RU2264409C2

RU2264409C2 - 2`-амино-2`-дезоксинуклеозиды - ингибиторы репродукции вирусов кори и марбург

Info

Publication number: RU2264409C2
Application number: RU2003129439/04A
Authority: RU
Inventors: А.Г. Покровский (RU); А.Г. Покровский; Т.Н. Ильичева (RU); Т.Н. Ильичева; Е.Ф. Беланов (RU); Е.Ф. Беланов; Г.Н. Волков (RU); Г.Н. Волков; М.К. Куханова (RU); М.К. Куханова; Л.А. Александрова (RU); Л.А. Александрова
Original assignee: Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ГНЦ ВБ "Вектор"); Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН
Priority date: 2003-10-01
Filing date: 2003-10-01
Publication date: 2005-11-20
Also published as: RU2003129439A

Abstract

Изобретение относится к производным 2'-амино-2'-дезоксинуклеозидов, имеющим формулу

где R = Н, алкил, аминоалкил, R¹ = (R²NR³), где R² и/или R³ = Н, ОН, NH₂, алкил, бензил, при условии, что R не представляет собой Н или метил, когда R² и R³ = Н. Соединения по изобретению проявляют антивирусную активность в отношении вирусов кори и Марбург, превосходящую активность рибавирина. 4 табл., 2 ил.

Description

Изобретение относится к области молекулярной биологии, вирусологии и медицины, а именно к применению новых производных нуклеозидов для подавления репродукции вирусов кори и Марбург.

В настоящее время известен целый ряд соединений - аналогов нуклеотидов, обладающих противовирусной активностью, в том числе и используемых в медицинской практике. К последним относятся ацикловир, азидотимидин, рибавирин и другие препараты. Для лечения тяжелых случаев коревой инфекции применяют в основном рибавирин [1-(β-d-рибофуранозил-1)-1,2,4-триазол-3-карбоксамид] [1]. Проходя через клеточные мембраны, рибавирин метаболизируется, превращаясь в моно- и трифосфат. Монофосфат является конкурентным ингибитором инозинмонофосфат дегидрогеназы, что приводит к торможению синтеза вирусных РНК и ДНК, слабо действуя на клетки хозяина. Кроме вируса кори рибавирин подавляет репродукцию вирусов гриппа типа А и В, герпеса, гепатита А и В и других [2, 3].

Однако в отношении вируса Марбург нет препаратов, обладающих противовирусной активностью.

Известны L-нуклеозиды и его фармацевтически приемлемые соли для лечения заболеваний вирусных инфекций (заявка на патент РФ №96117323, МПК С 07 Н 19/06, опубл. 10.12.1998) [4].

Однако препараты, приготовленные на основе указанных соединений, эффективны для лечения заболеваний, вызванных вирусом гепатита В и вирусом Эпштейна-Барра, и не проявляют активность в отношении вирусов кори и Марбург.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) являются фармацевтические соединения, включающие в себя замещенные или незамещенные нуклеозиды и их аналоги, которые активны в отношении геморрагической лихорадки, вызванной вирусом Денге, и вирусной инфекции кори (Международная заявка № WO 00/15214, МПК А 61 К 31/19, опубл. 23.03.2000) [5].

Однако указанные фармацевтические соединения не проявляют активности в отношении вируса Марбург и вируса кори.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является использование производных нуклеозидов, эффективных в отношении вирусов кори и Марбург, способных проникать внутрь клетки и обладающих избирательной активностью в подавлении репродукции указанных вирусов.

Указанный технический результат достигается тем что, ингибиторами репродукции вирусов являются производные нуклеозидов, согласно изобретению в качестве производных нуклеозидов используют пиримидиновые 2'-амино-2'-дезоксинуклеозиды с химической формулой:

где R=H, галоид, галоидалкил, алкил, аминоалкил, арил, арилалкил и др. R¹=(R²NR³), R² или (и) R³=H, ОН, NH₂, алкил, арил, арилалкил и др. Известно несколько способов синтеза пиримидиновых 2'-амино-2'-дезоксинуклеозидов, основанных на модификации углеводного остатка нуклеозида [6-9].

2'-Амино-2'-дезоксиуридин и его модифицированные по 5-положению нуклеинового основания производные были синтезированы авторами заявляемого технического решения по приведенной ниже схеме I с общим выходом 35-50%:

где R=H, галоид, галоидалкил, алкил, аминоалкил, арил, арилалкил и др.

На первой стадии синтеза в результате воздействия дифенилкарбоната на коммерческий уридин (I, R=H) либо на модифицированный по 5-положению нуклеинового основания уридин (I, R=галоид, алкил, аминоалкил, арил, арилалкил и др.) были синтезированы 2,2'-O-ангидропроизводные (5-R)-уридина (II). Следующая стадия синтеза - азидирование 2,2'-O-ангидро-(5-R)-уридина (II). Последней стадией синтеза было восстановление 2'-азидогруппы до аминогруппы. Выделение целевого 2'-амино-2'-дезокси-(5-R)-уридина осуществляли ионообменной хроматографией на колонке с Dowex 50 (H⁺) с последующей очисткой на колонке с обращеннофазовым силикагелем LiChroprep RP-8 и лиофилизацией продукта (IV).

2'-Амино-2'-дезокси-N⁴-(R^l,R²)-цитидин (VIII) и его модифицированные по 5-положению нуклеинового основания производные были синтезированы авторами заявляемого технического решения из соответствующих 2'-азидо-2'-дезокси-(5-R)-уридинов (III) по приведенной ниже схеме II с общим выходом 30-65%:

R¹ или (и) R²=H, ОН, NH₂, алкил, арил, арилалкил и др.

Первой стадией синтеза явилось ацетилирование 2'-азидо-2'-дезокси-(5-R)-уридина (III). Полученный 3',5'-ди-O-ацетил-2'-азидо-2'-дезокси-(5-R)-уридин (V) обрабатывали свежеприготовленным фосфо-тристриазолидом. По окончании реакции проводили замещение триазолидной группы в соединении VI на N⁴-(R¹NR²) -группу действием NH₄OH либо соответствующего амина с последующим удалением защитных групп. Последней стадией синтеза было восстановление 2'-азидогруппы в (VII) до аминогруппы. Выделение целевого 2'-амино-2'-дезокси-N⁴-(R¹, R²)-(5-R)-цитидина (VIII) осуществляли ионообменной хроматографией на колонке с Dowex 50 (Н⁺) с последующей очисткой на колонке с обращеннофазовым силикагелем LiChroprep RP-8 и лиофилизацией продукта (VIII).

Структура 2'-амино-2'-дезокси-(5-R)-уридина (IV) и 2'-амино-2'-дезокси-N⁴-(R^l,R²)-(5-R)-цитидина (VIII) была подтверждена масс-, УФ- и ЯМР-спектрами. Чистота целевых субстанций была оценена с помощью ВЭЖХ и составляет 98%.

Ингибирование репродукции вируса кори и вируса Марбург исследовали в первично инфицированных клетках почки зеленой мартышки Vero в присутствии экспериментального препарата, конечная концентрация которого в культуральной среде составляла 0,1-400 мкг/мл, на протяжении одного пассажа - в течение 5 суток в случае вируса кори и 6 суток при исследовании вируса Марбург. Об ингибировании исследуемым соединением репродукции вируса в культуре чувствительных клеток судили по снижению вирус-индуцированного цитопатического действия в присутствии препарата по сравнению с контролем. В качестве препарата сравнения использовали рибавирин.

Противовирусную активность в отношении вируса Марбург исследовали также методом количественного определения вируса в культуре клеток Vero под полужидким агаровым покрытием.

На чертежах приведены дозозависимые кривые, иллюстрирующие ингибирующую активность заявляемых соединений. На фиг.1 приведены графики, иллюстрирующие противовирусную активность соединений (IVa), (VIIIa) и рибавирина в отношении вируса кори. На фиг.2 приведены графики, иллюстрирующие цитотоксичность и противовирусную активность соединения (VIIIa) в отношении вируса Марбург.

Ниже приведены конкретные примеры, раскрывающие сущность изобретения.

Пример 1. Синтез 2'-амино-2'-дезоксиуридина (соединение IVa, R=H)

Раствор 1,95 г (8 ммол) уридина, 1,93 г (9 ммол) дифенилкарбоната и 100 мг NaHCO₃ в 5 мл абс. диметилформамида (ДМФ) нагревали при 120°С до прекращения выделения газа (5 час.), затем упарили до 1/2 объма, охладили и отфильтровали осадок 2,2'-O-ангидроуридина, промыли его 5 мл холодного метанола. Продукт суспендировали в 3 мл метанола и кипятили при перемешивании 3 часа, затем охладили, осадок отфильтровали, промыли его 5 мл холодного метанола, 5 мл эфира и высушили в вакуум-эксикаторе над КОН. Выход 2,2'-O-ангидроуридина (II) 1,4 г 78%.

К раствору 0,9 г (4 ммол) 2,2'-O-ангидроуридина (II) в 10 мл абс. ДМФ добавили 0,98 г (20 ммол.) LiN₃, 0,54 г (10 ммол.) NH₄Cl, 0,61 г (10 ммол.) LiCl×H₂O и 0,45 мл гексаметилфосфотриамида. Смесь нагревали при перемешивании при 110°С в течение 8 час., затем упарили, к остатку добавили 9 мл МеОН и 18 мл ацетона и оставили на 18 час при 0°С. Осадок отфильтровали, промыли 10 мл смеси МеОН/ацетон (1/3), раствор упарили, остаток растворили в 3 мл ацетона и профильтровали через колонку с силикагелем в ацетоне (3×10 см). Фильтрат упарили. Густое масло растворили в 3 мл МеОН и нанесли на колонку с силикагелем (2×21 см) в хлороформе. Целевой продукт элюировали системой хлороформ-метанол 8:2. 2'-Азидо-2'-дезоксиуридин (III) получен с выходом 0,59 г (55%).

К раствору 0,54 г (2 ммол) 2'-азидо-2'-дезоксиуридина (III) в 10 мл смеси диоксан-вода (1:1) добавили трифенилфосфин 1,31 г (5 ммол.) и 2 мл 25% NH₄OH. Через 18 час при 20°С смесь упарили, растворили в 50 мл воды, раствор проэкстрагировали хлороформом (2×10 мл) и нанесли на колонку с Dowex 50 (Н⁺) (3×10 см), которую промыли 100 мл 30% МеОН. Продукт элюировали 2% NH₄OH в 30% МеОН, элюат упарили, остаток растворили в 2 мл воды и нанесли на колонку с обращеннофазовым силикагелем LiChroprep RP-8 (3×24 см). Элюировали в градиенте концентраций МеОН (0→5%) в присутствии 0,01 М NH₄НСО₃. Целевые фракции упарили, переупарили с водой (3×10 мл) и лиофилизовали. Выход 2'-амино-2'-дезоксиуридина (IVa) 0,39 г (80%).

2'-Амино-2'-дезоксиуридин (IV, R=H), 2'-amino-2'-deoxyuridine C₉H₁₃N₃O₅ Mr 243.2,

УФ: λmax 261 (ε9600), [D₂O; δ, м.д.; (J, Гц)]: 7,90 d (1H, J_5,6 8, H-6), 5,90 d (1H, J_1',2' 5,5, Н-1'), 5,67 d (1H, H-5), 4,31 br t (1H, J_,2,3' 5,5, J_,3',4' 5, H-3'), 4,03 t (1H, H-2'), 3.90 m (1H, H-4'), 3,62 m (2H, H-5').

Пример 2.Синтез 5-Метил-2'-амино-2'-дезоксиуридина (IVb, R=СН₃)

5-Метил-2'-амино-2'-дезоксиуридин (IV, R=СН₃) получен из тимидина, как в примере 1, с выходом 85%.

5-Метил-2'-амино-2'-дезоксиуридин (IV, R=СН₃), УФ: λmax 265 (ε9800), [D₂O; δ, м.д.; (J, Гц)]: 7,91 s (1H, H-6), 5,92 d (1H, J_1',2' 5,5, Н-1'), 4,35 br t (1H, J_,2,3' 5,5, J_,3',4' 5, H-3'), 4,07 t (1H, H-2'), 3.92 m (1H, H-4'), 3,65 m (2H, H-5'), 1.89 s (3Н, СН₃).

Пример 3. Синтез 5-Бром-2'-амино-2'-дезоксиуридина (IVc, R=Br)

5-Бром-2'-амино-2'-дезоксиуридин (IVc, R=Br) получен из 5-бром-2'-дезоксиуридина, как в примере 1, с выходом 68%.

5-Бром-2'-амино-2'-дезоксиуридин (IVc, R=Br) 5-Bromo-2'-amino-2'-deoxyuridine М-322.12, C₉H₁₂BrN₃O₅, УФ: λmax 265 (ε9800), [D₂O; δ, м.д.; (J, Гц)]:8,09 s (1H, H-6), 5,92 d (1H, J_1',2' 5,5, Н-1'), 4,35 br t (1H, J_,2,3' 5,5, J_,3',4' 5, H-3'), 4,07 t (1H, H-2'), 3.92 m (1H, H-4'), 3,65 m (2H, H-5'), 1.89 s (3H, СН₃).

Пример 4. Синтез 5-Аминометил-2'-амино-2'-дезоксиуридина (IVd, R=CH₂NH₂)

5-Аминометил-2'-амино-2'-дезоксиуридин (IVd, R=CH₂NH₂) получен из 5-азидометил-2'-амино-2'-дезоксиуридина[10], как в примере 1, с выходом 63%.

5-Аминометил-2'-амино-2'-дезоксиуридин (IVd, R=CH₂NH₂) УФ: λmax 265 (ε9800), [D₂O, δ, м.д.; (J, Гц)]: 7,91 s (1H, H-6), 5,90 d (1H, J_1',2' 5,5, Н-1'), 4,35 br t (1H, J_,2,3' 5,5, J_,3',4' 5, H-3'), 4,07 t (1H, H-2'), 3.90 br q (1H,J_4',5' 4 H-4'), 3,62 m (2Н, Н-5'), 2,77t (2H,J 6, CH ₂NH₂).

Пример 5. Синтез 5-Аминометил-2'-амино-2'-дезоксиуридина (IVe, R=CH₂-O(CH₂)₆NH₂)

5-(6-аминогексилоксиметил)-2'-амино-2'-дезоксиуридин (IVe, R=CH₂-O(CH₂)₆NH₂) получен из 5-(6-азидогексилоксиметил)-2'-амино-2'-дезоксиуридина [11], как в примере 1, с выходом 65%.

5-(6-аминогексилоксиметил)-2'-амино-2'-дезоксиуридин (IVe, R=CH₂-O(CH₂)₆NH₂), УФ: λmax 265 (ε9800), [D₂O δ, м.д.; (J, Гц)]: 7,89 s (1H, H-6), 5,90 d (1H, J_1',2' 5,5, Н-1'), 4,35 br t (1H, J_,2,3'. 5,5, J_,3',4' 5, H-3'), 4,15 s (2H,5-CH₂), 4,07 t (1H, H-2'), 3.90 br q (1H, J_4',5' 4 H-4'), 3,62 m (2H, Н-5'), 3,31 t (2H, J 6,OCH ₂C₅H₁₀), 2,77 t (2H, J 6, CH₂N), 1.41 m, 1,15 m [8Н,(CH₂)₄].

Пример 6. Синтез 2'-амино-2'-дезоксицитидина (VIIIa, R=Н)

К раствору 2'-азидо-2'-дезоксиуридина (IIIa) 1,35 г (5 ммол) в 5 мл абс. пиридина добавили 1.2, мл (13,3 ммол.) уксусного ангидрида и смесь выдерживали 16 час при 20°С, затем упарили, остаток переупарили с н.бутанолом (2×5 мл) и толуолом. 3',5'-Диацетил-2'-азидо-2'-дезоксиуридин (Va) был получен в виде маслянистого осадка с выходом 1,59 г (90%).

3',5'-Диацетил-2'-азидо-2'-дезоксиуридин (Va, 2,46 ммол.) в 5 мл абс. ацетонитрила охладили до -10°С. Триазол (1,43 г, 20 ммол) растворили в 5 мл. абс. ацетонитрила и 2,9 мл триэтиламина (20 ммол), охладили до -10°С и добавили при перемешивании POCl₃, (0,64 мл, 6,9 ммол). Реакционную смесь перемешивали 30 мин при -10°С, затем отфильтровали в колбу с (Va). Реакционную смесь перемешивали 2 час при комнатной температуре, затем добавили 0,5 мл воды, упарили, остаток растворили в этилацетате, промыли его водой, нас. NaHCO₃, водой, высушили Na₂SO₄ и профильтровали через колонку с силикагелем в этилацетате (3×10 см). Фильтрат упарили. N⁴-Триазолил-3',5'-диацетил-2'-азидо-2'-дезоксиуридин (VIa) был получен в виде маслянистого осадка с выходом 0,78 (78%).

К раствору N⁴-триазолил-3',5'-диацетил-2'-азидо-2'-дезоксиуридина (VIa, 0,67 г, 1,64 ммол) в 6 мл диоксана добавили 25 ммол. соответствующего амина и оставили на 48 час при комнатной температуре, затем добавили 2 мл конц. NH₄OH и оставили на 18 час при комнатной температуре. Реакционную смесь упарили, остаток растворили в 50 мл 30% МеОН и нанесли на колонку с Dowex 50 (H⁺) (3×10 см), которую промыли 100 мл 30% МеОН. Продукт элюировали 2% NH₄OH в 30% МеОН, элюат упарили, остаток растворили в 2 мл воды и нанесли на колонку с обращеннофазовым силикагелем LiChroprep RP-8 (3×24 см). Продукт элюировали в градиенте концентраций МеОН (0→30%) в присутствии 0,01 М NH₄HCO₃. Целевые фракции переупаривали с водой (3×10 мл) и лиофилизовали. 2'-Азидо-2'-дезоксицитидин (VIIa) был получен с выходом 0,33 г (75%).

К раствору 2'-азидо-2'-дезоксицитидина (VI, 0,54 г, 2 ммол) в 10 мл смеси диоксан-вода (1:1) добавили трифенилфосфин (1,31 г, 5 ммол) и 2 мл. 25% NH₄OH. Через 18 час при 20°С смесь упарили, растворили в 50 мл воды, раствор проэкстрагировали хлороформом (2×10 мл) и нанесли на колонку с Dowex 50 (Н⁺) (3×10 см), которую промыли 100 мл 30% МеОН. Продукт элюировали 2% NH₄OH в 30% МеОН, элюат упарили, остаток растворили в 2 мл воды и нанесли на колонку с обращеннофазовым силикагелем LiChroprep RP-8 (3×24 см). Элюировали в градиенте концентраций МеОН (0→30%) в присутствии 0,01 М NH₄HCO₃. Целевые фракции упарили, переупарили с водой (3×10 мл) и лиофилизовали. Выход 2'-амино-2'-дезоксицитидина (VIIIa) 0,39 г (80%).

2'-Амино-2'-дезоксицитидин (VIII, R=R¹=R²=H), M=242, УФ: рН 7,5: λmax 271 (ε8200), рН 2: λmax 276 (ε11900), [DMSO-d₆; δ, м.д.; (J, Гц)]: 7,79 d (1H, J_5,6 7,5, H-6), 7,12 br s (2H, NH₂), 5,79 d (1H, H-5), 5,67 d, (1H, J_1',2' 5,5, H-1'), 4,31 br t (1H, J_,2,3' 5,5, J_,3',4' 5, H-3'), 4,03 t (1H, H-2'), 3.90 br q (1H, J_4',5' 4 H-4'), 3,62 m (2H, H-5'). 2'-amino-2'-deoxycytidine.

Пример 7. Синтез (5-Метил)-2'-амино-2'-дезоксицитидина (VIIIb, R=СН₃, R¹=R²=H))

(5-Метил)-2'-амино-2'-дезоксицитидин (VIIIb, R=СН_з, R¹=R²=H) получен из (5-метил)-2'-азидо-2'-дезоксиуридина (IIIb), как в примере 6, с общим выходом 52%

(5-Метил)-2'-амино-2'-дезоксицитидин (VIIIb, R=СН₃, R¹=R²=H), УФ: рН 7,5: λmax 272 (ε8200), рН 2: λmax 278 (ε11900), [DMSO-d₆; δ, м.д.; (J, Гц)]: 7,91 s (1H, H-6), 7,14 br s (2H, NH₂), 5,79 d (1H, J_1',2' 5,5, Н-1'), 4,35 br t (1H, J_,2,3' 5,5, J_,3',4' 5, H-3'), 4,07 t (1H, Н-2'), 3.92 m (1H, 4 H-4'), 3,65 m (2H, Н-5'), 1.89 s (3Н, СН₃).

Пример 8. Синтез (5-Аминометил)-2'-амино-2'-дезоксицитидина (VIIIc, R=CH₂NH₂, R¹=R²=H)

(5-Аминометил)-2'-амино-2'-дезоксицитидин (VIIIc, R=CH₂NH₂, R¹=R²=H) получен из (5-азидометил)-2'-азидо-2'-дезоксиуридина (IIIc), как в примере 6, с общим выходом 43%.

(5-Аминометил)-2'-амино-2'-дезоксицитидин (VIIIc, R=CH₂NH₂, R¹=R²=H), УФ: рН 7,5: λmax 274 (ε8200), рН 2: λmax 280 (ε11900), [DMSO-d₆; δ, м.д.; (J, Гц)]: 7,89 s (1H, H-6), 7,14 br s (2H, NH₂), 5,82 d (1H, J_1',2' 5,5, Н-1'), 4,36 br t (1H, J_,2,3' 5,5, J_3',4' 5, H-3'), 4,07 t (1H, H-2'), 3.90 m (1H, H-4'), 3,62 m (2H, H-5'), 2,77 t (2H, J 6, CH ₂NH₂).

Пример 9. Синтез N⁴-окси-2'-амино-2'-дезоксицитидина (VIIId, R=R¹=H, R²=OH)

N⁴-окси-2'-амино-2'-дезоксицитидин (VIIId, R=R¹=H, R²=OH) получен из 2'-азидо-2'-дезоксиуридина (IIId), как в примере 6, с общим выходом 51%.

N⁴-окси-2'-амино-2'-дезоксицитидин (VIIId, R=R¹=H, R²=ОН), УФ: рН 7,5: λmax 271 (ε8200), рН 2: λmax 276 (ε11900), [DMSO-d₆; δ, м.д.; (J, Гц)]: 7,79 d (1H, J_5,6 7,5 H-6), 7,12 br s (2H, NH₂), 5,79 d (1H, H-5), 5,67 d, (1H, J_1',2' 5,5, Н-1'), 4,31 br t (1H, J_,2,3' 5,5, J_,3',4' 5, H-3'), 4,03 t (1H, H-2'), 3.90 br q (1H, J_4',5' 4 H-4'), 3,62 m (2H, H-5').

Пример 10. Синтез N⁴-амино-2'-амино-2'-дезоксицитидина (VIIIe, R=R¹=H, R²=NH₂)

N⁴-амино-2'-амино-2'-дезоксицитидин (VIIIe, R=R¹=Н, R²=NH₂) получен из 2'-азидо-2'-дезоксиуридина (IIIe), как в примере 6, с общим выходом 39%.

N⁴-амино-2'-амино-2'-дезоксицитидин (VIIIe, R=R¹=Н, R²=NH₂) М=257.25, С₉Н₁₅O₄, УФ: рН 7,5: λmax 271 (ε8200), рН 2: λmax 276 (ε11900), [DMSO-d₆; δ, м.д.; (J, Гц)]: 7,79 d (1H, J_5,6 7,5, H-6), 7,12 br s (2H, NH₂), 5,79 d (1H, H-5), 5,67 d, (1H, J_1',2' 5,5, H-1'), 4,31 br t (1H, J_,2,3' 5,5, J_,3',4' 5, H-3'), 4,03 t (1H, H-2'), 3.90 br q (1H, J_,4',5' 4 H-4'), 3,62 m (2H, N⁴-Amino-2'-amino-2'-deoxycytidine.

Пример 11. Синтез N⁴-бензил-2'-амино-2'-дезоксицитидина (VIIIf, R=R¹=Н, R²=СН₂С₆Н₅)

N⁴-бензил-2'-амино-2'-дезоксицитидин (VIIIf, R=R¹=Н, R²=NHCH₂С₆Н₅) получен из 2'-азидо-2'-дезоксиуридина (IIIe), как в примере 6, с общим выходом 52%.

N⁴-бензил-2'-амино-2'-дезоксицитидин (VIIIf, R=R¹=Н, R²=NHCH₂C₆H₅), М=332.36, C₁₆H₂₀N₄O₄, УФ: рН 7,5: λmax 271 (ε8200), рН 2: λmax 276 (ε11900), [DMSO-d₆; δ, м.д.; (J, Гц)]: 7,79 d (1H, J_5,6 7,5, H-6), 7,25 m (5H, С₆Н₅) 7,12 br s (2H, NH₂), 5,79 d (1H, H-5), 5,67 d, (1H, J_1',2' 5,5, Н-1'), 4,4 s (2H, СН ₂С₆Н₅), 4,31 br t (1H, J_,2,3' 5,5, J_,3',4' 5, H-3'), 4,03 t (1H, H-2'), 3.90 br q (1H, J_4',5' 4 H-4'), 3,62 m (2H, H-5'). N⁴-Benzyl-2'-amino-2'-deoxycytidine

Пример 12. Синтез N⁴-диэтил-2'-амино-2'-дезоксицитидина (VIIIg, R=Н, R¹=R²=C₂H₅)

N⁴-диэтил-2'-амино-2'-дезоксицитидина (VIIIg, R=H, R¹=R²=C₂H₅) получен из 2'-азидо-2'-дезоксиуридина (IIIe), как в примере 6, с общим выходом 58%.

N⁴-диэтил-2'-амино-2'-дезоксицитидин (VIIIg, R=Н, R¹=R²=C₂H₅), М=298.34, C₁₃H₂₂N₄O₄, УФ: рН 7,5: λmax 271 (ε8200), рН 2: λmax 276 (ε11900), [DMSO-d⁶; δ, м.д.; (J, Гц)]: 7,79 d (1H, J_5,6 7,5, H-6), 7,12 br s (2H, NH₂), 5,79 d (1H, H-5), 5,67 d, (1H, J_1',2' 5,5, Н-1'), 4,31 br t (1H, J_,2,3' 5,5, J_,3',4' 5, H-3'), 4,03 t (1H, H-2'), 3.50 m (5H, H-4' + (СН₂СН₃)₂), 3,62 m (2H, Н-5'), 1.1 s (6H, (CH ₂CH₃)₂). N⁴-Diethyl-2'-amino-2'-deoxycytidine.

Пример 13. Синтез N⁴-этил-2'-амино-2'-дезоксицитидина (VIIIh R=R¹=H, R²=C₂H₅)

N⁴-этил-2'-амино-2'-дезоксицитидин (VIIIh R=R¹=Н, R²=С₂H₅ получен из 2'-азидо-2'-дезоксиуридина (IIIe), как в примере 6, с общим выходом 53%. N⁴-этил-2'-амино-2'-дезоксицитидин (VIIIh R=R¹=Н, R²=С₂Н₅), M=270.29, C₁₁H₁₈N₄O₄, УФ: рН 7,5: λmax 271 (ε8200), рН 2: λmax 276 (ε11900), [DMSO-d₆; 5, м.д.; (J, Гц)]: 7,79 d (1H, J_5,6 7,5, H-6), 7,12 br s (2H, NH₂), 5,79 d (1H, Н-5), 5,67 d,(1H, J_1',2' 5,5, Н-1'), 4,3 1br t(1H, J_,2,3' 5,5, J_,3',4' 5, H-3'), 4,03 t (1H, H-2'), 3.90 br q (1H, J_4',5' 4 H-4'), 3,62 m (2H, H-5' a, b), 3,21 m (2H, CH ₂СН₃), 1,03 m (3H, СН₂ СН ₃). N⁴-Ethyl-2'-атто-2'-deoxycytidine.

Пример 14. Синтез N⁴-метил-2'-амино-2'-дезоксицитидина (VIIIi, R=R¹=Н, R²=СН₃)

N⁴-метил-2'-амино-2'-дезоксицитидина (VIIIi, R=R¹=Н, R²=СН,) получен из 2'-азидо-2'-дезоксиуридина (IIIe), как в примере 6, с общим выходом 58%. N⁴-метил-2'-амино-2'-дезоксицитидина (VIIIi, R=R¹=Н, R²=СН₃), M=256.26, C₁₀H₁₆N₄O₄, УФ: рН 7,5: λmax 271 (ε8200), рН 2: λmax 276 (ε11900), [DMSO-d₆; 5, м.д.; (J, Гц)]: 7,79 d (1H, J_5,6 7,5, H-6), 7,12 br s (2H, NH₂), 5,79 d (1H, H-5), 5,67 d, (1H, J_1',2' 5,5, Н-1'), 4,31 br t (1H, J_,2,3' 5,5, J_,3',4' 5, H-3'), 4,03 t (1H, H-2'), 3.90 br q (1H,.J_4',5' 4 H-4'), 3,62 m (2H, H-5'), 2,71 m (1H, CH₃). N⁴-Methyl-2'-amino-2'-deoxycytidine.

Пример 15. Оценка цитотоксичности 2'-амино-2'-дезоксинуклеозидов

Цитотоксичность соединений оценивают путем добавления разведений каждого препарата в среде Игла MEM к монослою клеточной культуры Vero в лунки 96-луночного планшета ("Cel-Cult", England) до конечных концентраций 0,1-400 мкг/мл (по три лунки на каждую дозу) с последующим культивированием при 37°С в CO₂-инкубаторе в течение 5 суток. Контролем служат клетки без добавления соединения (1). Жизнеспособность клеток оценивают по оптической плотности (при 570 нм) после окрашивания раствором кристаллического фиолетового (1,3 г красителя, 50 мл этанола, до 700 мл Н₂О, 300 мл 40% формалина) в течение 1,5 часов при комнатной температуре. Токсичность различных доз соединений определяют по жизнеспособности клеток относительно контроля, по полученным результатам рассчитывают дозу, на 50% снижающую жизнеспособность клеток (CD₅₀). Данные приведены в таблице 1. Следует отметить, что 2'-амино-2'-дезоксинуклеозиды обладают слабой цитотоксичностью.

Пример 16. Исследование влияния 2'-амино-2'-дезоксинуклеозидов на репродукцию вируса кори в культуре клеток Vero

Исследование противовирусной активности экспериментальных препаратов в отношении вируса кори проводят на перевиваемой линии чувствительных клеток почки зеленой мартышки Vero. Для заражения используют супернатант инфицированных клеток, хранившийся в жидком азоте, множественность заражения составляет 0,2-0,5 инфекционных единиц на клетку. В лунки 96-луночного планшета ("Cel-Cult", England) помещают суспензию клеток Vero с посевной концентрацией 150 тыс кл/мл, инкубируют 2 суток при 37°С в СО₂-инкубаторе. После формирования монослоя из лунок планшета удаляют культуральную жидкость, вносят вирус (15 мкл) и одновременно такой же объем ростовой среды с исследуемым соединением до конечной концентрации 0,1-400 мкг/мл (по три лунки на каждую дозу). Контролями служат инфицированные клетки Vero без добавления препарата (вместо препарата вносят такое же количество среды Игла MEM без добавок) и неинфицированные клетки.

Адсорбцию вируса проводят в течение 1,5 часов при 37°С в СО₂-инкубаторе. Затем в лунки вносят питательную среду Игла MEM с добавлением 2% фетальной сыворотки КРС, предварительно инактивированной прогреванием при 56°С в течение 30 минут, 300 мг/мл L-глютамина, 100 мкг/мл гентамицина, 100 мкг/мл линкомицина и исследуемым соединением до конечной концентрации 0,1-400 мкг/мл. В контрольные лунки вносят питательную среду со всеми добавками, но без препарата. Через 5 суток культивирования удаляют культуральную жидкость, вносят по 30 мкл раствора кристаллического фиолетового в каждую лунку, выдерживают 1,5 часа при комнатной температуре и измеряют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 570 нм. Относительную степень защиты инфицированных клеток рассчитывают по формуле:

Защита (%)=(А-O)/(В-O)·100%,

где А - % жизнеспособности инфицированных клеток в присутствии соединения на 5 сутки культивирования, В - % жизнеспособности в контроле клеток, О - % жизнеспособности инфицированных клеток без добавления соединения (контроль вируса).

По полученным данным строят график зависимости защиты клеток от возрастающих доз соединения (для соединения VIIIa на фиг.1) и находят дозу препарата, на 50% защищающую клетки (ED₅₀). Терапевтический индекс, или индекс селективности (IS), определяют как отношение концентрации соединения, токсичной для 50% клеток (CD₅₀), к концентрации, на 50% защищающей клетки от гибели (ED₅₀):

IS=CD₅₀/ED₅₀

В таблице 1 представлены результаты по цитотоксичностии и противокоревой активности 2'-амино-2'-дезоксинуклеозидов. Из этих данных видно, что выраженной противовирусной активностью кори обладает соединение (VIIIa), результаты исследования которого показаны в табл. 2. Соединение (IVa) обладает противокоревой активностью, сравнимой с антивирусным действием рибавирина.

Таблица 1 Данные по цитотоксичности и противовирусной активности 2'-амино-2'-дезоксинуклеозидов в отношении вируса кори
Соединение	CD₅₀, μМ	ED₅₀, μM	IS
IVa	823	140	5,9
IVc	>620,9	не достигает
VIIIa	846,7	25,4	33,3
VIIId	>774,6	не достигает
VIIIf	>601,9	601,9	>1
VIIIg	>670,4	670,4	>1
VIIIi	>780,5

Из таблицы 2 видно, что 50% эффективная доза рибавирина равна 57 мкМ или 12,4 мкг/мл, что соответствует данным литературы [12]. 50% эффективная доза соединения (VIIIa) составила 25,4 мкМ или 6,25 мкг/мл. 50% цитотоксичные дозы, полученные для рибавирина и соединения (VIIIa), отличаются незначительно (846,7 и 823 мкМ соответственно), индексы селективности, или терапевтические индексы, равны 14,37 и 33,3 соответственно. Таким образом, противовирусное действие соединения (VIIIa) в отношении вируса кори превосходит антивирусную активностью рибавирина in vitro.

Пример 17. Исследование влияния соединения (IVa) на репродукцию вируса кори в культуре клеток Vero в комбинации с рибавирином.

Исследование противовирусной активности заявляемого соединения в комбинации с рибавирином проводят на перевиваемой линии клеток почки зеленой мартышки Vero. Для заражения используют супернатант инфицированных клеток, хранившийся в жидком азоте, множественность заражения составляет 0,2-0,5 инфекционных единиц на клетку. В лунки 96-луночного планшета ("Cel-Cult", England) помещают суспензию клеток Vero с посевной концентрацией 150 тыс кл/мл, инкубируют 2 суток при 37°С в CO₂-инкубаторе. После формирования монослоя из лунок планшета удаляют культуральную жидкость, вносят вирус (15 мкл) и сразу такой же объем ростовой среды с исследуемыми соединениями в концентрации: рибавирин - 3,125-25 мкг/мл, соединение (IVa) - 8,750-70 мкг/мл (по три лунки на каждую комбинацию доз). Контролями служат инфицированные клетки Vero без добавления препаратов (вносят такое же количество среды RPMI-1640 без добавок) и неинфицированные клетки.

Адсорбцию вируса проводят в течение 1,5 часов при 37°С в CO₂-инкубаторе. Затем в лунки вносят питательную среду RPMI-1640 с добавлением 2% фетальной сыворотки КРС, предварительно инактивированной прогреванием при 56°С в течение 30 минут, 300 мг/мл L-глютамина и 100 мкг/мл гентамицина, содержащую исследуемую комбинацию соединений в нужной концентрации. В контрольные лунки вносят питательную среду со всеми добавками, но без соединений. Через 5 суток культивирования удаляют питательную среду, вносят по 30 мкл на лунку раствора генциан виолета, выдерживают 1,5 часа при комнатной температуре и измеряют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 570 нм. Относительную степень защиты инфицированных клеток от гибели различными комбинациями рибавирина и соединения (IVa) рассчитывают по формуле:

Защита (%)=(А-O)/(В-O)×100,

где А - % жизнеспособности инфицированных клеток в присутствии соединений на 4 сутки культивирования, В - % жизнеспособности в контроле клеток, О - % жизнеспособности инфицированных клеток без добавления соединения (1) и (или) рибавирина (контроль вируса).

По полученным данным строят графики зависимости защиты клеток от возрастающих доз рибавирина и соединения (IVa) (фиг.2) и находят дозу рибавирина, которая в сочетании с соединением (IVa) на 50% защищает клетки от гибели, и дозу соединения (IVa), которая в сочетании с рибавирином на 50% защищает клетки от гибели (ID₅₀). В таблице 3 представлены значения ID₅₀, рассчитанные для разных сочетаний рибавирина и соединения (IVa).

Из таблицы 3 видно, что использование в комбинации с рибавирином соединение (IVa) в концентрации 70 мкМ снижает 50% эффективную дозу рибавирина в 4,45 раза.

Пример 18. Влияние соединеия (VIIIa) на репродукцию вируса Марбург в культуре клеток Vero.

Исследование проводят с помощью количественного определения вируса в культуре клеток под полужидким агаровым покрытием.

Перевиваемую линию чувствительных клеток почки зеленой мартышки Vero вносят в пенфлаконы (посевная концентрация 200 тыс кл/мл) и инкубируют 2 суток при 37°С в атмосфере 5% CO₂. После формирования монослоя из пенфлаконов удаляют культуральную жидкость, вносят вирус в дозе 5,5×10⁴ БОЕ в объеме 0,1 мл. Адсорбцию проводят при 37°С. Затем во флаконы вносят по 2 мл полужидкого агарового покрытия (среда Игла MEM с 2% сывороки, 10% агара (2,4% гель), антибиотиками по 100 ЕД/мл и препаратом) и инкубируют 6 суток при 37°С. Контролями служат инфицированные клетки Vero без добавления препарата (контроль вируса) и неинфицированные клетки (контроль клеток). После окончания культивирования агаровое покрытие удаляют, монослой окрашивают кристаллическим фиолетовым в течение 1 часа, промывают водой и подсчитывают количество бляшек. Результаты представлены в таблице 4.

По данным, представленным в таблице 4, определяют комбинационный индекс, FIC, который равен:

FIC=ID_{50 вещества А в смеси}/ID_{50 вещества А}+ID_{50 вещества В в смеси}/ID_{50 вещества В}

Комбинационный индекс позволяет оценить характер взаимодействия препаратов в смеси: если FIC меньше 1, делают вывод о синергическом взаимодействии препаратов, если FIC больше 1, то об антагонистическом взаимодействии [13]. Комбинационный индекс для комбинации рибавирина и соединения (IVa) равен:

FIC=12,8/57+49/140=0,575, т.е. взаимодействие рибавирина и соединения (IVa) синергическое.

Таблица 4 Ингибирование репродукции вируса Марбург соединением (VIIIa)
Концентрация препарата, мкг/мл	Количество бляшек
	IMB-119		Контроль вируса
	Общее*	x±s_x	Общее*	x±S_x
100,0	41	14,0±1,5	78,0	26,0±2,0
50,0	38	12,6±2,8
25,0	36	12,0±2,0
12,5	44	14,6±1,2
6,25	73	24,3±2,8
* Сумма трех измерений

Из представленных в таблице 4 данных видно, что ингибирование репродукции вируса Марбург не достигало 100% даже при дозе препарата 100 мкг/мл, однако концентрации соединения (VIIIa), равные 12,5 мкг/мл и выше, снижали количество вирусиндуцированных бляшек на 50%.

Таким образом, показано, что 2'-амино-2'-дезоксиуридин и 2'-амино-2'-дезоксицитидин обладают слабой цитотоксичностью в культуре клеток Vero (CD₅₀ равны 823 и 846,7 мкМ соответственно) и выраженным противовирусным действием в отношении вируса кори (ID₅₀ равны 140 мкг и 25,4 мкМ, соответственно). Кроме того, 2'-амино-2'-дезоксицитидин оказывает противовирусное действие в отношении вируса Марбург: в концентрации 12,5 мкг/мл и более соединение (VIIIa) снижает количество вирусиндуцированных бляшек или вирусиндуцированного цитопатического действия в культуре клеток Vero на 50%.

2'-Амино-2'-дезоксицитидин по своим противовирусным свойствам превосходит препарат сравнения рибавирин, и в связи с этим представляется перспективной разработка лекарственного препарата на основе соединения (VIIIa) для терапии инфекций, вызванных вирусами кори или Марбург.

Источники информации

1. Mason W.H. Measles. // Adolesc. Med. - 1995. - v.6. - p.1-14.

2. Hosoya M., Shigeta S., Nakamura K., De Clerq E. Inhibitory effect of selected antiviral compounds on measles (SSPE) virus replication in vitro. // Antiviral res. - 1989. - v.12. - p.87-98.

3. Shigeta S., Mori S., Baba M., Honzumi К., Nakamura К., Numazaki Y., Matsuda A., Obara T. Antiviral activities of ribavirin, 5-ethynyl-1-b-ribofuranosylimidazole-4-carboxamide, and 6'-(R)-methylneplanocin A against several ortho- and paramyxoviruses. // Antimicrob. Agents chemother. - 1992. - v.36. - p.435-9.

4. Заявка на патент РФ №96117323, МПК С 07 Н 19/06, опубл. 10.12.1998.

5. Международная заявка WO № 00/15214, МПК А 61 К 31/19, опубл. 23.03.2000

6. Verheyden. J.P.H., Wagner. D., Moffat. J.G. // Synthesis of some pyrimidine 2'-amino-2'-deoxynucleosides. // J. Org. Chem. V.36, pp.250-254, 1971.

7. Wagner. D., Verheyden. J.P.H., Moffat. J.G. // Preparation and synthetic utility of some organotin derivatives of nucleosides. // J. Org. Chem., V.39, pp.24-30,1974.

8. Matsuda. A., Yasuoka. J., Sasaki Т., Ueda. Т. // Nucleosides and Nucleotides. 95. Improved synthesis of 1-(2-azido-2-deoxy-β-D-arabinofuranosyl)cytosine (Cytarazide) and thymine. Inhibitory spectrum of cytarazide on the growth of various human tumor cells in vitro. // J. Med. Chem., V.34, pp.999-1002, 1991.

9. McGee. D.P.C., Vaughn-Settle. A., Vargeese. C., Zhai. Y. // 2'-Amino-2'-deoxyuridine via an intermolecular cyclization of a trichloroacetimidate // J. Org. Chem., V.61, pp.781-785, 1996.

10. Barwoiff, D., Langen, P. // in Townsend, L.B. and Tipson, R.S., (eds.) Nucleic Acid Chemistry, Wiley, NY. Vol.1, pp.359-366.

11. Alexandrova L.A., Skoblov A.Yu., Jasko M.V., Victorova L.S., Krayevsky A.A., 2'-Deoxynucleoside 5'-triphosphates modified at α-, β- and γ-phosphates as substrates for DNA polymerases, Nucl. Acids Res., 1998, 26, №3, 778-786.

12. Watanabe W., Konno К., Ijichi К., Inoue H., Yokota Т., Shigeta S. MTT colorimetric assay system for the screening of anti-orthomtxo- and anti-paramyxoviral agents. // J.Virol. Nethods. - 1994. - v.48. - p.257-65.

13. Suhnel J. Evaluation of synergism or antagonism for the combined action of antiviral agents. // Antiviral res. - 1990. - v.13. - p.23-40.

Claims

2'-Амино-2'-дезоксинуклеозиды, имеющие формулу

где R = Н, алкил, аминоалкил,

R¹ = (R²NR³), где R² и/или R³ = Н, ОН, NH₂, алкил, бензил,

при условии, что R не представляет собой Н или метил, когда R² и R³ = Н.