RU2266539C1 - METHOD OF DETERMINING TOXICITY OF AN AQUEOUS MEDIUM (OPTIONS), REAGENT FOR DETERMINING TOXICITY OF AN AQUEOUS MEDIUM, AND USE OF ANIMAL BRAIN PLASMA MEMBRANE Mg2+-ATPase - Google Patents
METHOD OF DETERMINING TOXICITY OF AN AQUEOUS MEDIUM (OPTIONS), REAGENT FOR DETERMINING TOXICITY OF AN AQUEOUS MEDIUM, AND USE OF ANIMAL BRAIN PLASMA MEMBRANE Mg2+-ATPase Download PDFInfo
- Publication number
- RU2266539C1 RU2266539C1 RU2004129244/15A RU2004129244A RU2266539C1 RU 2266539 C1 RU2266539 C1 RU 2266539C1 RU 2004129244/15 A RU2004129244/15 A RU 2004129244/15A RU 2004129244 A RU2004129244 A RU 2004129244A RU 2266539 C1 RU2266539 C1 RU 2266539C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- aqueous medium
- toxicity
- sample
- source
- inorganic phosphorus
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 57
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 title claims abstract description 57
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 title claims abstract description 57
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 title claims abstract description 44
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 title claims abstract description 39
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 title claims abstract description 36
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title claims abstract description 34
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims abstract description 22
- 108010080705 Ca(2+) Mg(2+)-ATPase Proteins 0.000 title 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 58
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 claims abstract description 58
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 claims abstract description 58
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 claims abstract description 34
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 33
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 30
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 claims abstract description 29
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 28
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 claims abstract description 28
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 19
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 claims abstract description 19
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 17
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims abstract description 15
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 14
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 48
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 239000013068 control sample Substances 0.000 claims description 25
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 14
- -1 chlorine ions Chemical class 0.000 claims description 12
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 claims description 9
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 5
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N carbonic acid Chemical class OC(O)=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 4
- 150000001804 chlorine Chemical class 0.000 claims description 4
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 claims description 4
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 claims description 4
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 3
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000001763 2-hydroxyethyl(trimethyl)azanium Substances 0.000 claims description 2
- 235000019743 Choline chloride Nutrition 0.000 claims description 2
- SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M choline chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)CCO SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 229960003178 choline chloride Drugs 0.000 claims description 2
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 235000011285 magnesium acetate Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 claims description 2
- 229940069446 magnesium acetate Drugs 0.000 claims description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 8
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 abstract description 8
- 239000008239 natural water Substances 0.000 abstract description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 3
- 230000035622 drinking Effects 0.000 abstract description 3
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 abstract description 3
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 abstract description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 2
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 abstract description 2
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 abstract description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 abstract 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 32
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 32
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 32
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 20
- 108091006112 ATPases Proteins 0.000 description 8
- 102000057290 Adenosine Triphosphatases Human genes 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 6
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 150000004945 aromatic hydrocarbons Chemical class 0.000 description 4
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 229910001385 heavy metal Chemical class 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 150000002903 organophosphorus compounds Chemical class 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 2
- VSOYJNRFGMJBAV-UHFFFAOYSA-N N.[Mo+4] Chemical compound N.[Mo+4] VSOYJNRFGMJBAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000010842 industrial wastewater Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 2
- 238000004313 potentiometry Methods 0.000 description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 2
- HPGGPRDJHPYFRM-UHFFFAOYSA-J tin(iv) chloride Chemical compound Cl[Sn](Cl)(Cl)Cl HPGGPRDJHPYFRM-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003911 water pollution Methods 0.000 description 2
- GKWLIQDHWRWNRS-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC(N)(CO)CO.OCCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 GKWLIQDHWRWNRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLFDGMDQNMQCGF-UHFFFAOYSA-M 2-butanoylsulfanylethyl(trimethyl)azanium;bromide Chemical compound [Br-].CCCC(=O)SCC[N+](C)(C)C JLFDGMDQNMQCGF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- WEQAAFZDJROSBF-UHFFFAOYSA-M 2-butanoylsulfanylethyl(trimethyl)azanium;iodide Chemical compound [I-].CCCC(=O)SCC[N+](C)(C)C WEQAAFZDJROSBF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 102000003914 Cholinesterases Human genes 0.000 description 1
- 108090000322 Cholinesterases Proteins 0.000 description 1
- 241000237852 Mollusca Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000296 active ion transport Effects 0.000 description 1
- 230000009056 active transport Effects 0.000 description 1
- 230000001171 adenosinetriphosphoric effect Effects 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000010876 biochemical test Methods 0.000 description 1
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 229940048961 cholinesterase Drugs 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000006912 hydrolase reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000002887 neurotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 150000004045 organic chlorine compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000003992 organochlorine insecticide Substances 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940048102 triphosphoric acid Drugs 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретения относятся к экологии, токсикологии, санитарии и гигиене и могут быть использованы для наблюдения, контроля и анализа качества питьевой, природной и сточных вод.The invention relates to ecology, toxicology, sanitation and hygiene and can be used to monitor, control and analyze the quality of drinking, natural and wastewater.
Разработано несколько достаточно чувствительных биохимических тест-методов, позволяющих оценить уровень загрязнения водоемов токсикантами. Из уровня техники известен способ определения токсичности воды (SU 1762232, G 01 N 33/48, опубликованный 15.09.1992), включающий инкубацию биологического тест-объекта и пробы воды с последующим определением токсичности. В качестве тест-объекта используют реагент, состоящий из исследуемой пробы воды, которую предварительно фильтруют и затем к 5 мл подготовленной пробы добавляют эритроцитарную массу в количестве, обеспечивающем концентрацию 200-250 клеток на 1 мкл (10 мкл эритроцитарной массы на 1 мл пробы). Определение токсичности проводят по реакции термогемолиза на спектрофотометре при длине волны 670 нм и сравнивают с контрольной пробой оценкой по формуле.Several fairly sensitive biochemical test methods have been developed to assess the level of pollution of water bodies with toxicants. The prior art method for determining the toxicity of water (SU 1762232, G 01 N 33/48, published 09/15/1992), including the incubation of a biological test object and a sample of water with subsequent determination of toxicity. As a test object, a reagent is used, consisting of a test sample of water, which is pre-filtered and then erythrocyte mass is added to 5 ml of the prepared sample in an amount providing a concentration of 200-250 cells per 1 μl (10 μl of red blood cell per 1 ml of sample). Determination of toxicity is carried out according to the reaction of hemogolysis on a spectrophotometer at a wavelength of 670 nm and compared with a control sample by the formula.
Получению требуемого технического результата препятствует сложность способа и длительность анализа, большая трудоемкость.The required technical result is hindered by the complexity of the method and the duration of the analysis, a large complexity.
Наиболее близким аналогом, принятым за прототип для всех объектов изобретения, является способ определения токсичных веществ в воде (SU 1359741, G 01 N 33/48, опубликованный 15.12.1987), используемый в этом способе реагент и его назначение. Согласно указанному изобретению способ определения токсических веществ (в частности, для указанного способа - фосфороорганических пестицидов) включает отбор пробы, забуферирование ее до рН 7,5, введение холинэстеразы и субстрата - бутирилтиохолинбромида или бутирилтиохолиниодида, инкубирование с последующим колометрированием.The closest analogue adopted for the prototype for all objects of the invention is a method for the determination of toxic substances in water (SU 1359741, G 01 N 33/48, published 15.12.1987), the reagent used in this method and its purpose. According to the specified invention, a method for determining toxic substances (in particular, for the specified method, organophosphorus pesticides) includes sampling, buffering it to pH 7.5, introducing cholinesterase and a substrate, butyrylthiocholin bromide or butyrylthiocholiniodide, incubation, followed by colorimetry.
С существенными признаками первого объекта заявляемого изобретения совпадают такие признаки прототипа, как назначение, определение токсичности по изменению активности фермента. С существенными признаками второго объекта заявляемого изобретения совпадают такие признаки прототипа, как назначение, смешение фермента с пробой водной среды, предварительно забуференной до физиологических рН, добавление раствора, инкубацию с образованием продукта реакции и определение токсичности по содержанию продукта реакции. С существенными признаками третьего объекта заявляемого изобретения совпадают такие признаки прототипа, как назначение, вид вещества реагента - фермент. С существенными признаками четвертого объекта заявляемого изобретения совпадают такие признаки прототипа, как вид применяемого вещества по указанному назначению, а именно фермент.Significant features of the first object of the claimed invention coincide with such features of the prototype as purpose, determination of toxicity by changing the activity of the enzyme. The essential features of the second object of the claimed invention coincide with such features of the prototype as purpose, mixing the enzyme with a sample of the aqueous medium previously buffered to physiological pH, adding a solution, incubation with the formation of the reaction product and determining toxicity by the content of the reaction product. With the essential features of the third object of the claimed invention coincide such signs of the prototype, as the purpose, type of substance of the reagent is an enzyme. Significant features of the fourth object of the claimed invention coincide with such features of the prototype as the type of substance used for the specified purpose, namely the enzyme.
Получению требуемого технического результата препятствует ограниченные функциональные возможности способа, т.к. этот метод позволяет определять уровень загрязнения воды только фосфорорганическими пестицидами.Obtaining the desired technical result is hampered by the limited functionality of the method, because This method allows you to determine the level of water pollution only with organophosphorus pesticides.
Задачей изобретений является разработка новых биологических экспресс-методов и реагентов, позволяющих определять низкие концентрации различных токсических веществ в водной среде.The objective of the invention is the development of new biological rapid methods and reagents that allow to determine low concentrations of various toxic substances in the aquatic environment.
Технический результат, получаемый при реализации изобретений, выражается в расширении функциональных возможностей способа и применения реактива, увеличении чувствительности, обеспечении возможности определения токсичности при более низких концентрациях различных классов токсических веществ, например, ароматических углеводородов, хлорорганических и фосфорорганических соединений и солей тяжелых металлов в питьевой, природных и сточных водах, повышении надежности способа. Дополнительный технический результат выражается в упрощении и ускорении проведения тест-анализа. Кроме того, очевидным достоинством предлагаемого метода является доступность биологического материала для изготовления тест-объекта и возможность его использования в любой лаборатории, имеющей недорогостоящее оборудование. Заявленные способы, реагент и применение позволяют исследовать степень загрязнения природных водоемов или сточных вод промышленных предприятий на уровне ферментной системы, что позволяет установить степень токсичности образца, избежав трудноулавливаемого нивелирования токсичности веществ, нередко наблюдаемого при использовании в качестве биотеста целого организма.The technical result obtained by the implementation of the invention is expressed in expanding the functionality of the method and application of the reagent, increasing the sensitivity, providing the ability to determine toxicity at lower concentrations of various classes of toxic substances, for example, aromatic hydrocarbons, organochlorine and organophosphorus compounds and heavy metal salts in drinking, natural and waste waters, increasing the reliability of the method. An additional technical result is expressed in the simplification and acceleration of the test analysis. In addition, the obvious advantage of the proposed method is the availability of biological material for the manufacture of the test object and the possibility of its use in any laboratory that has low-cost equipment. The claimed methods, reagent and application allow us to study the degree of pollution of natural water bodies or industrial wastewater at the level of the enzyme system, which allows us to establish the degree of toxicity of the sample, avoiding the difficult to level toxicity of substances, which is often observed when using the whole organism as a biotest.
Для достижения вышеуказанного технического результата в качестве первого объекта предложен способ определения токсичности водной среды, заключающийся в определении изменения активности Mg2+-АТФазы плазматических мембран мозга животных, активированной ионами хлора и/или бикарбоната.To achieve the above technical result, as a first object, a method for determining the toxicity of an aqueous medium is proposed, which consists in determining the change in the activity of Mg 2+ -ATPase of plasma membranes of animal brain activated by chlorine and / or bicarbonate ions.
Отличительными от наиболее близкого аналога являются такие признаки, как использование конкретного фермента - Mg2+-АТФазы плазматических мембран мозга животных, и активация его ионами хлора и/или бикарбоната.Distinctive from the closest analogue are such signs as the use of a particular enzyme — Mg 2+ -ATPase of plasma membranes of the brain of animals, and its activation by chlorine and / or bicarbonate ions.
Большинство методов определения активности ферментов основано на измерении концентрации фосфора неорганического Фн в пробе. К таким методам относятся, например, метод Ратбуна и Бетлах или метод Фиске и Суббароу, а также метод Чена. Методика выполнения вышеуказанных методов подробно раскрыта в литературе, например в [Болдырев А.А., Лопина О.Д., Рубцов А.М., И.А. Свинухова. Биохимия активного транспорта ионов и транспортные АТФазы. Издательство МГУ, 1983, 126 с.].Most methods for determining the activity of the enzymes is based on measuring the concentration of inorganic phosphorus F n in the sample. Such methods include, for example, the Rathbun and Betlach method or the Fiske and Subbarow method, as well as the Chen method. The methodology for implementing the above methods is described in detail in the literature, for example, in [Boldyrev A.A., Lopina O.D., Rubtsov A.M., I.A. Svinukhov. Biochemistry of active ion transport and transport ATPases. MSU Publishing House, 1983, 126 pp.].
Разработаны также другие методы, позволяющие определить активность АТФаз.Other methods have also been developed to determine the activity of ATPases.
Регенерирующая система. Целый ряд задач (при исследовании свойств фермента) позволяет решить применение регенерирующей системы, в которую входит фермент (ферменты), превращающий продукт исследуемой реакции в исходный субстрат, а также дополнительный субстрат для реакции регенерации. Наиболее часто при исследовании транспортных АТФаз для превращения АДФ в АТФ используют пируваткиназную регенерирующую систему пируваткиназа-фосфоенолпируват (ФЕП). Использование сопряженной системы ферментов позволяет вести непрерывную регистрацию активности фермента по уменьшению оптической плотности при 340 нм.Regenerating system. A whole series of problems (when studying the properties of an enzyme) makes it possible to solve the use of a regenerating system, which includes an enzyme (s), which turns the product of the test reaction into an initial substrate, as well as an additional substrate for the regeneration reaction. Most often, in the study of transport ATPases, the pyruvate kinase-regenerating system pyruvate kinase-phosphoenolpyruvate (PEP) is used to convert ADP to ATP. The use of a conjugated enzyme system allows continuous recording of enzyme activity to reduce optical density at 340 nm.
рН-метрия. Удобным методом определения ферментативной активности АТФаз является потенциометрический метод. В основе этого метода лежит регистрация скорости накопления протона (рК для Н2PO4' равно 6,8, т.е. в физиологических условиях диссоциирует 50% ионов Н2PO4). Закисление регистрируют в слабозабуференной среде инкубации. Потенциометрический метод позволяет избежать ряд методических трудностей, возникающих при регистрации АТФазной активности по возрастанию Фн в присутствии некоторых фармакологических веществ и, кроме того, также позволяет получить ответ достаточно быстро. Для этого метода необходимы рН-метр с электродом, термостатируемая ячейка, самописец, магнитная мешалка.pH meter A convenient method for determining the enzymatic activity of ATPases is the potentiometric method. The basis of this method is the registration of the proton accumulation rate (pK for H 2 PO 4 'is 6.8, i.e., under physiological conditions 50% of H 2 PO 4 ions dissociate). Acidification is recorded in a slightly buffered incubation medium. The potentiometric method avoids a number of methodological difficulties that arise when registering ATPase activity by increasing F n in the presence of certain pharmacological substances and, in addition, also allows you to get an answer quickly enough. For this method, a pH meter with an electrode, a thermostatic cell, a recorder, and a magnetic stirrer are required.
В частном случае выполнения изобретения по первому объекту изменение активности Mg2+-АТФазы плазматических мембран мозга животных, активированной ионами хлора и/или бикарбоната, определяют по содержанию фосфора неорганического, образуемого при инкубации раствора, полученного путем смешения пробы водной среды, доведенной до физиологических рН не содержащим фосфор буфером, с раствором, содержащим трис-АТФ и источник ионов магния, а также источник ионов хлора и/или бикарбоната.In the particular case of the invention, according to the first object, the change in the activity of the Mg 2+ -ATPase of the plasma membranes of the animal brain activated by chlorine and / or bicarbonate ions is determined by the inorganic phosphorus content formed during the incubation of the solution obtained by mixing a sample of the aqueous medium adjusted to physiological pH a phosphorus-free buffer, with a solution containing Tris-ATP and a source of magnesium ions, as well as a source of chlorine ions and / or bicarbonate.
Для достижения вышеуказанного технического результата в качестве второго объекта предложен способ определения токсичности водной среды, включающий смешение плазматических мембран мозга животных с пробой водной среды, доведенной до физиологических рН не содержащим фосфор буфером, добавление раствора, содержащего трис-АТФ и источник ионов магния, а также источник/источники ионов хлора и/или бикарбоната, инкубацию с образованием фосфора неорганического и определение токсичности по содержанию фосфора неорганического.To achieve the above technical result, as a second object, a method for determining the toxicity of an aqueous medium is proposed, including mixing plasma membranes of the brain of animals with a sample of the aqueous medium adjusted to physiological pH without phosphorus-containing buffer, adding a solution containing Tris-ATP and a source of magnesium ions, and source / sources of chlorine and / or bicarbonate ions, incubation with the formation of inorganic phosphorus and determination of toxicity by the inorganic phosphorus content.
Отличительными от наиболее близкого аналога являются такие признаки как использование фермента - плазматических мембран мозга животных, добавление раствора, содержащего трис-АТФ и источник ионов магния, а также источник/источники ионов хлора и/или бикарбоната, что обеспечивает при инкубации образование фосфора неорганического, по содержанию которого и определяют токсичность.Distinguishing from the closest analogue are such signs as the use of an enzyme - plasma membranes of the brain of animals, the addition of a solution containing Tris-ATP and a source of magnesium ions, as well as the source / sources of chlorine ions and / or bicarbonate, which ensures the formation of inorganic phosphorus during incubation the content of which is determined by toxicity.
В частном случае выполнения изобретения по второму объекту может быть дополнительно проведено преинкубирование после смешения плазматических мембран с пробой водной среды, доведенной до физиологических рН не содержащим фосфор буфером.In the particular case of the invention, the second object can be additionally preincubated after mixing the plasma membranes with a sample of the aqueous medium adjusted to physiological pH without phosphorus-containing buffer.
В частном случае выполнения изобретения по второму объекту дополнительно используют контрольную пробу с чистой средой, доведенной до физиологических рН не содержащим фосфор буфером, которую смешивают с плазматическими мембранами мозга животных, добавляют раствор трис-АТФ и источник ионов магния, а также источник/источники ионов хлора и/или бикарбоната соответственно составу раствора для пробы водной среды, инкубируют с образованием фосфора неорганического, определяют содержание фосфора неорганического в контрольной пробе, а определение токсичности водной среды по содержанию фосфора неорганического проводят с учетом содержания фосфора неорганического в контрольной пробе. При этом может быть дополнительно проведено преинкубирование после смешения плазматических с контрольной пробой, доведенной до физиологических рН не содержащим фосфор буфером.In the particular case of carrying out the invention, the second object additionally uses a control sample with a clean medium adjusted to physiological pH without phosphorus-containing buffer, which is mixed with plasma membranes of the animal’s brain, a Tris-ATP solution and a source of magnesium ions are added, as well as a source / sources of chlorine ions and / or bicarbonate according to the composition of the solution for the sample of the aqueous medium, incubated with the formation of inorganic phosphorus, determine the content of inorganic phosphorus in the control sample, and determine The toxicity of the aqueous medium according to the inorganic phosphorus content is carried out taking into account the inorganic phosphorus content in the control sample. In this case, preincubation can be carried out after mixing plasma with a control sample adjusted to physiological pH with a phosphorus-free buffer.
В частном случае выполнения изобретения по второму объекту в качестве источника ионов хлора используют соли хлора. Причем в качестве солей хлора может быть использован натрий хлористый или холин хлористый.In the particular case of the invention according to the second aspect, chlorine salts are used as a source of chlorine ions. Moreover, sodium chloride or choline chloride can be used as chlorine salts.
В частном случае выполнения изобретения по второму объекту в качестве источника ионов бикарбоната используют соль бикарбоната. Причем в качестве соли бикарбоната используют натрия бикарбонат.In the particular case of the invention according to the second aspect, a bicarbonate salt is used as a source of bicarbonate ions. Moreover, sodium bicarbonate is used as the bicarbonate salt.
В частном случае выполнения изобретения по второму объекту ионов магния используют соли магния, например, сульфат магния или ацетат магния.In a particular embodiment of the invention, magnesium salts, for example, magnesium sulfate or magnesium acetate, are used in the second object of magnesium ions.
В частном случае выполнения изобретения по второму объекту содержание фосфора неорганического определяют путем измерения экстинкции окрашенных растворов на спектрофотометре.In the particular case of carrying out the invention for the second object, the inorganic phosphorus content is determined by measuring the extinction of the colored solutions on a spectrophotometer.
В частном случае выполнения изобретения по второму объекту степень токсичности рассчитывают по отношению содержания фосфора неорганического в пробе с водной средой к содержанию фосфора неорганического в контрольной пробе.In the particular case of the invention according to the second object, the degree of toxicity is calculated by the ratio of the inorganic phosphorus content in the sample with the aqueous medium to the inorganic phosphorus content in the control sample.
В частном случае выполнения изобретения по второму объекту после смешения плазматических мембран мозга животных с пробой водной среды, доведенной до физиологических рН не содержащим фосфор буфером, полученный раствор разделяют на две части: основную и фоновую, в основную часть добавляют раствор, содержащий трис-АТФ и источник ионов магния, а также источник/источники ионов хлора и/или бикарбоната, в фоновую часть добавляют раствор, содержащий трис-АТФ и источник ионов магния, а определение токсичности водной среды по содержанию фосфора неорганического проводят с учетом фонового содержания фосфора неорганического.In the particular case of the invention according to the second object, after mixing the plasma membranes of the brain of animals with a sample of the aqueous medium adjusted to physiological pH without phosphorus-containing buffer, the resulting solution is divided into two parts: the main and the background, the solution containing Tris-ATP is added to the main part the source of magnesium ions, as well as the source / sources of chlorine and / or bicarbonate ions, add a solution containing Tris-ATP and a source of magnesium ions to the background, and the determination of the toxicity of the aqueous medium by the phosphorus content of organic performed with the background content of inorganic phosphorus.
В частном случае выполнения изобретения по второму объекту после смешения плазматических мембран мозга животных с пробой водной среды и контрольной пробой, доведенных до физиологических рН не содержащим фосфор буфером, полученные растворы разделяют на соответствующие две части: основную и фоновую, в основные части пробы водной среды и контрольной пробы добавляют раствор, содержащий трис-АТФ и источник ионов магния, а также источник/источники ионов хлора и/или бикарбоната, в фоновые части пробы водной среды и контрольной пробы добавляют раствор, содержащий трис-АТФ и источник ионов магния, а определение токсичности водной среды по содержанию фосфора неорганического проводят с учетом фонового содержания фосфора неорганического в водной среде и контрольной пробе. При этом определение степени токсичности рассчитывают, в частности, по отношению разности содержания фосфора неорганического в пробе с водной средой и фонового содержания фосфора неорганического в пробе с водной средой к разности содержания фосфора неорганического в контрольной пробе и фонового содержания фосфора неорганического в контрольной пробе.In the particular case of performing the invention according to the second object, after mixing the plasma membranes of the brain of animals with a sample of the aqueous medium and a control sample adjusted to physiological pH with a phosphorus-free buffer, the resulting solutions are divided into two parts: the main and the background, into the main parts of the sample of the aqueous medium and a control sample add a solution containing Tris-ATP and a source of magnesium ions, as well as a source / sources of chlorine ions and / or bicarbonate, add to the background parts of the sample of the aqueous medium and the control sample a solution containing Tris-ATP and a source of magnesium ions, and the determination of the toxicity of the aqueous medium by the inorganic phosphorus content is carried out taking into account the background content of inorganic phosphorus in the aqueous medium and a control sample. In this case, the determination of the degree of toxicity is calculated, in particular, from the difference between the inorganic phosphorus content in the sample with the aqueous medium and the background inorganic phosphorus content in the sample with the aqueous medium to the difference inorganic phosphorus content in the control sample and the background inorganic phosphorus content in the control sample.
Для достижения вышеуказанного технического результата в качестве третьего объекта предложен реагент для определения токсичности водной среды, представляющий собой плазматические мембраны мозга животных, содержащие Mg2+-АТФазу, способную к активации ионами хлора и бикарбоната.To achieve the above technical result, as a third object, a reagent for determining the toxicity of the aquatic environment is proposed, which is a plasma membrane of the animal brain containing Mg 2+ -ATPase capable of activation by chlorine and bicarbonate ions.
Отличительными от наиболее близкого аналога являются такие признаки, как использование конкретного фермента -Mg2+-АТФазы плазматических мембран мозга животных и ее способность к активации ионами хлора и/или бикарбоната.Distinctive features from the closest analogue are such signs as the use of a particular enzyme — Mg 2+ —ATPase of plasma membranes of the brain of animals and its ability to be activated by chlorine and / or bicarbonate ions.
В частном случае выполнения изобретения по третьему объекту реагент получают путем гомогенизации мозга животных с не содержащим фосфор буфером с физилогическим рН с последующим центрифугированием при скорости от 40 до 167 об/сек и отделением надосадочной жидкости, ее повторным центрифугированием при скорости от 300 до 3000 об/сек, добавлением основной среды и ресуспендированием.In the particular case of the invention according to the third object, the reagent is obtained by homogenizing the brain of animals with a phosphorus-free buffer with physiological pH, followed by centrifugation at a speed of 40 to 167 rpm and separation of the supernatant, its repeated centrifugation at a speed of 300 to 3000 rpm sec by adding basic medium and resuspending.
Для достижения вышеуказанного технического результата в качестве четвертого объекта предложено применение Mg2+-АТФазы плазматических мембран мозга животных, активированной ионами хлора и/или бикарбоната, в качестве реагента для определения токсичности воды.To achieve the above technical result, as the fourth object, the use of Mg 2+ -ATPase of plasma membranes of the animal brain activated by chlorine and / or bicarbonate ions as a reagent for determining water toxicity is proposed.
Отличительными от наиболее близкого аналога являются такие признаки, как применение конкретного фермента - Mg2+-АТФазы плазматических мембран мозга животных, активированной ионами хлора и/или бикарбоната.Distinctive from the closest analogue are such signs as the use of a particular enzyme — Mg 2+ -ATPase of plasma membranes of the brain of animals activated by chlorine and / or bicarbonate ions.
Технический результат достигается тем, что для получения белка, обладающего Mg2+-АТФазной активностью, используют мозг животных с различным уровнем организации от беспозвоночных до позвоночных животных (моллюски, рыбы или кролики). В мозге животных этот белок содержится в максимальном количестве, он высокочувствителен к реагентам, и его функциональные свойства легко поддаются регистрации.The technical result is achieved by the fact that to obtain a protein having Mg 2+ -ATPase activity, the brains of animals with different levels of organization from invertebrates to vertebrates (mollusks, fish or rabbits) are used. In the brain of animals, this protein is contained in the maximum amount, it is highly sensitive to reagents, and its functional properties are easily detectable.
В клетках мозга животных АТФ содержится в наибольшем количестве. АТФ (аденозинтрифосфорная кислота) участвует во многих реакциях, катализируемых ферментами АТФазами, осуществляющими метаболизм всех видов соединений. Во всех живых клетках АТФ, находящаяся в ядре клетки, выступает в качестве депо для хранения и переноса химической энергии. Химическая природа этих превращений проста - происходит гидролиз АТФ, сопровождаемый освобождением энергии. Происходящий процесс: Н2O+АТФ→АДФ+Фн In the brain cells of animals, ATP is found in the greatest quantity. ATP (adenosine triphosphoric acid) is involved in many reactions catalyzed by ATPase enzymes that metabolize all types of compounds. In all living cells, ATP, located in the cell nucleus, acts as a depot for storing and transferring chemical energy. The chemical nature of these transformations is simple - ATP hydrolysis occurs, accompanied by the release of energy. The ongoing process: N 2 O + ATP → ADP + F n
Транспортные АТФазы (в частности исследуемая нами Cl-, HCO3- АТФаза) ускоряют гидролиз АТФ и используют выделяющуюся энергию для транспорта анионов через мембраны клеток.Transport ATPases (in particular, Cl - , HCO 3 - ATPase under study) accelerate ATP hydrolysis and use the released energy to transport anions across cell membranes.
Способ, реагент и применение позволяют оценить степень загрязнения пробы водной среды по ее воздействию на предварительно приготовленный из мозга животных белковый препарат (плазматические мембраны), содержащий фермент - Mg2+-АТФазу. Механизм нейротоксического действия ароматических углеводородов и, в частности, инсектицидов, состоит в нарушении белковых ансамблей ионных каналов нервных клеток. Mg2+-АТФ-гидролазная реакция плазматических мембран, активированных ионами, демонстрирует прямую сопряженность данного фермента с рецептор/канальными ансамблями, отражает их энергозависимость и, кроме того, при действии токсических лигандов изменяет свою активность абсолютно идентично изменению кинетики скорости ионных потоков. Изобретение основано на исследовании функциональных свойств рецепторных белков, управляющих ионными каналами при действии токсических веществ без непосредственного изучения транспортной функции того или иного иона, а только по Mg2+-АТФазной активности плазматических мембран, которая в отличие от Mg2+-АТФаз других клеточных органелл отражает не только энергетическое, но конформационное состояние рецепторно/канального ансамбля мозга животных.The method, reagent and application make it possible to assess the degree of contamination of a sample of the aquatic environment by its effect on a protein preparation (plasma membranes) pre-prepared from the animal brain containing the enzyme Mg 2+ -ATPase. The mechanism of the neurotoxic action of aromatic hydrocarbons and, in particular, insecticides, is a violation of protein ensembles of ion channels of nerve cells. The Mg 2+ -ATP-hydrolase reaction of plasma membranes activated by ions demonstrates the direct conjugation of this enzyme with receptor / channel ensembles, reflects their energy dependence and, in addition, under the action of toxic ligands, it changes its activity absolutely identical to the change in the kinetics of ion flow velocity. The invention is based on the study of the functional properties of receptor proteins that control ion channels under the action of toxic substances without directly studying the transport function of an ion, but only on the Mg 2+ -ATPase activity of plasma membranes, which, in contrast to Mg 2+ -ATPases of other cellular organelles reflects not only the energy, but the conformational state of the receptor / channel ensemble of the animal brain.
Способ определения токсичности воды осуществляется следующим образом.A method for determining the toxicity of water is as follows.
Для получения плазматических мембран, которые содержат фермент - Mg2+-АТФазу, применяют следующие этапы. Декапитируют достаточное количество половозрелых животных для получения от 10 до 100 г мозга. Мозг, по мере вычленения, помещают в стакан, охлаждаемый в ледяной бане. Помещают от 10 до 100 г мозга в ступку или гомогенизатор Поттера и добавляют от 20 до 200 мл основной среды, представленной не содержащим фосфор буфером с физиологическим рН от 10-2 до 10-1 М. Тщательно гомогенизируют ткань при температуре от 4 до 10°С. К гомогенату добавляют от 80 до 800 мл основной среды, поддерживая температуру от 4 до 10°С, размешивают его в течение 5-15 мин. Распределяют гомогенат поровну между центрифужными пробирками объемом от 5 до 100 мл и проводят центрифугирование на лабораторной центрифуге в течение времени от 10 до 70 мин при скорости от 40 до 160 об/сек, используя угловой ротор или ротор с подвесными стаканами. Надосадочную жидкость центрифугируют повторно при 300-3000 об/сек в течение от 0,5 до 2 часов. Надосадочную жидкость осторожно сливают, ее остаток удаляют из перевернутого стакана с помощью фильтровальной бумаги. В стакан добавляют от 1 до 100 мл основной среды (буфера) и ресуспендируют осадок путем пропускания его через иглу. Суспензию разливают по пробиркам объемом от 0,5 мл до 2 мл и замораживают в морозильной камере при температуре не выше -20°С для хранения. Образцы хранят в морозильной камере. Активность фермента в этих условиях сохраняется в течение 60 суток.To obtain plasma membranes that contain the enzyme - Mg 2+ -ATPase, the following steps are used. A sufficient number of mature animals are decapitated to obtain from 10 to 100 g of the brain. The brain, as it is isolated, is placed in a glass, cooled in an ice bath. Place from 10 to 100 g of the brain in a Potter mortar or homogenizer and add from 20 to 200 ml of the basic medium, which is a phosphorus-free buffer with a physiological pH of 10 -2 to 10 -1 M. Thoroughly homogenize the tissue at a temperature of 4 to 10 ° FROM. From 80 to 800 ml of the basic medium is added to the homogenate, maintaining the temperature from 4 to 10 ° C, stirring it for 5-15 minutes. Distribute the homogenate equally between centrifuge tubes with a volume of 5 to 100 ml and carry out centrifugation in a laboratory centrifuge for a time of 10 to 70 minutes at a speed of 40 to 160 rpm using an angular rotor or a rotor with hanging cups. The supernatant is centrifuged repeatedly at 300-3000 rpm for 0.5 to 2 hours. The supernatant is carefully drained, its residue is removed from the inverted beaker using filter paper. From 1 to 100 ml of basic medium (buffer) is added to the beaker and the precipitate is resuspended by passing it through a needle. The suspension is poured into test tubes with a volume of 0.5 ml to 2 ml and frozen in a freezer at a temperature not exceeding -20 ° C for storage. Samples are stored in a freezer. The enzyme activity under these conditions lasts for 60 days.
При определении токсичности водной среды отбирают пробу. Размораживают часть плазматических мембран, например, объемом 0,5 мл. Исследуемую пробу воды доводят до рН 5,5-9,0 любым не содержащим фосфор буфером, используемым в энзимологии, и разливают в стеклянные пробирки по 0,5 мл в каждую. Выбирают любой не содержащий фосфор буфер, применяемый в энзимологии, с концентрацией от 10-2 до 10-1 M с pH 6,0-9,0. Выбор буфера, не содержащего фосфор, обусловлен тем, что в результате протекания биохимической реакции выделяется фосфор неорганический, и фосфор, содержащийся в буфере, будет мешать определению содержания фосфора неорганического, выделяющегося при гидролизе.When determining the toxicity of the aquatic environment, a sample is taken. Part of the plasma membranes is thawed, for example, with a volume of 0.5 ml. The test water sample is adjusted to pH 5.5-9.0 with any phosphorus-free buffer used in enzymology and poured into glass tubes of 0.5 ml each. Any phosphorus-free buffer used in enzymology with a concentration of from 10 -2 to 10 -1 M with a pH of 6.0-9.0 is chosen. The choice of a buffer that does not contain phosphorus is due to the fact that inorganic phosphorus is released as a result of the biochemical reaction, and the phosphorus contained in the buffer will interfere with the determination of the inorganic phosphorus released during hydrolysis.
Для приготовления контрольной пробы воды в пробирки вносят буфер, приготовленный на дистиллированной воде в том же объеме, как исследуемые образцы.To prepare a control water sample, a buffer prepared in distilled water in the same volume as the test samples is added to the tubes.
Плазматические мембраны вносят по 5 (до 50) мкл в каждую пробирку. Проводят преинкубацию плазматических мембран в течение 10-30 мин при комнатной температуре. Затем в каждую пробирку добавляют смесь, содержащую трис-АТФ (3·10-4-5·10-3 М), и источник ионов магния, например, MgSO4 (5·10-4-5·10-3 М). Трис-АТФ является буфером, используемым в биохимии для создания щелочной среды при исследовании белковых структур. Трис-АТФ добавляют к растворенной в воде АТФ, чтобы нейтрализовать кислую среду, которую создает в инкубационной среде АТФ. При добавлении Трис-АТФ создают рН среды раствора АТФ, близкую к 7,0, т.е. к физиологическим значениям, т.к. фермент оптимально функционирует только при физиологических значениям рН среды инкубации.Plasma membranes contribute 5 (up to 50) μl to each tube. Plasma membranes are preincubated for 10-30 minutes at room temperature. Then to each tube was added a mixture containing ATP-tris (3 · 10 -4 -5 · 10 -3 M) and a source of magnesium ions, for example, MgSO 4 (5 · 10 -4 -5 · 10 -3 M). Tris-ATP is a buffer used in biochemistry to create an alkaline environment in the study of protein structures. Tris-ATP is added to ATP dissolved in water to neutralize the acidic environment that ATP creates in the incubation medium. When Tris-ATP is added, the pH of the ATP solution medium is close to 7.0, i.e. to physiological values, because the enzyme functions optimally only at physiological pH values of the incubation medium.
Для определения фонового содержания фосфора неорганического в присутствии Mg2+-АТФазы в несколько пробирок из вышеприведенных с исследуемой пробой воды и в несколько пробирок с буфером, приготовленным на дистиллированной воде, вносят хлорид натрия (5·10-3-10-2 М) и/или бикарбонат натрия (2·10-3-5·10-3 М). В пробы для определения фонового содержания фосфора неорганического дополнительно вводят анионы хлора Cl- и/или бикарбоната HCO3 - для активации фермента Mg2+-АТФазы. Все пробирки встряхивают и помещают в водяную баню на 5-60 мин и выдерживают там при температуре, соответствующей стандартным условиям протекания биохимических реакций. После инкубирования во все пробирки предпочтительно добавляют по 0,5 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты для остановки реакции.To determine the background content of inorganic phosphorus in the presence of Mg 2+ -ATPase, sodium chloride (5 · 10 -3 -10 -2 M) is added to several test tubes from the above water with a test sample of water and to a buffer prepared with distilled water / or sodium bicarbonate (2 · 10 -3 -5 · 10 -3 M). In the samples to determine the background content of inorganic phosphorus, chlorine anions Cl - and / or bicarbonate HCO 3 - are additionally introduced to activate the enzyme Mg 2+ -ATPase. All tubes are shaken and placed in a water bath for 5-60 minutes and kept there at a temperature corresponding to standard biochemical reaction conditions. After incubation, 0.5 ml of a 10% trichloroacetic acid solution is preferably added to all tubes to stop the reaction.
Определяют содержание фосфора неорганического, который образуется в результате протекания реакции при инкубации, любым методом, например методом Чена. Для определения содержания фосфора неорганического во все пробирки вносят реагенты в следующей последовательности: 1,5 мл дистиллированной воды + 1,8 мл смеси (1 часть 30% Н2SO4+2 части Н2Oдист.+1 часть 5% аммония молибденовокислого) + 0,2 мл 0,25% хлористого олова и аккуратно перемешивают. Через 15 мин измеряют экстинцию окрашенных растворов (Е) на спектрофотометре при длине волны 650 нм.The inorganic phosphorus content, which is formed as a result of the reaction during incubation, is determined by any method, for example, by the Chen method. To determine the inorganic phosphorus content, reagents are added to all tubes in the following sequence: 1.5 ml of distilled water + 1.8 ml of the mixture (1 part 30% H 2 SO 4 + 2 parts H 2 O dist. +1 part 5% ammonium molybdenum acid ) + 0.2 ml of 0.25% tin chloride and mix gently. After 15 minutes, the extinction of the colored solutions (E) was measured on a spectrophotometer at a wavelength of 650 nm.
Далее вычисляют процент активности Mg2+-АТФазы по формуле:Next, calculate the percentage of activity of Mg 2+ -ATPase according to the formula:
А - активность фермента Mg2+-АТФазы,And the activity of the enzyme Mg 2+ -ATPase,
Еоп.Cl/HCO3 - средняя арифметическая экстинкция исследуемой пробы воды в присутствии Mg2+-АТФазы, активированной ионами хлора и/или бикарбоната;E op.Cl / HCO3 — arithmetic mean extinction of the studied water sample in the presence of Mg 2+ -ATPase activated by chlorine and / or bicarbonate ions;
Eоп.Mg-АТФ - средняя арифметическая экстинкция исследуемой пробы воды для определения фонового содержания фосфора неорганического в присутствии Mg2+-АТФазы;E op.Mg-ATP - arithmetic mean extinction of the studied water sample to determine the background content of inorganic phosphorus in the presence of Mg 2+ -ATPase;
Еконт.Cl/HCO3 - средняя арифметическая экстинция контрольного образца в присутствии Mg2+-АТФазы, активированной ионами хлора и/или бикарбоната;E CONT. Cl / HCO3 — Arithmetic mean extinction of a control sample in the presence of Mg 2+ -ATPase activated by chlorine and / or bicarbonate ions;
Еконт.Mg-АТФ - средняя арифметическая экстинкция контрольного образца для определения фонового содержания фосфора неорганического в присутствии Mg2+-АТФазы;E contact Mg-ATP - arithmetic mean extinction of the control sample to determine the background content of inorganic phosphorus in the presence of Mg 2+ -ATPase;
По полученным данным оценивают уровень токсичности исследуемого образца водной среды, например, по 10-балльной шкале табл.1.According to the data obtained, the toxicity level of the studied sample of the aquatic environment is estimated, for example, on a 10-point scale of Table 1.
Чем выше балл, тем токсичнее исследуемый образец.The higher the score, the more toxic the test sample.
Заявленный способ определения токсичности воды и реагент для определения токсичности воды подтверждаются следующими примерами.The claimed method for determining the toxicity of water and a reagent for determining the toxicity of water are confirmed by the following examples.
Пример 1. Применение плазматических мембран мозга животных для определения степени токсичности водного образца, содержащего хлорорганический инсектицид -4-этилбициклофосфат.Example 1. The use of plasma membranes of the brain of animals to determine the degree of toxicity of an aqueous sample containing an organochlorine insecticide -4-ethylbicyclophosphate.
Активность Mg2+-АТФазы измеряют по содержанию Фн, образующегося в ходе реакции, следующим образом.The activity of Mg 2+ -ATPase is measured by the content of Ф n formed during the reaction, as follows.
Размораживают часть плазматических мембран (объем 0,5 мл). Берут 4 группы пробирок, по 4 пробирки в каждой. В 1 группу пробирок (контрольную) вносят по 0,5 мл буфера рН 7,4, а в каждую следующую группу пробирок по 0,5 мл проб анализируемой воды, содержащей 4-этилбициклофосфат, приготовленный на буфере ХЕПЕС-трис, рН 7,4 в концентрации соответственно 10-5 М; 5·10-6 M; 10-6 М. Плазматические мембраны вносят во все пробирки по 5-50 мкл. Преинкубирование плазматических мембран с буфером и 4-этилбициклофосфатом проводят в течение 10-20 мин при комнатной температуре. Во все пробирки добавляют по 300 мкл смеси, содержащей 7·10-4 М трис-АТФ и 7·10-4 М MgSO4. Кроме того, в 3 и 4 пробирку каждой группы вносят 10-2 М хлорида натрия и/или 2·10-З M бикарбоната натрия для получения фонового содержания фосфора неорганического. Пробирки встряхивают и помещают на 30 мин в водяную баню с температурой 37°С. После инкубации в каждую пробирку предпочтительно внести по 0,5 мл 10% трихлоруксусной кислоты для остановки реакции. Во всех пробирках проводят выявление содержания фосфора неорганического окрашиванием по методу Чена. Для этого в каждую пробирку вносят реагенты в следующей последовательности: 1,5 мл дистиллированной Н2O+1,8 мл смеси (1 часть 30% H2SO4+2 части Н2Oдист.+1 часть 5% аммония молибденовокислого) + 0,2 мл 0,25% хлористого олова и аккуратно перемешивают. Через 15 мин измеряют экстинцию окрашенных растворов (Е) на спектрофотометре при длине волны 650 нм.Defrost part of the plasma membranes (volume 0.5 ml). Take 4 groups of tubes, 4 tubes in each. In 1 group of test tubes (control), 0.5 ml of pH 7.4 buffer is added, and in each subsequent group of test tubes 0.5 ml of samples of analyzed water containing 4-ethylbicyclophosphate prepared on HEPES-Tris buffer, pH 7.4 in a concentration of respectively 10 -5 M; 5 · 10 -6 M; 10 -6 M. Plasma membranes are introduced into all tubes of 5-50 μl. Preincubation of plasma membranes with buffer and 4-ethylbicyclophosphate is carried out for 10-20 minutes at room temperature. 300 μl of a mixture containing 7 · 10 -4 M Tris-ATP and 7 · 10 -4 M MgSO 4 are added to all tubes. In addition, 3 and 4 of each tube group 10 making -2 M sodium chloride and / or -s 2 * 10 M sodium bicarbonate solution to obtain background content of inorganic phosphorus. The tubes are shaken and placed for 30 min in a water bath with a temperature of 37 ° C. After incubation, it is preferable to add 0.5 ml of 10% trichloroacetic acid to each tube to stop the reaction. Inorganic staining of phosphorus is carried out in all tubes by Chen method. To do this, reagents are added to each tube in the following sequence: 1.5 ml of distilled H 2 O + 1.8 ml of the mixture (1 part 30% H 2 SO 4 + 2 parts H 2 O dist. +1 part 5% ammonium molybdenum acid) + 0.2 ml of 0.25% tin chloride and mix gently. After 15 minutes, the extinction of the colored solutions (E) was measured on a spectrophotometer at a wavelength of 650 nm.
Результаты представлены в табл.2:The results are presented in table 2:
Отсутствие
4-этилбициклофосфатаI control group -
Lack of
4-ethylbicyclophosphate
2-0,210
Средняя - 0,2051-0,200
2-0,210
Medium - 0.205
4-0,340
Средняя - 0,3353-0.330
4-0,340
Medium - 0.335
Присутствие
10-6 М
4-этилбициклофосфатаII experimental group
Presence
10 -6 M
4-ethylbicyclophosphate
6-0,210
Средняя - 0,2105-0,210
6-0,210
Average - 0,210
8-0,290
Средняя - 0,2957-0,300
8-0,290
Average - 0.295
4-этилбициклофосфатаIII experimental group - the presence of 5 · 10 -6 M
4-ethylbicyclophosphate
10-0,230
Средняя - 0,2259-0,220
10-0,230
Average - 0.225
12-0,260
Средняя - 0,26511-0.270
12-0,260
Average - 0.265
присутствие 10-5 М
4-этилбициклофосфатаIV experimental group
presence of 10 -5 M
4-ethylbicyclophosphate
14-0,240
Средняя - 0,23513-0,230
14-0,240
Average - 0.235
16-0,240
Средняя - 0,24515-0,250
16-0,240
Average - 0.245
Складывают результаты измерения, высчитывают средние значения (см. таблицу 2) и по формуле определяют активность фермента в процентах.The measurement results are added up, the average values are calculated (see table 2) and the enzyme activity in percent is determined by the formula.
По полученной активности фермента, выраженной в процентах, оценивают степень токсичности водного образца по 10-балльной шкале, результаты представлены в табл.3:The obtained enzyme activity, expressed as a percentage, assesses the degree of toxicity of the aqueous sample on a 10-point scale, the results are presented in table 3:
Пример 2. Применение плазматических мембран мозга животных для определения степени токсичности водного образца, содержащего ароматический углеводород - фенол.Example 2. The use of plasma membranes of the brain of animals to determine the degree of toxicity of an aqueous sample containing an aromatic hydrocarbon - phenol.
По полученной активности фермента, выраженной в процентах, оценивают степень токсичности водного образца по 10-балльной шкале, результаты представлены в табл.4The obtained enzyme activity, expressed as a percentage, assesses the degree of toxicity of the aqueous sample on a 10-point scale, the results are presented in table 4
Пример 3. Применение плазматических мембран мозга животных для определения степени токсичности водного образца, содержащего фосфорорганическое соединение - карбафос.Example 3. The use of plasma membranes of the brain of animals to determine the degree of toxicity of an aqueous sample containing an organophosphorus compound - karbafos.
По полученной активности фермента, выраженной в процентах, оценивают степень токсичности водного образца по 10-балльной шкале, результаты представлены в табл.5:The obtained enzyme activity, expressed as a percentage, assesses the degree of toxicity of the aqueous sample on a 10-point scale, the results are presented in table 5:
Пример 4. Применение плазматических мембран мозга животных для определения степени токсичности водного образца, содержащего тяжелые металлы - Zn2+.Example 4. The use of plasma membranes of the brain of animals to determine the degree of toxicity of an aqueous sample containing heavy metals - Zn 2+ .
По полученной активности фермента, выраженной в процентах, оценивают степень токсичности водного образца по 10-балльной шкале, результаты представлены в табл.6:The obtained enzyme activity, expressed as a percentage, assesses the degree of toxicity of the aqueous sample on a 10-point scale, the results are presented in table 6:
Из приведенных примеров видно, что заявленный способ, применение и реагент позволяют определять низкие концентрации различных классов токсических веществ, содержащихся в водной среде. Например, определяемые концентрации ароматических углеводородов составляют от 10-5 M, концентрации хлорорганических примесей составляют ниже 10-6 M, фосфорорганических соединений 10-4 М, а ионы тяжелых металлов от 10-5 М.From the above examples it is seen that the claimed method, application and reagent allow us to determine low concentrations of various classes of toxic substances contained in the aquatic environment. For example, the determined concentrations of aromatic hydrocarbons are from 10 -5 M, the concentrations of organochlorine impurities are below 10 -6 M, organophosphorus compounds 10 -4 M, and heavy metal ions from 10 -5 M.
Использование заявленного способа определения токсичности водной среды позволяет дешево, эффективно и с высокой степенью надежности оценить загрязненность воды по 10-балльной системе. Активность фермента плазматических мембран в условиях заморозки сохраняется в течение 60 суток. Поэтому плазматические мембраны являются доступным биологическим материалом для реализации способа определения токсичности воды и получения реагента в любой момент. Измерение экстинции окрашенных растворов проводят на спектрофотометре, который возможно использовать в любой лаборатории, имеющей недорогостоящее оборудование. В связи с тем что заявленные способ и реагент исследуют степень загрязнения природных водоемов или сточных вод промышленных предприятий на уровне ферментной системы, это позволяет установить степень токсичности образца, избежав трудноулавливаемого нивелирования токсичности веществ, нередко наблюдаемого при использовании в качестве био-теста целого организма.Using the inventive method for determining the toxicity of an aqueous medium, it is possible to cheaply, efficiently and with a high degree of reliability assess water pollution by a 10-point system. The activity of the plasma membrane enzyme under freezing conditions is maintained for 60 days. Therefore, plasma membranes are available biological material for implementing the method for determining the toxicity of water and obtaining a reagent at any time. Measurement of the extinction of colored solutions is carried out on a spectrophotometer, which can be used in any laboratory that has low-cost equipment. Due to the fact that the claimed method and reagent investigate the degree of contamination of natural water bodies or industrial wastewater at the level of the enzyme system, this allows us to establish the degree of toxicity of the sample, avoiding the difficult to level toxicity of substances, which is often observed when using the whole organism as a bio-test.
Claims (20)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2004129244/15A RU2266539C1 (en) | 2004-10-05 | 2004-10-05 | METHOD OF DETERMINING TOXICITY OF AN AQUEOUS MEDIUM (OPTIONS), REAGENT FOR DETERMINING TOXICITY OF AN AQUEOUS MEDIUM, AND USE OF ANIMAL BRAIN PLASMA MEMBRANE Mg2+-ATPase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2004129244/15A RU2266539C1 (en) | 2004-10-05 | 2004-10-05 | METHOD OF DETERMINING TOXICITY OF AN AQUEOUS MEDIUM (OPTIONS), REAGENT FOR DETERMINING TOXICITY OF AN AQUEOUS MEDIUM, AND USE OF ANIMAL BRAIN PLASMA MEMBRANE Mg2+-ATPase |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2266539C1 true RU2266539C1 (en) | 2005-12-20 |
Family
ID=35869744
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2004129244/15A RU2266539C1 (en) | 2004-10-05 | 2004-10-05 | METHOD OF DETERMINING TOXICITY OF AN AQUEOUS MEDIUM (OPTIONS), REAGENT FOR DETERMINING TOXICITY OF AN AQUEOUS MEDIUM, AND USE OF ANIMAL BRAIN PLASMA MEMBRANE Mg2+-ATPase |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2266539C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2369867C1 (en) * | 2008-06-16 | 2009-10-10 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Нижегородская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию ГОУ ВПО НижГМА Росздрава) | Method of determining toxicity of aqueous media |
| RU2680519C1 (en) * | 2017-11-07 | 2019-02-22 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Уральский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО УГМУ Минздрава России) | Method for estimating complex forming properties of medicinal substances with regard to magnesium compounds |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1359741A1 (en) * | 1985-12-02 | 1987-12-15 | Институт Биологии Внутренних Вод Ан Ссср | Method of determining phosphoorganic pesticides in water |
| SU1762232A1 (en) * | 1989-05-29 | 1992-09-15 | Экспериментальная Лаборатория Медико-Биологических Проблем | Method for determining toxicity of water |
-
2004
- 2004-10-05 RU RU2004129244/15A patent/RU2266539C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1359741A1 (en) * | 1985-12-02 | 1987-12-15 | Институт Биологии Внутренних Вод Ан Ссср | Method of determining phosphoorganic pesticides in water |
| SU1762232A1 (en) * | 1989-05-29 | 1992-09-15 | Экспериментальная Лаборатория Медико-Биологических Проблем | Method for determining toxicity of water |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Yuxiang S. Wang et al., Ref Comparative biochemistry and physiology, MOLECULAR & INTEGRATIVE PHYSIOLOGY, Part A, 2003, v.134, N 2, p.409-421 (реферат). * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2369867C1 (en) * | 2008-06-16 | 2009-10-10 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Нижегородская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию ГОУ ВПО НижГМА Росздрава) | Method of determining toxicity of aqueous media |
| RU2680519C1 (en) * | 2017-11-07 | 2019-02-22 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Уральский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО УГМУ Минздрава России) | Method for estimating complex forming properties of medicinal substances with regard to magnesium compounds |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ryan et al. | Sub-lethal pharmaceutical hazard tracking in adult zebrafish using untargeted LC–MS environmental metabolomics | |
| Miseta et al. | Relationship between cellular ATP, potassium, sodium and magnesium concentrations in mammalian and avian erythrocytes | |
| Linderstrøm-Lang | Distribution of Enzymes in Tissue and Cells: Harvey Lecture, March 16, 1939 | |
| Purcell et al. | Food supply effects on the asexual reproduction and respiratory metabolism of Aurelia aurita polyps | |
| RU2266539C1 (en) | METHOD OF DETERMINING TOXICITY OF AN AQUEOUS MEDIUM (OPTIONS), REAGENT FOR DETERMINING TOXICITY OF AN AQUEOUS MEDIUM, AND USE OF ANIMAL BRAIN PLASMA MEMBRANE Mg2+-ATPase | |
| CN101952301A (en) | The polypeptide that is used for microorganism detection | |
| Rahaman-Noronha et al. | Excretion and distribution of ammonia and the influence of boundary layer acidification in embryonic rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) | |
| Weinbach et al. | Protein as the mitochondrial site for action of uncoupling phenols | |
| Kley et al. | Establishing canine clinical chemistry reference values for the Hitachi® 912 using the International Federation of Clinical Chemistry (IFCC) recommendations | |
| RU2232992C1 (en) | Method for assay of functional activity of human complement component c3 by alternative pathway of activation | |
| Zhang et al. | Comparative transcriptome analysis reveals the biological mechanism of selective cadmium enrichment in Tegillarca granosa | |
| Shimizu et al. | Gluconeogenesis in the yolk syncytial layer‐like tissue of cloudy catshark (Scyliorhinus torazame) | |
| Buznikov et al. | Sea urchin embryos and larvae as biosensors for neurotoxicants | |
| Nájera-Martínez et al. | Disruption of neurotransmission, membrane potential, and mitochondrial calcium in the brain and spinal cord of nile tilapia elicited by microcystis aeruginosa extract: An uncommon consequence of the eutrophication process | |
| RU2308719C1 (en) | Method of determining toxic contamination of effluent and natural fresh waters | |
| Narvaez | The role of phenotypic plasticity in reproductive colonization of land by frogs: Urea excretion and mechanisms to prevent ammonia toxicity during terrestrial development | |
| Bervinova et al. | Discerning Comparison of 1 and 0.5% Ethylene Glycol in Sprague-Dawley Rats with Modeled Urolithiasis | |
| Dahm | The first discovery of DNA | |
| Wada et al. | Gleaning of δ15N in ecosystems and its animal-organ isotope data: perspectives for the construction of the isotopically ordered world | |
| SU1748060A1 (en) | Method of estimating aqueous medium toxicity | |
| RU2196987C2 (en) | Method for detecting activity of acid phosphatase in blood smears | |
| Lang et al. | Population and biomarker responses of Daphnia magna towards anticholinesterase exposures | |
| Nunes et al. | Odor preference in house mice: influences of habitat heterogeneity and chromosomal incompatibility | |
| Old et al. | Haematology and serum biochemistry of three Australian desert murids: the Plains rat (Pseudomys australis), the Spinifex hopping-mouse (Notomys alexis) and the Central rock-rat (Zyzomys pedunculatus) | |
| RU2189040C2 (en) | Method for estimating a blood serum bactericidal activity in farm animals |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20131006 |