RU2292393C2 - Method for production of collagenase inhibitor from hepatopancreas of commercial crab species - Google Patents
Method for production of collagenase inhibitor from hepatopancreas of commercial crab species Download PDFInfo
- Publication number
- RU2292393C2 RU2292393C2 RU2005105966/13A RU2005105966A RU2292393C2 RU 2292393 C2 RU2292393 C2 RU 2292393C2 RU 2005105966/13 A RU2005105966/13 A RU 2005105966/13A RU 2005105966 A RU2005105966 A RU 2005105966A RU 2292393 C2 RU2292393 C2 RU 2292393C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- inhibitor
- supernatant
- centrifugation
- distilled water
- collagenase inhibitor
- Prior art date
Links
- 210000000514 hepatopancreas Anatomy 0.000 title claims abstract description 11
- 101000645291 Bos taurus Metalloproteinase inhibitor 2 Proteins 0.000 title claims abstract description 10
- 229940122097 Collagenase inhibitor Drugs 0.000 title claims abstract description 10
- 101000669513 Homo sapiens Metalloproteinase inhibitor 1 Proteins 0.000 title claims abstract description 10
- 102100039364 Metalloproteinase inhibitor 1 Human genes 0.000 title claims abstract description 10
- 239000002442 collagenase inhibitor Substances 0.000 title claims abstract description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 26
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims abstract description 20
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 18
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 13
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims abstract description 13
- VSGNNIFQASZAOI-UHFFFAOYSA-L calcium acetate Chemical compound [Ca+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O VSGNNIFQASZAOI-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 11
- 235000011092 calcium acetate Nutrition 0.000 claims abstract description 11
- 239000001639 calcium acetate Substances 0.000 claims abstract description 11
- 229960005147 calcium acetate Drugs 0.000 claims abstract description 11
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims abstract description 7
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 claims abstract description 6
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 claims abstract description 6
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 238000011033 desalting Methods 0.000 claims description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 7
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 abstract description 6
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 5
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 abstract description 5
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 33
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 13
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 13
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 12
- 230000003366 colagenolytic effect Effects 0.000 description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 8
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 8
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 7
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 5
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 5
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 241001529572 Chaceon affinis Species 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 4
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 4
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 241000251730 Chondrichthyes Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 2
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 2
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 230000000791 anti-collagenolytic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 2
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 239000003475 metalloproteinase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 2
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 208000032544 Cicatrix Diseases 0.000 description 1
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 description 1
- 101150024478 MMT1 gene Proteins 0.000 description 1
- BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N Orthosilicate Chemical compound [O-][Si]([O-])([O-])[O-] BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000238124 Paralithodes camtschaticus Species 0.000 description 1
- 206010063493 Premature ageing Diseases 0.000 description 1
- 208000032038 Premature aging Diseases 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 206010040799 Skin atrophy Diseases 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000001772 anti-angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 239000003541 chymotrypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 208000030533 eye disease Diseases 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002440 industrial waste Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N n-[(2s,3r,4r,5s,6r)-2-[(2r,3s,4r,5r,6s)-5-acetamido-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-(4-methyl-2-oxochromen-7-yl)oxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]acetamide Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](NC(C)=O)[C@H](OC=2C=C3OC(=O)C=C(C)C3=CC=2)O[C@@H]1CO UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 210000003079 salivary gland Anatomy 0.000 description 1
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 1
- 230000037387 scars Effects 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000011121 sodium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- -1 therefore Substances 0.000 description 1
- 230000001228 trophic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 230000037303 wrinkles Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению высокоочищенных и высокоактивных препаратов ингибиторов ферментов, которые могут быть использованы в медицине, косметологии, ветеринарии и пищевой промышленности, а также для исследовательских целей.The invention relates to biotechnology, in particular to the production of highly purified and highly active preparations of enzyme inhibitors, which can be used in medicine, cosmetology, veterinary medicine and the food industry, as well as for research purposes.
Коллагеназы камчатского краба успешно используются в медицине для лечения ожогов, гнойно-трофических язв, послеоперационных рубцов. Механизм процесса заживления ран при применении препарата протеолитического/коллагенолитического действия заключается в лизисе некротических тканей, что приводит к очищению раны. Следующей стадией является процесс заживления раны, восстановление новых клеток тканей и кожи. Если концентрация коллагеназ и коллагенолитических ферментов в препарате очень большая, то процессы восстановления могут замедлиться за счет гидролиза этими ферментами коллагена здоровых тканей, поэтому необходимо блокировать ферментативное действие. Особенно это важно при лечении глазных заболеваний. Наиболее физиологичный способ - применение соответствующих ингибиторов, однако как коллагеназы, так и коллагенолитические ферменты устойчивы к действию известных ингибиторов трипсина и химотрипсина. Коллагеназы вызывают деградацию коллагена, что связано с преждевременным старением кожи. Поэтому ингибитор коллагеназ можно ввести в различные косметические средства (кремы, лосьоны, гели, мази) для предотвращения образования морщин или лечения атрофии кожи.King crab collagenases are successfully used in medicine for the treatment of burns, purulent trophic ulcers, postoperative scars. The mechanism of the wound healing process with the use of a proteolytic / collagenolytic drug consists in the lysis of necrotic tissues, which leads to wound cleansing. The next stage is the process of wound healing, restoration of new tissue and skin cells. If the concentration of collagenases and collagenolytic enzymes in the preparation is very high, then the recovery processes can slow down due to the hydrolysis of healthy tissues by the collagen enzymes, therefore it is necessary to block the enzymatic effect. This is especially important in the treatment of eye diseases. The most physiological method is the use of appropriate inhibitors, however, both collagenase and collagenolytic enzymes are resistant to known trypsin and chymotrypsin inhibitors. Collagenases cause degradation of collagen, which is associated with premature aging of the skin. Therefore, a collagenase inhibitor can be introduced into various cosmetics (creams, lotions, gels, ointments) to prevent the formation of wrinkles or to treat skin atrophy.
Известен способ получения ингибитора протеиназ (но не коллагеназ) из органов крупного рогатого скота, который заключается в том, что сырье измельчают, проводят экстракцию в кислой среде, обрабатывают экстракт, после удаления осадка целевой продукт выделяют хроматографией на адсорбенте силикатного типа и осаждают из элюата органическими растворителями. По указанному способу удается выделить продукт с активностью 500-1500 КИЕ/мг, однако указанный продукт не отвечает требованиям, предъявляемым к медицинским препаратам ингибитора протеиназ.A known method of producing a proteinase inhibitor (but not collagenase) from cattle organs is that the raw materials are crushed, extracted in an acidic medium, the extract is treated, after removal of the precipitate, the target product is isolated by chromatography on a silicate adsorbent and precipitated from the eluate with organic solvents. By this method, it is possible to isolate a product with an activity of 500-1500 KIE / mg, however, this product does not meet the requirements for proteinase inhibitor medications.
Патент Германии №1492114, А 61 К 17/00, 1972.German patent No. 1492114, A 61 K 17/00, 1972.
Известен способ получения ингибитора коллагеназы из акульих хрящей. Экстракты хрящей акулы обладают антиангиогенной, непосредственной противоопухолевопролиферирующей, антивоспалительной и антиколлагенолитической активностями. Способ включает стадии получения гомогената хряща в водном растворе, центрифугирования этого гомогената и дальнейшего его фракционирования до получения полного экстракта, содержащего молекулы до 500 кДа. Дополнительное фракционирование экстракта с помощью ультрафильтрации на мембранных фильтрах и гель-фильтрации на Суперозе S-12 и гидрофобной хроматографии на колонке с СДС-S-гексил в режиме FPLC (жидкостной хроматографии высокого давления) позволило выделить одну из фракций экстракта (до 10 кДа), обладающую антиколлагенолитической активностью. Ингибиторное действие на коллагеназу 1 типа (ММТ1) определяли по флюорогенному субстрату и с помощью электрофореза в SDS-PAGE.A known method of producing a collagenase inhibitor from shark cartilage. Cartilage shark extracts have antiangiogenic, direct antitumor proliferating, anti-inflammatory and anticollagenolytic activities. The method includes the steps of obtaining cartilage homogenate in an aqueous solution, centrifuging this homogenate and further fractionating it to obtain a complete extract containing molecules of up to 500 kDa. Additional fractionation of the extract using ultrafiltration on membrane filters and gel filtration on Superose S-12 and hydrophobic chromatography on a column with SDS-S-hexyl in FPLC mode (high pressure liquid chromatography) made it possible to isolate one of the extract fractions (up to 10 kDa), possessing anticollagenolytic activity. The inhibitory effect on type 1 collagenase (MMT1) was determined by fluorogenic substrate and by electrophoresis in SDS-PAGE.
Способ очень сложен в исполнении, т.к. на стадии фракционирования включает множество трудоемких сложных операций, осуществимых только в хорошо оборудованных лабораториях. Кроме того, источник ингибитора - акулий хрящ практически не содержит протеолитические ферменты, и ингибитор, полученный по вышеуказанному способу, относится к ингибиторам металлопротеиназ.The method is very difficult to implement, because at the fractionation stage, it includes many time-consuming complex operations that can be carried out only in well-equipped laboratories. In addition, the source of the inhibitor - shark cartilage practically does not contain proteolytic enzymes, and the inhibitor obtained by the above method refers to metalloproteinase inhibitors.
Патент РФ №2157695, А 61 К 35/60, 20.10.2000.RF patent No. 2157695, A 61 K 35/60, 20.10.2000.
Ближайшим техническим решением является способ получения основного ингибитора протеиназ (но не коллагеназ), из органов крупного рогатого скота, заключающийся в том, что органы крупного рогатого скота, содержащие ингибитор (легкие, поджелудочная железа, слюнные железы, измельчают (гомогенизируют), проводят экстракцию в кислой среде, отделяют жмых, удаляют липиды и белки, центрифугируют, основной экстракт-ингибитор протеиназ хроматографируют на сульфокатионите, элюат обрабатывают соляной кислотой до рН 1-3, удаляют осадок балластных белков, полученный супернатант обрабатывают трихлоруксусной кислотой до ее концентрации 2,5-7,0%, повторно удаляют примесные белки, из надосадочной жидкости высаливают основной ингибитор протеиназ, который потом очищают хроматографией на сефадексе, а затем выделяют препарат осаждением ацетоном или лиофильной сушкой. Получают апирогенный препарат, активность которого не менее 5000 КИЕ/мг.The closest technical solution is a method for producing a basic inhibitor of proteinases (but not collagenases) from cattle organs, which consists in the fact that cattle organs containing an inhibitor (lungs, pancreas, salivary glands, are crushed (homogenized), extracted into acidic medium, oilcake is separated, lipids and proteins are removed, centrifuged, the main proteinase inhibitor extract is chromatographed on sulfocationite, the eluate is treated with hydrochloric acid to pH 1-3, and the ballast protein precipitate is removed , the obtained supernatant is treated with trichloroacetic acid to a concentration of 2.5-7.0%, impurity proteins are removed again, the main proteinase inhibitor is salted out from the supernatant, which is then purified by chromatography on Sephadex, and then the drug is isolated by precipitation with acetone or freeze-drying. a drug whose activity is not less than 5000 KIE / mg.
Недостатками способа является многостадийность процесса, использование большого количества легко воспламеняющихся дорогих органических растворителей (спирт, ацетон) и высоких концентраций трихлоруксусной кислоты (50%), соляной кислоты и едкого натра, которые требуют при использовании особых условий, также отрицательно влияют на экологические условия, требуя разработки специальных способов утилизации отходов производства. Существенным недостатком является применение на стадии обессоливания препарата колонки с дорогостоящим сефадексом импортного производства. По существу этот многостадийный лабораторный метод получения ингибитора не поддается масштабированию.The disadvantages of the method is the multi-stage process, the use of a large number of easily flammable expensive organic solvents (alcohol, acetone) and high concentrations of trichloroacetic acid (50%), hydrochloric acid and caustic soda, which require special conditions, also negatively affect environmental conditions, requiring development of special methods for the disposal of industrial waste. A significant drawback is the use at the stage of desalination of the drug column with expensive Sephadex imported. In essence, this multi-stage laboratory method for producing an inhibitor is not scalable.
Патент РФ №2067868, А 61 К 35/39, 20.10.1996.RF patent No. 2067868, A 61 K 35/39, 10.20.1996.
Задачей изобретения является создание способа выделения неизвестного ранее эндогенного ингибитора коллагенолитических ферментов из гепатопанкреаса камчатского краба экономичным способом.The objective of the invention is to provide a method for isolating previously unknown endogenous inhibitor of collagenolytic enzymes from hepatopancreas king crab in an economical way.
Поставленная задача решается тем, что в способе получения ингибитора коллагеназы, включающем гомогенизацию сырья, содержащего протеолитические ферменты, способ характеризуется проведением гомогенизации сырья в 0,1 М ацетате аммония, содержащем 0,1-1 мМ ацетата кальция при рН 6,4-7,0, гомогенат затем центрифугируют, к супернатанту добавляют сульфат аммония до 60-70% насыщения, полученный комплекс ферментов отделяют центрифугированием, растворяют последний в дистиллированной воде с добавлением 0,1-1 мМ ацетата кальция до получения истинного раствора с последующей очисткой, концентрированием и обессоливанием ферментов на поливолоконной мембране с размером пор 100 кДа и промывкой супернатанта, содержащего ингибитор коллагеназы дистиллированной водой, с последующим прогреванием до 60-100°С, отделением осадка центрифугированием и лиофильным высушиванием.The problem is solved in that in the method for producing a collagenase inhibitor, including the homogenization of raw materials containing proteolytic enzymes, the method is characterized by the homogenization of raw materials in 0.1 M ammonium acetate containing 0.1-1 mm calcium acetate at pH 6.4-7, 0, the homogenate is then centrifuged, ammonium sulfate is added to the supernatant to 60-70% of saturation, the resulting enzyme complex is separated by centrifugation, the latter is dissolved in distilled water with the addition of 0.1-1 mM calcium acetate to obtain a true solution. ora, followed by purification, concentration and desalting polyfiber enzymes on the membrane with a pore size of 100 kDa and wash supernatant containing collagenase inhibitor distilled water, followed by heating to 60-100 ° C, separating the precipitate by centrifugation and freeze-drying.
Обычно супернатант промывают дистиллированной водой не менее 3-х раз, а прогревание супернатанта ведут преимущественно при 80-85°С в течение 25-40 мин.Typically, the supernatant is washed with distilled water at least 3 times, and the supernatant is heated predominantly at 80-85 ° C for 25-40 minutes.
Гепатопанкреас крабов, особенно камчатского краба, является источником протеолитических ферментов, в том числе и коллагеназ, способных образовывать комплексы с эндогенным ингибитором, коллагенолитические ферменты гепатопанкреаса краба относятся к особому семейству ферментов - брахиуринам. Это сериновые протеиназы, совмещающие в себе свойства трипсина и химотрипсина, поэтому ингибиторы металлопротеиназ на них не действуют. Гепатопанкреас является доступным, дешевым и нетоксичным сырьем для получения ферментных препаратов, поэтому выделение неизвестного ранее эндогенного ингибитора коллагенолитических ферментов из гепатопанкреаса камчатского краба является основной задачей настоящего изобретения.Hepatopancreas of crabs, especially Kamchatka crab, is a source of proteolytic enzymes, including collagenases that can form complexes with an endogenous inhibitor, collagenolytic enzymes of hepatopancreas crab belong to a special family of enzymes - brachiurins. These are serine proteinases that combine the properties of trypsin and chymotrypsin, therefore, metalloproteinase inhibitors do not act on them. Hepatopancreas is an affordable, cheap and non-toxic raw material for the preparation of enzyme preparations; therefore, the isolation of a previously unknown endogenous inhibitor of collagenolytic enzymes from king crab hepatopancreas is the main objective of the present invention.
Сущность предлагаемого способа заключается в следующем. В качестве источника ингибитора коллагеназы используют гепатопанкреас промысловых видов краба, который гомогенизируют в 0,1 М ацетате аммония рН 6,4, содержащем 0,1-1-мМ ацетат кальция. Экстракт отделяют центрифугированием, добавляют сульфат аммония 60-70% насыщения, осадок, содержащий комплекс коллагеназ и коллагенолитических ферментов с ингибитором, отделяют центрифугированием, растворяют в воде с добавлением 0,1-1,0 мМ ацетата кальция до получения истинного раствора. Концентрирование, обессоливание, очистку проводят следующим образом. Концентрирование раствора проводят на мембранном аппарате для микрофильтрации PELLICON, "Millipore" с размером пор 100 кДа. Супернатант, содержащий целевой продукт, промывают дистиллированной водой 3 раза, прогреванют до 60-100°С, преимущественно при 80-85°С, в течение 25-40 мин для инактивации протеолитических ферментов, удаляют образовавшийся осадок центрифугированием (12000g, 7 мин), а супернатант, содержащий ингибитор, лиофильно высушивают. Получают препарат ингибитора в количестве 56 г.The essence of the proposed method is as follows. As a source of collagenase inhibitor, hepatopancreas of commercial species of crab is used, which are homogenized in 0.1 M ammonium acetate, pH 6.4, containing 0.1-1 mm calcium acetate. The extract is separated by centrifugation, ammonium sulfate 60-70% of saturation is added, the precipitate containing a complex of collagenases and collagenolytic enzymes with an inhibitor is separated by centrifugation, dissolved in water with the addition of 0.1-1.0 mm calcium acetate to obtain a true solution. Concentration, desalination, purification is carried out as follows. Concentration of the solution is carried out on a PELLICON "Millipore" membrane microfiltration apparatus with a pore size of 100 kDa. The supernatant containing the target product is washed 3 times with distilled water, heated to 60-100 ° C, mainly at 80-85 ° C, for 25-40 minutes to inactivate proteolytic enzymes, the precipitate formed is removed by centrifugation (12000g, 7 min), and the supernatant containing the inhibitor is freeze-dried. Get the inhibitor drug in the amount of 56 g.
Пример 1.Example 1
20 кг гепатопанкреаса гомогенизируют в 0,1 М ацетате аммония рН 6,4, содержащем 0,3 мМ ацетата кальция, затем осадок отделяют центрифугированием при 10000 об/мин, к супернатанту добавляют сульфат аммония 60-70% насыщения и через 20 часов снова центрифугируют. Полученный осадок (сульфат-паста) растворяют в 15 л дистиллированной с добавлением 0,1 мМ ацетата кальция воды до получения истинного раствора, объем доводят до 100 л и тщательно перемешивают. Концентрирование раствора проводят на мембранном аппарате для микрофильтрации PELLICON, "Millipore" с размером пор 100 кДа. Концентрат объемом 10 л доводят дистиллированной водой до 50 л и снова концентрируют до 10 л. Эту процедуру проводят еще два раза. Супернатант, содержащий целевой продукт, прогревают при 80°С в течение 25 мин, удаляют образовавшийся осадок центрифугированием (12000g, 7 мин), а раствор высушивают на сублимационной сушке TG-50, Германия. Выход препарата ингибитора составляет 56 г.20 kg of hepatopancreas are homogenized in 0.1 M ammonium acetate, pH 6.4, containing 0.3 mM calcium acetate, then the precipitate is separated by centrifugation at 10,000 rpm, ammonium sulfate 60-70% saturation is added to the supernatant and centrifuged again after 20 hours . The resulting precipitate (sulfate paste) is dissolved in 15 L of distilled water with the addition of 0.1 mM calcium acetate to obtain a true solution, the volume is adjusted to 100 L and mixed thoroughly. Concentration of the solution is carried out on a PELLICON "Millipore" membrane microfiltration apparatus with a pore size of 100 kDa. A 10 L concentrate is adjusted to 50 L with distilled water and concentrated again to 10 L. This procedure is carried out two more times. The supernatant containing the target product is heated at 80 ° C for 25 min, the precipitate formed is removed by centrifugation (12000g, 7 min), and the solution is freeze dried TG-50, Germany. The yield of the inhibitor drug is 56 g.
Пример 2.Example 2
500 г препарата коллагеназы производства фирмы «Биопрогресс» растворяют в 15 л дистиллированной воды с добавлением 0,2 мМ ацетата кальция до получения истинного раствора. Объем полученного раствора доводят до 50 л, тщательно перемешивают. Раствор далее подвергают очистке на мембранном аппарате для микрофильтрации PELLICON, "Millipore" с размером пор 100 кДа. Целевой продукт содержится в супернатанте. Супернатант затем концентрируют до 10 л, три раза промывают дистиллированной водой, прогревают до 90°С в течение 40 мин, удаляют образовавшийся осадок центрифугированием (12000g, 7 мин), а раствор, содержащий ингибитор, высушивают на сублимационной сушке TG-50, Германия. Выход препарата ингибитора составляет 45 г.500 g of the bioprogress collagenase preparation are dissolved in 15 l of distilled water with the addition of 0.2 mM calcium acetate until a true solution is obtained. The volume of the resulting solution was adjusted to 50 l, mix thoroughly. The solution is then cleaned on a PELLICON, Millipore microfiltration membrane apparatus with a pore size of 100 kDa. The target product is contained in the supernatant. The supernatant is then concentrated to 10 L, washed three times with distilled water, heated to 90 ° C for 40 minutes, the precipitate formed is removed by centrifugation (12000g, 7 minutes), and the solution containing the inhibitor is dried on a TG-50 freeze dryer, Germany. The output of the inhibitor is 45 g.
Полученный в соответствии с предлагаемым способом ингибитор представляет собой порошок светло-коричневого оттенка, хорошо растворимый в водных буферных растворах.Obtained in accordance with the proposed method, the inhibitor is a light brown powder, readily soluble in aqueous buffer solutions.
При исследовании ингибирующего действия полученного препарата с применением хромогенного субстрата коллагенолитической сериновой протеиназы PC Glp-Ala-Ala-Leu-pNA было показано, что ингибирующая активность является дозозависимой. Результаты исследований приведены в таблице.When studying the inhibitory effect of the obtained preparation using the chromogenic substrate of collagenolytic serine protease PC Glp-Ala-Ala-Leu-pNA, it was shown that the inhibitory activity is dose-dependent. The research results are shown in the table.
Ингибирование коллагеназной активности препарата «Морикраза» было подтверждено электрофорезом гидролизата коллагена типа I.Inhibition of the collagenase activity of Moricrase was confirmed by electrophoresis of type I collagen hydrolyzate.
На чертеже показана электрофоретическая характеристика ингибитора и его ингибирующего действия коллагенолитической активности препарата «Морикраза». 12% ПААГ, инкубация проводилась при комнатной температуре. Дорожка 1 - препарат «Морикраза», дорожка 2 - препарат ингибитора, дорожка 3 - исходный препарат коллагена типа I, дорожка 4 - препарат коллагена + препарат «Морикраза» в соотношении 30:1, время инкубации 1 час, + препарат ингибитора без инкубации с ним; дорожки 5-8: время инкубации с ингибитором 2 часа, соотношение фермент: ингибитор = 1:100 - дорожки 5 (время инкубации коллагена с «Морикразой» 1 час) и дорожка 6 (время инкубации коллагена с «Морикразой»24 часа); соотношение фермент: ингибитор = 1:50 - дорожка 7 (время инкубации коллагена с «Морикразой» 1 час) и дорожка 8 (инкубации коллагена с «Морикразой» время 24 часа). Стрелкой отмечено положение полосы, соответствующей неразрушенному коллагену.The drawing shows the electrophoretic characteristic of the inhibitor and its inhibitory effect of the collagenolytic activity of the drug "Morikraz". 12% SDS page, incubation was carried out at room temperature. Lane 1 - Moricrase preparation, Lane 2 - inhibitor preparation, Lane 3 - initial type I collagen preparation, Lane 4 - collagen preparation + Moricrase preparation in a ratio of 30: 1, incubation time 1 hour, + inhibitor preparation without incubation with him; lanes 5-8: incubation time with the inhibitor 2 hours, the ratio of enzyme: inhibitor = 1: 100 - lanes 5 (incubation time of collagen with Moricrase 1 hour) and lane 6 (incubation time of collagen with Moricrase 24 hours); the ratio of enzyme: inhibitor = 1:50 - lane 7 (incubation time of collagen with Morikraz "1 hour) and lane 8 (incubation of collagen with" Morikraz "24 hours). The arrow indicates the position of the strip corresponding to undestructed collagen.
Коллагеназное действие препарата блокируется при наличии эндогенного ингибитора в соотношении фермент: ингибитор не менее чем 1:100.The collagenase effect of the drug is blocked in the presence of an endogenous inhibitor in the ratio of enzyme: inhibitor of at least 1: 100.
Как видно из чертежа, только при соотношении препарат «Морикраза»: ингибитор = 100:1 наблюдается полное ингибирование истинной коллагеназной активности (см. дорожки 5 и 6). Чистоту ингибитора демонстрирует дорожка 2, где видны только две интенсивные белковые полосы. Возможно это изоформы одного и того же ингибитора.As can be seen from the drawing, only with the ratio of the drug "Morikraz": inhibitor = 100: 1, a complete inhibition of true collagenase activity is observed (see lanes 5 and 6). The purity of the inhibitor is demonstrated by lane 2, where only two intense protein bands are visible. Perhaps these are isoforms of the same inhibitor.
Предлагаемый способ позволяет получить неизвестный ранее эндогенный ингибитор коллагенолитических ферментов из гепатопанкреаса камчатского краба достаточно экономичным способом благодаря использованию метода микрофильтрации на специально подобранных мембранах. Это позволяет значительно сократить время проведения процесса и удешевить производство ингибитора. Проведение микрофильтрации на мембране с размером пор 100 кДа позволяет удалять низкомолекулярные примеси и коллагенолитические ферменты, полностью сохраняя ингибитор, осуществить обессоливание и концентрирование препарата на том же аппарате, что приводит к получению концентрированных растворов, время высушивания которых значительно сокращается. Высаливание белков дешевым сульфатом аммония при слабокислом и нейтральном рН способствует сохранению активности ингибиторов и удешевлению процесса. Кроме того, применение ацетата и сульфата аммония для экстракции и высаливания ингибитора вместо спирта, ацетона, трихлоруксусной кислоты, применяемых по прототипу, более удачно с точки зрения экологической безопасности процесса, т.к. растворы солей аммония при разбавлении могут быть использованы для удобрения растений.The proposed method allows to obtain previously unknown endogenous inhibitor of collagenolytic enzymes from hepatopancreas of king crab in a rather economical way due to the use of microfiltration on specially selected membranes. This can significantly reduce the time of the process and reduce the cost of production of the inhibitor. Microfiltration on a membrane with a pore size of 100 kDa allows you to remove low molecular weight impurities and collagenolytic enzymes, completely preserving the inhibitor, desalting and concentrating the drug on the same apparatus, which leads to concentrated solutions, the drying time of which is significantly reduced. Salting out proteins with cheap ammonium sulfate at low acid and neutral pH helps to maintain the activity of inhibitors and reduce the cost of the process. In addition, the use of ammonium acetate and sulfate for extraction and salting out of the inhibitor instead of the alcohol, acetone, trichloroacetic acid used in the prototype is more successful from the point of view of environmental safety of the process, because solutions of ammonium salts upon dilution can be used to fertilize plants.
Claims (3)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2005105966/13A RU2292393C2 (en) | 2005-03-03 | 2005-03-03 | Method for production of collagenase inhibitor from hepatopancreas of commercial crab species |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2005105966/13A RU2292393C2 (en) | 2005-03-03 | 2005-03-03 | Method for production of collagenase inhibitor from hepatopancreas of commercial crab species |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2005105966A RU2005105966A (en) | 2006-08-10 |
| RU2292393C2 true RU2292393C2 (en) | 2007-01-27 |
Family
ID=37059368
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2005105966/13A RU2292393C2 (en) | 2005-03-03 | 2005-03-03 | Method for production of collagenase inhibitor from hepatopancreas of commercial crab species |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2292393C2 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2403284C1 (en) * | 2009-11-25 | 2010-11-10 | Закрытое акционерное общество Научно-производственное предприятие "Тринита" | Method of producing anticoagulative collagenase inhibitor from king crab hepatopancreas |
| RU2412995C1 (en) * | 2009-11-25 | 2011-02-27 | Закрытое акционерное общество Научно-производственное предприятие "Тринита" | Method of obtaining collagenase inhibitor with anti-tumour action from hepatopancreas of red king crab |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992010197A1 (en) * | 1990-12-11 | 1992-06-25 | Zetesis S.P.A. | Substances of polypeptide nature useful in human therapy |
| RU2067868C1 (en) * | 1993-03-19 | 1996-10-20 | Игорь Алексеевич Донецкий | Method of preparing basic proteinase inhibitor from cattle organs |
-
2005
- 2005-03-03 RU RU2005105966/13A patent/RU2292393C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992010197A1 (en) * | 1990-12-11 | 1992-06-25 | Zetesis S.P.A. | Substances of polypeptide nature useful in human therapy |
| RU2067868C1 (en) * | 1993-03-19 | 1996-10-20 | Игорь Алексеевич Донецкий | Method of preparing basic proteinase inhibitor from cattle organs |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2403284C1 (en) * | 2009-11-25 | 2010-11-10 | Закрытое акционерное общество Научно-производственное предприятие "Тринита" | Method of producing anticoagulative collagenase inhibitor from king crab hepatopancreas |
| RU2412995C1 (en) * | 2009-11-25 | 2011-02-27 | Закрытое акционерное общество Научно-производственное предприятие "Тринита" | Method of obtaining collagenase inhibitor with anti-tumour action from hepatopancreas of red king crab |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2005105966A (en) | 2006-08-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Shanmugam et al. | Antioxidative peptide derived from enzymatic digestion of buffalo casein | |
| Raskovic et al. | Identification, purification and characterization of a novel collagenolytic serine protease from fig (Ficus carica var. Brown Turkey) latex | |
| MX2007006074A (en) | Debriding composition from bromelain and methods of production thereof. | |
| KR20170049432A (en) | Peptides having effects on promoting wound healing, collagen production, angiogenesis, activation of immunocytes and reducing wound infection, and applications thereof | |
| Bédouet et al. | Heterogeneity of proteinase inhibitors in the water-soluble organic matrix from the oyster nacre | |
| DE3230151A1 (en) | NEW POLYPEPTIDE WITH EFFECT ON THE IMMUNE SYSTEM, METHOD FOR ITS INSULATION AND CLEANING, ITS USE, ITS CONTAINER, AND ITS DIFFERENT PRODUCTS, THEIR USE AND ITEMS | |
| Jain et al. | Review on isolation and purification of papain enzyme from papaya fruit | |
| RU2292393C2 (en) | Method for production of collagenase inhibitor from hepatopancreas of commercial crab species | |
| JP2004149736A (en) | Chondroitin sodium sulfate, chondroitin sulfate-containing substance, and method for producing them | |
| US12325868B2 (en) | Purified fish proteases with high specific activities and its process of production | |
| RU2249047C2 (en) | Method of preparing protein hydrolyzate from solid chromium-containing leather manufacture waste | |
| RU2272808C2 (en) | Method for preparing collagen | |
| RU2088241C1 (en) | Method of preparing the protease basic inhibitor from the cattle lung and pancreas | |
| Renu et al. | Studies on collagen hydrolysis by pineapple (Ananas comosus) stem bromelain | |
| CN104892723B (en) | Preparation method of hairtail liver antibacterial peptide | |
| RU2749424C1 (en) | Method for obtaining drug with anti-coagulant activity | |
| RU2236460C1 (en) | Method for preparing collagenase | |
| KR100381363B1 (en) | A new method of extracting and refining a porphyran from laver for treating hyperlipemia | |
| RU2610669C1 (en) | Method for production of proteolytic preparation for medical use | |
| RU2067868C1 (en) | Method of preparing basic proteinase inhibitor from cattle organs | |
| Nurhayati et al. | Purification and characterization of a cathepsin inhibitor from catfish (Pangasius sp.) of Indonesian water. | |
| RU2584601C1 (en) | Method of extracting proteolytic terrilytin enzyme | |
| ES2456697T3 (en) | Procedure for obtaining chondroitinsulfuric acid and its uses | |
| RU2157381C1 (en) | Method of preparing hyaluronic acid | |
| CN119842848B (en) | Hydrolyzed collagen and its preparation method and application |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20160304 |