | 1996-05-27 | Пермский фармацевтический институт | 1-фенил-3-окси-4-этоксикарбонил-5-п-бромфенил-2,5-дигидропиррол-2-он, проявляющий противовирусную активность |
| JP2001316362A (ja) * | 1999-05-11 | 2001-11-13 | Sankyo Co Ltd | Ｎ−置換ジヒドロピロール誘導体 |
-
2002
- 2002-03-25 RU RU2003107051/04A patent/RU2294923C2/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1573813A1 (ru) * | 1988-10-17 | 1996-05-27 | Пермский фармацевтический институт | 1-фенил-3-окси-4-этоксикарбонил-5-п-бромфенил-2,5-дигидропиррол-2-он, проявляющий противовирусную активность |
| JP2001316362A (ja) * | 1999-05-11 | 2001-11-13 | Sankyo Co Ltd | Ｎ−置換ジヒドロピロール誘導体 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Mycobiology. 29(2), p.96-99, 2001. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Honda et al. | Antimycobacterial activity of lichen substances | |
| Liu et al. | Anti-Helicobacter pylori activity of bioactive components isolated from Hericium erinaceus | |
| Tomczykowa et al. | Antimicrobial and antifungal activities of the extracts and essential oils of Bidens tripartita. | |
| Prabhu et al. | Biological properties of brittle star Ophiocnemis marmorata collected from Parangipettai, Southeast coast of India | |
| Sun et al. | Antifungal and cytotoxic activities of the secondary metabolites from endophytic fungus Massrison sp. | |
| WO2019119992A1 (zh) | 一株银杏内生真菌及其代谢产物产品和应用 | |
| Santos et al. | Molecular network for accessing polyketide derivatives from Phomopsis sp., an endophytic fungus of Casearia arborea (Salicaceae) | |
| Almaqtari et al. | Antioxidant and antimicrobial of three extracts of Caralluma deflersiana Laver | |
| Sheeba et al. | In-vitro anti-cancer activity of endophytic fungi isolated from Ziziphus mauritiana in cervical cancer cell line | |
| Zhao et al. | Isolation of antifungal compound from Paeonia suffruticosa and its antifungal mechanism | |
| KR20000075672A (ko) | 항균제 | |
| RU2294923C2 (ru) | Новое противогрибковое соединение 2-(3,4-диметил-2,5-дигидро-1h-пиррол-2-ил)-1-метилэтила пентаноат | |
| Goyal et al. | Antifungal activity of Calotropis procera towards dermatoplaytes | |
| JP4420678B2 (ja) | 新規の抗真菌分子、２−（３，４−ジメチル−２，５−ジヒドロ−１ｈ−ピロル−２−イル）−１−メチルエチルペンタノエート | |
| Tawfik et al. | Metabolomics and bioactivity guided isolation of secondary metabolites from the endophytic fungus Chaetomium sp. | |
| Kosalec et al. | Isolation and cytotoxicity of low-molecular-weight metabolites of Candida albicans | |
| US6713504B2 (en) | Antifungal molecule 2-(3,4-dimethyl-2,5-dihydro-1H-pyrrol-2-yl)-1-methylethyl pentanoate | |
| KR100729437B1 (ko) | 항진균 활성이 우수한 히어리 잎 추출물과 이로부터 분리된텔리마그란딘 ⅰ | |
| Ajijolakewu et al. | Phytochemical Profiling, GC-MS Analysis and Antibacterial Activity of Sida acuta leave Extracts against Helicobacter pylori | |
| EP2468718A1 (en) | Cabanillasin, a new antifungal compound, produced by entomopathogenic xenorhabdus cabanillasii | |
| CN104818226B (zh) | 一种具有抑制Aβ聚集活性的化合物的制备方法与用途 | |
| Aboellil et al. | Effect of some alternative medicine and biological factors on Candida albicans in Saudi Arabia | |
| Uzair et al. | In vitro antifungal activity of 9, 10-dihydrophenanthrene-2-carboxylic acid isolated from a marine bacterium: Pseudomonas putida | |
| Abdulrazik et al. | Structure elucidation and anti-Klebsiella activity with in silico ADME prediction and molecular docking of the bioactive metabolite from Aspergillus sp. 3MAG | |
| Shukla et al. | Evaluation of the in-vitro antifungal activity of selected fungal species tested against opportunistic human pathogen Candida albicans |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20160326 |