RU2261901C2 - Fungus strain aspergillus terreus 44-62 as producer of lovastatin, industrial method for isolation of lovastatin and method for lactoninization of statins - Google Patents
Fungus strain aspergillus terreus 44-62 as producer of lovastatin, industrial method for isolation of lovastatin and method for lactoninization of statins Download PDFInfo
- Publication number
- RU2261901C2 RU2261901C2 RU2003130693/13A RU2003130693A RU2261901C2 RU 2261901 C2 RU2261901 C2 RU 2261901C2 RU 2003130693/13 A RU2003130693/13 A RU 2003130693/13A RU 2003130693 A RU2003130693 A RU 2003130693A RU 2261901 C2 RU2261901 C2 RU 2261901C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- lovastatin
- lactonization
- carried out
- dehydrating
- solvent
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 113
- PCZOHLXUXFIOCF-UHFFFAOYSA-N Monacolin X Natural products C12C(OC(=O)C(C)CC)CC(C)C=C2C=CC(C)C1CCC1CC(O)CC(=O)O1 PCZOHLXUXFIOCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 96
- 229960004844 lovastatin Drugs 0.000 title claims abstract description 96
- QLJODMDSTUBWDW-UHFFFAOYSA-N lovastatin hydroxy acid Natural products C1=CC(C)C(CCC(O)CC(O)CC(O)=O)C2C(OC(=O)C(C)CC)CC(C)C=C21 QLJODMDSTUBWDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 96
- PCZOHLXUXFIOCF-BXMDZJJMSA-N lovastatin Chemical compound C([C@H]1[C@@H](C)C=CC2=C[C@H](C)C[C@@H]([C@H]12)OC(=O)[C@@H](C)CC)C[C@@H]1C[C@@H](O)CC(=O)O1 PCZOHLXUXFIOCF-BXMDZJJMSA-N 0.000 title claims abstract description 89
- 229940121710 HMGCoA reductase inhibitor Drugs 0.000 title claims abstract description 21
- 239000002471 hydroxymethylglutaryl coenzyme A reductase inhibitor Substances 0.000 title claims abstract description 17
- 241001465318 Aspergillus terreus Species 0.000 title claims abstract description 14
- 238000002955 isolation Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 241000233866 Fungi Species 0.000 title claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 11
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 41
- 238000007273 lactonization reaction Methods 0.000 claims abstract description 38
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims abstract description 33
- 150000002596 lactones Chemical class 0.000 claims abstract description 24
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims abstract description 23
- 239000000047 product Substances 0.000 claims abstract description 19
- RYMZZMVNJRMUDD-UHFFFAOYSA-N SJ000286063 Natural products C12C(OC(=O)C(C)(C)CC)CC(C)C=C2C=CC(C)C1CCC1CC(O)CC(=O)O1 RYMZZMVNJRMUDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 229960002855 simvastatin Drugs 0.000 claims abstract description 15
- RYMZZMVNJRMUDD-HGQWONQESA-N simvastatin Chemical compound C([C@H]1[C@@H](C)C=CC2=C[C@H](C)C[C@@H]([C@H]12)OC(=O)C(C)(C)CC)C[C@@H]1C[C@@H](O)CC(=O)O1 RYMZZMVNJRMUDD-HGQWONQESA-N 0.000 claims abstract description 15
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims abstract description 12
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 5
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 42
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 claims description 22
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 20
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 17
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 15
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000012024 dehydrating agents Substances 0.000 claims description 14
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 14
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 claims description 12
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 11
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 10
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 claims description 9
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 claims description 8
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 8
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 8
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 claims description 8
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 7
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 claims description 7
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 claims description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 6
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 6
- DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N Butyl acetate Natural products CCCCOC(C)=O DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000005352 clarification Methods 0.000 claims description 5
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 5
- TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Al]O[Al]=O TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 claims description 5
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims description 5
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims description 5
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims description 5
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid group Chemical class S(O)(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000003513 alkali Substances 0.000 claims description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 4
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N hexanoic acid Chemical compound CCCCCC(O)=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000011707 mineral Substances 0.000 claims description 3
- 239000012454 non-polar solvent Substances 0.000 claims description 3
- 239000002798 polar solvent Substances 0.000 claims description 3
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 claims description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 2
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 claims 6
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 3
- SCYULBFZEHDVBN-UHFFFAOYSA-N 1,1-Dichloroethane Chemical compound CC(Cl)Cl SCYULBFZEHDVBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N N-Heptane Chemical compound CCCCCCC IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 claims 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 claims 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims 2
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims 2
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 claims 2
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 claims 2
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 claims 2
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 claims 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- KXKVLQRXCPHEJC-UHFFFAOYSA-N acetic acid trimethyl ester Natural products COC(C)=O KXKVLQRXCPHEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims 1
- 150000004945 aromatic hydrocarbons Chemical class 0.000 claims 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims 1
- 150000008280 chlorinated hydrocarbons Chemical class 0.000 claims 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 claims 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 claims 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 claims 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 claims 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims 1
- LMBFAGIMSUYTBN-MPZNNTNKSA-N teixobactin Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H]1C(N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C[C@@H]2NC(=N)NC2)C(=O)N[C@H](C(=O)O[C@H]1C)[C@@H](C)CC)=O)NC)C1=CC=CC=C1 LMBFAGIMSUYTBN-MPZNNTNKSA-N 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 17
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 abstract 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 17
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 10
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 10
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 8
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 6
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 5
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 5
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 5
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 5
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 5
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 4
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 4
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 4
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 3
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 3
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 3
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 3
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- CABVTRNMFUVUDM-VRHQGPGLSA-N (3S)-3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C[C@@](O)(CC(O)=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 CABVTRNMFUVUDM-VRHQGPGLSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010020100 Hip fracture Diseases 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- OAIVIYSBZFEOIU-UHFFFAOYSA-N chloroform;propan-2-one Chemical compound CC(C)=O.ClC(Cl)Cl OAIVIYSBZFEOIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- SRCZQMGIVIYBBJ-UHFFFAOYSA-N ethoxyethane;ethyl acetate Chemical compound CCOCC.CCOC(C)=O SRCZQMGIVIYBBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DEQYTNZJHKPYEZ-UHFFFAOYSA-N ethyl acetate;heptane Chemical compound CCOC(C)=O.CCCCCCC DEQYTNZJHKPYEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OAYLNYINCPYISS-UHFFFAOYSA-N ethyl acetate;hexane Chemical compound CCCCCC.CCOC(C)=O OAYLNYINCPYISS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000002625 immunotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 229940096701 plain lipid modifying drug hmg coa reductase inhibitors Drugs 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 description 1
- 235000002247 Aspergillus oryzae Nutrition 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 1
- 241000209763 Avena sativa Species 0.000 description 1
- 235000007558 Avena sp Nutrition 0.000 description 1
- 208000010392 Bone Fractures Diseases 0.000 description 1
- XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N Cyclohexane Chemical compound C1CCCCC1 XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 238000004566 IR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- TUZYXOIXSAXUGO-UHFFFAOYSA-N Pravastatin Natural products C1=CC(C)C(CCC(O)CC(O)CC(O)=O)C2C(OC(=O)C(C)CC)CC(O)C=C21 TUZYXOIXSAXUGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical class C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 1
- 206010047249 Venous thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002785 anti-thrombosis Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- PKANYGVBNOANHF-UHFFFAOYSA-N butyl acetate;heptane Chemical compound CCCCCCC.CCCCOC(C)=O PKANYGVBNOANHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VOFJQEALMGAGCL-UHFFFAOYSA-N butyl acetate;hexane Chemical compound CCCCCC.CCCCOC(C)=O VOFJQEALMGAGCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- ZCDOYSPFYFSLEW-UHFFFAOYSA-N chromate(2-) Chemical compound [O-][Cr]([O-])(=O)=O ZCDOYSPFYFSLEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical class CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 1
- NLFBCYMMUAKCPC-KQQUZDAGSA-N ethyl (e)-3-[3-amino-2-cyano-1-[(e)-3-ethoxy-3-oxoprop-1-enyl]sulfanyl-3-oxoprop-1-enyl]sulfanylprop-2-enoate Chemical compound CCOC(=O)\C=C\SC(=C(C#N)C(N)=O)S\C=C\C(=O)OCC NLFBCYMMUAKCPC-KQQUZDAGSA-N 0.000 description 1
- 239000002024 ethyl acetate extract Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 244000005709 gut microbiome Species 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 238000002657 hormone replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 230000000871 hypocholesterolemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000009878 intermolecular interaction Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 230000000622 irritating effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003642 osteotropic effect Effects 0.000 description 1
- 229940062054 oxygen 30 % Drugs 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 229940066779 peptones Drugs 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229960002965 pravastatin Drugs 0.000 description 1
- TUZYXOIXSAXUGO-PZAWKZKUSA-N pravastatin Chemical compound C1=C[C@H](C)[C@H](CC[C@@H](O)C[C@@H](O)CC(O)=O)[C@H]2[C@@H](OC(=O)[C@@H](C)CC)C[C@H](O)C=C21 TUZYXOIXSAXUGO-PZAWKZKUSA-N 0.000 description 1
- -1 precipitants Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000000583 progesterone congener Substances 0.000 description 1
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- CZDYPVPMEAXLPK-UHFFFAOYSA-N tetramethylsilane Chemical compound C[Si](C)(C)C CZDYPVPMEAXLPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000001551 toxigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000005292 vacuum distillation Methods 0.000 description 1
- 208000004043 venous thromboembolism Diseases 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Description
Область техники, к которой относятся изобретенияFIELD OF THE INVENTION
Изобретения относятся к биотехнологии и органической химии, касаются микробиологического синтеза ловастатина - ингибитора 3-гидрокси 3-метилглутарил-кофермент A (HMG-CoA) редуктазы и представляют собой штамм-продуцент ловастатина, промышленный способ его выделения и отдельную стадию этого процесса, а именно способ лактонизации статинов.The invention relates to biotechnology and organic chemistry, relates to the microbiological synthesis of lovastatin, an inhibitor of 3-hydroxy 3-methylglutaryl coenzyme A (HMG-CoA) reductase, and is a producer strain of lovastatin, an industrial method for its isolation and a separate stage of this process, namely, a method lactonization of statins.
Изобретения могут быть использованы в химико-фармацевтической, парафармацевтической, парфюмерно-косметической промышленностях, медицине, ветеринарии и сельском хозяйстве.The invention can be used in the pharmaceutical, parapharmaceutical, perfumery and cosmetic industries, medicine, veterinary medicine and agriculture.
Уровень техникиState of the art
Ловастатин наряду с другими статинами находит чрезвычайно широкое применение в качестве активного начала фармацевтических препаратов гипохолестеролемического действия. Препараты этого класса обнаруживают также высокую остеотропную и антитромботическую клиническую эффективность (Meier G.R., Schlienger R.G., Kraenzlin M.E., et al. HMG-CoA reductase inhibitors and risk of hip fractures. JAMA. 2000; 283:3205-3210.; Wang P.S., Solomon D.H., Mogan J. HMG-CoA reductase inhibitors and risk of hip fractures in elderly patients. JAMA. 2000; 283:3211-3216.; EP 1291017 A3; Grady D., Wenger N.K., Herrington D., et al. Postmenopausal hormone therapy increases risk for venous thromboembolic disease: the Heart and Estrogen/progestin Replacement Study. Ann Intern Med. 2000; 132: 689-696).Lovastatin, along with other statins, is extremely widely used as an active principle in pharmaceutical preparations with a hypocholesterolemic effect. Drugs of this class also exhibit high osteotropic and antithrombotic clinical efficacy (Meier GR, Schlienger RG, Kraenzlin ME, et al. HMG-CoA reductase inhibitors and risk of hip fractures. JAMA. 2000; 283: 3205-3210 .; Wang PS, Solomon DH, Mogan J. HMG-CoA reductase inhibitors and risk of hip fractures in elderly patients. JAMA. 2000; 283: 3211-3216; EP 1291017 A3; Grady D., Wenger NK, Herrington D., et al. Postmenopausal hormone therapy increases risk for venous thromboembolic disease: the Heart and Estrogen / progestin Replacement Study. Ann Intern Med. 2000; 132: 689-696).
Поскольку атеросклероз является главной причиной смертности в экономически развитых странах, а переломы костей, связанные в том числе с остеопорозом, и венозный тромбоз являются основными причинами инвалидизации населения, потребность в вышеуказанных препаратах постоянно возрастает.Since atherosclerosis is the main cause of death in economically developed countries, and bone fractures, including those associated with osteoporosis, and venous thrombosis are the main causes of disability in the population, the need for the above drugs is constantly increasing.
Кроме того, ловастатин и его химические аналоги являются исходной субстанцией для получения их производных того же биологического действия, а также других известных статинов, в частности симвастатина и правастатина, путем химической и биологической трансформации (JP 2003012607; EP 1284264 A1; US 6.472.542; JP 2001286293).In addition, lovastatin and its chemical analogues are the starting substance for obtaining their derivatives of the same biological effect, as well as other known statins, in particular simvastatin and pravastatin, by chemical and biological transformation (JP 2003012607; EP 1284264 A1; US 6.472.542; JP 2001286293).
В связи с вышеизложенным особое значение приобретают получение высокопродуктивных промышленных штаммов - продуцентов ловастатина и разработка экономичных, технологичных и экологически безопасных способов его выделения, а также отдельных операций этого процесса, обеспечивающих получение коммерческого продукта фармакопейной чистоты с максимальным выходом и низкой себестоимостью.In connection with the foregoing, it is of particular importance to obtain highly productive industrial strains - producers of lovastatin and the development of economical, technologically advanced and environmentally friendly methods for its isolation, as well as individual operations of this process, providing a commercial pharmacopoeial product with maximum yield and low cost.
Известны штаммы грибов-продуцентов ловастатина из рода Aspergillus: Asp. terreus AD 43, DS 28373, CBS 456.95 (Cenrraal Bureau voor Schimmelcultures, Delfr, The Netherlands; EP 0877089 Al); Asp. terreus CCM 8236 (WO 99/19458; WO 00/63411); Asp. terreus ATCC 20541 (US 4.231.938); Asp. terreus ATCC 20542 (EP 0022478); Asp. oryzae ATCC 74135 (RU 2114912; US 5.362.638); Asp. obscurus - MV-1 holotype strain (NCAIM (P) F 001189; WO 94/10328).Known strains of fungi-producers of lovastatin from the genus Aspergillus: Asp. terreus AD 43, DS 28373, CBS 456.95 (Cenrraal Bureau voor Schimmelcultures, Delfr, The Netherlands; EP 0877089 Al); Asp. terreus CCM 8236 (WO 99/19458; WO 00/63411); Asp. terreus ATCC 20541 (US 4,231,938); Asp. terreus ATCC 20542 (EP 0022478); Asp. oryzae ATCC 74135 (RU 2114912; US 5.362.638); Asp. obscurus - MV-1 holotype strain (NCAIM (P) F 001189; WO 94/10328).
Однако продуктивность известных штаммов не превышает 3 г/л культуральной жидкости, что обусловливает недостаточную рентабельность производства ловастатина.However, the productivity of the known strains does not exceed 3 g / l of culture fluid, which leads to insufficient profitability of the production of lovastatin.
Известны способы выделения ловастатина в лактонной форме из сырья, полученного культивированием грибов-продуцентов из рода Aspergillus: (RU 2114912; WO 00/63411; ЕР 0877742 B1; WO 94/10328; ЕР 0 877 089 A1; WO 97/20834; WO 00/17182; WO 98/50572; ЕР 0 556 699; US 5.362.638).Known methods for the isolation of lovastatin in lactone form from raw materials obtained by cultivating fungi-producers from the genus Aspergillus: (RU 2114912; WO 00/63411; EP 0877742 B1; WO 94/10328; EP 0 877 089 A1; WO 97/20834; WO 00 / 17182; WO 98/50572; EP 0 556 699; US 5,362,638).
Недостатками известных способов являются:The disadvantages of the known methods are:
- недостаточная чистота целевого продукта вследствие загрязненности его, в частности, такими трудноотделяемыми примесями, как димеры и кислотная форма ловастатина;- insufficient purity of the target product due to its contamination, in particular by such difficult to separate impurities as dimers and the acid form of lovastatin;
- недостаточный выход целевого продукта, в ряде случаев не превышающий 50-60%;- insufficient yield of the target product, in some cases not exceeding 50-60%;
- низкая производственная и экологическая безопасность вследствие использования в процессе больших объемов токсичных органических растворителей, кислот, катализаторов и т.п.;- low production and environmental safety due to the use of large amounts of toxic organic solvents, acids, catalysts, etc .;
- высокая энергоемкость по причине отгонки в процессе высококипящих органических растворителей;- high energy intensity due to the distillation of high-boiling organic solvents in the process;
- низкие экономичность и технологичность вследствие сложности и многостадийности ряда процессов, а также использования специального дорогостоящего оборудования.- low efficiency and manufacturability due to the complexity and multi-stage of a number of processes, as well as the use of special expensive equipment.
Ближайшим аналогом заявленного способа выделения ловастатина является способ выделения его из культуральной жидкости, полученной культивированием гриба-продуцента вида Aspergillus terreus, включающий подкисление культуральной жидкости соляной кислотой, экстракцию ловастатина этилацетатом, концентрирование полученного экстракта перегонкой в вакууме, лактонизацию кислотной формы ловастатина путем кипячения концентрата в толуоле при 106°С в течение двух часов, двухстадийную очистку лактонной формы ловастатина от примесей посредством хроматографии на силикагеле и осветления активированным углем и, наконец, кристаллизацию целевого продукта (ЕР 0033536 В1; Compound III a, pp.3-4; steps B1-B3).The closest analogue of the claimed method for isolating lovastatin is a method for isolating it from a culture fluid obtained by culturing a producer fungus of the species Aspergillus terreus, including acidification of the culture fluid with hydrochloric acid, extraction of lovastatin with ethyl acetate, concentration of the extract by distillation in vacuo, lactonization of the acid form of lovastatin by boiling the concentrate at 106 ° C for two hours, two-stage purification of the lactone form of lovastatin from impurities by means of chromate graphy on silica gel and clarification with activated charcoal and finally crystallized title product (EP 0033536 B1; Compound III a, pp.3-4; steps B1-B3).
Известный способ имеет ряд существенных недостатков:The known method has several significant disadvantages:
- целевой продукт не обладает фармокопейной чистотой вследствие загрязненности его димерами, образующимися при высокотемпературной лактонизации в присутствии растворителя;- the target product does not have pharmacopoeial purity due to contamination with its dimers formed during high-temperature lactonization in the presence of a solvent;
- низкая производственная и экологическая безопасность процесса вследствие использования в нем больших объемов токсичных органических растворителей (толуола, метиленхлорида и т.д.);- low production and environmental safety of the process due to the use of large volumes of toxic organic solvents (toluene, methylene chloride, etc.);
- высокая энергоемкость процесса по причине длительности и высокотемпературного режима стадии лактонизации;- high energy intensity of the process due to the duration and high temperature stage of the lactonization;
- низкие экономичность и технологичность процесса в связи с необходимостью утилизации и/или регенерации больших объемов силикагеля и органических растворителей, а также использованием специального дорогостоящего оборудования.- low cost-effectiveness and manufacturability of the process due to the need for disposal and / or regeneration of large volumes of silica gel and organic solvents, as well as the use of special expensive equipment.
Несмотря на то обстоятельство, что физиологически активной является кислотная форма статинов, последние, как правило, получают в лактонной форме, являющейся коммерческим продуктом, так как лактон легко кристаллизуется, хорошо очищается от примесей и подлежит длительному хранению и сертификации.Despite the fact that the acid form of statins is physiologically active, the latter, as a rule, are obtained in the lactone form, which is a commercial product, since the lactone is easily crystallized, well cleansed of impurities, and is subject to long-term storage and certification.
Поэтому ключевой стадией выделения ловастатина, а также получения других статинов является процесс лактонизации их кислотной формы.Therefore, the key stage in the isolation of lovastatin, as well as the production of other statins, is the process of lactonization of their acid form.
Известны различные способы лактонизации кислотной формы статинов, заключающиеся в проведении процесса в толуоле при температуре 106-110°С в течение двух-шести часов (ЕР 0033536 B1; WO 98/50572; US 5.362.638); осуществлении лактонизации одновременно с концентрированном в бутилацетате при пониженном давлении и температуре 55-60°С (RU 2114912, US 5.712.130); кипячении в хлороформе и других галогенсодержащих растворителях (WO 97/20834); нагревании в водной среде до температуры 50-60°С в присутствии больших количеств минеральной кислоты в качестве катализатора в течение 24 ч (WO 02/0065); вакуумной перегонке в органическом растворителе при температуре 60°С в присутствии 0,1-1,0%-ной уксусной кислоты (WO 00/63411); нагревании аммонийной соли ловастатина или симвастатина в уксусной кислоте до температуры 35-40°С в атмосфере азота (ЕР 0955297 А1); нагревании аммонийной соли ловастатина или симвастатина до температуры 100-110°С в толуоле в токе азота в присутствии дегидратирующих агентов в течение 3 ч (ЕР 1288212 A1); проведении лактонизации в органическом растворителе в атмосфере азота при комнатной температуре в присутствии агентов лактонизации, связывающих в нерастворимый комплекс образующуюся в процессе реакции воду (US 6.562.984 В2).There are various methods of lactonization of the acid form of statins, consisting in carrying out the process in toluene at a temperature of 106-110 ° C for two to six hours (EP 0033536 B1; WO 98/50572; US 5.362.638); the implementation of lactonization simultaneously with concentrated in butyl acetate under reduced pressure and a temperature of 55-60 ° C (RU 2114912, US 5.712.130); boiling in chloroform and other halogenated solvents (WO 97/20834); heating in an aqueous medium to a temperature of 50-60 ° C in the presence of large quantities of mineral acid as a catalyst for 24 hours (WO 02/0065); vacuum distillation in an organic solvent at a temperature of 60 ° C in the presence of 0.1-1.0% acetic acid (WO 00/63411); heating the ammonium salt of lovastatin or simvastatin in acetic acid to a temperature of 35-40 ° C in a nitrogen atmosphere (EP 0955297 A1); heating the ammonium salt of lovastatin or simvastatin to a temperature of 100-110 ° C in toluene in a stream of nitrogen in the presence of dehydrating agents for 3 hours (EP 1288212 A1); carrying out lactonization in an organic solvent in a nitrogen atmosphere at room temperature in the presence of lactonization agents that bind water formed during the reaction into an insoluble complex (US 6.562.984 B2).
Недостатками известных способов являются:The disadvantages of the known methods are:
- образование побочных продуктов, в частности димеров, при проведени лактонизации в режиме высоких температур и присутствии растворителей и/или использовании в качестве катализаторов сильных минеральных кислот, что препятствует получению целевых продуктов фармакопейной чистоты и приводит к необходимости их дополнительной очистки (US 20020002288; US 6.521.762);- the formation of by-products, in particular dimers, during lactonization at high temperatures and in the presence of solvents and / or the use of strong mineral acids as catalysts, which prevents the preparation of target products of pharmacopeia purity and leads to the need for additional purification (US 20020002288; US 6.521 .762);
- неполная лактонизация (кислотная форма трансформируется в лактон лишь на 50-90%) и нежелательная длительности процесса (до 24 ч) при умеренных температурах и использовании кислот в качестве катализаторов;- incomplete lactonization (the acid form is transformed into a lactone only by 50-90%) and an undesirable duration of the process (up to 24 hours) at moderate temperatures and the use of acids as catalysts;
- необходимость отделения и/или выделения целевого продукта из реакционной смеси;- the need for separation and / or isolation of the target product from the reaction mixture;
- высокая энергоемкость и недостаточная технологическая и экологическая безопасность процесса при использовании высококипящих токсичных растворителей (толуол, галогенсодержащие растворители и т.п.);- high energy intensity and insufficient technological and environmental safety of the process when using high-boiling toxic solvents (toluene, halogen-containing solvents, etc.);
- необходимость утилизации и/или регенерации используемых в процессе, как правило, больших объемов растворителей, осадителей, катализаторов и т.п.;- the need for disposal and / or regeneration used in the process, as a rule, large volumes of solvents, precipitants, catalysts, etc .;
- необходимость предварительного выделения ловастатина или симвастатина в виде аммонийных солей.- the need for preliminary isolation of lovastatin or simvastatin in the form of ammonium salts.
Процесс лактонизации в отсутствии растворителя в литературе не описан.The process of lactonization in the absence of solvent is not described in the literature.
Краткое описание фигурBrief Description of the Figures
В дальнейшем изобретения поясняются фигурами, при этомFurther, the invention is illustrated by figures, while
Фиг.1 - иллюстрирует 1H ЯМР - спектр выделенного заявленным способом вещества - ловастатина в растворе CDCl3 относительно тетраметилсилана;Figure 1 - illustrates the 1 H NMR spectrum of the selected substance of the claimed method - lovastatin in a solution of CDCl 3 relative to tetramethylsilane;
Фиг.2 - иллюстрирует ИК-спектр выделенного заявленным способом вещества - ловастатина в KBr.Figure 2 - illustrates the IR spectrum selected by the claimed method of the substance is lovastatin in KBr.
Сущность изобретенийSUMMARY OF INVENTIONS
В основу изобретений положена задача получения нового высокопродуктивного штамма Aspergillus terreus - продуцента ловастатина и разработки высокотехнологичных, экономичных и экологически безопасных способа его выделения, а также отдельной операции этого способа, а именно процесса лактонизации статинов.The inventions are based on the task of obtaining a new highly productive strain of Aspergillus terreus - a producer of lovastatin and the development of a high-tech, economical and environmentally friendly method for its isolation, as well as a separate operation of this method, namely the process of statin lactonization.
Задача изобретений в части штамма решена тем, что получен новый штамм Aspergillus terreus №44-62 (депонирован в коллекции фирмы Меткинен, Литтойнен, Финляндия) - продуцент ловастатина. Техническими результатами заявленного изобретения являются:The objective of the invention in terms of the strain is solved by the fact that a new strain of Aspergillus terreus No. 44-62 was obtained (deposited in the collection of the company Metkinen, Littoynen, Finland) - producer of lovastatin. The technical results of the claimed invention are:
- высокая продуктивность (6-8 г/л культуральной жидкости);- high productivity (6-8 g / l of culture fluid);
- генетическая устойчивость;- genetic resistance;
- стабильность в условиях производства (заявленный штамм не теряет начальную продуктивность в течение 4-5 циклов культивирования).- stability under production conditions (the claimed strain does not lose its initial productivity within 4-5 cycles of cultivation).
Заявленный штамм получен путем многостадийного комбинированного метода индуцированного мутагенеза исходного штамма Asp. terreus, хранящегося в Американской Коллекции Типированных Культур под номером АТСС 20542.The claimed strain is obtained by a multi-stage combined method of induced mutagenesis of the original strain Asp. terreus stored in the American Typed Culture Collection under ATCC number 20542.
Штамм депонирован в коллекции фирмы Меткинен, Литтойнен, Финляндия под номером 44-62.The strain is deposited in the collection of the company Metkinen, Littoynen, Finland under the number 44-62.
Штамм характеризуется следующими признаками:The strain is characterized by the following features:
- культурально-морфологическими- cultural and morphological
На агаризованной среде 12-суточная колония имеет округлую неправильную форму с нерегулярно изрезанными краями, вулканическим профилем. Возможен кратер в центре. Диаметр колонии 20-30 мм; окраска колонии коричневато-красная. Мицелий плотный, компактный, без воздушного пушистого слоя. Гифы короткие, разветвленные, состоящие из расширенных клеток нерегулярной формы, диаметром от 5 до 30 мкм. Субстратный мицелий прорастает глубоко в питательную среду, образуя воздушные полости на дне чашки.On an agar medium, a 12-day-old colony has a rounded irregular shape with irregularly curved edges and a volcanic profile. Possible crater in the center. The diameter of the colony is 20-30 mm; colony coloration brownish-red. The mycelium is dense, compact, without an airy fluffy layer. Hyphae are short, branched, consisting of expanded cells of irregular shape, with a diameter of 5 to 30 microns. The substrate mycelium grows deep into the nutrient medium, forming air cavities at the bottom of the cup.
В жидкой питательной среде растет в виде открытой мицелиальной и компактной шарообразной формы. Гифы в основном короткие, силько разветвленные, закручивающиеся, состоящие из нерегулярных расширенных коротких клеток.In a liquid nutrient medium it grows in the form of an open mycelial and compact spherical shape. Hyphae are mostly short, highly branched, twisting, consisting of irregular extended short cells.
- физиологическими- physiological
Штамм является строгим аэробом, при ферментации необходима интенсивная аэрация. Растет на многих органических субстратах, таких как овсяная, рисовая, кукурузная мука. Рост на пительной среде и ферментация могут происходить при температуре 20-37°С, при этом температурный оптимум составляет 25-27°С, оптимальное значение рН среды - 5,5-6,5.The strain is a strict aerobic, fermentation requires intensive aeration. It grows on many organic substrates, such as oat, rice, corn flour. Growth on the culture medium and fermentation can occur at a temperature of 20-37 ° C, while the temperature optimum is 25-27 ° C, the optimal pH of the medium is 5.5-6.5.
- биохимическими- biochemical
Штамм в питательных средах усваивает в качестве источника углеводов глюкозу, сахарозу, фруктозу, мальтозу и глицерин; в качестве источника азота использует пептон, дрожжевой экстракт, гидролизат казеина; из неорганических солей предпочтительно использует хлорид натрия, сульфат магния и фосфат калия.The strain in nutrient media assimilates glucose, sucrose, fructose, maltose and glycerin as a source of carbohydrates; uses peptone, yeast extract, casein hydrolyzate as a nitrogen source; of inorganic salts, preferably sodium chloride, magnesium sulfate and potassium phosphate are used.
- биотехнологическими- biotechnological
Максимальная продуктивность штамма составляет 6-8 г/л культуральной жидкости в течение 200-240 часов при температуре 26°С и следующем составе среды для ферментации (г/л):The maximum productivity of the strain is 6-8 g / l of culture fluid for 200-240 hours at a temperature of 26 ° C and the following composition of the medium for fermentation (g / l):
пептон 10 г; соевая мука 40 г; солодовый экстракт 5 г; сахароза 200 г; КН2PO4 0,5 г; NaCl 2 г; MgSO4·7H2O 0,5 г; дистиллированная вода до 1 л; до стерилизации рН составляет 6,0.peptone 10 g; soy flour 40 g; malt extract 5 g; sucrose 200 g; KH 2 PO 4 0.5 g; NaCl 2 g; MgSO 4 · 7H 2 O 0.5 g; distilled water up to 1 liter; before sterilization, the pH is 6.0.
При этом заявленный штамм не теряет вышеуказанную продуктивность в течение 4-5 циклов культивирования.Moreover, the claimed strain does not lose the above productivity for 4-5 cycles of cultivation.
- патогенность штамма- pathogenicity of the strain
Экспериментально исследованы патогенные свойства микроорганизма, влияние его на интегральные показатели состояния организма экспериментальных животных и микрофлору кишечника, иммунотоксические свойства и возможность диссеминации его во внутренние органы с целью установления лимитирующего критерия вредного действия (ЛКВД) и обоснования ПДКр.з и ПДКа.в.The pathogenic properties of the microorganism, its influence on the integral indicators of the state of the organism of experimental animals and the intestinal microflora, immunotoxic properties and the possibility of its dissemination to internal organs in order to establish a limiting criterion of harmful effect (LKVD) and justify the MPC of r.z and MPC a.v. were experimentally studied .
При внутрибрюшинном введении высоких доз микромицета не выявлено вирулентных и токсигенных свойств изучаемого штамма плесневого гриба. Он не обладает способностью к диссеминации в кровь и внутренние органы животных при однократном внутрибрюшинном введении больших доз штамма-продуцента. Раздражающее действие суспензии гриба при однократном нанесении на слизистые оболочки глаз кролика также отсутствует.With the intraperitoneal administration of high doses of micromycete, no virulent and toxigenic properties of the studied mold fungus were revealed. It does not have the ability to disseminate to the blood and internal organs of animals with a single intraperitoneal injection of large doses of the producer strain. The irritant effect of the suspension of the fungus with a single application to the mucous membranes of the eyes of the rabbit is also absent.
Обследование подопытных животных в хроническом эксперименте показало, что воздействие штамма-продуцента в двух концентрациях (3.5·103 и 3.5·104 кл/м3) в течение 1 месяца не приводило к изменению интегральных показателей состояния организма экспериментальных животных, которое оценивалось по динамике массы тела в течение эксперимента и в восстановительном периоде. Полученные данные свидетельствуют об отсутствии общего токсического действия штамма-продуцента на организм крыс при хронической экспозиции его в изученных концентрациях.Examination of experimental animals in a chronic experiment showed that the exposure of the producer strain in two concentrations (3.5 · 10 3 and 3.5 · 10 4 cells / m 3 ) for 1 month did not lead to a change in the integral indicators of the state of the organism of the experimental animals, which was estimated by the dynamics body weight during the experiment and in the recovery period. The data obtained indicate the absence of a general toxic effect of the producer strain on the rat organism during chronic exposure in the studied concentrations.
В результате проведенных исследований по изучению иммунотоксических свойств микроорганизма установлено, что коэффициенты массы тимуса и селезенки экспериментальных животных при воздействии большей концентрации не отличались от таковых у животных контрольной группы.As a result of studies on the immunotoxic properties of the microorganism, it was found that the mass coefficients of the thymus and spleen of experimental animals when exposed to a higher concentration did not differ from those in animals of the control group.
Таким образом, результаты экспериментальных исследований свидетельствуют о том, что Aspergillus terreus №44-62 (депонирован в коллекции фирмы Меткинен, Литтойнен, Финляндия) не обладает патогенными свойствами для теплокровных животных.Thus, the results of experimental studies indicate that Aspergillus terreus No. 44-62 (deposited in the collections of the company Metkinen, Littoynen, Finland) does not have pathogenic properties for warm-blooded animals.
Техническими результатами заявленных изобретений в части способа выделения ловастатина являются:The technical results of the claimed inventions in terms of the method of isolation of lovastatin are:
- получение целевого продукта фармакопейной чистоты без примеси димеров и кислотной формы ловастатина при одновременном увеличении его выхода (более 70%);- obtaining the target product of pharmacopeia purity without impurities of dimers and the acid form of lovastatin with a simultaneous increase in its yield (more than 70%);
- повышение производственной и экологической безопасности процесса вследствие исключения из него использования больших объемов токсичных органических растворителей (толуола, метиленхлорида) при высокотемпературных режимах;- increasing the production and environmental safety of the process due to the exclusion from it of the use of large volumes of toxic organic solvents (toluene, methylene chloride) under high temperature conditions;
- снижение энергоемкости процесса;- reduction of the energy intensity of the process;
- повышение экономичности и технологичности процесса вследствие его простоты, отсутствия специального дорогостоящего оборудования и возможности использования замкнутого производственного цикла (применения одного растворителя, в частности этилацетата, в течение всего производства).- increasing the efficiency and manufacturability of the process due to its simplicity, lack of special expensive equipment and the possibility of using a closed production cycle (the use of one solvent, in particular ethyl acetate, throughout the entire production).
Способ выделения ловастатина согласно изобретению включает следующие стадии:The method for isolating lovastatin according to the invention comprises the following steps:
a) экстракцию его из сырья, полученного культивированием гриба-продуцента ловастатина;a) extracting it from raw materials obtained by culturing a producer fungus lovastatin;
b) концентрирование экстракта;b) concentrating the extract;
c) лактонизацию в отсутствии растворителя;c) lactonization in the absence of solvent;
d) двухстадийную очистку от примесей, а именно промывание органическим растворителем или смесью органических растворителей и осветление;d) two-stage purification from impurities, namely washing with an organic solvent or a mixture of organic solvents and clarification;
e) кристаллизацию целевого продукта.e) crystallization of the target product.
В частных случаях реализации заявленного способа в качестве гриба-продуцента могут использоваться штаммы Aspergillus terreus, Aspergillus orysae или Aspergillus obscurus, предпочтительно Asp. terreus №44-62 (депонирован в коллекции фирмы Меткинен, Литтойнен, Финляндия); при этом сырьем, полученным культивированием гриба-продуцента, может служить культуральная жидкость, ее фильтрат или мицелий.In particular cases of the implementation of the claimed method, Aspergillus terreus, Aspergillus orysae or Aspergillus obscurus, preferably Asp. terreus No. 44-62 (deposited in the collection of Metkinen, Littoynen, Finland); in this case, the culture fluid, its filtrate or mycelium can serve as a raw material obtained by culturing a producer fungus.
Экстракцию ловастатина целесообразно осуществлять органическим растворителем после доведения рН культуральной жидкости до значения в интервале 2-5 с помощью соляной, фосфорной или серной кислоты или щелочью. В качестве органического растворителя предпочтительно использовать этилацетат или бутиацетат, а в качестве щелочи - гидроокись аммония. Концентрирование экстракта ловастатина желательно проводить при пониженном давлении.It is advisable to extract lovastatin with an organic solvent after adjusting the pH of the culture fluid to a value in the range of 2-5 with hydrochloric, phosphoric or sulfuric acid or with alkali. Ethyl acetate or butyacetate is preferable as an organic solvent, and ammonium hydroxide as an alkali. Concentration of the lovastatin extract is preferably carried out under reduced pressure.
Лактонизацию кислотной формы ловастатина предпочтительно осуществлять в интервале температур 70-75°С при пониженном давлении в отсутствии других реагентов и/или компонентов в реакционной среде.The lactonization of the acid form of lovastatin is preferably carried out in the temperature range of 70-75 ° C under reduced pressure in the absence of other reagents and / or components in the reaction medium.
Однако указанный процесс можно проводить и в токе азота в присутствии дегидратирующих агентов - солей или высокомолекулярных твердых дегидратирующих адсорбентов.However, this process can also be carried out in a stream of nitrogen in the presence of dehydrating agents — salts or high molecular weight solid dehydrating adsorbents.
На первой стадии очистки от примесей - промывании в качестве органического растворителя возможно использование бензола или толуола, а в качестве смеси органических растворителей - смесь неполярного и полярного растворителя. Предпочтительно применение для данной процедуры смеси гексан - этилацетат (3:1), петролейный эфир - этилацетат (4:1), гептан - этилацетат (2:1), гексан - бутилацетат (3:1), петролейный эфир - бутилацетат (4:1), гептан - бутилацетат (2:1) и др.At the first stage of purification from impurities — washing as an organic solvent, it is possible to use benzene or toluene, and as a mixture of organic solvents — a mixture of non-polar and polar solvent. It is preferable to use for this procedure a mixture of hexane - ethyl acetate (3: 1), petroleum ether - ethyl acetate (4: 1), heptane - ethyl acetate (2: 1), hexane - butyl acetate (3: 1), petroleum ether - butyl acetate (4: 1), heptane - butyl acetate (2: 1), etc.
На второй стадии очистки от примесей - осветлении целесообразно использовать в качестве адсорбента окись алюминия или активированный уголь или тот и другой адсорбент последовательно.At the second stage of purification from impurities - clarification, it is advisable to use aluminum oxide or activated carbon or both adsorbent in series as an adsorbent.
Кристаллизацию целевого продукта можно осуществлять из этанола или его водного раствора.Crystallization of the target product can be carried out from ethanol or its aqueous solution.
Техническими результатами заявленных изобретений в части способа лактонизации кислотной формы статинов являются:The technical results of the claimed inventions regarding the method of lactonization of the acid form of statins are:
- практически полное отсутствие в продукте лактонизации примесей в виде димеров, поскольку большая вязкость реакционной среды и кристаллизация из нее лактонов по мере их образования препятствует межмолекулярным взаимодействиям, приводящим к образованию димеров (минимальное содержание димеров в продукте лактонизации составляет 0.13-0.17 мас.% для ловастатина или симвастатина, ЕР 1288212 A1 и 0.06-0.1 мас.% для симвастатина, US 6.562.984 В2);- the almost complete absence of impurities in the form of dimers in the lactonization product, since the high viscosity of the reaction medium and the crystallization of lactones from it prevents formation of intermolecular interactions leading to the formation of dimers (the minimum dimer content in the lactonization product is 0.13-0.17 wt.% for lovastatin or simvastatin, EP 1288212 A1 and 0.06-0.1 wt.% for simvastatin, US 6.562.984 B2);
- протекание реакции практически до конца, что обеспечивает 100%-ный выход лактонной формы статинов вследствие последовательного смещения равновесия в сторону образования лактона по мере его кристаллизации;- the reaction proceeds almost to the end, which provides a 100% yield of the lactone form of statins due to the successive shift of equilibrium towards the formation of lactone as it crystallizes;
- получение лактонной формы статинов по окончании процесса непосредственно в виде кристаллов, вследствие чего исключается необходимость отделения и/или выделения целевого продукта из реакционной смеси;- obtaining the lactone form of statins at the end of the process directly in the form of crystals, which eliminates the need for separation and / or isolation of the target product from the reaction mixture;
- снижение себестоимости продукта лактонизации вследствие исключения расходов на растворители, катализаторы, осадители, дегидратирующие агенты и т.п. и на последующую их утилизацию и/или регенерацию;- reducing the cost of the product of lactonization due to the exclusion of costs for solvents, catalysts, precipitants, dehydrating agents, etc. and their subsequent disposal and / or regeneration;
- производственная и экологическая безопасность процесса вследствие исключения из него органических растворителей, кислот, осадителей и т.п., а также высокотемпературных режимов.- industrial and environmental safety of the process due to the exclusion from it of organic solvents, acids, precipitants, etc., as well as high temperature conditions.
Лактонизацию кислотной формы статинов согласно изобретению проводят в отсутствии растворителя.The lactonization of the acid form of statins according to the invention is carried out in the absence of a solvent.
Процесс лактонизации статинов предпочтительно осуществлять в интервале температур 60-80°С при пониженном давлении в отсутствии других реагентов и/или компонентов в реакционной среде. Однако заявленный способ лактонизации можно проводить и в токе азота в присутствии дегидратирующих агентов - солей или высокомолекулярных твердых дегидратирующих адсорбентов.The process of statin lactonization is preferably carried out in the temperature range of 60-80 ° C under reduced pressure in the absence of other reagents and / or components in the reaction medium. However, the claimed method of lactonization can be carried out in a stream of nitrogen in the presence of dehydrating agents - salts or high molecular weight solid dehydrating adsorbents.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретенийInformation confirming the possibility of carrying out inventions
ПРИМЕР 1EXAMPLE 1
В примере использовали штамм Aspergillus terreus №44-62 (депонирован в коллекции фирмы Меткинен, Литтойнен, Финляндия). Культивирование проводили в биореакторе объемом 10 дм3 с 4,5 дм3 реакционной среды, содержащей углеводы, источники азота (соевую, овсяную муку, пептоны) и неорганические соли. Параметры процесса культивирования: температура 28°С, перемешивание 3,6-13,3 сек-1, аэрация 0,13-0,90 объем/объем/мин, концентрация растворенного кислорода 30%. В процессе ферментации при повышении вязкости культуральной жидкости проводили добавки раствором сахарозы и дистиллированной воды. Длительность процесса составляет 180-240 ч, Культуральная жидкость по окончании процесса ферментации содержит 8,7 г/дм3 ловастатина (сумма кислотной и лактонной форм).In the example used strain Aspergillus terreus No. 44-62 (deposited in the collection of the company Metkinen, Littoynen, Finland). Cultivation was carried out in a 10 dm 3 bioreactor with 4.5 dm 3 of a reaction medium containing carbohydrates, nitrogen sources (soy, oat flour, peptones) and inorganic salts. The cultivation process parameters: temperature 28 ° C, stirring 3.6-13.3 sec -1 , aeration 0.13-0.90 volume / volume / min, the concentration of dissolved oxygen 30%. In the fermentation process, with an increase in the viscosity of the culture fluid, additives were added with a solution of sucrose and distilled water. The duration of the process is 180-240 hours, the culture fluid at the end of the fermentation process contains 8.7 g / DM 3 lovastatin (the sum of the acid and lactone forms).
5 дм3 культуральной жидкости, содержащей 43,5 г ловастатина, подкисляют разбавленной ортофосфорной кислотой до рН 3,5 и выдерживают 30 мин. Биомассу отфильтровывают, промывают подкисленной водой и отжимают. Ловастатин дважды экстрагируют из сырой биомассы этилацетатом. Объединенные этилацетатные экстракты концентрируют упариванием при пониженном давлении. Растворитель отгоняют полностью, остаток прогревают при пониженном давлении и/или в токе азота в течение 3 ч при 70-75°С для полной лактонизации кислотной формы ловастатина. Реакционную массу промывают 80 см3 смеси гексан - этилацетат в соотношении 3:1 для удаления липидов и неполярных примесей. Осадок отфильтровывают и промывают 20 см3 этой же смеси. Полученный технический ловастатин (34,4 г 96% чистоты) растворяют в этилацетате и раствор осветляют, пропуская через слой нейтральной окиси алюминия (150 г) или активированного угля (50 г) или того и другого последовательно. Окись алюминия и/или активированный уголь промывают этилацетатом и объединенные этилацетатные растворы упаривают досуха. Отработанный этилацетат регенерируют и вновь используют для экстракции ловастатина.5 dm 3 of a culture fluid containing 43.5 g of lovastatin is acidified with diluted phosphoric acid to pH 3.5 and incubated for 30 minutes. The biomass is filtered off, washed with acidified water and squeezed. Lovastatin is extracted twice from crude biomass with ethyl acetate. The combined ethyl acetate extracts were concentrated by evaporation under reduced pressure. The solvent is completely distilled off, the residue is heated under reduced pressure and / or in a stream of nitrogen for 3 hours at 70-75 ° C to completely lactonize the acid form of lovastatin. The reaction mass is washed with 80 cm 3 of a mixture of hexane - ethyl acetate in a ratio of 3: 1 to remove lipids and non-polar impurities. The precipitate is filtered off and washed with 20 cm 3 of the same mixture. The obtained technical lovastatin (34.4 g of 96% purity) was dissolved in ethyl acetate and the solution was clarified by passing through a layer of neutral alumina (150 g) or activated carbon (50 g), or both. The alumina and / or activated carbon are washed with ethyl acetate and the combined ethyl acetate solutions are evaporated to dryness. The spent ethyl acetate is regenerated and reused for the extraction of lovastatin.
Получают 33 г ловастатина 98% чистоты. Целевой продукт перекристаллизовывают из водного этанола и сушат. Выход ловастатина составляет 70% (30,4 г), содержание основного вещества (HPLC) - 99,5%. Димеры отсутствуют. Хроматографическая подвижность соединения на пластинах Силуфола (Чехия) в системе хлороформ - ацетон (3:1) Rf~0,45. Структура выделенного вещества - ловастатина подтверждена ЯМР-спектроскопией (фиг.1) и ИК-спектроскопией (фиг.2).Obtain 33 g of lovastatin 98% purity. The expected product is recrystallized from aqueous ethanol and dried. The yield of lovastatin is 70% (30.4 g), the content of the main substance (HPLC) is 99.5%. There are no dimers. Chromatographic mobility of the compound on Silufol plates (Czech Republic) in the chloroform - acetone (3: 1) system R f ~ 0.45. The structure of the selected substance - lovastatin confirmed by NMR spectroscopy (figure 1) and IR spectroscopy (figure 2).
В ультрафиолетовой области спектра для раствора выделенного вещества в метаноле максимумы поглощения наблюдаются при 246,0; 237,5 и 230,0 nm. Для максимума 237,5 nm A1% в метаноле составляет 594.In the ultraviolet region of the spectrum for a solution of the isolated substance in methanol, absorption maxima are observed at 246.0; 237.5 and 230.0 nm. For a maximum of 237.5 nm, A 1 % in methanol is 594.
ПРИМЕР 2EXAMPLE 2
Для биосинтеза ловастатина использовали штамм Aspergillus terreus №43-16 (депонирован в коллекции фирмы Меткинен, Литтойнен, Финляндия). Культуральную жидкость, содержащую ловастатин, получали в биореакторе объемом 10 дм3 с 6 дм3 среды, идентичной среде в примере 1. Процесс ферментации проводили при следующих параметрах: температура 28°С, перемешивание 5,0-14,0 сек-1, аэрация 0,16-10,8 объем/объем/мин, концентрация растворенного кислорода 10%. В процессе ферментации добавляли раствор сахарозы в количестве 20% от объема среды. Длительность процесса составляет 192 ч. Культуральная жидкость по окончании процесса ферментации содержит 8,5 г/дм3 ловастатина (сумма лактонной и кислотной форм).For the biosynthesis of lovastatin, Aspergillus terreus strain No. 43-16 was used (deposited in the collection of Metkinen, Littoynen, Finland). A culture fluid containing lovastatin was obtained in a 10 dm 3 bioreactor with 6 dm 3 of medium identical to the medium in Example 1. The fermentation process was carried out at the following parameters: temperature 28 ° C, stirring 5.0-14.0 sec -1 , aeration 0.16-10.8 volume / volume / min, the concentration of dissolved oxygen is 10%. During the fermentation, a sucrose solution was added in an amount of 20% of the medium volume. The duration of the process is 192 hours. At the end of the fermentation process, the culture fluid contains 8.5 g / dm 3 of lovastatin (the sum of the lactone and acid forms).
5,5 дм3 культуральной жидкости, содержащей 46,75 г ловастатина, подкисляют разбавленной соляной кислотой до рН 4,0. Мицелий отфильтровывают, промывают и отжимают. Ловастатин из мицелия экстрагируют хлороформом. Хлороформенный раствор концентрируют на роторном испарителе. Хлороформ отгоняют полностью, а к остатку добавляют дегидратирующий агент - сульфат магния (7,5 г) или хлорид кальция (6 г) и полученную смесь перемешивают, после чего прогревают при 70-75°С для полной лактонизации кислотной формы ловастатина. Масло с кристаллов сливают, а остаток промывают смесью петролейный эфир - этилацетат в соотношении 4:1. Технический продукт растворяют в хлороформе, фильтруют и фильтрат осветляют, пропуская через слой окиси алюминия или активированного угля. Окись алюминия или активированный уголь промывают хлороформом до полного вымывания ловастатина. Хлороформенные растворы объединяют, растворитель отгоняют. Остаток промывают небольшим количеством гексана, перекристаллизовывают из этанола и сушат. Выход ловастатина составляет 55% (25,7 г) с содержанием основного вещества 99% (HPLC). Содержание димеров не превышает 0,01%. Структура выделенного вещества - ловастатина подтверждена, как указано в примере 1.5.5 dm 3 of a culture fluid containing 46.75 g of lovastatin is acidified with dilute hydrochloric acid to pH 4.0. The mycelium is filtered off, washed and squeezed. Lovastatin from mycelium is extracted with chloroform. The chloroform solution is concentrated on a rotary evaporator. Chloroform is completely distilled off, and a dehydrating agent, magnesium sulfate (7.5 g) or calcium chloride (6 g), is added to the residue, and the resulting mixture is stirred and then heated at 70-75 ° C to completely lactonize the acid form of lovastatin. The oil from the crystals is drained, and the residue is washed with a mixture of petroleum ether - ethyl acetate in a ratio of 4: 1. The technical product is dissolved in chloroform, filtered and the filtrate is clarified by passing through a layer of aluminum oxide or activated carbon. Alumina or activated carbon is washed with chloroform until lovastatin is completely washed out. Chloroform solutions are combined, the solvent is distilled off. The residue was washed with a small amount of hexane, recrystallized from ethanol and dried. The yield of lovastatin is 55% (25.7 g) with a basic substance content of 99% (HPLC). The content of dimers does not exceed 0.01%. The structure of the selected substance - lovastatin is confirmed, as indicated in example 1.
ПРИМЕР 3EXAMPLE 3
В примере использовали штамм Aspergillus terreus №44-62 (депонирован в коллекции фирмы Меткинен, Литтойнен, Финляндия). Культивирование проводили в биореакторе объемом 250 дм3 с 120 дм3 среды, по составу идентичной среде примера 1. Параметры процесса ферментации: температура 28°С, перемешивание 1,6-7,5 сек-1, аэрация 0,08-1,2 объем/объем/мин, концентрация растворенного кислорода 50%. По ходу процесса ферментации проводили добавки раствором сахарозы и дистиллированной воды, общий объем добавок составил 60 дм3. Длительность процесса составляет 216 ч. Культуральная жидкость по окончании процесса содержит 5,1 г/дм3 ловастатина.In the example used strain Aspergillus terreus No. 44-62 (deposited in the collection of the company Metkinen, Littoynen, Finland). Cultivation was carried out in a bioreactor with a volume of 250 dm 3 with 120 dm 3 of medium, identical in composition to the medium of example 1. The parameters of the fermentation process: temperature 28 ° C, mixing 1.6-7.5 sec -1 , aeration 0.08-1.2 volume / volume / min, the concentration of dissolved oxygen is 50%. During the fermentation process, additives were added with a solution of sucrose and distilled water; the total amount of additives was 60 dm 3 . The duration of the process is 216 hours. The culture fluid at the end of the process contains 5.1 g / DM 3 lovastatin.
8 дм3 культуральной жидкости подкисляют разбавленной серной кислотой до рН 2-3 и выдерживают 1 ч. Биомассу отфильтровывают и промывают на фильтре подкисленной водой. Получают 2 кг сырой биомассы, содержащей 40 г ловастатина. Ловастатин дважды экстрагируют из биомассы этилацетатом. Экстракт концентрируют на роторном испарителе до полной отгонки этилацетата. Остаток прогревают при 70-75°С в течение 3 ч. Кристаллы промывают смесью гептан - этилацетат в соотношении 2:1. Технический ловастатин растворяют в этилацетате и полученный раствор осветляют, перемешивая 30 мин со 100 г окиси алюминия и фильтруя через слой окиси алюминия. Осветленный раствор упаривают досуха. Остаток перекристаллизовывают из водного спирта. Получают 25,2 г ловастатина, что составляет 63%. Чистота вещества 99% (HPLC). Димеры отсутствуют. Структура выделенного вещества - ловастатина подтверждена, как указано в примере 1.8 dm 3 of the culture fluid is acidified with diluted sulfuric acid to pH 2-3 and held for 1 hour. The biomass is filtered and washed on the filter with acidified water. Get 2 kg of raw biomass containing 40 g of lovastatin. Lovastatin is extracted twice from biomass with ethyl acetate. The extract was concentrated on a rotary evaporator until complete distillation of ethyl acetate. The residue was heated at 70-75 ° C for 3 hours. The crystals were washed with a heptane-ethyl acetate mixture in a ratio of 2: 1. Technical lovastatin is dissolved in ethyl acetate and the resulting solution is clarified by stirring for 30 minutes with 100 g of aluminum oxide and filtering through a layer of aluminum oxide. The clarified solution was evaporated to dryness. The residue was recrystallized from aqueous alcohol. 25.2 g of lovastatin are obtained, which is 63%. The purity of the substance is 99% (HPLC). There are no dimers. The structure of the selected substance - lovastatin is confirmed, as indicated in example 1.
ПРИМЕР 4EXAMPLE 4
В примере использовали штамм Aspergillus oryzae ATCC 74135.In the example used the strain Aspergillus oryzae ATCC 74135.
Культивирование проводили в биореакторе объемом 10 дм3 с 6 дм3 среды, идентичной среде в примере 1, в условиях, приведенных в примере 2.Cultivation was carried out in a bioreactor with a volume of 10 dm 3 with 6 dm 3 of medium identical to the medium in example 1, under the conditions given in example 2.
Полученную культуральную жидкость (5 л), содержащую 1,3 г/дм3 ловастатина (сумма кислотной и лактонной форм) в фильтрате и 0,12 г/дм3 в мицелии, фильтруют. Мицелий удаляют, а к фильтрату добавляют 2 л бутилацетата и экстрагируют ловастатин в течение 1 ч. Экстракт охлаждают, затем на роторном испарителе растворитель отгоняют полностью при пониженном давлении. Остаток прогревают в течение 3 ч в токе азота при 75°С. Жидкость сливают и оставшиеся кристаллы промывают смесью циклогексана и бензола (10:1). Далее промытые кристаллы перерабатывают, как описано в примере 1.The resulting culture fluid (5 L) containing 1.3 g / dm 3 of lovastatin (the sum of the acid and lactone forms) in the filtrate and 0.12 g / dm 3 in the mycelium is filtered. The mycelium is removed, and 2 L of butyl acetate is added to the filtrate and lovastatin is extracted for 1 hour. The extract is cooled, then the solvent is completely distilled off on a rotary evaporator under reduced pressure. The residue is heated for 3 hours in a stream of nitrogen at 75 ° C. The liquid is drained and the remaining crystals are washed with a mixture of cyclohexane and benzene (10: 1). Next, the washed crystals are processed as described in example 1.
Выход ловастатина в лактонной форме составляет 3,2 г (49%) с чистотой 98,7% (HPLC). Димеры отсутствуют. Структура выделенного вещества - ловастатина подтверждена, как указано в примере 1.The yield of lovastatin in lactone form is 3.2 g (49%) with a purity of 98.7% (HPLC). There are no dimers. The structure of the selected substance - lovastatin is confirmed, as indicated in example 1.
ПРИМЕР 5EXAMPLE 5
В примере использовали лабораторный штамм Aspergillus obscums VJ-1.In the example, a laboratory strain of Aspergillus obscums VJ-1 was used.
Процесс биосинтеза ловастатина проводили, как описано в примере 1. 5 дм3 культуральной жидкости, содержащей 6,5 г ловастатина, подкисляют Н3PO4 до рН 3-5, выдерживают 30 мин и осуществляют двухкратную экстракцию ловастатина толуолом из сырой отжатой биомассы.The process of biosynthesis of lovastatin was carried out as described in example 1. 5 dm 3 of a culture fluid containing 6.5 g of lovastatin, acidified with H 3 PO 4 to pH 3-5, incubated for 30 minutes, and lovastatin was extracted twice with toluene from crude squeezed biomass.
Далее растворитель от экстракта отгоняют полностью и остаток прогревают в течение 6 ч при 60°С при пониженном давлении.Then, the solvent was completely distilled off from the extract, and the residue was heated for 6 hours at 60 ° C under reduced pressure.
От остатка отделяют жидкую фазу и кристаллы промывают смесью толуол-петролейный эфир (1:10).The liquid phase is separated from the residue and the crystals are washed with toluene-petroleum ether (1:10).
Промытые кристаллы перерабатывают, как это описано в примере 1.The washed crystals are processed as described in example 1.
Выход ловастатина составил 5 г (77%) с чистотой 98% (HPLC). Содержание димеров не превышает 0,01%.The yield of lovastatin was 5 g (77%) with a purity of 98% (HPLC). The content of dimers does not exceed 0.01%.
Структура выделенного вещества - ловастатина подтверждена, как указано в примере 1.The structure of the selected substance - lovastatin is confirmed, as indicated in example 1.
ПРИМЕР 6EXAMPLE 6
В примере использовали штамм Aspergillus terreus №44-62 (депонирован в коллекции фирмы Меткинен, Литтойнен, Финляндия). Культивирование проводили в биореакторе объемом 10 дм3 с 6 дм3 среды, идентичной среде в примере 1 в условиях, приведенных в примере 2.In the example used strain Aspergillus terreus No. 44-62 (deposited in the collection of the company Metkinen, Littoynen, Finland). Cultivation was carried out in a bioreactor with a volume of 10 dm 3 with 6 dm 3 of medium identical to the medium in example 1 under the conditions given in example 2.
Культуральная жидкость содержала 8,5 г/дм3 ловастатина (сумма лактонной и кислотной форм).The culture fluid contained 8.5 g / DM 3 lovastatin (the sum of the lactone and acid forms).
К 5,5 дм3 культуральной жидкости, содержащей 46,75 г ловастатина, добавляют 0,5 дм3 10%-ного водного раствора NH3 и экстрагируют в течение 3 ч при комнатной температуре. Затем биомассу отфильтровывают, промывают 0,5%-ным водным раствором NH3 и отжимают.To 5.5 dm 3 of a culture fluid containing 46.75 g of lovastatin, 0.5 dm 3 of a 10% aqueous solution of NH 3 was added and extracted for 3 hours at room temperature. Then the biomass is filtered off, washed with a 0.5% aqueous solution of NH 3 and squeezed.
Экстракт и промывку объединяют и концентрируют упариванием при пониженном давлении до полного удаления воды.The extract and washing are combined and concentrated by evaporation under reduced pressure until the water is completely removed.
Остаток прогревают при пониженном давлении при 70-80°С в течение 3-4 ч для полной лактонизации ловастатина.The residue is heated under reduced pressure at 70-80 ° C for 3-4 hours for complete lactonization of lovastatin.
Жидкость с кристаллов сливают, а кристаллический остаток перерабатывают, как это описано в примере 1.The liquid from the crystals is drained, and the crystalline residue is processed, as described in example 1.
Выход ловастатина составляет 80% (37,4 г) с содержанием основного вещества 98,5% (HPLC). Димеры отсутствуют.The yield of lovastatin is 80% (37.4 g) with a basic substance content of 98.5% (HPLC). There are no dimers.
Структура выделенного вещества - ловастатина подтверждена, как указано в примере 1.The structure of the selected substance - lovastatin is confirmed, as indicated in example 1.
ПРИМЕР 7EXAMPLE 7
Хлороформенный раствор, содержащий ловастатин или симвастатин в кислотной форме, концентрируют в вакууме при 30-40°С. Растворитель отгоняют полностью.The chloroform solution containing lovastatin or simvastatin in acid form is concentrated in vacuo at 30-40 ° C. The solvent is completely distilled off.
Остаток прогревают при пониженном давлении или в токе азота при 70-75°С в течение 2,5 ч. За это время кислота полностью переходит в лактон (контроль методом ТСХ на пластинах силикагеля в системе хлороформ - ацетон 3:1; Rf лактона 0,45-0,50; Rf кислоты 0,15-0,20). Образование димера не более 0,01% (HPLC).The residue is heated under reduced pressure or in a stream of nitrogen at 70-75 ° C for 2.5 hours. During this time, the acid completely passes into lactone (TLC control on silica gel plates in a chloroform - acetone 3: 1 system; R f of lactone 0 , 45-0.50; R f acid 0.15-0.20). Dimer formation not more than 0.01% (HPLC).
Лактоны статинов по окончании процесса получают в кристаллическом виде.Statin lactones at the end of the process are obtained in crystalline form.
ПРИМЕР 8EXAMPLE 8
Этилацетатный раствор, содержащий ловастатин или симвастатин в кислотной форме, концентрируют в вакууме при 40-45°С. Растворитель отгоняют полностью, а остаток прогревают при пониженном давлении и/или в токе азота при 65-70°С в течение 3 ч. Кислота полностью трансформируется в лактон (контроль методом ТСХ, как указано в примере 7). Образование димеров не наблюдается (HPLC). Лактоны статинов по окончании процесса получают в кристаллическом виде.An ethyl acetate solution containing lovastatin or simvastatin in acid form is concentrated in vacuo at 40-45 ° C. The solvent is completely distilled off, and the residue is heated under reduced pressure and / or in a stream of nitrogen at 65-70 ° C for 3 hours. The acid is completely transformed into lactone (control by TLC, as described in example 7). No dimer formation is observed (HPLC). Statin lactones at the end of the process are obtained in crystalline form.
ПРИМЕР 9EXAMPLE 9
2 г аммонийной соли ловастатина или симвастатина (99% чистоты, HPLC) нагревают при пониженном давлении и/или в токе азота при 70-80°С в течение 3-4 ч.2 g of the ammonium salt of lovastatin or simvastatin (99% pure, HPLC) is heated under reduced pressure and / or in a stream of nitrogen at 70-80 ° C for 3-4 hours.
По окончании процесса получают 1,82 г ловастатина или 1,83 г симвастатина в лактонной форме в кристаллическом виде с чистотой 99% (HPLC).At the end of the process, 1.82 g of lovastatin or 1.83 g of simvastatin in lactone form are obtained in crystalline form with a purity of 99% (HPLC).
Примеси кислотной формы статинов, а также димеров отсутствуют (контроль методом ТСХ, как указано в примере 7; HPLC).There are no impurities of the acid form of statins, as well as dimers (TLC control, as described in Example 7; HPLC).
ПРИМЕР 10EXAMPLE 10
2 г аммонийной соли ловастатина или симвастатина (95% чистоты, HPLC) нагревают при 70-80°С в течение 3-4 ч в присутствии дегидратирующего агента - сульфата магния (0,4 г) или сульфата натрия (0,4 г) или хлорида кальция (0,3 г).2 g of the ammonium salt of lovastatin or simvastatin (95% purity, HPLC) is heated at 70-80 ° C for 3-4 hours in the presence of a dehydrating agent - magnesium sulfate (0.4 g) or sodium sulfate (0.4 g) or calcium chloride (0.3 g).
Реакционную массу перекристаллизовывают из этанола. Получают 1,38 г ловастатина или 1,40 г симвастатина в лактонной форме с чистотой 99,9% (HPLC).The reaction mass is recrystallized from ethanol. 1.38 g of lovastatin or 1.40 g of simvastatin are obtained in lactone form with a purity of 99.9% (HPLC).
Образование димеров не наблюдается (HPLC), кислотная форма отсутствует (контроль методом ТСХ).No dimer formation was observed (HPLC), no acid form (TLC control).
Claims (48)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2003130693/13A RU2261901C2 (en) | 2003-10-17 | 2003-10-17 | Fungus strain aspergillus terreus 44-62 as producer of lovastatin, industrial method for isolation of lovastatin and method for lactoninization of statins |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2003130693/13A RU2261901C2 (en) | 2003-10-17 | 2003-10-17 | Fungus strain aspergillus terreus 44-62 as producer of lovastatin, industrial method for isolation of lovastatin and method for lactoninization of statins |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2003130693A RU2003130693A (en) | 2005-06-27 |
| RU2261901C2 true RU2261901C2 (en) | 2005-10-10 |
Family
ID=35836280
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2003130693/13A RU2261901C2 (en) | 2003-10-17 | 2003-10-17 | Fungus strain aspergillus terreus 44-62 as producer of lovastatin, industrial method for isolation of lovastatin and method for lactoninization of statins |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2261901C2 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2320713C1 (en) * | 2006-06-13 | 2008-03-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Сириус" | Strain acremonium species g25 as producer of complex of biologically active compounds |
| RU2522806C1 (en) * | 2012-11-27 | 2014-07-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Центр "Биоинженерия" Российской академии наук | Improved method of purification of pravastatin |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5362638A (en) * | 1992-02-10 | 1994-11-08 | Dahiya Jagroop S | Fungal strains and use thereof in antibiotic production |
| RU93004784A (en) * | 1992-02-10 | 1996-03-10 | Новофарм Лимитед | METHOD OF OBTAINING LOVASTATIN, STRAINS |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SI9800046A (en) * | 1998-02-18 | 1999-08-31 | LEK, tovarna farmacevtskih in kemi�nih izdelkov, d.d. | Process for obtaining of HMG-CoA reductase inhibitors of high purity |
-
2003
- 2003-10-17 RU RU2003130693/13A patent/RU2261901C2/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5362638A (en) * | 1992-02-10 | 1994-11-08 | Dahiya Jagroop S | Fungal strains and use thereof in antibiotic production |
| RU93004784A (en) * | 1992-02-10 | 1996-03-10 | Новофарм Лимитед | METHOD OF OBTAINING LOVASTATIN, STRAINS |
| RU2000124064A (en) * | 1998-02-18 | 2002-10-20 | Лек Фармасьютикал Энд Кемикал Компани Д.Д. | METHOD FOR PRODUCING HMG-COA-HIGH PURITY PERIODIC INHIBITORS |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2320713C1 (en) * | 2006-06-13 | 2008-03-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Сириус" | Strain acremonium species g25 as producer of complex of biologically active compounds |
| RU2522806C1 (en) * | 2012-11-27 | 2014-07-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Центр "Биоинженерия" Российской академии наук | Improved method of purification of pravastatin |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2003130693A (en) | 2005-06-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0702679B1 (en) | Process for the isolation of lovastatin | |
| FI66427B (en) | FOERFARANDE FOER FRAMSTAELLNING AV EN NY SOM CEILING MODEL | |
| FI67231C (en) | FRAMEWORK FOR HYPOKOLESTEREMISK FOERENING | |
| WO1994029292A9 (en) | Process for the isolation of lovastatin | |
| US6268186B1 (en) | HMG-CoA reductase inhibitor preparation process | |
| US20030215932A1 (en) | Process for the isolation of lovastatin | |
| IE51477B1 (en) | Hydrogenation products of mevinolin and dihydromevinolin a process for preparing the same and an antihypercholesterolemic pharmaceutical composition containing the same | |
| RU2261901C2 (en) | Fungus strain aspergillus terreus 44-62 as producer of lovastatin, industrial method for isolation of lovastatin and method for lactoninization of statins | |
| EP1265884A1 (en) | A process for purifying lovastatin and simvastatin with reduced levels of dimeric impurities | |
| NL8204904A (en) | DIHYDRO- AND TETRAHYDROMONACOLIN L, METAL SALTS AND ALKYL ESTERS, AND METHOD FOR PREPARING THE SAME. | |
| WO2008092950A1 (en) | Fermentation process for preparing pravastatin | |
| WO2001081611A1 (en) | A novel process for the manufacture and purification of compactin | |
| US7566792B2 (en) | Method for the manufacture of Lovastatin | |
| JPH06256278A (en) | Optically active alpha-carbamoylalkanoic acid derivative and its production | |
| JPH07145161A (en) | New sesquiterpene derivative | |
| WO2018218903A1 (en) | Method for preparing troxerutin ester using whole cell catalysis | |
| JPH0717957A (en) | Novel physiologically active substance pf1131 and production thereof | |
| JPS5840475B2 (en) | New physiologically active substance ML-236A and its manufacturing method | |
| CN103910776B (en) | A kind of spirolactone derivative and microbial transformation preparation method thereof and application | |
| JPS6113798B2 (en) | ||
| JPS5889187A (en) | No14-a substance and its preparation | |
| JPH0767668A (en) | Wb968 substance group and its production | |
| JP2002255969A (en) | Novel physiologically active substance FO-7711 CD4 and / or CD6 and methods for producing them | |
| AU2001241833A2 (en) | A process for purifying lovastatin and simvastatin with reduced levels of dimeric impurities | |
| JPS6320215B2 (en) |