[go: up one dir, main page]

RU2285540C2 - METHOD FOR PRODUCTION OF Bordetella pertussis ANATOXIN - Google Patents

METHOD FOR PRODUCTION OF Bordetella pertussis ANATOXIN Download PDF

Info

Publication number
RU2285540C2
RU2285540C2 RU2005101243/13A RU2005101243A RU2285540C2 RU 2285540 C2 RU2285540 C2 RU 2285540C2 RU 2005101243/13 A RU2005101243/13 A RU 2005101243/13A RU 2005101243 A RU2005101243 A RU 2005101243A RU 2285540 C2 RU2285540 C2 RU 2285540C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
concentration
supernatant
toxoid
sucrose
sorption
Prior art date
Application number
RU2005101243/13A
Other languages
Russian (ru)
Other versions
RU2005101243A (en
Inventor
Нинель Сергеевна Захарова (RU)
Нинель Сергеевна Захарова
Ирина Глебовна Бажанова (RU)
Ирина Глебовна Бажанова
Марина Васильевна Брицина (RU)
Марина Васильевна Брицина
Натали Устиновна Мерцалова (RU)
Наталия Устиновна Мерцалова
Мари Николаевна Озерецковска (RU)
Мария Николаевна Озерецковская
Елена Викторовна Ермолова (RU)
Елена Викторовна Ермолова
Евгений Михайлович Зайцев (RU)
Евгений Михайлович Зайцев
кина Тать на Ивановна Вал (RU)
Татьяна Ивановна Валякина
Равил Люкмановна Комалева (RU)
Равиля Люкмановна Комалева
нов Владимир Андреевич Несме (RU)
Владимир Андреевич Несмеянов
Тать на Михайловна Андронова (RU)
Татьяна Михайловна Андронова
Original Assignee
Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова filed Critical Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова
Priority to RU2005101243/13A priority Critical patent/RU2285540C2/en
Publication of RU2005101243A publication Critical patent/RU2005101243A/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2285540C2 publication Critical patent/RU2285540C2/en

Links

Landscapes

  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

FIELD: medicine, microbiology, in particular production of cell-free whooping-cough vaccine.
SUBSTANCE: claimed method includes cultivation of whooping-cough bacteria in liquid broth, supernatant separation, stabilization thereof with sucrose, isolation of toxic material therefrom; detoxication of toxic material with formalin and anatoxin sorption on aluminum hydroxide gel. After sorption adsorbed preparation is combined with glucoseminyl muramyl dipeptide in concentration of 0.02-0.2 %. Moreover supernatant stabilization is carried out by subsequent sucrose addition to obtain concentration of 3-4 % followed by mixture conditioning at 4-10°C for 16-20 hours.
EFFECT: high active and low toxic Bordetella pertussis anatoxin useful in production of cell-free whooping-cough vaccine.
2 cl, 2 ex

Description

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для производства бесклеточной коклюшной вакцины.The invention relates to medical microbiology and can be used for the production of acellular pertussis vaccine.

Известен способ получения анатоксина Bordetella pertussis путем культивирования коклюшных бактерий в жидкой питательной среде, отделения супернатанта, выделения из него токсина с последующей детоксикацией формалином и сорбцией анатоксина на гидроокиси алюминия, токсин из супернатанта выделяют осаждением 3-7%-ным раствором гексаметафосфата натрия в присутствии 0,002-0,006 М растворов соляной, серной и трихлоруксусной кислот при рН 3,4-3,6, а детоксикацию токсина проводят в 8-12%-ном растворе сахарозы (RU 1369042, А 61 К 39/10, 1986 г.).There is a method of producing Bordetella pertussis toxoid by cultivating pertussis bacteria in a liquid nutrient medium, separating the supernatant, releasing toxin from it, followed by detoxification with formalin and sorption of the toxoid on aluminum hydroxide, toxin from the supernatant is isolated by precipitation with a 3-7% sodium hexametaphosphate solution in the presence of 0.002 -0.006 M solutions of hydrochloric, sulfuric and trichloroacetic acids at pH 3.4-3.6, and toxin detoxification is carried out in an 8-12% sucrose solution (RU 1369042, A 61 K 39/10, 1986).

Проблема получения высокоэффективных низкотоксичных вакцин для профилактики коклюшной инфекции остается актуальной, поскольку применяемая в практике корпускулярная вакцина обладает высокой реактогенностью, а бесклеточные коклюшные вакцины характеризуются выраженной протективной активностью и более низкой токсичностью.The problem of obtaining highly effective low-toxic vaccines for the prophylaxis of pertussis infection remains relevant, since the corpuscular vaccine used in practice is highly reactogenic, and acellular pertussis vaccines are characterized by pronounced protective activity and lower toxicity.

Повышение протективной активности бесклеточной коклюшной вакцины - одно из важных условий совершенствования этих препаратов.An increase in the protective activity of acellular pertussis vaccine is one of the important conditions for the improvement of these drugs.

Технический результат заявленного способа заключается в получении высокоактивного и низкотоксичного анатоксина Bordetella pertussis.The technical result of the claimed method is to obtain a highly active and low toxic toxoid Bordetella pertussis.

Для достижения указанного технического результата в способе получения анатоксина Bordetella pertussis путем культивирования коклюшных бактерий в жидкой питательной среде, отделения супернатанта, стабилизации его сахарозой, выделения из него токсического материала, детоксикацию токсического материала формалином и сорбцией анатоксина на геле гидроокиси алюминия, согласно изобретению после сорбции полученного анатоксина на геле гидроокиси алюминия сорбированный препарат соединяют с глюкозаминилмурамилдипептидом в концентрации 0,02-0,2%.In order to achieve the indicated technical result in the method for producing Bordetella pertussis toxoid by cultivating pertussis bacteria in a liquid nutrient medium, separating the supernatant, stabilizing it with sucrose, releasing toxic material from it, detoxifying the toxic material with formalin and sorption of the toxoid on an aluminum hydroxide gel according to the invention after sorption of the obtained toxoid on an aluminum hydroxide gel, the sorbed preparation is combined with glucosaminylmuramyl dipeptide at a concentration of 0.02-0.2%.

Кроме того, стабилизацию супернатанта осуществляют путем последовательного добавления сахарозы до концентрации 3-4% с последующим выдерживанием смеси при 4-10°С в течение 16-20 часов.In addition, the stabilization of the supernatant is carried out by successive addition of sucrose to a concentration of 3-4%, followed by maintaining the mixture at 4-10 ° C for 16-20 hours.

Сущность изобретения поясняется на следующих примерах выполнения способа.The invention is illustrated in the following examples of the method.

Пример 1. Штамм 475a Bordetella pertussis 1 фазы со среды Борде-Жангу (2-ой пассаж) инокулируют до концентрации 3,0 -3,5 МОЕ в 1 мл в матрацы, содержащие 150-200 мл жидкой питательной среды и культивируют при 35,5°С в течение 5 суток. Супернатант отделяют от микробных клеток центрифугированием при 12500 оборотов в минуту в течение 60 минут.Example 1. Strain 475a Bordetella pertussis of the 1st phase from the Borde-Zhangu medium (2nd passage) is inoculated to a concentration of 3.0-3.5 MOI in 1 ml in mattresses containing 150-200 ml of a liquid nutrient medium and cultivated at 35, 5 ° C for 5 days. The supernatant is separated from the microbial cells by centrifugation at 12,500 rpm for 60 minutes.

К 1 л супернатанта добавляют последовательно сахарозу до концентрации 3%. Смесь помещают в холодильник при 4-10°С в течение 16 часов. Затем к 1 л смеси приливают последовательно 50 мл 20% раствора гексаметафосфата натрия, 2 мл 2 Н соляной, 2 мл 2 Н серной кислот и рН смеси доводят до 3,4 2 Н трихлоруксусной кислотой (ТХУ). Осадок отделяют центрифугированием при 12500 об/мин в течение 60 минут и растворяют в 20 мл 0,07 М фосфатного буфера рН 7,5. К полученному препарату добавляют сахарозу до концентрации 10% и формалин до концентрации 0,4%. Детоксикацию препарата проводят в термостате при 37°С в течение 17 суток. Полученный анатоксин сорбируют на геле гидроокиси алюминия в концентрации 8 мкг белкового азота на 1 мг геля в 1 мл в течение 20 часов в холодильнике при 4-10°С. Сорбированный препарат соединяют с глюкозаминилмурамилдипептидом в концентрации 0,02%.Sucrose is added successively to 1 L of the supernatant to a concentration of 3%. The mixture was placed in a refrigerator at 4-10 ° C. for 16 hours. Then, 50 ml of a 20% solution of sodium hexametaphosphate, 2 ml of 2 N hydrochloric, 2 ml of 2 N sulfuric acid are successively poured into 1 L of the mixture, and the pH of the mixture is adjusted to 3.4 with 2 N trichloroacetic acid (TCA). The precipitate was separated by centrifugation at 12,500 rpm for 60 minutes and dissolved in 20 ml of 0.07 M phosphate buffer pH 7.5. Sucrose to a concentration of 10% and formalin to a concentration of 0.4% are added to the resulting preparation. Detoxification of the drug is carried out in a thermostat at 37 ° C for 17 days. The resulting toxoid is sorbed on an aluminum hydroxide gel at a concentration of 8 μg of protein nitrogen per 1 mg of gel in 1 ml for 20 hours in a refrigerator at 4-10 ° C. The sorbed preparation is combined with glucosaminylmuramyl dipeptide at a concentration of 0.02%.

Пример 2. Штамм 475a Bordetella pertussis 1 фазы со среды Борде-Жангу (2-ой пассаж) инокулируют до концентрации 3,0-3,5 МОЕ в 1 мл в матрацы, содержащие 150-200 мл жидкой питательной среды и культивируют при 35,5°С в течение 5 суток. Супернатант отделяют от микробных клеток центрифугированием при 12500 оборотов в минуту в течение 60 минут.Example 2. The strain 475a Bordetella pertussis phase 1 from the environment of Borde-Zhangu (2nd passage) is inoculated to a concentration of 3.0-3.5 MOU in 1 ml in mattresses containing 150-200 ml of liquid nutrient medium and cultivated at 35, 5 ° C for 5 days. The supernatant is separated from the microbial cells by centrifugation at 12,500 rpm for 60 minutes.

К 1 л супернатанта добавляют последовательно сахарозу до концентрации 4%. Смесь помещают в холодильник при 4-10°С в течение 20 часов. Затем к 1 л смеси приливают последовательно 50 мл 20% раствора гексаметафосфата натрия, 2 мл 2 Н соляной, 2 мл 2 Н серной кислоты и рН смеси доводят до 3,5 2 Н трихлоруксусной кислотой (ТХУ). Осадок отделяют центрифугированием при 12500 об/мин в течение 60 минут и растворяют в 20 мл 0,07 М фосфатного буфера рН 7,5. К полученному препарату добавляют сахарозу до концентрации 10% и формалин до концентрации 0,4%. Детоксикацию препарата проводят в термостате при 37°С в течение 17 суток. Полученный анатоксин сорбируют на геле гидроокиси алюминия в концентрации 8 мкг белкового азота на 1 мг геля в 1 мл в течение 20 часов в холодильнике при 4-10°С. Сорбированный препарат соединяют с глюкозаминилмурамилдипептидом в концентрации 0,2%.Sucrose is added successively to 1 l of the supernatant to a concentration of 4%. The mixture was placed in a refrigerator at 4-10 ° C for 20 hours. Then 50 ml of a 20% solution of sodium hexametaphosphate, 2 ml of 2 N hydrochloric, 2 ml of 2 N sulfuric acid are successively poured into 1 L of the mixture and the pH of the mixture is adjusted to 3.5 with 2 N trichloroacetic acid (TCA). The precipitate was separated by centrifugation at 12,500 rpm for 60 minutes and dissolved in 20 ml of 0.07 M phosphate buffer pH 7.5. Sucrose to a concentration of 10% and formalin to a concentration of 0.4% are added to the resulting preparation. Detoxification of the drug is carried out in a thermostat at 37 ° C for 17 days. The resulting toxoid is sorbed on an aluminum hydroxide gel at a concentration of 8 μg of protein nitrogen per 1 mg of gel in 1 ml for 20 hours in a refrigerator at 4-10 ° C. The sorbed preparation is combined with glucosaminylmuramyl dipeptide at a concentration of 0.2%.

Сравнительное изучение протективной активности анатоксинов, полученных предлагаемым и известным способами, показало, что препараты, полученные предлагаемым способом, были в 2 раза активнее препаратов, полученных известным способом. Средняя иммунизирующая доза (ED50) анатоксинов, полученных заявляемым способом, составляла 0,0992 (0,0830:0,1152) мкг белкового азота, а ED50 анатоксина, полученного известным способом составляла 0,2144 (0,1856:0,2432) мкг белкового азота.A comparative study of the protective activity of toxoids obtained by the proposed and known methods showed that the preparations obtained by the proposed method were 2 times more active than the preparations obtained by the known method. The average immunizing dose (ED 50 ) of the toxoids obtained by the claimed method was 0.0992 (0.0830: 0.1152) μg of protein nitrogen, and the ED 50 of the toxoids obtained in a known manner was 0.2144 (0.1856: 0.2432 ) μg protein nitrogen.

Различия были статистически достоверны при р>0,001.The differences were statistically significant at p> 0.001.

Индекс резистентности к заражению вирулентной культурой Bordetella pertussis мышей, иммунизированных анатоксином, приготовленньм по заявляемому способу, составил 7,9-9,34, а мышей, иммунизированных анатоксином, приготовленным известным способом, составлял 3,1, что свидетельствует о более высокой напряженности иммунитета, вызываемого анатоксином, приготовленным заявленным способом.The index of resistance to infection with a virulent culture of Bordetella pertussis mice immunized with the toxoid prepared by the present method was 7.9-9.34, and mice immunized with the toxoid prepared in a known manner was 3.1, which indicates a higher immunity, caused by toxoid prepared by the claimed method.

Анатоксин, полученный заявленным способом, в иммунизирующей дозе для человека не сенсибилизировал мышей к гистамину дигидрохлориду (гибель составляла 0%), а анатоксин, полученный известным способом, вызывал гибель 14,28% мышей после введения гистамина, что свидетельствует о более низкой токсичности анатоксина, полученного заявленным способом.The toxoid obtained by the claimed method, in an immunizing dose for humans, did not sensitize mice to histamine dihydrochloride (death was 0%), and the toxoid obtained in a known manner caused the death of 14.28% of mice after administration of histamine, which indicates a lower toxicity of toxoid, obtained by the claimed method.

Claims (2)

1. Способ получения анатоксина Bordetella pertussis путем культивирования коклюшных бактерий в жидкой питательной среде, отделения супернатанта, стабилизации его сахарозой, выделения из него токсического материала, детоксикации токсического материала формалином и сорбции анатоксина на геле гидроокиси алюминия, отличающийся тем, что после сорбции полученного анатоксина на геле гидроокиси алюминия сорбированный препарат соединяют с глюкозаминилмурамилдипептидом в концентрации 0,02-0,2%.1. The method of producing Bordetella pertussis toxoid by cultivating pertussis bacteria in a liquid nutrient medium, separating the supernatant, stabilizing it with sucrose, releasing toxic material from it, detoxifying the toxic material with formalin and sorption of the toxoid on an aluminum hydroxide gel, characterized in that after sorption of the obtained toxoid on gel aluminum hydroxide sorbed preparation is combined with glucosaminylmuramyl dipeptide at a concentration of 0.02-0.2%. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что стабилизацию супернатанта осуществляют путем последовательного добавления сахарозы до концентрации 3-4% с последующим выдерживанием смеси при 4-10°С в течение 16-20 ч.2. The method according to claim 1, characterized in that the stabilization of the supernatant is carried out by successive addition of sucrose to a concentration of 3-4%, followed by maintaining the mixture at 4-10 ° C for 16-20 hours
RU2005101243/13A 2005-01-20 2005-01-20 METHOD FOR PRODUCTION OF Bordetella pertussis ANATOXIN RU2285540C2 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2005101243/13A RU2285540C2 (en) 2005-01-20 2005-01-20 METHOD FOR PRODUCTION OF Bordetella pertussis ANATOXIN

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2005101243/13A RU2285540C2 (en) 2005-01-20 2005-01-20 METHOD FOR PRODUCTION OF Bordetella pertussis ANATOXIN

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2005101243A RU2005101243A (en) 2006-06-27
RU2285540C2 true RU2285540C2 (en) 2006-10-20

Family

ID=36714520

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2005101243/13A RU2285540C2 (en) 2005-01-20 2005-01-20 METHOD FOR PRODUCTION OF Bordetella pertussis ANATOXIN

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2285540C2 (en)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU1297712A3 (en) * 1980-09-12 1987-03-15 Такеда Кемикал Индастриз,Лтд. (Фирма) Method for producing bordetella pertussis anatoxin
SU1369042A1 (en) * 1986-02-26 1995-08-09 Центральный научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова Method for obtaining bordetella pertussis anatoxin

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU1297712A3 (en) * 1980-09-12 1987-03-15 Такеда Кемикал Индастриз,Лтд. (Фирма) Method for producing bordetella pertussis anatoxin
SU1369042A1 (en) * 1986-02-26 1995-08-09 Центральный научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова Method for obtaining bordetella pertussis anatoxin

Also Published As

Publication number Publication date
RU2005101243A (en) 2006-06-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN100387618C (en) Acellular pertussis vaccine and its preparation method
EP1762246A1 (en) Multivalent DTP-Polio vaccines
EP1028750B1 (en) Method for preparing multivalent vaccines
JP2911603B2 (en) A novel attenuated Pseudomonas aeruginosa strain
HU185404B (en) Process for preparing pertussis toxoide
CN102238960B (en) Process for production of vaccines
US4220584A (en) E. coli enterotoxin vaccine for veterinary and human use
US4551429A (en) Stimulation of antigen production by Bordetella pertussis
US5578308A (en) Glutaraldehyde and formalin detoxified bordetella toxin vaccine
KR900007644B1 (en) Method of cultivating pertussis bacteria, pertussis toxoid and pertussis vaccine
KR101623994B1 (en) Method of producing Japanese encephalitis vaccine stably storable over long time and use of the vaccine
AU2018204879A1 (en) Toxoid, compositions and related methods
EP0515415B1 (en) Novel vaccine and method therefor
RU2285540C2 (en) METHOD FOR PRODUCTION OF Bordetella pertussis ANATOXIN
HK1004524B (en) Novel vaccine and method therefor
KR102543648B1 (en) Vaccin composition containing inactivated Salmonella Gallinarum cells by the culture medium containing plantaricin of Lactobacillus plantarum for preventing or treating Fowl Typhoid
RU2227746C1 (en) Method for obtaining bordetella pertussis anatoxin
ES2625011T3 (en) Method of formulating a vaccine containing at least two antigens capable of adsorbing on aluminum oxyhydroxide
US6214356B1 (en) Use of adenylate cyclase or bacteria producing it as vaccines against bordetella
KR102077701B1 (en) Vaccin composition containing novel inactivated Salmonella Gallinarum whole cells for preventing or treating Fowl Typhoid
JPWO2000023107A1 (en) Vaccine preparations containing attenuated toxins
Navruzshoeva et al. Current trends in increasing the biological activity of vaccine strains of Bacillus anthracic
KR102376876B1 (en) Non-toxic Clostridium difficile toxin protein-fragments and uses thereof
CN103861095B (en) Containing the vaccine combination and its preparation method and application of mycoplasmal pneumonia of swine antigen and pig streptococcicosis antigen
RU2540144C1 (en) METHOD FOR OBTAINING ANATOXIN Bordetella pertussis

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20160121