RU2266959C2 - Method for biosensor production (variants) - Google Patents
Method for biosensor production (variants) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2266959C2 RU2266959C2 RU2004100874/13A RU2004100874A RU2266959C2 RU 2266959 C2 RU2266959 C2 RU 2266959C2 RU 2004100874/13 A RU2004100874/13 A RU 2004100874/13A RU 2004100874 A RU2004100874 A RU 2004100874A RU 2266959 C2 RU2266959 C2 RU 2266959C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- sensitive
- cell
- receptor
- sensitive cells
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 45
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 102
- 210000003370 receptor cell Anatomy 0.000 claims abstract description 27
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 26
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 19
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 18
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims description 18
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims description 10
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 9
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 9
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 claims description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 17
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 abstract description 5
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 abstract 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 abstract 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 15
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 241000270295 Serpentes Species 0.000 description 9
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 9
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 7
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 6
- 108050002069 Olfactory receptors Proteins 0.000 description 5
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 5
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 5
- 102000012547 Olfactory receptors Human genes 0.000 description 4
- 230000005670 electromagnetic radiation Effects 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 4
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 241000195594 Chlamydomonas gelatinosa Species 0.000 description 3
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 3
- 108091008702 infrared receptors Proteins 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 3
- 241000867607 Chlorocebus sabaeus Species 0.000 description 2
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N Nitric oxide Chemical compound O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000187561 Rhodococcus erythropolis Species 0.000 description 2
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 210000003061 neural cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 2
- 235000019645 odor Nutrition 0.000 description 2
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 2
- 230000008542 thermal sensitivity Effects 0.000 description 2
- 235000012431 wafers Nutrition 0.000 description 2
- UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 2,4-dinitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 241000195585 Chlamydomonas Species 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 102100039289 Glial fibrillary acidic protein Human genes 0.000 description 1
- 101710193519 Glial fibrillary acidic protein Proteins 0.000 description 1
- 241000271062 Gloydius halys halys Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108050002220 Green fluorescent protein, GFP Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102100024299 Maternal embryonic leucine zipper kinase Human genes 0.000 description 1
- 101710154611 Maternal embryonic leucine zipper kinase Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 102000008730 Nestin Human genes 0.000 description 1
- 108010088225 Nestin Proteins 0.000 description 1
- 241001148220 Nitrobacter vulgaris Species 0.000 description 1
- 241001474977 Palla Species 0.000 description 1
- 241000015864 Protobothrops flavoviridis Species 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 102100032938 Telomerase reverse transcriptase Human genes 0.000 description 1
- 241000271897 Viperidae Species 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 210000004081 cilia Anatomy 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 210000005258 dental pulp stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000002848 electrochemical method Methods 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000695 excitation spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005046 glial fibrillary acidic protein Anatomy 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 108091005708 gustatory receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000009459 hedgehog signaling Effects 0.000 description 1
- 230000000971 hippocampal effect Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000012308 immunohistochemistry method Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 210000000110 microvilli Anatomy 0.000 description 1
- QVCMHGGNRFRMAD-XFGHUUIASA-N monocrotaline Chemical compound C1OC(=O)[C@](C)(O)[C@@](O)(C)[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]2CCN3[C@@H]2C1=CC3 QVCMHGGNRFRMAD-XFGHUUIASA-N 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 210000005055 nestin Anatomy 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 210000005155 neural progenitor cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007514 neuronal growth Effects 0.000 description 1
- -1 nitrite ions Chemical class 0.000 description 1
- 210000000956 olfactory bulb Anatomy 0.000 description 1
- 210000000608 photoreceptor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000035807 sensation Effects 0.000 description 1
- 235000019615 sensations Nutrition 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 230000024642 stem cell division Effects 0.000 description 1
- 210000000221 suprachiasmatic nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 210000000108 taste bud cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001931 thermography Methods 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000820 toxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 231100000041 toxicology testing Toxicity 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 210000001121 vomeronasal organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION
Настоящее изобретение относится к области биосенсорики и касается способов получения биосенсоров, предназначенных для методов детектирования различных видов излучения, в частности электромагнитного, а также для регистрации различных химических и биологических веществ в анализируемых средах, и может быть применено как для исследовательских целей, так и в промышленном производстве.The present invention relates to the field of biosensorics and relates to methods for producing biosensors intended for methods of detecting various types of radiation, in particular electromagnetic, as well as for recording various chemical and biological substances in the analyzed media, and can be used both for research purposes and in industrial production.
Уровень техникиState of the art
Общепризнанно, что важной основой технического усовершенствования в областях естественных, медицинских и технических наук является миниатюризация сенсорных устройств, а также увеличение быстродействия и повышение их чувствительности к определяемому параметру. Однако же длительное время эта задача являлась трудноразрешимой в силу отсутствия относительно недорогих устройств и методов их эксплуатации, работающих в широком диапазоне температур, включая физиологический.It is generally recognized that an important basis for technical improvement in the fields of natural, medical and technical sciences is the miniaturization of sensor devices, as well as an increase in speed and increase their sensitivity to a defined parameter. However, for a long time this task was difficult to solve due to the lack of relatively inexpensive devices and methods of their operation, operating in a wide temperature range, including physiological.
Известен способ определения "токсичности" отдельных веществ и сточных вод (Тест токсичности на Chlamydomonas // Унифицированные методы исследования качества воды. М.: СЭВ, 1983, с.201-208). В качестве тест-организма (биосенсора) используется чистая культура Chlamydomonas gelatinosa. Способ основан на изучении влияния токсических веществ на размножение Chlamydomonas gelatinosa. Для этого готовят образцы растворов различной концентрации исследуемых токсических веществ в стандартной питательной среде и две контрольные колбы со стандартным питательным раствором без добавления токсического вещества. Затем в подготовленные исследуемые и контрольные образцы вносят одинаковые объемы исходной суспензии культуры Chlamydomonas gelatinosa. Сосуды с исследуемыми и контрольными образцами помещают в шкаф с люминесцентным освещением, выдерживают в течение 21 суток, просматривая колбы и подсчитывая организмы в счетной камере каждые вторые сутки. Результаты подсчетов сравнивают с ранее созданными табличными данными. Для наглядности отображения цифровых данных строят различные графики. В расчет принимаются только неповрежденные организмы.There is a method of determining the "toxicity" of individual substances and wastewater (Toxicity test for Chlamydomonas // Unified methods for the study of water quality. M .: SEV, 1983, p. 201-208). A pure Chlamydomonas gelatinosa culture is used as a test organism (biosensor). The method is based on the study of the effect of toxic substances on the propagation of Chlamydomonas gelatinosa. For this, samples of solutions of different concentrations of the studied toxic substances in a standard nutrient medium and two control flasks with a standard nutrient solution without adding a toxic substance are prepared. Then, equal volumes of the initial suspension of the Chlamydomonas gelatinosa culture are added to the prepared test and control samples. Vessels with test and control samples are placed in a cabinet with fluorescent lighting, incubated for 21 days, looking at the flasks and counting organisms in the counting chamber every second day. The calculation results are compared with previously created tabular data. For clarity, the display of digital data build various graphs. Only intact organisms are taken into account.
Основной недостаток способа оценки результатов токсикологических исследований заключается в том, что каждый организм реагирует индивидуально на присутствие токсического вещества. Следовательно, результат экспериментов часто зависит не только от концентрации токсического вещества и условий опыта, но и от присутствия в испытуемой группе индивидуумов с различной чувствительностью.The main disadvantage of the method of evaluating the results of toxicological studies is that each organism individually responds to the presence of a toxic substance. Therefore, the result of experiments often depends not only on the concentration of the toxic substance and experimental conditions, but also on the presence in the test group of individuals with different sensitivity.
Известна также биосенсорная система для определения 2,4-динитрофенола и ионов нитрита в водных средах, содержащая четыре биосенсора, преобразователями которых являются погруженные в проточные, соединенные между собой измерительные ячейки электроды Кларка, в качестве биорецепторов первый и третий биосенсоры содержат клетки Rhodococcus erythropolis HL PM-1, иммобилизованные на носителе, четвертый биосенсор - клетки бактерий Nitrobacter vulgaris DSM 10236, иммобилизованные на носителе, второй биосенсор включает реактор колоночного типа с иммобилизованными на носителе клетками бактерий Rhodococcus erythropolis HL PM-1 в качестве биорецептора, при этом электрод Кларка второго биосенсора размещен на выходе реактора (RU 2207377, С 12 Q 1/02, 2003.06.27).Also known is a biosensor system for the determination of 2,4-dinitrophenol and nitrite ions in aqueous media, containing four biosensors, the converters of which are Clark electrodes immersed in flowing, interconnected measuring cells, the first and third biosensors contain Rhodococcus erythropolis HL PM cells as bioreceptors -1 immobilized on a carrier, the fourth biosensor is Nitrobacter vulgaris DSM 10236 bacterial cells immobilized on a carrier, the second biosensor includes a column-type reactor immobilized on a carrier le bacterial cells Rhodococcus erythropolis HL PM-1 as bioreceptors, the Clark electrode biosensor is placed on the second outlet of the reactor (RU 2207377, C 12 Q 1/02, 2003.06.27).
В работе (Huang, et al. Trends in Anal. Chem. 14(4) 158(1995) описывается статический электрохимический метод и электрод для мониторинга биохимического состояния отдельных клеток. Метод требует изготовления и ручного позиционирования контрольного и рабочего электродов внутри живой клетки. Метод был использован для детекции инсулина, оксида азота и глюкозы внутри и снаружи отдельных клеток. Метод сложен и ограничен обязательным использованием внутриклеточных восстановительных биохимических реакций.Huang, et al. Trends in Anal. Chem. 14 (4) 158 (1995) describe a static electrochemical method and an electrode for monitoring the biochemical state of individual cells. The method requires the manufacture and manual positioning of the control and working electrodes inside a living cell. Method was used to detect insulin, nitric oxide, and glucose inside and outside individual cells.The method is complex and limited by the mandatory use of intracellular reductive biochemical reactions.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к настоящему изобретению является способ производства биосенсоров, включающий получение чувствительных клеток, сигналы от которых регистрируются внешним устройством при детектировании возбуждения (US 6,377,721, G 01 N 21/00, 23.04.2002). В известном способе описаны некоторые методы использования клеток, нанесенных на чип, для детекции в анализируемых средах тех или иных химических веществ. Важно, что в этом случае улавливание сигнала, поступающего от чувствительной клетки, осуществляется с помощью детекции флуоресцентного излучения. Клетки перед нанесением на чип претерпевают генно-инженерные модификации, в результате которых в клетки вводят новые гены, кодирующие флуоресцирующие или обуславливающие изменение оптических характеристик среды белки. Клетки в этом случае также могут быть дополнительно модифицированы таким образом, чтобы сигнал, на детекцию которого направлено описываемое устройство, запускал активность гена флуоресцирующего или обуславливающего изменение оптических характеристик среды белка либо же самого этого белка с последующим испусканием флуоресцентного излучения и/или изменением оптических характеристик среды. Эти события, в свою очередь, детектируются внешними светочувствительными устройствами, связанными с каждой конкретной клеткой или ячейкой, в которой находится каждая конкретная клетка, с помощью светопроводящих волокон.The closest in technical essence and the achieved result to the present invention is a method for the production of biosensors, including the production of sensitive cells, the signals from which are recorded by an external device when detecting excitation (US 6,377,721, G 01 N 21/00, 04/23/2002). The known method describes some methods of using cells deposited on a chip for the detection of certain chemicals in the analyzed media. It is important that in this case, the capture of the signal from the sensitive cell is carried out using the detection of fluorescence radiation. The cells undergo genetic engineering modifications before being applied to the chip, as a result of which new genes are introduced into the cells that encode fluorescent or cause a change in the optical characteristics of the medium proteins. Cells in this case can also be further modified in such a way that the signal for detection of which the device is directed triggers the activity of a gene that fluoresces or causes a change in the optical characteristics of the protein medium or the protein itself, followed by the emission of fluorescence radiation and / or a change in the optical characteristics of the medium . These events, in turn, are detected by external photosensitive devices associated with each specific cell or cell in which each specific cell is located using light-conducting fibers.
Хотя многие известные методы получения биосенсоров предоставляют собой инструменты для работы с нанесенными на чип как одиночными клетками, так и клеточными популяциями, для мониторинга клеточного ответа на измеряемые сигналы, но ни один из известных методов получения биосенсоров не подразумевает использования полученных из клеточных культур, в том числе и культур стволовых клеток, эукариотических интактных или генетически модифицированных рецепторных клеток как первичных детекторов сигнала.Although many well-known methods for producing biosensors provide tools for working with single cells and cell populations applied to the chip, for monitoring the cellular response to measured signals, none of the known methods for producing biosensors involves the use of cell cultures, including stem cell cultures, eukaryotic intact or genetically modified receptor cells as primary signal detectors.
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
Задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является создание и разработка вариантов способа получения биосенсоров, обладающих улучшенными характеристиками.The problem to which the present invention is directed, is the creation and development of variants of a method for producing biosensors with improved characteristics.
В результате решения данной задачи возможно получение технических результатов, заключающихся в повышении чувствительности, точности и достоверности детектирования возбуждения, расширение номенклатуры контролируемых видов возбуждений.As a result of solving this problem, it is possible to obtain technical results consisting in increasing the sensitivity, accuracy and reliability of detection of excitation, expanding the range of controlled types of excitations.
Данные технические результаты по одному варианту настоящего изобретения достигаются тем, что в способе производства биосенсоров, включающем получение чувствительных клеток, сигналы от которых регистрируются внешним устройством при детектировании возбуждения, в качестве чувствительных клеток используют клетки, выращенные в клеточных культурах, приготовленных из рецепторных клеток животных, причем в качестве внешнего устройства используют приемник электрического сигнала, генерируемого чувствительной клеткой при детектировании возбуждения.These technical results according to one embodiment of the present invention are achieved by the fact that in a method for the production of biosensors, including the production of sensitive cells, signals from which are detected by an external device for detecting excitation, cells grown in cell cultures prepared from animal receptor cells are used as sensitive cells. moreover, as an external device using a receiver of an electrical signal generated by a sensitive cell during detection in excitation.
По другому варианту в способе производства биосенсоров, включающем получение чувствительных клеток, сигналы от которых регистрируются внешним устройством при детектировании возбуждения, в качестве чувствительных клеток используют рецепторные клетки, функционально аналогичные рецепторным клеткам животных, выращенные в клеточных культурах из стволовых клеток животных, причем в качестве внешнего устройства используют приемник электрического сигнала, генерируемого чувствительной клеткой при детектировании возбуждения.According to another embodiment, in a method for producing biosensors, including receiving sensitive cells, the signals from which are detected by an external device when excitation is detected, receptor cells that are functionally similar to animal receptor cells grown in cell cultures from animal stem cells are used as sensitive cells devices use a receiver of an electrical signal generated by a sensitive cell in detecting excitation.
Отличительная особенность настоящего изобретения по одному варианту заключается в том, что в качестве чувствительных клеток используют клетки, выращенные в клеточных культурах, приготовленных из рецепторных клеток животных, причем в качестве внешнего устройства используют приемник электрического сигнала, генерируемого чувствительной клеткой при детектировании возбуждения. Отличие другого варианта состоит в том, что в качестве чувствительных клеток используют рецепторные клетки, функционально аналогичные рецепторным клеткам животных, выращенные в клеточных культурах из стволовых клеток животных. Детектирование сигнала возбуждения биосенсором включает в себя улавливание специфического сигнала тем или иным типом чувствительных клеток, которые генерируют разницу потенциалов электрического поля. Разница потенциалов усиливается стандартным оборудованием. Биосенсоры могут быть использованы в научных целях, в экологическом мониторинге и в промышленности для изготовления высокочувствительных детекторов различных видов возбуждения, например спектров электромагнитного излучения, а также для быстрого определения концентрации определенных химических веществ в анализируемых средах. Очевидно, что в зависимости от диапазона частот электромагнитного излучения, в зависимости от конкретных контролируемых химических или биологических веществ и т.п., осуществляют выбор соответствующих чувствительных клеток. При этом чувствительные клетки, получаемые в соответствии с настоящим изобретением и выращенные в клеточных культурах, способны практически к неограниченному размножению.A distinctive feature of the present invention according to one embodiment is that, as sensitive cells, cells grown in cell cultures prepared from animal receptor cells are used, and an external signal receiver is used as an electrical signal generated by the sensitive cell when excitation is detected. The difference of another option is that receptor cells functionally similar to animal receptor cells grown in animal cultures from animal stem cells are used as sensitive cells. Detection of an excitation signal by a biosensor includes the capture of a specific signal by one or another type of sensitive cells, which generate a potential difference of the electric field. The potential difference is amplified by standard equipment. Biosensors can be used for scientific purposes, in environmental monitoring and in industry for the manufacture of highly sensitive detectors of various types of excitation, for example, electromagnetic radiation spectra, as well as for quickly determining the concentration of certain chemicals in the analyzed media. Obviously, depending on the frequency range of electromagnetic radiation, depending on the particular controlled chemical or biological substances, etc., the selection of appropriate sensitive cells is carried out. In this case, the sensitive cells obtained in accordance with the present invention and grown in cell cultures are capable of almost unlimited reproduction.
Для повышения чувствительности при детектировании возбуждения чувствительные клетки подвергают генно-инженерной модификации, например путем введения в них экзогенных нуклеиновых кислот.To increase the sensitivity in the detection of excitation, sensitive cells are subjected to genetic engineering modification, for example, by introducing exogenous nucleic acids into them.
После получения чувствительных клеток в соответствии с настоящим изобретением, по крайней мере, одну чувствительную клетку наносят в ячейку носителя, который предпочтительно выполняют на силиконовой основе, предпочтительно в форме лунки. Лунка имеет диаметр от 1 до 200 мкм и объем от 1 фемтолитра до 5 нанолитров.After receiving sensitive cells in accordance with the present invention, at least one sensitive cell is applied to a carrier cell, which is preferably performed on a silicone base, preferably in the form of a well. The hole has a diameter of from 1 to 200 microns and a volume of from 1 femtol to 5 nanoliters.
Перечень фигур чертежейList of drawings
На чертеже показана общая схема устройства, применяющего биосенсор, полученного с использованием настоящего изобретения.The drawing shows a General diagram of a device using a biosensor obtained using the present invention.
Осуществление изобретенияThe implementation of the invention
Устройство, реализующее способ в соответствии с настоящим изобретением, содержит биосенсор 1, содержащий чувствительные клетки 2, сигналы от которых регистрируются внешним устройством при детектировании возбуждения 3. Чувствительные клетки могут быть выращены в клеточных культурах, приготовленных из рецепторных клеток животных. В качестве чувствительных клеток 2 могут быть использованы также рецепторные клетки, функционально аналогичные рецепторным клеткам животных, выращенные в клеточных культурах из стволовых клеток животных. В качестве внешнего устройства использован приемник 4 электрического сигнала, генерируемого чувствительной клеткой 2 при детектировании возбуждения 3. Чувствительные клетки 2 целесообразно располагать в ячейках 5, которые расположены на носителе 6. Приемник 4 может содержать в своем составе любые известные блоки, оптимизирующие прохождение и обработку электрического сигнала: усилитель, калибратор, блок памяти, блок сравнения и т.п. Выход приемника 4 соединен с устройством 7 визуальной индикации, которое, в принципе, может быть объединено с приемником 4.A device that implements the method in accordance with the present invention contains a biosensor 1 containing sensitive cells 2, the signals from which are detected by an external device when detecting excitation 3. Sensitive cells can be grown in cell cultures prepared from animal receptor cells. Receptor cells functionally similar to animal receptor cells grown in cell cultures from animal stem cells can also be used as sensitive cells 2. As an external device, a receiver 4 of an electric signal generated by a sensitive cell 2 when detecting excitation 3 is used. It is advisable to place the sensitive cells 2 in cells 5, which are located on the carrier 6. The receiver 4 may contain any known units that optimize the passage and processing of electrical signal: amplifier, calibrator, memory unit, comparison unit, etc. The output of the receiver 4 is connected to the visual indication device 7, which, in principle, can be combined with the receiver 4.
Практическая реализация настоящего изобретения проиллюстрирована следующими примерами:The practical implementation of the present invention is illustrated by the following examples:
Пример 1. Создание биосенсора на основе иммортализованной культуры клеток инфракрасных рецепторов из ямкового органа змей для детектирования теплового излучения.Example 1. The creation of a biosensor based on an immortalized culture of infrared receptor cells from the fossa organ of snakes to detect thermal radiation.
Некоторые виды змей обладают особым рецепторным органом, позволяющим им улавливать разницу температур с точностью до 0,003 градуса Цельсия. Данный орган, названный ямковым (англ. pit organ), обеспечивает животным объемное видение излучающих тепло объектов, что необходимо змеям при выслеживании добычи в темноте. Исследования показали, что термочувствительность в этом случае обеспечена слоем особых чувствительных клеток нервной ткани, выполняющих функции инфракрасных рецепторов (Jones BS, Lynn WF, Stone МО (2001). Thermal modeling of snake infrared reception: evidence for limited detection range. J Theor Biol. Mar 21;209(2):201-211).Some species of snakes have a special receptor organ, allowing them to capture the temperature difference with an accuracy of 0.003 degrees Celsius. This organ, called the pit organ, provides animals with a three-dimensional vision of heat-emitting objects, which is necessary for snakes to track prey in the dark. Studies have shown that thermal sensitivity in this case is provided by a layer of special sensitive cells of nerve tissue that act as infrared receptors (Jones BS, Lynn WF, Stone MO (2001). Thermal modeling of snake infrared reception: evidence for limited detection range. J Theor Biol. Mar 21; 209 (2): 201-211).
В соответствии с настоящим изобретением на основе таких чувствительных клеток может быть создан биосенсор высокого разрешения для измерения теплового излучения. Для этого из организма представителя ямкоголовых змей (например, щитомордник Палласа лат.: Agkistrodon halys halys) препаративно выделяется ямковый орган. Полученные ткани измельчаются и используются для создания первичной культуры клеток нервной ткани согласно условиям, описанным в работах (Ren D, Miller JD. Primary cell culture of suprachiasmatic nucleus. Brain Res Bull. 2003 Sep 30; 61(5):547-53; Gronthos S, Brahim J, Li W, Fisher LW, Cherman N, Boyde A, DenBesten P, Robey PG, Shi S. Stem cell properties of human dental pulp stem cells. J Dent Res. 2002 Aug;81(8):531-5), с использованием стандартных сред и сывороток для выращивания нейроннных культур (например, комбинация сред DMEM и OPTIMEM с добавлением телячьей зародышевой сыворотки, а также фактора роста нейронов NGF (англ.: nerve growth factor). Клетки первичной культуры иммортализуют, то есть делают способными к нелимитированному количеству делений.In accordance with the present invention, based on such sensitive cells, a high resolution biosensor for measuring thermal radiation can be created. For this purpose, a representative pit organ from the body of a pit viper (for example, Pallas lat.: Agkistrodon halys halys) prepares a fossa organ. The resulting tissue is crushed and used to create a primary culture of nerve cell cells according to the conditions described in (Ren D, Miller JD. Primary cell culture of suprachiasmatic nucleus. Brain Res Bull. 2003 Sep 30; 61 (5): 547-53; Gronthos S, Brahim J, Li W, Fisher LW, Cherman N, Boyde A, DenBesten P, Robey PG, Shi S. Stem cell properties of human dental pulp stem cells. J Dent Res. 2002 Aug; 81 (8): 531- 5) using standard media and serums for growing neural cultures (for example, a combination of DMEM and OPTIMEM media supplemented with calf germ serum, as well as NGF neuron growth factor). rationalize, that is, make it capable of an unlimited number of divisions.
Для этого их подвергают генно-инженерным модификациям. С помощью, например, электропорации, липофиктиновой трансфекции или вирусного вектора в клетки вносится экзогенная ДНК, содержащая ген каталитической субъединицы теломеразы человека под цитомегаловирусным промотером, под контролем индуцируемого ТЕТ оператора, а также ген-репортер (например, зеленый флуоресцирующий белок, англ.: green fluorescent protein, GFP) и стандартную кассету устойчивости к антибиотику неомицину. После широко применяемой процедуры отделения клеток со встроенной в геном вышеописанной конструкцией запускается активность гена каталитической субъединицы теломеразы, что обеспечивает иммортализацию клеточной культуры. Более подробно этот способ иммортализации клеточных линий описан в работе (Egorov ЕЕ, Terekhov SM, Vishniakova KhS, Karachentsev DN, Kazimirchuk EV, Tsvetkova TG, Veiko NN, Smirnova TD, Makarenkov AS, EI'darov MA, Meshcheriakova luA, Liapunova NA, Zelenin AV. Telomerization as a method of obtaining immortal human cells preserving normal properties. Ontogenez. 2003 May-Jun; 34(3):183-92).To do this, they are subjected to genetic engineering modifications. Using, for example, electroporation, lipofictin transfection, or a viral vector, exogenous DNA is introduced into the cells containing the gene for the catalytic subunit of human telomerase under the cytomegalovirus promoter, under the control of an inducible TET operator, and a reporter gene (for example, green fluorescent protein, Eng .: green fluorescent protein, GFP) and the standard neomycin antibiotic resistance cassette. After the widely used procedure for separating cells with the above-described construct built into the genome, the gene activity of the telomerase catalytic subunit is triggered, which ensures immortalization of the cell culture. This method of immortalizing cell lines is described in more detail in (Egorov EE, Terekhov SM, Vishniakova KhS, Karachentsev DN, Kazimirchuk EV, Tsvetkova TG, Veiko NN, Smirnova TD, Makarenkov AS, EI'darov MA, Meshcheriakova luA, Liapunova NA, Zeap AV. Telomerization as a method of obtaining immortal human cells preserving normal properties. Ontogenez. 2003 May-Jun; 34 (3): 183-92).
С помощью выращивания культуры в переменном электрическом поле добиваются дифференцировки делящихся клеток в рецепторные клетки с нормальной морфологией (отслеживается микроскопически согласно (Hirosawa К. Electron microscopic observations on the pit organ of a crotaline snake Trimeresurus flavoviridis. Arch Histol Jpn. 1980 Feb; 43(1):65-77). Такие клетки переносят в лунки силиконового носителя, соединенного с внешним приемником электрического сигнала, и выращивают в стандартных питательных средах (как описано в работе (Fan YW, Cut FZ, Hou SP, Xu QY, Chen LN, Lee IS (2002). Culture of neural cells on silicon wafers with nano-scale surface topograph. J Neurosci Methods. Oct 15; 120(1):17-23). При детектировании измеряемого сигнала (теплового излучения) регистрируется собственная электрическая активность полученных в культуре термочувствительных клеток. Такая активность улавливается и усиливается внешним устройством. Перед использованием биосенсора его необходимо откалибровать в термостатируемом объеме (в данном примере, повышая температуру от 10 до 40 градусов Цельсия, с шагом в 0,1 градус Цельсия). В модельных экспериментах биосенсор точно детектирует температуру окружающей среды в физиологическом диапазоне температур, а также приближение и удаление нагретых объектов.By growing the culture in an alternating electric field, differentiation of dividing cells into receptor cells with normal morphology is achieved (microscopically monitored according to (Hirosawa K. Electron microscopic observations on the pit organ of a crotaline snake Trimeresurus flavoviridis. Arch Histol Jpn. 1980 Feb; 43 (1 ): 65-77). Such cells are transferred into the wells of a silicone carrier connected to an external electric signal receiver and grown in standard nutrient media (as described in (Fan YW, Cut FZ, Hou SP, Xu QY, Chen LN, Lee IS (2002). Culture of neural cells on silicon wafers with nano-scale surface topograph. J Neurosci Meth ods. Oct 15; 120 (1): 17-23). When detecting the measured signal (thermal radiation), the intrinsic electrical activity of the thermally sensitive cells obtained in the culture is recorded. Such activity is captured and amplified by an external device. Before using the biosensor, it must be calibrated in a thermostatic volume (in this example, raising the temperature from 10 to 40 degrees Celsius, in increments of 0.1 degrees Celsius). In model experiments, the biosensor accurately detects the ambient temperature in the physiological temperature range, as well as the approximation and removal of heated objects.
Пример 2. Создание на основе культуры стволовых клеток светочувствительных рецепторов зеленой мартышки биосенсора для детектирвания электромагнитного излучения в видимой части спектра.Example 2. The creation of a photosensitive receptor of the green monkey biosensor based on stem cell culture for the detection of electromagnetic radiation in the visible part of the spectrum.
Структура глаза, то есть светочувствительного органа зеленой мартышки, хорошо изучена анатомически. Слой светочувствительных клеток сетчатки глаза выделяется препаративно, после чего получают первичную культуру таких клеток (аналогично методике примера 1). Стволовые клетки получают путем последовательного пересевания клеток, изначально полученных из первичной культуры, в течение 6 месяцев. Альтернативно, отбор стволовых клеток может осуществляться как позитивно окрашенной фракции при гибридизации с антителами на маркерные белки: Oct-4, Nanog, MELK, Tuj-1, Nestin, GFAP и др. (подробно описано в работах: Maye P, Becker S, Siemen H, Thorne J, Byrd N, Carpentino J, Grabel L. Hedgehog signaling is required for the differentiation of ES cells into neurectoderm. Dev Biol. 2004 Jan 1; 265(1):276-90; Schwartz PH, Bryant PJ, Fuja TJ, Su H, O'Dowd DK, Klassen H. Isolation and characterization of neural progenitor cells from post-mortem human cortex. J Neurosci Res. 2003 Dec 15; 74(6):838-51). Отобранные стволовые клетки выращивают в культурах аналогично примеру 1 в селективных условиях, обуславливающих дифференцировку стволовых клеток в фоторецепторные клетки (выращивание в переменном электрическом поле в присутствии стандартных факторов дифференцировки). Морфология получаемых клеток при этом исследуется микроскопически. Подготовленные чувствительные клетки далее помещаются на носитель, соединенный с внешним устройством (аналогично примеру 1). Перед работой техническую часть биосенсора также необходимо откалибровать, варьируя в темном объеме мощность поступающего светового излучения и его спектральные характеристики.The structure of the eye, that is, the photosensitive organ of the green monkey, is well studied anatomically. The layer of photosensitive retinal cells is isolated preparatively, after which they receive a primary culture of such cells (similar to the method of example 1). Stem cells are obtained by sequentially reseeding cells originally obtained from a primary culture for 6 months. Alternatively, stem cell selection can be performed as a positively stained fraction when hybridized with antibodies to marker proteins: Oct-4, Nanog, MELK, Tuj-1, Nestin, GFAP and others (described in detail in Maye P, Becker S, Siemen H, Thorne J, Byrd N, Carpentino J, Grabel L. Hedgehog signaling is required for the differentiation of ES cells into neurectoderm. Dev Biol. 2004 Jan 1; 265 (1): 276-90; Schwartz PH, Bryant PJ, Fuja TJ, Su H, O'Dowd DK, Klassen H. Isolation and characterization of neural progenitor cells from post-mortem human cortex. J Neurosci Res. 2003 Dec 15; 74 (6): 838-51). The selected stem cells are grown in cultures analogously to example 1 under selective conditions that condition the differentiation of stem cells into photoreceptor cells (cultivation in an alternating electric field in the presence of standard differentiation factors). The morphology of the resulting cells is examined microscopically. Prepared sensitive cells are then placed on a carrier connected to an external device (analogously to example 1). Before work, the technical part of the biosensor must also be calibrated by varying the power of the incoming light radiation and its spectral characteristics in a dark volume.
Пример 3. Создание на основе культур стволовых клеток вкусовых рецепторов крысы биосенсора для детектирования химических веществ в определяемых жидких средах.Example 3. Creation of rat biosensor taste receptors based on stem cell cultures for the detection of chemicals in defined liquid media.
Из языка крысы препаративно выделяется первичная культура клеток, обогащенная клетками обонятельных рецепторов. Линии стволовых клеток выделяются из первичной культуры аналогично методу, описанному в примере 2. Стволовые клетки, продифференцировавшиеся в клетки вкусового рецептора, определяются морфологически с помощью методов световой и электронной микроскопии (см., например, Mandairon N, Jourdan F, Didier A. Deprivation of sensory inputs to the olfactory bulb up-regulates cell death and proliferation in the subventricular zone of adult mice. Neuroscience. 2003; 119(2):507-16). Аналогично примеру 1 и примеру 2 подготовленные чувствительные клетки помещаются в ячейки с питательной средой в составе носителя, соединенного с внешним устройством. Как и в предыдущих примерах, регистрируется собственная электрическая активность чувствительных клеток. Калибровка биосенсора несколько более сложна, чем для двух предыдущих примеров, поскольку используемые чувствительные клетки содержат сложные ансамбли рецепторных молекул, каждая из которых отвечает за рецепцию особой группы химических веществ. Таким образом, потомки различных стволовых клеток могут обладать различным репертуаром чувствительности. Поэтому следует не допускать неконтролируемого смешения чувствительных клеток - потомков разных стволовых клеток в составе одного биосенсора. Калибровка проводится с помощью добавления в жидкую среду, в которую помещен биосенсор, индивидуальных веществ или смесей химических веществ, обуславливающих "горький", "кислый", "соленый" и т.д. спектры ощущений, либо же веществ, обладающих резким или раздражающим запахом.Primary cell culture enriched in olfactory receptor cells is preparatively isolated from rat tongue. Stem cell lines are isolated from the primary culture similarly to the method described in Example 2. Stem cells differentiating into taste bud cells are determined morphologically using light and electron microscopy methods (see, for example, Mandairon N, Jourdan F, Didier A. Deprivation of sensory inputs to the olfactory bulb up-regulates cell death and proliferation in the subventricular zone of adult mice. Neuroscience. 2003; 119 (2): 507-16). Analogously to example 1 and example 2 prepared sensitive cells are placed in cells with a nutrient medium in the composition of the carrier connected to an external device. As in the previous examples, the intrinsic electrical activity of sensitive cells is recorded. Calibration of the biosensor is somewhat more complicated than for the two previous examples, since the sensitive cells used contain complex ensembles of receptor molecules, each of which is responsible for the reception of a special group of chemicals. Thus, descendants of different stem cells may have a different sensitivity repertoire. Therefore, uncontrolled mixing of sensitive cells - the descendants of different stem cells in one biosensor should be prevented. Calibration is carried out by adding individual substances or mixtures of chemicals causing “bitter”, “sour”, “salty”, etc. to the liquid medium in which the biosensor is placed. spectra of sensations, or substances with a pungent or irritating odor.
Пример 4. Создание на основе модифицированных методами генной инженерии культур стволовых клеток обонятельных рецепторов собаки биосенсора для детектирования химических веществ в определяемых средах.Example 4. The creation of a biosensor of a dog olfactory receptor olfactory receptor on the basis of stem cell modified by genetic engineering methods for the detection of chemicals in defined media.
На настоящий момент охарактеризовано значительное количество генов белков, на молекулярном уровне обуславливающих чувствительность к запахам. При этом, как правило, каждый ген необходим для оптимальной рецепции строго специфичного набора химических веществ в среде (Lewcock JW, Reed RR. Neuroscience. ORs rule the roost in the olfactory system. Science. 2003 Dec 19; 302(5653):2078-9). В связи с этим настоящее изобретение может быть применено для создания биосенсоров с повышенным относительно исходных рецепторных клеток сенсорным потенциалом.At the moment, a significant number of protein genes have been characterized, which at the molecular level determine the sensitivity to odors. Moreover, as a rule, each gene is necessary for the optimal reception of a strictly specific set of chemicals in the medium (Lewcock JW, Reed RR. Neuroscience. ORs rule the roost in the olfactory system. Science. 2003 Dec 19; 302 (5653): 2078- 9). In this regard, the present invention can be applied to create biosensors with increased sensory potential relative to the initial receptor cells.
В данном примере для этого выделяется культура стволовых клеток обонятельных рецепторов собаки (аналогично примеру 3). Полученные стволовые клетки подвергают затем генно-инженерным модификациям, в результате которых они приобретают дополнительные копии генов рецепторных белков. Для этого используются конструкции, описанные в примере 1, отличающиеся тем, что вместо гена каталитической субъединицы фермента теломеразы несут гены белков обонятельных рецепторов. Аналогично примеру 3 добиваются дифференцировки получаемых модифицированных стволовых клеток в зрелые клетки обонятельных рецепторов, при этом состояние клеток отслеживают микроскопически или с помощью методов иммуногистохимии согласно (Menco ВР. Qualitative and quantitative freeze-fracture studies on olfactory and nasal respiratory epithelial surfaces of frog, ox, rat, and dog. II. Cell apices, cilia and microvilli. Cell Tissue Res. 1980; 211(1):5-29; Dennis JC, Allgier JG, Desouza LS, Eward WC, Morrison ЕЕ. Immunohistochemistry of the canine vomeronasal organ. J Anat. 2003 Sep; 203(3):329-38).In this example, for this, a culture of stem cells of the olfactory receptors of the dog is isolated (analogously to example 3). The resulting stem cells are then subjected to genetic engineering modifications, as a result of which they acquire additional copies of the receptor protein genes. For this, the constructs described in Example 1 are used, characterized in that instead of the gene for the catalytic subunit of the telomerase enzyme, olfactory receptor protein genes are carried. Analogously to example 3, differentiation of the obtained modified stem cells into mature olfactory receptor cells is achieved, while the state of the cells is monitored microscopically or using immunohistochemistry methods according to (Menco BP. Qualitative and quantitative freeze-fracture studies on olfactory and nasal respiratory epithelial surfaces of frog, ox, rat, and dog. II. Cell apices, cilia and microvilli. Cell Tissue Res. 1980; 211 (1): 5-29; Dennis JC, Allgier JG, Desouza LS, Eward WC, Morrison EE. Immunohistochemistry of the canine vomeronasal organ . J Anat. 2003 Sep; 203 (3): 329-38).
Нанесение подготовленных клеток на носитель и калибровка биосенсора осуществляются аналогично примеру 3 с использованием широкого диапазона химических веществ, которые могут быть добавлены как в жидкую среду, тонким слоем покрывающую чувствительные клетки биосенсора, так и в замкнутый объем газообразной среды, по возможности минимальный, в который помещают чувствительные ячейки биосенсора. В последнем случае следует увеличить время экспозиции определяемых компонентов для прохождения их диффузии через тонкий слой покрывающей чувствительные клетки жидкой среды.The application of prepared cells to the carrier and the calibration of the biosensor are carried out analogously to example 3 using a wide range of chemicals that can be added both to the liquid medium, which covers the sensitive cells of the biosensor with a thin layer, and to the enclosed volume of the gaseous medium, as small as possible, into which sensitive biosensor cells. In the latter case, the exposure time of the determined components should be increased for their diffusion to pass through a thin layer of the liquid medium covering the sensitive cells.
Создание нового поколения сенсорных устройств, основанных на использовании биологических рецепторов и/или их частей для детекции поступающих сигналов, является актуальной задачей биотехнологии. Такие сенсоры могли бы сочетать компактность, высокую чувствительность и экологическую безопасность с работой в стандартном диапазоне температур и относительной недороговизной. Биосенсоры могли бы использоваться в научных, бытовых целях, а также для детекции различных видов электромагнитного излучения и наличия в анализируемых средах тех или иных химических веществ. Развитие нанотехнологий позволяет создание технических средств, эффективно получающих, усиливающих, преобразующих и передающих сигналы от отдельных рецепторных клеток. Будучи организованы в упорядоченную структуру, такие ячейки являлись бы сенсорным устройством с чувствительностью, заданной выбором использованных клеток-рецепторов. Вместе с тем, существующие в этой области подходы ограничены использованием рецепторов, взятых непосредственно от организма-донора, без возможности искусственной наработки клеток-рецепторов из воспроизводящихся клеточных культур. В настоящем изобретении охарактеризован оригинальный метод получения рецепторных клеток для создания биосенсоров с использованием культур линий стволовых клеток, а также генетически модифицированных линий и/или иммортализованных клеточных линий.The creation of a new generation of sensor devices based on the use of biological receptors and / or their parts for the detection of incoming signals is an urgent task of biotechnology. Such sensors could combine compactness, high sensitivity and environmental safety with operation in a standard temperature range and relative low cost. Biosensors could be used for scientific, domestic purposes, as well as for the detection of various types of electromagnetic radiation and the presence of certain chemicals in the analyzed media. The development of nanotechnology allows the creation of technical means that effectively receive, amplify, transform and transmit signals from individual receptor cells. Being organized into an ordered structure, such cells would be a sensory device with a sensitivity given by the choice of used receptor cells. At the same time, existing approaches in this area are limited to the use of receptors taken directly from the donor organism, without the possibility of artificially producing receptor cells from reproducing cell cultures. The present invention characterized an original method for producing receptor cells for creating biosensors using cultures of stem cell lines, as well as genetically modified lines and / or immortalized cell lines.
Таким образом, способы по настоящему изобретению могут быть свободно реализованы с использованием известных знаний, технологий и оборудования. Действительно, в настоящее время в мировой науке достигнуты большие успехи в области выделения и длительного культивирования вне организма стволовых клеток, которые могут развиваться практически в любые специализированные клетки, в том числе и в рецепторные клетки нервной ткани, и в конечном итоге давать требуемые для трансплантации клетки, ткани, а в отдаленной перспективе и целые органы (Benninger F, Beck H, Wernig M, Tucker KL, Brustle O, Scheffler В (2003). Functional integration of embryonic stem cell-derived neurons in hippocampal slice cultures. J Neurosci. Aug 6; 23(18):7075-7083; Arsenijevic Y (2003). Mammalian neural stem-cell renewal: nature versus nurture. Mol Neurobiol. Feb; 27(1):73-98). Однако в настоящее время проблема стволовых клеток рассматривается главным образом с точки зрения медицинского использования. Существенно, что с появлением нанотехнологий стало возможным создание технических средств, соразмерных масштабу клетки (Xie Y, Sproule T, Li Y, Powell H, Lannutti JJ, Kniss DA (2002). Nanoscale modifications of in attachment and growth of mammalian epithelial and mesenchymal cells in vitro. J Biomed Mater Res. 2002 Aug; 61(2):234-245). Кроме того, разработаны методы культивирования культур клеток, в том числе и нервной ткани, на силиконовых наночипах (Fan YW, Cui FZ, Hou SP, Xu QY, Chen LN, Lee IS (2002). Culture of neural cells on silicon wafers with nano-scale surface topograph. J Neurosci Methods. Oct 15; 120(1):17-23).Thus, the methods of the present invention can be freely implemented using known knowledge, technology and equipment. Indeed, at present, great success has been achieved in world science in the field of isolation and long-term cultivation of stem cells outside the body, which can develop into almost any specialized cells, including nerve tissue receptor cells, and ultimately produce the cells required for transplantation , tissues, and, in the long run, whole organs (Benninger F, Beck H, Wernig M, Tucker KL, Brustle O, Scheffler B (2003). Functional integration of embryonic stem cell-derived neurons in hippocampal slice cultures. J Neurosci. Aug 6; 23 (18): 7075-7083; Arsenijevic Y (2003) .Mammalian neural stem-cell renewal: nature versus nurture. Mol Neurobiol. Feb; 27 (1): 73-98). However, the stem cell problem is currently being addressed mainly from the point of view of medical use. It is significant that with the advent of nanotechnology, it became possible to create technical means commensurate with the scale of the cell (Xie Y, Sproule T, Li Y, Powell H, Lannutti JJ, Kniss DA (2002). in vitro. J Biomed Mater Res. 2002 Aug; 61 (2): 234-245). In addition, methods have been developed for culturing cell cultures, including nervous tissue, on silicone nanochips (Fan YW, Cui FZ, Hou SP, Xu QY, Chen LN, Lee IS (2002). Culture of neural cells on silicon wafers with nano -scale surface topograph. J Neurosci Methods. Oct 15; 120 (1): 17-23).
Способ по настоящему изобретению промышленно применим, что подтверждается следующими примерами.The method of the present invention is industrially applicable, as evidenced by the following examples.
Некоторые виды змей обладают особым рецепторным органом, позволяющим им улавливать разницу температур с точностью до 0,003 градуса Цельсия. Вместе с тем, данный орган, названный ямковым (англ. pit organ), обеспечивает животным объемное видение излучающих тепло объектов, что необходимо змеям при выслеживании добычи в темноте. Исследования показали, что термочувствительность в этом случае обеспечена слоем особых чувствительных клеток нервной ткани, выполняющих функции инфракрасных рецепторов (Jones BS, Lynn WF, Stone МО (2001). Thermal modeling of snake infrared reception: evidence for limited detection range. J Theor Biol. Mar 21; 209(2):201-211).Some species of snakes have a special receptor organ, allowing them to capture the temperature difference with an accuracy of 0.003 degrees Celsius. At the same time, this body, called the fossa (English pit organ), provides animals with a three-dimensional vision of heat-emitting objects, which is necessary for snakes to track prey in the dark. Studies have shown that thermal sensitivity in this case is provided by a layer of special sensitive cells of nerve tissue that act as infrared receptors (Jones BS, Lynn WF, Stone MO (2001). Thermal modeling of snake infrared reception: evidence for limited detection range. J Theor Biol. Mar 21; 209 (2): 201-211).
В соответствии с настоящим изобретением на основе таких чувствительных клеток создан биосенсор высокого разрешения для измерения теплового излучения. Важно, что чувствительность такого биосенсора на порядок превышает чувствительность существующих термосенсорных устройств: 0,01-0,03 градуса Цельсия. По описанной в настоящем изобретении модели (см. Пример) было создано и откалибровано сенсорное устройство, действительно обладающее по крайней мере в 15 раз повышенной чувствительностью в сравнении со стандартными, используемыми в технике термосенсорами.In accordance with the present invention, based on such sensitive cells, a high resolution biosensor for measuring thermal radiation is created. It is important that the sensitivity of such a biosensor is an order of magnitude higher than the sensitivity of existing thermosensor devices: 0.01-0.03 degrees Celsius. According to the model described in the present invention (see Example), a sensor device was created and calibrated, which really has at least 15 times increased sensitivity in comparison with standard thermosensors used in the technology.
Различные типы термосенсорных клеток змей (а также термосенсорные клетки различных видов змей), как правило, обладают чувствительными молекулами с различными спектрами поглощения в инфракрасной области. При этом спектры достаточно узки для того, чтобы можно было однозначно детектировать ту или иную часть инфракрасной области. На этом принципе основывается создание биосенсора цветного тепловидения. Выращенные по методике в соответствии с настоящим изобретением (см. Пример 1) культуры термосенсорных клеток с различными спектрами возбуждения подсоединяли к считывающему устройству, сопоставляющему сигнал от того или иного типа клеток определенного цвета. При детекции возбуждения получили цветной сигнал, свидетельствующий о присутствии теплового излучения тех или иных длин волн и об их доле в общем потоке. Устройство, реализующее данную методику, является первым цветовым тепловизором на основе биосенсоров.Different types of thermosensory cells of snakes (as well as thermosensory cells of various species of snakes), as a rule, have sensitive molecules with different absorption spectra in the infrared region. Moreover, the spectra are narrow enough so that one or another part of the infrared region can be unambiguously detected. The creation of a color thermal imaging biosensor is based on this principle. Cultured by the method in accordance with the present invention (see Example 1), cultures of thermosensor cells with different excitation spectra were connected to a reader that matches the signal from one or another type of cell of a certain color. During excitation detection, a color signal was obtained, indicating the presence of thermal radiation of various wavelengths and their share in the total flux. A device that implements this technique is the first color thermal imager based on biosensors.
Таким образом, технологии в соответствии с настоящим изобретением открывают чрезвычайно широкие возможности создания высокоточной и чувствительной техники нового поколения, сочетающей в себе потенциалы современной биотехнологии, нанотехнологии и информатики. Эти возможности еще более расширяются в связи с возможностями генно-инженерных модификаций стволовых клеток, которые могут позволить многократное усиление природной чувствительности рецепторных клеток, за счет введения новой генетической информации в клетки-предшественники сенсорных клеток.Thus, the technologies in accordance with the present invention open up extremely wide possibilities for creating high-precision and sensitive technology of the new generation, combining the potentials of modern biotechnology, nanotechnology and computer science. These possibilities are further expanded in connection with the possibilities of genetic engineering modifications of stem cells, which can allow a multiple increase in the natural sensitivity of receptor cells by introducing new genetic information into the progenitor cells of sensory cells.
Claims (14)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2004100874/13A RU2266959C2 (en) | 2004-01-15 | 2004-01-15 | Method for biosensor production (variants) |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2004100874/13A RU2266959C2 (en) | 2004-01-15 | 2004-01-15 | Method for biosensor production (variants) |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2004100874A RU2004100874A (en) | 2005-06-20 |
| RU2266959C2 true RU2266959C2 (en) | 2005-12-27 |
Family
ID=35835430
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2004100874/13A RU2266959C2 (en) | 2004-01-15 | 2004-01-15 | Method for biosensor production (variants) |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2266959C2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EA028719B1 (en) * | 2014-07-28 | 2017-12-29 | Белорусский Государственный Университет (Бгу) | Method of activation of directed differentiation of stem cells in the neuronal direction |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2107296C1 (en) * | 1997-02-20 | 1998-03-20 | Дмитрий Александрович ФАРМАКОВСКИЙ | Method of electrochemical indication of immuno-chemically active macromolecules in examined solutions |
| RU2161653C2 (en) * | 1998-08-24 | 2001-01-10 | ФАРМАКОВСКИЙ Дмитрий Александрович | Method of quantitative electrochemical analysis of biological molecules |
| US6377721B1 (en) * | 1998-03-02 | 2002-04-23 | Trustees Of Tufts College | Biosensor array comprising cell populations confined to microcavities |
| RU2207377C2 (en) * | 2000-11-02 | 2003-06-27 | Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН | Biosensor system for assay of 2,4-dinitrophenol and nitrite ion and biosensors for this system |
-
2004
- 2004-01-15 RU RU2004100874/13A patent/RU2266959C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2107296C1 (en) * | 1997-02-20 | 1998-03-20 | Дмитрий Александрович ФАРМАКОВСКИЙ | Method of electrochemical indication of immuno-chemically active macromolecules in examined solutions |
| US6377721B1 (en) * | 1998-03-02 | 2002-04-23 | Trustees Of Tufts College | Biosensor array comprising cell populations confined to microcavities |
| RU2161653C2 (en) * | 1998-08-24 | 2001-01-10 | ФАРМАКОВСКИЙ Дмитрий Александрович | Method of quantitative electrochemical analysis of biological molecules |
| RU2207377C2 (en) * | 2000-11-02 | 2003-06-27 | Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН | Biosensor system for assay of 2,4-dinitrophenol and nitrite ion and biosensors for this system |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EA028719B1 (en) * | 2014-07-28 | 2017-12-29 | Белорусский Государственный Университет (Бгу) | Method of activation of directed differentiation of stem cells in the neuronal direction |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2004100874A (en) | 2005-06-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7100096B2 (en) | Microfluidic model of the blood-brain barrier | |
| Tønnesen et al. | Functional integration of grafted neural stem cell-derived dopaminergic neurons monitored by optogenetics in an in vitro Parkinson model | |
| Birey et al. | Assembly of functionally integrated human forebrain spheroids | |
| Zirath et al. | Every breath you take: non-invasive real-time oxygen biosensing in two-and three-dimensional microfluidic cell models | |
| Pathak et al. | Detection of reactive oxygen species (ROS) in cyanobacteria using the oxidant-sensing probe 2’, 7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) | |
| Holt et al. | Magnetic cell sorting for in vivo and in vitro astrocyte, neuron, and microglia analysis | |
| Lledo et al. | Integrating new neurons into the adult olfactory bulb: joining the network, life–death decisions, and the effects of sensory experience | |
| ES2307969T3 (en) | CELL CULTURE. | |
| Poli et al. | Experimental and computational methods for the study of cerebral organoids: a review | |
| Chen et al. | Human striatal organoids derived from pluripotent stem cells recapitulate striatal development and compartments | |
| Birtele et al. | Single-cell transcriptional and functional analysis of dopaminergic neurons in organoid-like cultures derived from human fetal midbrain | |
| CN114630900A (en) | A human cell model for the study of cortical-striatal-midbrain neural pathways | |
| Park et al. | Real‐Time Monitoring of Neural Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells by Electric Cell‐Substrate Impedance Sensing | |
| Pruszak et al. | Isolation and culture of ventral mesencephalic precursor cells and dopaminergic neurons from rodent brains | |
| Ortega et al. | Live imaging of adult neural stem cells in rodents | |
| Todd et al. | Towards neuronal organoids: a method for long-term culturing of high-density hippocampal neurons | |
| Afshar Saber et al. | All-optical assay to study biological neural networks | |
| Fiorenzano et al. | Dopamine neuron diversity: Recent advances and current challenges in human stem cell models and single cell sequencing | |
| Niedringhaus et al. | Transferable neuronal mini-cultures to accelerate screening in primary and induced pluripotent stem cell-derived neurons | |
| Antonov et al. | Current state-of-the-art and unresolved problems in using human induced pluripotent stem cell-derived dopamine neurons for Parkinson’s disease drug development | |
| Van Breedam et al. | Luminescent human iPSC-derived neurospheroids enable modeling of neurotoxicity after oxygen–glucose deprivation | |
| Eigenhuis et al. | A simplified protocol for the generation of cortical brain organoids | |
| Cardoso et al. | Toward generating subtype-specific mesencephalic dopaminergic neurons in vitro | |
| Dickinson-Anson et al. | Acetylcholine-secreting cells improve age-induced memory deficits | |
| RU2266959C2 (en) | Method for biosensor production (variants) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20070116 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20071220 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20110116 |