RU2263148C1 - Способ дифференцированного определения численности бактерий в смешанных культурах - Google Patents
Способ дифференцированного определения численности бактерий в смешанных культурах Download PDFInfo
- Publication number
- RU2263148C1 RU2263148C1 RU2004104606/13A RU2004104606A RU2263148C1 RU 2263148 C1 RU2263148 C1 RU 2263148C1 RU 2004104606/13 A RU2004104606/13 A RU 2004104606/13A RU 2004104606 A RU2004104606 A RU 2004104606A RU 2263148 C1 RU2263148 C1 RU 2263148C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- determination
- bacteria
- growth
- mixed cultures
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 96
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title abstract description 13
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims abstract description 29
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 21
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 55
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 28
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 abstract description 36
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 31
- 239000006152 selective media Substances 0.000 abstract description 22
- 238000009331 sowing Methods 0.000 abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 7
- 239000002689 soil Substances 0.000 abstract description 7
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 abstract description 5
- 238000011138 biotechnological process Methods 0.000 abstract description 4
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 4
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 abstract description 2
- 244000005706 microflora Species 0.000 abstract description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 abstract description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 abstract 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 abstract 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 abstract 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 abstract 1
- 239000010865 sewage Substances 0.000 abstract 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 163
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 56
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 33
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 29
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 26
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 26
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 13
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 11
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 11
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 11
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 11
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 11
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 11
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 11
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 9
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- 238000013048 microbiological method Methods 0.000 description 8
- 241000605762 Desulfovibrio vulgaris Species 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 241000266272 Acidithiobacillus Species 0.000 description 6
- 241000605716 Desulfovibrio Species 0.000 description 6
- 240000001046 Lactobacillus acidophilus Species 0.000 description 6
- 241000316848 Rhodococcus <scale insect> Species 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 241000186000 Bifidobacterium Species 0.000 description 5
- 241000131482 Bifidobacterium sp. Species 0.000 description 5
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 5
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 5
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 5
- 241000194020 Streptococcus thermophilus Species 0.000 description 5
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 5
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 5
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 description 5
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 5
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 4
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 4
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012067 mathematical method Methods 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 241000605222 Acidithiobacillus ferrooxidans Species 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 235000013956 Lactobacillus acidophilus Nutrition 0.000 description 3
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 3
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 3
- 239000000306 component Substances 0.000 description 3
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 229940039695 lactobacillus acidophilus Drugs 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000606215 Bacteroides vulgatus Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 2
- 240000001929 Lactobacillus brevis Species 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 241000606210 Parabacteroides distasonis Species 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000007797 corrosion Effects 0.000 description 2
- 238000005260 corrosion Methods 0.000 description 2
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 2
- 235000014048 cultured milk product Nutrition 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 2
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- LCCNCVORNKJIRZ-UHFFFAOYSA-N parathion Chemical compound CCOP(=S)(OCC)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 LCCNCVORNKJIRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 2
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 description 2
- 230000000529 probiotic effect Effects 0.000 description 2
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 2
- JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M sodium periodate Chemical compound [Na+].[O-]I(=O)(=O)=O JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 2
- YWYZEGXAUVWDED-UHFFFAOYSA-N triammonium citrate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[NH4+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O YWYZEGXAUVWDED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 1
- 241000606125 Bacteroides Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- MBMLMWLHJBBADN-UHFFFAOYSA-N Ferrous sulfide Chemical compound [Fe]=S MBMLMWLHJBBADN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000013957 Lactobacillus brevis Nutrition 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005949 Malathion Substances 0.000 description 1
- 241000872931 Myoporum sandwicense Species 0.000 description 1
- 241000589540 Pseudomonas fluorescens Species 0.000 description 1
- 241000187561 Rhodococcus erythropolis Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 244000057717 Streptococcus lactis Species 0.000 description 1
- 235000014897 Streptococcus lactis Nutrition 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- XFJKHWWMQBPMDW-UHFFFAOYSA-N [Li].C(CC)(=O)O Chemical compound [Li].C(CC)(=O)O XFJKHWWMQBPMDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 239000002154 agricultural waste Substances 0.000 description 1
- 239000003570 air Substances 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 1
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 1
- ICLJVKBSYXENIB-UHFFFAOYSA-N boric acid;carbonic acid Chemical compound OB(O)O.OC(O)=O ICLJVKBSYXENIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 229910052729 chemical element Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- BXNANOICGRISHX-UHFFFAOYSA-N coumaphos Chemical compound CC1=C(Cl)C(=O)OC2=CC(OP(=S)(OCC)OCC)=CC=C21 BXNANOICGRISHX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010779 crude oil Substances 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- JXSJBGJIGXNWCI-UHFFFAOYSA-N diethyl 2-[(dimethoxyphosphorothioyl)thio]succinate Chemical compound CCOC(=O)CC(SP(=S)(OC)OC)C(=O)OCC JXSJBGJIGXNWCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000003920 environmental process Methods 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- PGBHMTALBVVCIT-VCIWKGPPSA-N framycetin Chemical compound N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](N)C[C@@H](N)[C@@H]2O)O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O2)N)O[C@@H]1CO PGBHMTALBVVCIT-VCIWKGPPSA-N 0.000 description 1
- 235000013376 functional food Nutrition 0.000 description 1
- 210000005256 gram-negative cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005255 gram-positive cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000004519 grease Substances 0.000 description 1
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000010842 industrial wastewater Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 1
- 229960000453 malathion Drugs 0.000 description 1
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229940053050 neomycin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 1
- 238000006303 photolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000015843 photosynthesis, light reaction Effects 0.000 description 1
- 125000003367 polycyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 235000013580 sausages Nutrition 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 150000005691 triesters Chemical class 0.000 description 1
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011514 vinification Methods 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000004065 wastewater treatment Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для дифференцированного определения численности бактерий в смешанных культурах, которые имеют широкое распространение в природе: в воздухе, почве, водоемах, составе естественной микрофлоры высших организмов и среди контаминантов, вызывающих порчу различных объектов. В промышленности смешанные культуры находят широкое применение в различных отраслях пищевой (молочной, мясной, пивоваренной и др.) промышленности и других биотехнологических процессах (биологическая очистка сточных вод, биоремедиация почв, получение метана из отходов различных производств и др.). Способ предусматривает высев образцов смешанных культур в жидкие селективные питательные среды, определение биолюминесцентным методом численности клеток, накапливающихся в средах в ходе роста бактерий, и математическую обработку кинетических данных роста индивидуальных бактериальных культур, установление исходной концентрации бактерий, относящихся к разным таксономическим группам. Изобретение позволяет проведение одновременной количественной идентификации бактериальных клеток, относящихся к разным таксономическим группам и одновременно присутствующих в смешанных культурах, а также повысить точность определения численности клеток в широком концентрационном диапазоне и существенно сократить общее время анализа. 1 ил., 1 табл.
Description
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для дифференцированного определения численности бактерий в смешанных культурах на основе комбинированного подхода, сочетающего в себе микробиологические приемы работы с клетками микроорганизмов, предполагающих использование селективных питательных сред роста, биолюминесцентный метод анализа внутриклеточной концентрации аденозинтрифосфата, а также стандартные математические методы обработки кинетических данных.
Естественный кругооборот углерода, азота, кислорода и многих других химических элементов требуют активного участия разных типов микроорганизмов, поэтому столь широко распространение смешанных популяций микроорганизмов в природе - они встречаются в воздухе, почве, водоемах, являются естественной микрофлорой высших организмов. Смешанные культуры находят широкое применение в пищевой промышленности (в молочной - производство кисломолочных продуктов, сыроделие и др.; в мясной - производство колбасных заквасок, а также в виноделии и пивоварении). Смешанные культуры применяются во многих природоохранных и биотехнологичсеких процессах (биологическая очистка сточных вод, биоремедиация почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, получение метана из отходов сельского хозяйства и др.).
Дифференцированное определение микроорганизмов в смешанных культурах необходимо для изучения биологической активности данной биосистемы в целом и вклада каждого вида бактерий в общий процесс функционирования смешанных культур. Информация, полученная при дифференцированном анализе проб смешанных культур, может быть использована не только для изучения и повышения эффективности биотехнологических процессов, но и для детекции и предотвращения развития нежелательных процессов с участием смешанных культур, в частности различных заболеваний и процессов порчи готовой продукции (биокоррозии, гниения и др.).
Существует ряд методов, основанных на дифференцированной количественной идентификации одного вида клеток, присутствующих в популяции смешанных культур. Большинство этих методов предполагает применение классического микробиологического способа определения численности клеток, согласно которому производят посев анализируемых проб в жидкую или твердую агаризованную питательную среду и инкубируют в течение длительного времени [Под ред. Звягинцева Д.Г. Методы почвенной микробиологии и биохимии. М.: Изд-во. Моск. ун-та, 1991, с.59-63]. Далее в жидкой питательной среде количество выросших клеток микроорганизмов оценивают спектрофотометрически по поглощению клеточной суспензии при длине волны 520-560 нм или нефелометрически по мутности клеточной суспензии, используя калибровочные графики. На твердой питательной среде определяют количество колониеобразующих единиц. При этом для дифференцированного определения целевой культуры используются селективные среды роста.
Так, известен способ выделения и количественного определения бифидобактерий из смешанных культур [Пат. РФ №2154105 (2000) C 12 N 1/20, C 12 Q 1/04, Способ количественной оценки содержания бифидобактерий в смешанных культурах микроорганизмов]. Способ предусматривает посев исследуемых проб в питательную селективную среду для выделения бифидобактерий. Посевы культивируют в термостате и производят подсчет числа колоний бифидобактерий в исследуемом биоматериале. В качестве селективных компонентов (агентов) питательной среды используют азид натрия и литий пропионовокислый, которые одновременно вносят в среду в количестве, соответственно, 120-150 мг и 20-30 мл на 1 л питательной среды.
Также известен способ определения концентрации сульфатредуцирующих бактерий (СРБ) в пробах, взятых из биокоррозионных объектов [V.P.Kholodenko, S.K.Jigletsova, Chemico-Microbiological Diagnosis of Stress Corrosion Cracking of Pipelines. //Appl. Biochem. Microbiol, 2000, V.36, p.685-693]. Для определения концентрации СРБ используют модифицированную среду Постгейта. Стерильные среды разливают в пробирки по 9 мл и засевают по общепринятому методу предельных разведений. Культивирование проводят в течение 7-10 суток при 28°С. О присутствии жизнеспособных СРБ судят по образованию черного осадка сульфида железа. Определяя номер разведения, в котором уже не наблюдается сульфатредукция, дают количественную оценку концентрации СРБ в исходном образце.
Микробиологические способы определения численности клеток методом посева предельных разведении и комбинированные с ними методы достаточно универсальны, могут быть использованы при работе с разнообразными типами клеток, но имеют ряд существенных недостатков:
а) Методы требуют больших затрат времени, длительность инкубации определяется тем уровнем концентраций клеток, который допустим для данного объекта. Если допустимый порог концентраций составляет, например, 104-105 клеток/мл, то инкубация продолжается 24-72 ч. Если же предстоит анализ образца с очень низким содержанием клеток (около 1-10 клеток на 100 мл), то инкубация может продолжаться до 14-21 суток.
б) Успех проведения анализа во многом определяется квалификацией персонала, занятого подготовкой образцов и интерпретацией результатов анализа. Результаты анализа, полученные разными людьми, часто существенно отличаются друг от друга. Статистическая ошибка самого метода определения составляет 10%.
в) Прямой подсчет количества клеток микроорганизмов мало применим для непрозрачных образцов, содержащих малорастворимые химические соединения, что тоже ограничивает практическое применение метода и требует проведения предварительной пробоподготовки аналогичных образцов.
г) Микробиологические методы отличаются достаточно большой погрешностью и требуют постановки ряда параллельных экспериментов, которые делают метод еще более трудоемким и повышают стоимость анализа.
д) Так как определение концентрации клеток в образце основывается на прямом подсчете колониеобразующих единиц, выросших на агаризованных средах, то оно может быть ошибочным ввиду того, что не все жизнеспособные микробные клетки в принципе могут образовывать колонии на твердой питательной среде, а также отсутствие роста может быть результатом их определенного физиологического и метаболического состояния [Заварзин Г.А., Колотилова Н.Н. Введение в природоведческую микробиологию. Москва, 2001, с.71-74].
Другая группа дифференцированных методов определения численности клеток предполагает идентификацию специфической ферментативной активности, характерной для определенного типа бактерий.
Способ количественного определения и дифференциации колиформных бактерий и клеток E.coli [US Pat. 5393662 (1995), C 12 Q 1/10, C 12 Q 1/04, Test media for identifying and differentiating general coliforms and Escherichia coli bacteria] позволяет количественно определять все колиформные клетки, имеющие бета-галактозидазную активность, но не имеющие бета-глюкуронидазную активности, а затем проводить определение клеток E.coli, дополнительно имеющих бета-глюкуронидазную активность. Для этого используются хромогенные субстраты, которые образуют нерастворимый осадок одного цвета, взаимодействуя с бета-галактозидазой, и осадок другого цвета, контрастирующий с первым, взаимодействуя с бета-глюкуронидазой.
Основным недостатком этого метода является то, что он не является полностью количественным, так как клетки с бета-галактозидазной активностью определяют косвенным путем, вычитая из общего числа всех колиформ те, что имеют бета-глюкуронидазную активность, а также применим только для одного типа бактерий. К тому же концентрация фермента, как и его активность в клетках, может варьироваться в зависимости от разных факторов, что также может сильно влиять на адекватное определение численности клеток по ферментативной активности.
Существует также дифференцированный метод определения численности клеток бактерий, основанный на особенностях строения бактериальной клеточной стенки. Этот метод позволяет осуществить дифференциацию грамположительных и грамотрицательных клеток.
Так, известен способ дифференцированного определения грамположительных и грамотрицательных бактерий в жидких средах, содержащих смешанные культуры, с помощью устойчивого окрашивания клеток специфическим составом [US Pat. 5081017 (1992), C 12 Q 1/24, С 12 М 1/34, Method and apparatus for detection and quantitation of bacteria]. Способ предполагает нанесение образца, содержащего клетки, на отрицательно заряженный фильтр. Далее клетки обрабатывают реактивом с кислым значением рН, изменяющим электростатический заряд клеток и обеспечивающий, таким образом, их адсорбцию на целлюлозном фильтре, затем клетки окрашивают специальным составом при рН 8-12 (карбонатно-боратный буфер) и смывают несвязавшийся краситель. Интенсивность окраски поверхности фильтра в центре коррелирует с численностью клеток. Для определения точного количества бактериальных клеток используются пять окрашенных фильтров с известной концентрацией бактерий в качестве стандартных цветовых индикаторов, предполагающих следующие цвета: белый (нулевой контроль), светло-розовый (5×104 клеток/мл), розовый (105 клеток/мл), красный (106 клеток/мл) и темно-красный (107 клеток/мл).
Несмотря на эффективность и экспрессность, этот метод, очевидно, имеет ряд недостатков, главным из которых является его большая неточность (возможная минимальная концентрация клеток для определения - 5·104 клеток/мл), основанная на визуальной оценке полученных результатов, и возможность определения всего пяти концентраций бактериальных клеток.
Методы, основанные на особенностях строения клеточной стенки, позволяют дифференцировать бактерии, принадлежащие двум большим группам, но не определять их более подробную таксономическую принадлежность.
Известен высокочувствительный универсальный способ дифференцированного определения микроорганизмов в смешанных культурах, основанный на проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР). Способ предусматривает экстракцию ДНК из клеток с последующим проведением ПЦР с использованием соответствующих праймеров. Процедура ПЦР состоит в следующем [Б.Глик, Дж.Пастернак. Молекулярная биотехнология - принципы и применения. М.: Мир, 2002, с.94-103]. Денатурируют экстрагированную ДНК, отжигают одноцепочечные молекулы с праймерами, добавленными в избытке, и осуществляют синтез ДНК in vitro. Затем опять проводят денатурацию, отжиг с праймерами и синтез и т.д. до, примерно, 30-го раунда. К этому времени в реакционной смеси преобладают фрагменты, на одном конце которых находится одна праймерная последовательность, а на другом - последовательность комплементарная второму праймеру. Все реакции проводят в пробирках, помещенных в термостат. Смена температурного режима и его поддержание осуществляются автоматически. Каждый цикл обычно длится 3-5 мин.
Существуют различные модифицированные варианты данного метода для разных бактерий, в частности бактерий, окисляющих ароматические полициклические углеводороды нефти [Р.Padmanabhan, R.Shanker and P.Khanna, A method for extraction of DNA and PCR-based detection of polycyclic hydrocarbon-degrading bacteria in soil contaminated with oil and grease. //World J.Microbiol. & Biotech., 1998, V.14, 925-926], бактерий Lactobacillus brevis [T.Guameri, L.Rosetti and G.Giraffa, Rapid identification of Lactobacillus brevis using the polymerase chain reaction. //Lett. Appl. Microbiol., 2001, V.33, p.377-381], сульфатредуцирующих бактерий [Y.Tanaka, M.Sogabe, K.Okumura and R.Kurane, A highly selective direct method of detecting sulphate-reducing bacteria in crude oil. //Lett. Appl. Microbiol., 2002, V.35, p.242-246] и стрептококков [Т.Igarashi, Y.Yano, A.Yamamoto, R. Sasa, Identification of Streptococcus salivaris by PCR and DNA probe. //Lett. Appl. Microbiol., 2001, V.32, p.394-397]. Варианты метода, предназначенные для различных бактерий, отличаются, соответственно, объектом экстракции ДНК, применяемыми регентами для экстракции ДНК и используемыми праймерами в ПЦР.
Способ определения бактерий экстракцией ДНК, с последующим проведением ПЦР реакции, высокочувствительный, дифференцированный и универсальный, но имеет ряд недостатков:
а) Способ слишком трудоемкий, требует несколько стадий для экстракции и очистки ДНК.
б) Способ длительный и требует высокой подготовки персонала. В зависимости от объекта исследования бактерий процесс пробоподготовки для ПЦР может длиться до 6 ч, а общее время эксперимента составляет 9-11 ч.
в) Способ используется для дифференцированного определения бактерий, но не является количественным.
г) Реагенты, используемые в экстракции ДНК, и компоненты, составляющие объект экстракции, могут сильно ингибировать ПЦР амплификации, что требует проведение ряда повторных ПЦР амплификаций.
д) Использование различных реагентов, высокоэффективных приборов и праймеров для ПЦР, повышает стоимость анализа.
е) ПЦР является высокочувствительным методом, поэтому при наличии ДНК, случайно попавшей из одной реакционной смеси в другую, могут быть получены ложноположительные результаты. Это заставляет тщательно контролировать все используемые для ПЦР растворы и посуду.
Существуют способы дифференцированного определения бактерий с помощью иммунологических методов, в частности применения антител, высокоспецифичных по отношению к бактериям определенного типа. Так, известен способ селективного определения общего количества анаэробных бактериальных клеток B.vulgatus и B.distasonis, присутствующих в фекальной системе человека [G.Corthier, M.C.Muller, R.L'Haridon, Selective enumeration of Bacteroides vulgatus and B.distasonis organisms in the predominant human fecal flora by using monoclonal antibodies.// Appl. Environ. Microbiol, 1996, V.62, p.735-738]. Способ основан на использовании моноклональных антител к этим клеткам, которые не реагируют с другими клетками рода Bacteroides. Согласно способу, пробы фекальной системы инкубируют в питательной среде (мясопептонный агар) в течение 3 суток при 37°С, далее клетки приводят в контакт с моноклональными антителами. Клетки, реагирующие с антителами, окрашиваются в голубой цвет, что позволяет селективно вести их подсчет на отпечатках, снятых с поверхности чашек Петри с помощью специальных фильтров. Метод позволяет определять клетки, присутствующие в образце в концентрации 103-109 кл/г фекалий. Общая длительность анализа составляет 4-5 суток.
Способы дифференцированного определения численности клеток с помощью иммунологических методов, в том числе и рассмотренный, имеют несколько существенных недостатков, главным из которых является неуниверсальность этих способов и необходимость предварительного получения высоко специфичных моноклональных антител для каждого определяемого типа бактерий, что делает сами методы очень дорогими, а область их возможного применения очень узкой.
Известен метод дифференцированного определения численности микробных клеток в септической крови в присутствии соматических клеток, основанный на определении АТФ биолюминесцентным методом [В.Г.Фрунджян, Л.Ю.Бровко, М.А.Карабасова, Н.Н.Угарова, Биолюминесцентный метод определения антибиотикочувствительности микробных клеток в септической крови. // Прикл. Биохим. Микробиол., 1997, Т.33, №4, с.455-460]. Согласно методу, дифференцируют бактериальный и немикробный (свободный и соматический) АТФ путем обработки образцов 0,1 М раствором перийодата натрия в 5% Тритоне Х-100, в результате которой свободный и находящийся в соматичеких клетках АТФ разрушается. АТФ из бактериальных клеток экстрагируют диметилсульфоксидом (ДМСО). Обе операции проводят последовательно со строгим соблюдением временного регламента.
Согласно методу, первоначально из образца крови, содержащего клетки бактерий E.coli, удаляют немикробный АТФ. С этой целью проводят гемолиз, а именно кровь разбавляют в 25 раз водой и инкубируют 30 мин при комнатной температуре, затем восстанавливают осмомолярность, добавляя в равный объем среды удвоенную концентрацию компонентов LB-среды (Serva, Германия). Далее проводят культивирование пробы на качалке при 37°С в течение 5 часов, отбирают аликвоту (0,1 мл), добавляют к ней 0,01 мл 10 мМ раствора NaIO4 в 0,5%-ном Тритоне Х-100, встряхивают в течение 1 мин, затем вносят 0,9 мл ДМСО. В полученном экстракте биолюминесцентным методом определяют концентрацию АТФ. По калибровочным зависимостям определяют концентрацию клеток в среде de facto. Общее время эксперимента составляет 6-7 часов.
Данное техническое решение, как наиболее близкое к заявляемому по типу используемого подхода к дифференцированному количественному определению численности клеток в образце, содержащем бактериальные клетки, принято в качестве прототипа.
Несмотря на высокую точность метода, прототип не позволяет дифференцировать разные виды бактерий, присутствующие в смеси, а только определять общую численность бактерий в присутствии соматических клеток. При этом численность бактерий, определяемая, согласно прототипу, в среде для подращивания клеток, отражает количество клеток, фактически выросших в среде, и позволяет весьма условно судить об исходной концентрации клеток в образце, а не количественно определять ее.
Задачей предлагаемого изобретения является создание способа дифференцированного определения численности бактерий разных таксономических групп в смешанных культурах.
Поставленная задача решается тем, что применяется определенная последовательность действий, предусматривающая высев образцов смешанных культур в жидкие селективные питательные среды, определение численности клеток биолюминесцентным методом, накапливающихся в средах в ходе роста бактерий, с последующей математической обработкой кинетических данных роста индивидуальных бактериальных культур.
Предлагаемый способ сочетает в себе микробиологические приемы работы с клетками при использовании селективных сред роста, биолюминесцентный метод анализа АТФ, позволяющий достоверно оценить численность клеток в образцах, а также стандартные математические методы обработки кинетических данных.
Применение селективных сред, предназначенных для роста клеток одной определенной таксономической группы, позволяет осуществлять культивирование и дифференциацию целевых видов бактерий.
Применение биолюминесцентного метода определения концентрации внутриклеточного АТФ для определения численности клеток обеспечивает экспрессность и высокую точность определения, что существенно сокращает время дифференцированного количественного анализа.
Экспериментальные данные биолюминесцентного исследования линеаризуются математическими методами с целью определения начальной концентрации отдельных видов клеток в смешанной культуре.
Способ дифференцированного определения численности бактерий в смешанных культурах включает следующие стадии.
- Высев образцов смешанных культур в жидкие селективные питательные среды.
Это проводится известными приемами, а именно готовят стерильные селективные питательные среды роста определенного состава, необходимого для роста бактерий, численность которых необходимо определить в смешанных культурах. Далее в каждую емкость со средой инокулируют аликвоту жидкого образца исследуемой смешанной культуры.
- Определение численности клеток биолюминесцентным методом.
Это осуществляется путем проведения культивирования клеток в условиях (например, температура, аэрация среды, наличие анаэробных условий и др.), которые зависят от специфических характеристик роста клеток, принадлежащих к определяемой группе бактерий, и являются оптимальными. В процессе роста клеток производят отбор проб культуральной жидкости, начиная с момента инокуляции анализируемых проб. Культивирование клеток осуществляют до достижения ими конца логарифмической фазы роста. Для экстракции внутриклеточного АТФ из клеток, присутствующих в пробах, используется экстрагирующий агент. Определение концентрации АТФ проводят с применением препарата иммобилизованной люциферазы светляков.
- Математическая обработка кинетических данных роста индивидуальных бактериальных культур.
По данным биолюминесцентного анализа строят кинетические кривые роста клеток бактерий, дифференцированных при их культивировании в разных селективных средах. Для определения начальной концентрации каждого вида в смешанной культуре проводят линеаризацию кинетических кривых роста математическими методами анализа [Варфоломеев С.Д., Калюжный С.В. Биотехнология - кинетические основы микробиологических процессов. - М.: Изд-во "Выс. школа", 1990, стр.52-78]. Полученные линеаризованные кинетические кривые роста экстраполируют до начального момента клеточного роста и далее рассчитывают концентрацию бактерий каждой таксономической группы в исследуемой смешанной культуре.
Существенным отличием заявляемого изобретения является новое сочетание последовательно выполняемых действий и применяемых методов анализа (а именно микробиологического, биолюминесцентного и математического, т.е. культивирование аликвот смешанной культуры в селективных средах, количественный биолюминесцентный анализ концентраций внутриклеточного АТФ, построение кинетических кривых роста и последующая математическая обработка данных) для дифференцированного количественного определения бактерий разных таксономических групп, присутствующих исходно в одном образце в смеси, которое ранее не было известно.
Ниже приводятся конкретные примеры, иллюстрирующие заявляемый способ.
Пример 1. Дифференцированное определение численности бактерий в модельной смешанной культуре.
А. Микробиологическое определение численности клеток в образце (контроль).
В составе сточных вод нефтедобывающей промышленности присутствуют бактерии - представители разных таксономических групп, в частности гетеротрофные кислотообразующие, сульфатредуцирующие и железоокисляющие бактерии [V.P. Kholodenko, S.K. Jigletsova, Chemico-Microbiological Diagnosis of Stress Corrosion Cracking of Pipelines.// Appl. Biochem.Microbiol, 2000, V.36, p.685-693].
Образец смешанных культур бактериальных клеток готовят путем суспендирования в физиологическом растворе клеток Pseudomonas putida, Desulfovibrio vulgaris и Acidithiobacillus ferrooxidans, являющихся представителями указанных выше групп бактерий, так, чтобы их конечные концентрации в смеси были (1,6±0,6)×106, 106 и 104 кл/мл, соответственно. Эти концентрации клеток в полученной смеси определяют микробиологическим методом, а именно берут аликвоту (1 мл) смеси клеток, готовят 7-8 последовательных 10-кратных разведений этой пробы в физиологическом растворе и высевают каждое разведение по 0,1 мл на чашки Петри со Средой №1 и по 1 мл в пробирки со Средами №2 и 3 (по 9 мл) следующего состава:
Среда №1 (г/л): пептон - 10,0; глюкоза - 5,0; дрожжевой экстракт - 11,0; Nacl - 5,0; агар - 15,0; рН 6,8-7,0.
Среда №2 (г/л): лактат - 4,0; дрожжевой экстракт - 1,0; аскорбиновая кислота - 0,1; MgSO4×7H2О - 0,2; К2НРО4 - 0,01; Fe(SO4)2(NH4)2×6H2О - 0,2; NaCl - 10,0; рН 6,8-7,0.
Среда №3 (г/л): KCl - 0,1; К2HPO4 - 0,5; MgSO4×7H2O - 0,5; Са(NO3)2 - 0,01; Fe(SO4)2(NH4)2×6H2O - 63,0; H2SO4 (10 M) - 1 мл, рН 2,7-3,5.
Для роста клеток Ps.putida и Ac. ferrooxidans инокулированные Среды №1 и №3, соответственно, инкубируют при 28°С в аэробных условиях, а для роста клеток D. vulgaris Среду №2 - в анаэробных условиях при той же температуре.
Через 11 дней отмечают последнее разведение, инокулированное в питательные Среды №2 и 3 и давшее рост, проявляющийся в появлении характерной мутности, а на Среде №1 подсчитывают число выросших колониеобразующих единиц. Исходные концентрации отдельных клеток получают, учитывая все предыдущие разбавления исходной пробы смешанных клеток. Общее время анализа составляет 12 суток.
Б. Определение численности клеток в образце по заявляемому способу.
- Высев и культивирование образцов смешанных культур в жидких селективных питательных средах.
Берут аликвоты (по 0,5 мл) и высевают в жидкие питательные Среды №2, 3 и 4 (по 4, 5 мл). Среда №4 имеет тот же состав, что и Среда №1, но без агара. Культивирование образцов на Средах №3 и 4 проводят при 28°С в аэробных условиях, а на Среде №2 - в анаэробных условиях при той же температуре. Время культивирования составляет 86 ч. Селективные среды обеспечивают подавляющий рост клеток одного типа бактерий, для которого среды являются специфическими.
- Определение численности клеток биолюминесцентным методом.
В процессе культивирования образцов на разных селективных средах периодически отбирают пробы культуральной жидкости (по 0,1 мл) для определения в них общей концентрации АТФ. Для этого к взятой пробе добавляют 0,9 мл ДМСО, затем в полученный раствор (50 мкл) добавляют люциферин-люциферазный реагент (50 мкл), содержащий иммобилизованную люциферазу светляков, D-люциферин, соли магния, стабилизаторы и компоненты буферного раствора, и измеряют интенсивность биолюминесценции с помощью биолюминометра. Время анализа составляет 1 мин. Определение концентрации АТФ в пробе проводят по калибровочной зависимости интенсивности свечения от концентрации АТФ, полученной при использовании стандартных растворов АТФ со строго известной концентрацией вещества. Расчет численности клеток в каждой пробе, взятой в процессе роста клеток, производят при использовании известной средней величины удельной концентрации АТФ в одной клетке. Данный параметр является постоянным на протяжении всего жизненного цикла клетки и имеет строго определенную величину, характерную для каждого типа клеток. Например, для клеток Ps. putida, D. vulgaris и Ac.ferrooxidans величина удельной концентрации АТФ составляет, соответственно, (1,0±0,1)×10-16, (5,2±0,3)×10-18 и (2,7±0,4)×10-16 моль/кл.
- Математическая обработка кинетических данных роста индивидуальных бактериальных культур.
По данным, полученным в результате измерения общей концентрации АТФ в образцах и пересчитанным на концентрацию клеток, соответствующую определенному времени культивирования, строят кинетическую кривую роста клеток. Далее проводят линеаризацию экспоненциальных фаз кривых роста смешанных клеток на селективных средах, рассчитывая натуральный логарифм полученных концентраций клеток. Точка пересечения прямой, проведенной через полученные точки на графике в полулогарифмических координатах, определяет исходную концентрацию клеток строго определенного типа бактерий, исходно присутствовавших в смеси. Далее учитывают все разведения исходной пробы и получают исходную концентрацию каждой индивидуальной культуры в смеси. Фиг.1 (а, б, с) иллюстрирует типичные результаты линеаризации экспоненциальных фаз роста клеток на селективных средах. В Табл. 1 приведены исходные концентрации клеток, определенные согласно заявляемому методу. Время проведения всего анализа составляет 4 суток.
Пример 2. Дифференцированное определение, численности бактерий в модельной смешанной культуре.
А. Микробиологическое определение численности клеток в образце (контроль).
Образец смешанных культур бактериальных клеток готовят с использованием тех же клеток (Pseudomonas putida, Desulfovibrio vulgaris и Acidithiobacillus ferrooxidans), что и в Примере 1. Их конечные концентрации в смеси составляют (4,3±0,6)×106, 105 и 103 кл/мл, соответственно. Эти концентрации клеток в смесях определяют микробиологическим методом так же, как в Примере 1. Общее время анализа составляет 12 суток.
Б. Определение численности клеток в образце по заявляемому способу проводят так же, как и в Примере 1.
Полученные данные представлены в Табл. 1. Время проведения всего анализа составляет 4 суток.
Пример 3. Дифференцированное определение численности бактерий в модельной смешанной культуре.
А. Микробиологическое определение численности клеток в образце (контроль).
Образец смешанных культур бактериальных клеток готовят с использованием тех же клеток что и в Примере 1, а именно Pseudomonas putida, Desulfovibrio vulgaris, но вместо Acidithiobacillus ferrooxidans вводят клетки Rhodococcus erythropolis, широко распрастраненные в почве и способные осуществлять высокоэффективную биодеградацию углеводородов нефти [Т.В.Коронелли, Е.Д.Нестерова, Экологическая стратегия бактерий, использующих гидрофобный субстрат.// Микробиол., 1990, Т.59, с.993-997]. Их конечные концентрации в смеси составляют (1,3±0,6)×102, 104 и 103 кл/мл, соответственно. Эти концентрации клеток в полученной смеси определяют микробиологическим методом, а именно берут аликвоту (1 мл) смеси клеток, готовят 7-8 последовательных 10-кратных разведений этой пробы в физиологическом растворе и высевают каждое разведение по 0,1 мл на чашки Петри со Средами №1 и 5 и по 1 мл в пробирки со Средой №2 (по 9 мл).
Состав Сред №1 и 2 такой же, как в Примере 1.
Среда №5 имеет следующий состав (г/л): нефть - 5,0; агар - 15,0; NaCl - 5,0; KH2PO4 - 3,0; Na2CO3 - 0,1; К2НРО4 - 6,0; NH4Cl - 2,0; MgSO4×7H2O - 0,2; CaCl2×6Н2О - 0,01; MnSO4×5H2O - 0,02; FeSO4×7Н2O - 0,01; рН 6,7-7,2.
Для роста клеток Ps.putida и Rh.erythropolis инокулированные Среды №1 и №5, соответственно, инкубируют при 28°С в аэробных условиях, а для роста клеток D. vulgaris Среду №2 - в анаэробных условиях при той же температуре.
Через 14 дней отмечают последнее разведение, инокулированное в питательную Среду №2 и давшее рост, проявляющийся в появлении характерной мутности, а на Среде №1 и 5 подсчитывают число выросших колониеобразующих единиц. Исходные концентрации отдельных клеток получают, учитывая все предыдущие разбавления исходной пробы смешанных клеток. Общее время анализа составляет 15 суток.
Б. Определение численности клеток в образце по заявляемому способу.
- Высев и культивирование образцов смешанных культур в жидких селективных питательных средах.
Берут аликвоты (по 0,5 мл) и высевают сразу же в жидкие питательные среды №2, 4 и 6 (по 4, 5 мл).
Среда №6 имеет тот же состав, что и Среда №5, но без агара. Культивирование образцов на средах №4 и 6 проводили при 28°С в аэробных условиях, а на среде №2 - в анаэробных условиях при той же температуре. Время культивирования составляет 120 ч. Селективные среды обеспечивают подавляющий рост одного типа клеток, для которого среды являются специфическими.
- Определение численности клеток Pseudomonas putida и Desulfovibrio vulgaris биолюминесцентным методом проводят так же, как в Примере 1.
Для определения численности клеток Rh. erythropolis в процессе культивирования на Среде №6 периодически отбирают пробы культуральной жидкости (по 0,1 мл) для проведения биолюминесцентного анализа содержащейся в них общей концентрации АТФ. К взятой пробе добавляют 0,5 мл хлороформа, далее интенсивно перемешивают в течение 3 мин, добавляют 0,5 мл 0,1 М трис-ацетатного буфера, смесь вновь интенсивно встряхивают и после расслоения фаз 50 мкл водной фазы вносят в кювету люминометра, содержащую 50 мкл люциферазного реагента. Время анализа составляет 1 мин. Далее определение концентрации АТФ в пробе проводят по калибровочной зависимости интенсивности свечения от концентрации АТФ, полученной при использовании стандартных растворов АТФ со строго известной концентрацией вещества. Расчет численности клеток в каждой пробе, взятой в процессе роста клеток, производят с учетом известной средней величины удельной концентрации АТФ в одной клетке, которая для клеток Rh. erythropolis составляет (2,2±0,1)×10-17 моль/кл.
Математическую обработку кинетических данных роста индивидуальных бактериальных культур проводят, как в Примере 1. Полученные данные представлены в Табл. 1. Время проведения всего анализа составляет 5 суток.
Пример 4. Дифференцированное определение численности бактерий в смешанной культуре, содержащейся в реальных сточных водах нефтяного месторождения.
А. Микробиологическое определение численности клеток в образце (контроль).
Берут аликвоту (1 мл) образца сточной воды на нефтяном месторождении, готовят 7-8 последовательных 10-кратных разведений этой пробы в физиологическом растворе и высевают каждое разведение по 0,1 мл на чашки Петри со Средами №1 и 5 и по 1 мл в пробирки со Средами №2 и 3 (по 9 мл), составы которых указаны в Примерах 1 и 3, необходимых для обнаружения бактериальных клеток родов Pseudomonas, Desulfovibrio, Acidithiobacillus и Rhodococcus.
Культивирование клеток в селективных Средах №1, 3 и 5 проводят при 28°С в аэробных условиях, а культивирование клеток в Среде №2 - в анаэробных условиях при той же температуре.
Через 15 дней отмечают последнее разведение, инокулированное в питательные Среды №2 и 3 и давшее рост, проявляющийся в появлении характерной мутности, а на Средах №1 и 5 подсчитывают число выросших колониеобразующих единиц. Исходные концентрации отдельных клеток получают, учитывая все предыдущие разбавления исходной пробы смешанных клеток, а также считая, что для клеток родов Pseudomonas, Desulfovibrio, Acidithiobacillus и Rhodococcus являются селективными, соответственно, Среды №1, 2, 3 и 5. Полученные данные приведены в Табл. 1. Общее время анализа составляет 16 суток.
Б. Определение численности клеток в образце по заявляемому способу.
- Высев и культивирование образцов смешанных культур в жидких селективных питательных средах.
Берут аликвоты (по 0,5 мл) и высевают сразу же в жидкие питательные Среды №2, 3, 4 и 6 (по 4, 5 мл). Составы селективных Сред те же, что в Примерах 1 и 3. Культивирование образцов на Средах №3, 4 и 6 проводят при 28 С в аэробных условиях, а на Среде №2 - в анаэробных условиях при той же температуре. Время культивирования составляет 120 ч. Селективные среды обеспечивают подавляющий рост одного типа клеток, для которого среды являются специфическими.
- Определение численности клеток биолюминесцентным методом и математическую обработку кинетических данных роста индивидуальных бактериальных культур проводят так же, как описано в Примере 1 и 3 с учетом тех величин удельной концентрации АТФ для клеток родов Pseudomonas, Desulfovibrio, Acidithiobacillus и Rhodococcus, которые приведены в Примерах 1 и 3. Полученные данные представлены в Табл. 1. Время проведения всего анализа составляет 5 суток.
Пример 5. Дифференцированное определение численности бактерий в смешанной культуре, присутствующей в составе коррозионных биопленок.
Биопленки, образующиеся на поверхности металлических конструкций, вызывают развитие биокоррозии на местах их формирования. Биопленки представляют собой адгезированные на твердой поверхности смешанные культуры, в состав которых входят гетеротрофные кислотообразующие, сульфатредуцирующие и железоокисляющие бактерии [С.М.Santegoeds, T.G.Ferdelman, G.Muyzer, Structural and functional dynamics of sulfate-reducing populations in bacterial biofilms.// Appl. Environ. Microbiol., 1998, V.64, p.3731-3739].
А. Микробиологическое определение численности клеток в образце (контроль).
Берут соскоб биопленки с внутренней поверхности металлической трубы, служащей для отвода сточной воды из резервуара для хранения нефти на нефтяном месторождении, общей площадью 1,5 см2. Образец помещают в 10 мл физиологического раствора, проводят ресуспендирование биопленки в растворе с помощью ультразвуковой обработки. Далее берут аликвоту полученной суспензии (1 мл), готовят 7-8 последовательных 10-кратных разведений этой пробы в физиологическом растворе и высевают каждое разведение по 0,1 мл на чашки Петри со Средами №1 и 5 и по 1 мл в пробирки со Средами №2 и 3 (по 9 мл), составы которых указаны в Примерах 1 и 3, необходимых для обнаружения бактериальных клеток родов Pseudomonas, Desulfovibrio, Acidithiobacillus и Rhodococcus.
Культивирование клеток в селективных Средах №1, 3 и 5 проводят при 28°С в аэробных условиях, а культивирование клеток в Среде №2 - в анаэробных условиях при той же температуре.
Через 14 дней отмечают последнее разведение, инокулированное в питательные Среды №2 и 3 и давшее рост, проявляющийся в появлении характерной мутности, а на Средах №1 и 5 подсчитывают число выросших колониеобразующих единиц. Исходные концентрации клеток отдельных видов бактерий получают, учитывая все предыдущие разбавления исходной пробы смешанных клеток, а также считая, что для бактерий родов Pseudomonas, Desulfovibrio, Acidithiobacillus и Rhodococcus являются селективными, соответственно, Среды №1, 2, 3 и 5. Полученные данные приведены в Табл. 1. Общее время анализа составляет 15 суток.
Б. Определение численности клеток в образце по заявляемому способу.
- Высев и культивирование образцов смешанных культур в жидких селективных питательных средах.
Берут соскоб биопленки с внутренней поверхности металлической трубы, служащей для отвода сточной воды из резервуара для хранения нефти на нефтяном месторождении, общей площадью 1,5 см2. Образец помещают в 10 мл физиологического раствора, проводят ресуспендирование биопленки в растворе с помощью ультразвуковой обработки. Далее берут аликвоты суспензии (по 0,5 мл) и высевают сразу же в жидкие питательные Среды №2, 3, 4 и 6 (по 4, 5 мл). Составы селективных Сред те же, что в Примерах 1 и 3. Культивирование образцов на Средах №3, 4 и 6 проводят при 28°С в аэробных условиях, а на Среде №2 - в анаэробных условиях при той же температуре. Время культивирования составляет 120 ч. Селективные среды обеспечивают подавляющий рост одного типа клеток, для которого среды являются специфическими.
- Определение численности клеток биолюминесцентным методом и математическую обработку кинетических данных роста индивидуальных бактериальных культур проводят так же, как описано в Примере 1 и 3, с учетом тех величин удельной концентрации АТФ для клеток родов Pseudomonas, Desulfovibrio, Acidithiobacillus и Rhodococcus, которые приведены в Примерах 1 и 3. Полученные данные представлены в Табл. 1. Время проведения всего анализа составляет 5 суток.
Пример 6. Дифференцированное определение численности бактерий в смешанной культуре, используемой для разложения фосфорорганических пестицидов.
Бактериальные консорциумы, разрабатываемые для биологической очистки воды и состоящие из разных микроорганизмов, участвующих в последовательных стадиях разложения фосфорорганических пестицидов (ФП) типа малатион, паратион, кумафос и др., обнаруживаемых в сельскохозяйственных и промышленных сточных водах, в водах рек, как правило, состоят из бактерий Escherihia coli, являющихся генно-инженерным продуцентом ферментов, гидролизующих триэфиры ортофосфорной кислоты, и бактерий рода Pseudomonas, способных метаболизировать продукты ферментативного гидролиза ФП [E.S.Gilbert, A.W.Walker, J.D.Keasling, A constructed microbial consortium for biodegradation of the organophosphorus insecticide parathion.//Appl. Microbiol. Biotechnol., 2003, V.61, p.77-81].
А. Микробиологическое определение численности клеток в образце (контроль).
Образец смешанных культур бактериальных клеток готовят путем ресуспендирования в физиологическом растворе клеток E.coli, Pseudomonas putida и Pseudomonas fluorescens так, чтобы их конечные концентрации в смеси составили (3,3±0,7)×103 и (4,4±0,8)×106 кл/мл, соответственно, для клеток E.coli и суммарно для клеток рода Pseudomonas. Эти концентрации клеток в полученной смеси определяют микробиологическим методом, а именно берут аликвоту (1 мл) смеси клеток, готовят 7-8 последовательных 10-кратных разведений этой пробы в физиологическом растворе и высевают каждое разведение по 0,1 мл на чашки Петри со Средой №1 и 7.
Среда №7 имеет следующий состав (г/л): пептон - 10,0; дрожжевой экстракт - 5,0; NaCl - 5,0; агар - 15,0; ФП (паратион) - 0,002 г; ампициллин - 50 мкг; рН 6,8-7,0.
Инокулированные Среды №1 и 7 инкубируют при 28°С в аэробных условиях. Через 5 дней отмечают последнее разведение, давшее рост колониеобразующих единиц, число которых подсчитывают и используют для окончательного расчета исходных концентраций клеток E.coli и суммарной концентрации клеток рода Pseudomonas. При этом учитывают все предыдущие разбавления исходной пробы смешанных клеток. Общее время анализа составляет 6 суток.
Б. Определение численности клеток в образце по заявляемому способу.
- Высев и культивирование образцов смешанных культур в жидких селективных питательных средах.
Берут аликвоты смешанной культуры (по 0,5 мл) и высевают сразу же в жидкие питательные Среды №4 и 8 (по 4, 5 мл).
Среда №8 имеет тот же состав, что и Среда №7, но без агара. Культивирование образцов на Средах №4 и 8 проводят при 28°С в аэробных условиях. Время культивирования составляет 20 ч. Селективные среды обеспечивают подавляющий рост клеток бактерий одного таксономического типа, для которого среды являются специфическими.
- Определение численности клеток биолюминесцентным методом и математическая обработка кинетических данных роста индивидуальных бактериальных культур проводится, как описано в Примере 1, с учетом известной средней величины удельной концентрации АТФ в одной клетке, которая для клеток E.coli составляет (5,0±0,7)×10-17 моль/кл. В Табл. 1 приведены исходные концентрации клеток, определенные согласно заявляемому методу. Время проведения всего анализа составляет 2 суток.
Пример 7. Дифференцированное определение численности бактерий в смешанной культуре, используемой для получения молочно-кислых продуктов.
Для получения различных молочно-кислых продуктов пробиотического назначения широко используются разные смешанные культуры, основу которых составляют бактерии Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium sp. и Streptococcus lactis [M.E.Sanders, J.H.Veld, Bringing a probiotic-containing functional food to the market: microbiological, product, regulatory and labeling issues.//Antome van Leeeuwenhoek, 1999, V.76, p.293-315].
А. Микробиологическое определение численности клеток в образце (контроль).
Образец кисло-молочного продукта (1 мл), содержащий, согласно рецептуре приготовления, смешанную культуру бактерий Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium sp. и Streptococcus thermophilus, суспендируют в физиологическом растворе, готовят 7-8 последовательных 10-кратных разведений этой пробы в физиологическом растворе и высевают каждое разведение по 0,1 мл на чашки Петри со Средами №9, 10. В случае использования Среды №11 пробу (0,1 мл) предварительно вносят в чашку Петри и сверху заливают средой.
Используемые среды имеют следующий состав.
Среда №9 (селективная среда для клеток Lactobacillus acidophilus, г/л): пептон - 10,0; дрожжевой экстракт - 5,0; мясной экстракт - 10,0; глюкоза - 20,0; цитрат аммония - 2,0; ацетат натрия - 5,0; MnSO4 - 0,5; MgSO4×7Н2O - 0,2; К2НРО4 - 2,0; фенол - 0,005; агар - 15,0; рН 7,0-7,2.
Среда №10 (селективная среда для клеток Bifidobacterium sp, г/л): пептон - 10,0; дрожжевой экстракт - 5,0; мясной экстракт - 10,0; глюкоза - 20,0; цитрат аммония - 2,0; сульфат неомицина - 3,0; MnSO4 - 0,5; MgSO4×7Н2О - 0,2; К2HPO4 - 2,0; хлорид лития - 0,01; агар - 15,0; рН 7,0-7,2.
Среда №11 (селективная среда для клеток Streptococcus thermophilus, г/л): гидролизованное обезжиренное молоко - 10,0; сахароза - 20,0; агар - 20,0; рН 4,3-4,8.
Культивирование клеток бактерий на селективных Средах №9, 10 и 11 проводят, соответственно, при 37°С, 40°С и 45°С в аэробных условиях. Через 7 дней подсчитывают число выросших колониеобразующих единиц на Средах №9, 10 и 11. Исходные концентрации клеток бактерий определенного вида получают, учитывая все предыдущие разбавления исходной пробы смешанных клеток и считая, что для Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium sp. и Streptococcus thermophilus являются селективными, соответственно, Среды №9, 10 и 11. Полученные данные приведены в Табл. 1. Общее время анализа составляет 8 суток.
Б. Определение численности клеток в образце по заявляемому способу.
- Высев и культивирование образцов смешанных культур в жидких селективных питательных средах.
Аликвоты кисло-молочного продукта (по 0,5 мл), содержащего, согласно рецептуре приготовления, смешанную культуру бактерий Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium sp. и Streptococcus thermophilus вносят в жидкие питательные Среды №12, 13 и 14 (по 4, 5 мл).
Среды №12, 13 и 14 имеют тот же состав, что и Среды №9, 10 и 11, но без агара. Культивирование клеток на селективных Средах №12, 13 и 14 проводят, соответственно, при 37°С, 40°С и 45°С в аэробных условиях. Время культивирования составляет 24 ч. Селективные среды обеспечивают подавляющий рост одного типа клеток, для которого среды являются специфическими.
- Определение численности клеток биолюминесцентным методом и математическую обработку кинетических данных роста индивидуальных бактериальных культур проводят так же, как описано в Примере 1, учитывая известные средние величины удельной концентрации АТФ, характерные для клеток Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium sp. u Streptococcus thermophilus, которые составляют, соответственно, (1,5±0,1)×10-17, (4,2±0,6)×10-17 и (2,7±0,8)×10-17 моль/кл. В Табл. 1 приведены концентрации клеток, определенные, согласно заявляемому методу, в исходном образце. Время проведения всего анализа составляет 2 суток.
Таким образом, заявляемый способ дифференцированного определения численности бактерий в смешанных культурах, по сравнению с аналогами и прототипом, обладает рядом существенных преимуществ:
- способ позволяет параллельно количественно идентифицировать бактериальные клетки разных таксономических групп, одновременно присутствующие в смешанных культурах, вместо одной отдельно взятой, как в прототипе;
- способ позволяет существенно (до 9 раз) повысить точность дифференцированного определения численности клеток, особенно для бактерий, рост которых возможен только на жидких питательных средах, и поэтому подсчет колониеобразующих единиц для них традиционным методом на твердых питательных средах принципиально не возможен (Примеры 1-5);
- способ позволяет расширить концентрационный диапазон определения численности бактерий и снизить предел дифференцированного обнаружения до 1-10 кл/мл (Примеры 4 и 5);
- способ позволяет существенно (в 3-4 раза) сократить общее время анализа, особенно для клеток бактерий с низкими скоростями роста и при исходно низких концентрациях клеток в анализируемых образцах (Примеры 1-7);
- способ может быть применен для дифференцированного количественного определения широкого спектра бактерий, представляющих собой природные или генно-инженерные клетки и характеризующихся разными структурами клеточной стенки, ферментативными активностями, анаэробным или аэробным метаболизмом, а также обитающих в различных биосистемах или используемых в разных биотехнологических процессах (Примеры 1-7).
Claims (1)
- Способ дифференцированного определения численности бактерий в смешанных культурах, характеризующийся тем, что осуществляют высев образцов смешанных культур на жидкие селективные питательные среды, определяют биолюминесцентным методом численность клеток, накапливающихся в средах в ходе роста бактерий, математически обрабатывают кинетические данные роста индивидуальных бактерий и устанавливают исходную концентрацию бактерий, относящихся к разным таксономическим группам.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2004104606/13A RU2263148C1 (ru) | 2004-02-18 | 2004-02-18 | Способ дифференцированного определения численности бактерий в смешанных культурах |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2004104606/13A RU2263148C1 (ru) | 2004-02-18 | 2004-02-18 | Способ дифференцированного определения численности бактерий в смешанных культурах |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2004104606A RU2004104606A (ru) | 2005-08-10 |
| RU2263148C1 true RU2263148C1 (ru) | 2005-10-27 |
Family
ID=35844371
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2004104606/13A RU2263148C1 (ru) | 2004-02-18 | 2004-02-18 | Способ дифференцированного определения численности бактерий в смешанных культурах |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2263148C1 (ru) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008013512A1 (fr) * | 2006-07-25 | 2008-01-31 | Gosudarstvennyj Nauchno-Issledovatelskij Kontrolnyj Institut Veterinarnych Preparatov I Kormovych Dobavok | Procédé pour déterminer la quantité d'objets microbiologiques pendant la culture de ceux-ci |
| RU2432565C1 (ru) * | 2010-08-27 | 2011-10-27 | Общество с ограниченной ответственностью "ИТ-СЕРВИС" | Способ испытания сталей на стойкость к микробиологической коррозии |
| RU2542969C1 (ru) * | 2014-01-09 | 2015-02-27 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Ставропольский государственный аграрный университет" | Способ микробиологического анализа воздуха |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5081017A (en) * | 1986-02-18 | 1992-01-14 | Texas Bioresource Corporation | Method and apparatus for detection and quantitation of bacteria |
| US5393662A (en) * | 1990-04-20 | 1995-02-28 | Rcr Scientific, Inc. | Test media for identifying and differentiating general coliforms and Escherichia coli bacteria |
| RU2154105C1 (ru) * | 1999-03-30 | 2000-08-10 | Шендеров Борис Аркадьевич | Способ количественной оценки содержания бифидобактерий в смешанных культурах микроорганизмов |
-
2004
- 2004-02-18 RU RU2004104606/13A patent/RU2263148C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5081017A (en) * | 1986-02-18 | 1992-01-14 | Texas Bioresource Corporation | Method and apparatus for detection and quantitation of bacteria |
| US5393662A (en) * | 1990-04-20 | 1995-02-28 | Rcr Scientific, Inc. | Test media for identifying and differentiating general coliforms and Escherichia coli bacteria |
| RU2154105C1 (ru) * | 1999-03-30 | 2000-08-10 | Шендеров Борис Аркадьевич | Способ количественной оценки содержания бифидобактерий в смешанных культурах микроорганизмов |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ФРУНДЖЯН В.Г., БРОВКО Л.Ю., КАРАБАСОВА М.А., УГАРОВА Н.Н. Биолюминесцентный метод определения антибиотикочувствительности микробных клеток в септической крови. Прикладная биохимия и микробиология, 1977, т.33, №4, с.455-460. ЗАВАРЗИН Г.А., КОЛОТИЛОВА Н.Н. Введение в природоведческую микробиологию. М., 2001, с.71-74. * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008013512A1 (fr) * | 2006-07-25 | 2008-01-31 | Gosudarstvennyj Nauchno-Issledovatelskij Kontrolnyj Institut Veterinarnych Preparatov I Kormovych Dobavok | Procédé pour déterminer la quantité d'objets microbiologiques pendant la culture de ceux-ci |
| RU2401308C2 (ru) * | 2006-07-25 | 2010-10-10 | Государственный Научно-Исследовательский Контрольный Институт Ветеринарных Препаратов И Кормовых Добавок | Способ определения количества микробиологических объектов в процессе их культивирования |
| RU2432565C1 (ru) * | 2010-08-27 | 2011-10-27 | Общество с ограниченной ответственностью "ИТ-СЕРВИС" | Способ испытания сталей на стойкость к микробиологической коррозии |
| RU2542969C1 (ru) * | 2014-01-09 | 2015-02-27 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Ставропольский государственный аграрный университет" | Способ микробиологического анализа воздуха |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2004104606A (ru) | 2005-08-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hussain et al. | Biochemical characterization and identification of bacterial strains isolated from drinking water sources of Kohat, Pakistan | |
| Ventosa et al. | Numerical taxonomy of moderately halophilic Gram-negative rods | |
| US6046021A (en) | Comparative phenotype analysis of two or more microorganisms using a plurality of substrates within a multiwell testing device | |
| Sonune et al. | Isolation, characterization and identification of extracellular enzyme producer Bacillus licheniformis from municipal wastewater and evaluation of their biodegradability | |
| Yudina et al. | A yeast co-culture-based biosensor for determination of waste water contamination levels | |
| Pepper et al. | Cultural methods | |
| WO1989004372A1 (en) | Rapid process for detecting pathogenic microorganisms | |
| Rittmann et al. | Molecular and modeling analyses of the structure and function of nitrifying activated sludge | |
| US20110244510A1 (en) | Filtration method for detecting microbial contamination | |
| Basak et al. | Conventional microbial counting and identification techniques | |
| Kamako et al. | Establishment of axenic endosymbiotic strains of Japanese Paramecium bursaria and the utilization of carbohydrate and nitrogen compounds by the isolated algae | |
| Kirkinci et al. | Identification of Dalapon degrading bacterial strain, Psychrobacter sp. TaeBurcu001 isolated from Antarctica | |
| Srinandan et al. | Nutrients determine the spatial architecture of Paracoccus sp. biofilm | |
| Walker et al. | The effects of growth dynamics upon pH gradient formation within and around subsurface colonies of Salmonella typhimurium | |
| Pagel et al. | Numerical taxonomy of aquatic Acinetobacter isolates | |
| Jain | Evaluation of the semisolid Postgate's B medium for enumerating sulfate-reducing bacteria | |
| Tanaka et al. | Development and application of a bioluminescence ATP assay method for rapid detection of coliform bacteria | |
| Nybroe | Assessment of metabolic activity of single bacterial cells—new developments in microcolony and dehydrogenase assays | |
| RU2263148C1 (ru) | Способ дифференцированного определения численности бактерий в смешанных культурах | |
| Zdanowski et al. | Bacteria in the sea-ice zone between Elephant Island and the South Orkneys during the Polish sea-ice zone expedition,(December 1988 to January 1989) | |
| Kersters et al. | Utility of the Biolog system for the characterization of heterotrophic microbial communities | |
| Rybczyńska-Tkaczyk et al. | Biodecolorization of anthraquinone dyes using immobilised mycelium of Bjerkandera adusta CCBAS930 | |
| Palasuntheram | The halophilic properties of Vibrio parahaemolyticus | |
| Saleh | Differences in the resistance of sulphate-reducing bacteria to inhibitors | |
| Alaa et al. | Isolation and identification of microbial consortia for biodegradability of dairy effluent |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20140219 |