RU2245923C2 - Method for determination of anti-lactoferrin activity in microorganisms - Google Patents
Method for determination of anti-lactoferrin activity in microorganisms Download PDFInfo
- Publication number
- RU2245923C2 RU2245923C2 RU2003106561/13A RU2003106561A RU2245923C2 RU 2245923 C2 RU2245923 C2 RU 2245923C2 RU 2003106561/13 A RU2003106561/13 A RU 2003106561/13A RU 2003106561 A RU2003106561 A RU 2003106561A RU 2245923 C2 RU2245923 C2 RU 2245923C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- lactoferrin
- microorganisms
- activity
- control
- experimental
- Prior art date
Links
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 67
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 51
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 30
- 230000000356 anti-lactoferrin effect Effects 0.000 title claims abstract description 28
- CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N l-phenylalanyl-l-lysyl-l-cysteinyl-l-arginyl-l-arginyl-l-tryptophyl-l-glutaminyl-l-tryptophyl-l-arginyl-l-methionyl-l-lysyl-l-lysyl-l-leucylglycyl-l-alanyl-l-prolyl-l-seryl-l-isoleucyl-l-threonyl-l-cysteinyl-l-valyl-l-arginyl-l-arginyl-l-alanyl-l-phenylal Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N 0.000 claims abstract description 90
- 102000010445 Lactoferrin Human genes 0.000 claims abstract description 82
- 108010063045 Lactoferrin Proteins 0.000 claims abstract description 82
- 235000021242 lactoferrin Nutrition 0.000 claims abstract description 81
- 229940078795 lactoferrin Drugs 0.000 claims abstract description 81
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 28
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 22
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 15
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 239000013068 control sample Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 14
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims description 12
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 abstract description 12
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 abstract description 9
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 9
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 abstract description 4
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 abstract description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 abstract 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000011158 quantitative evaluation Methods 0.000 abstract 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 12
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 10
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 241001354013 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis Species 0.000 description 7
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 7
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 7
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 7
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 4
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 4
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 4
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 4
- 241000191963 Staphylococcus epidermidis Species 0.000 description 4
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 4
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 4
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 3
- 241000191938 Micrococcus luteus Species 0.000 description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 3
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 3
- 241000588777 Providencia rettgeri Species 0.000 description 3
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 3
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 3
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 3
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 3
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 3
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 101000798114 Homo sapiens Lactotransferrin Proteins 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010039438 Salmonella Infections Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 102000050459 human LTF Human genes 0.000 description 2
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 206010039447 salmonellosis Diseases 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 230000031068 symbiosis, encompassing mutualism through parasitism Effects 0.000 description 2
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000186000 Bifidobacterium Species 0.000 description 1
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 1
- 101710141836 DNA-binding protein HU homolog Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 241000588749 Klebsiella oxytoca Species 0.000 description 1
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000192041 Micrococcus Species 0.000 description 1
- 101710174628 Modulating protein YmoA Proteins 0.000 description 1
- 208000031858 Periproctitis Diseases 0.000 description 1
- 241000607762 Shigella flexneri Species 0.000 description 1
- 241000192087 Staphylococcus hominis Species 0.000 description 1
- 241000191973 Staphylococcus xylosus Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000002924 anti-infective effect Effects 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001420 bacteriolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- -1 complement Proteins 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 239000003041 laboratory chemical Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в лабораториях научно-исследовательских институтов, а также в бактериологических лабораториях клинических учреждений, занимающихся вопросами определения персистентных характеристик микроорганизмов для установления их этиологической значимости при патологических процессах.The invention relates to microbiology and can be used in laboratories of research institutes, as well as in bacteriological laboratories of clinical institutions involved in determining the persistent characteristics of microorganisms to establish their etiological significance in pathological processes.
В настоящее время характер течения большинства инфекций изменился в сторону увеличения доли затяжных и хронических форм [1]. Длительное переживание бактерий в организме хозяина (бактерионосительство), а также переход инфекционного процесса в хроническую форму обеспечивают механизмы персистенции микроорганизмов, заключающиеся в инактивации/деградации факторов естественной противоинфекционной резистентности: лизоцима, комплемента, интерферона, тромбоцитарного катионного белка, лактоферрина [2].Currently, the nature of the course of most infections has changed in the direction of increasing the proportion of protracted and chronic forms [1]. The long-term experience of bacteria in the host’s body (carriage of carriers), as well as the transition of the infectious process to a chronic form, are ensured by the mechanisms of persistence of microorganisms, which include inactivation / degradation of factors of natural anti-infection resistance: lysozyme, complement, interferon, platelet cationic protein, lactoferrin [2].
Установлено, что природный гликопротеин лактоферрин является одним из важнейших компонентов биохимической защиты человека и животных: обладает бактериостатическим и бактерицидным действием, принимает участие в процессах местной защиты большинства барьерных эпителиев респираторного, мочеполового, пищеварительного трактов, в регуляции гуморальных и клеточных иммунологических реакций, гемопоэза, влияет на систему комплемента, регулирует гранулоцитопоэз [3].It has been established that natural glycoprotein lactoferrin is one of the most important components of the biochemical protection of humans and animals: it has a bacteriostatic and bactericidal effect, takes part in the processes of local protection of the majority of barrier epitheliums of the respiratory, genitourinary, digestive tracts, and in the regulation of humoral and cellular immunological reactions, hematopoiesis, and on the complement system, regulates granulocytopoiesis [3].
Известен способ определения антилактоферриновой активности микроорганизмов (АЛфА), заключающийся в том, что исследуемую культуру микроорганизмов выращивают в жидкой питательной среде, выросшие культуры обрабатывают хлороформом, отделяют супернатант и смешивают его с лактоферрином, параллельно с опытной готовят две контрольные пробы, при этом в контроль 1 вместо супернатанта исследуемых культур микроорганизмов добавляют жидкую питательную среду, а контроль 2 готовят из забуференного физиологического раствора и жидкой питательной среды, опытную и контрольные пробы инкубируют, после инкубации добавляют тест-культуру Micrococcus luteus ГИСК №211001 и проводят первое измерение оптической плотности в опыте и контролях непосредственно по достижении режима термостатирования (37°С) и второе измерение через 18-24 часа инкубации, затем рассчитывают АЛфА по изменению оптических плотностей в опыте и контролях [4].A known method for determining the antilactoferrin activity of microorganisms (ALphA) is that the studied microorganism culture is grown in a liquid nutrient medium, the grown cultures are treated with chloroform, the supernatant is separated and mixed with lactoferrin, and two control samples are prepared in parallel with the experimental one, while control 1 instead of the supernatant of the studied cultures of microorganisms, a liquid nutrient medium is added, and control 2 is prepared from buffered saline and liquid nutrient medium After the incubation, the test culture Micrococcus luteus GISK No. 211001 is added and the first measurement of optical density in the experiment and controls is carried out immediately after reaching the temperature control mode (37 ° C) and the second measurement after 18-24 hours of incubation, then ALFA is calculated from the change in optical densities in the experiment and controls [4].
Однако указанный способ имеет ряд существенных недостатков. Известный способ является качественным и не позволяет выразить уровень антилактоферриновой активности в абсолютных величинах, что является важным в эколого-эпидемиологических исследованиях, поскольку по уровню количественных значений секретируемых факторов персистенции микроорганизмов, направленных на инактивацию факторов естественной резистентности, штаммы микроорганизмов, выделенные из разных источников (внешняя среда, больные, бактерионосители, здоровые люди и. т.д.), существенно отличаются [2]. Определение количественных значений АЛфА различных микроорганизмов позволит установить этиологическую значимость их при патологических процессах, изучить роль АЛфА в механизмах персистенции и формировании бактерионосительства.However, this method has several significant disadvantages. The known method is qualitative and does not allow to express the level of antilactoferrin activity in absolute terms, which is important in environmental and epidemiological studies, since, according to the level of quantitative values of secreted factors of persistence of microorganisms aimed at inactivation of factors of natural resistance, strains of microorganisms isolated from different sources (external environment, patients, bacteria carriers, healthy people, etc.), differ significantly [2]. Determination of the quantitative values of ALphA of various microorganisms will make it possible to establish their etiological significance in pathological processes, to study the role of ALphA in persistence mechanisms and the formation of bacterial carriage.
Кроме того, инкубация супернатантов, а не живых культур микроорганизмов с лактоферрином значительно снижает частоту выявления АЛфА бактерий, поскольку в первом случае могут быть обнаружены только конститутивные ингибиторы лактоферрина. Вместе с тем, для экспрессии многих белков бактерий требуется культивирование живых микроорганизмов в среде, содержащей субстрат или индуктор, что невозможно при инкубировании лактоферрина с супернатантами микроорганизимов.In addition, incubation of supernatants rather than living cultures of microorganisms with lactoferrin significantly reduces the detection rate of ALFA bacteria, since in the first case only constitutive lactoferrin inhibitors can be detected. However, the expression of many bacterial proteins requires the cultivation of living microorganisms in a medium containing a substrate or inducer, which is impossible when incubating lactoferrin with supernatants of microorganisms.
Другим существенным недостатком данного способа является то, что использование живой индикаторной культуры М.luteus не позволяет определить антилактоферриновую активность у штаммов микроорганизмов, продуцирующих лизоцим [5], гистоноподобные белки [6], перекись водорода, другие антагонистически активные вещества, что характерно для таких микроорганизмов как бифидобактерии, лактобациллы, стрептококки, синегнойная палочка и др., поскольку эти биологически активные вещества могут оказывать антимикробное действие на микрококк (бактериолитическое, бактерицидное и др.). Вместе с тем, супернатанты исследуемых микроорганизмов могут стимулировать рост индикаторной культуры, что приводит к ложноположительным результатам [7]. Обработка культур микроорганизмов хлороформом приводит к высвобождению некоторых бактериальных пигментов, что искажает результаты определения антилактоферриновой активности [8].Another significant drawback of this method is that the use of live indicator culture of M. luteus does not allow determination of antilactoferrin activity in strains of microorganisms producing lysozyme [5], histone-like proteins [6], hydrogen peroxide, and other antagonistically active substances, which is typical for such microorganisms like bifidobacteria, lactobacilli, streptococci, Pseudomonas aeruginosa, etc., since these biologically active substances can have an antimicrobial effect on micrococcus (bacteriolytic eskoe, bactericidal, etc.). At the same time, supernatants of the studied microorganisms can stimulate the growth of indicator culture, which leads to false positive results [7]. Treatment of microorganism cultures with chloroform leads to the release of some bacterial pigments, which distorts the results of determination of antilactoferrin activity [8].
Задачей заявляемого способа определения антилактоферриновой активности микроорганизмов является повышение чувствительности способа и точности количественной оценки АЛфА.The objective of the proposed method for determining the antilactoferrin activity of microorganisms is to increase the sensitivity of the method and the accuracy of the quantitative assessment of alpha.
Для решения указанной задачи в заявляемом способе определения АЛфА исследуемую культуру микроорганизмов выращивают на плотной питательной среде, из выросшей агаровой культуры готовят микробную взвесь, смешивают ее с лактоферрином, параллельно готовят контроль, при этом в контроль вместо микробной взвеси добавляют жидкую питательную среду, опытную пробу и контроль инкубируют, отделяют супернатант от бактериальных клеток центрифугированием, определяют концентрацию лактоферрина в опытной и контрольной пробах иммуноферментным анализом и затем рассчитывают АЛфА по формулеTo solve this problem, in the claimed method for determining ALFA, the studied culture of microorganisms is grown on a solid nutrient medium, a microbial suspension is prepared from the grown agar culture, mixed with lactoferrin, a control is prepared in parallel with this, instead of a microbial suspension, a liquid nutrient medium, an experimental sample are added to the control and the control is incubated, the supernatant is separated from the bacterial cells by centrifugation, the concentration of lactoferrin in the experimental and control samples is determined by enzyme immunoassay and m is then calculated by the formula ALfA
АЛфА=Ск-Со,ALFA = Sk-Co,
где АЛфА - антилактоферриновая активность, нг инактивированного лактоферрина/мл супернатанта;where ALfa - antilactoferrin activity, ng inactivated lactoferrin / ml supernatant;
Ск - концентрация лактоферрина в контроле, нг/мл;Ck is the concentration of lactoferrin in the control, ng / ml;
Со - концентрация лактоферрина в опыте, нг/мл.Co is the concentration of lactoferrin in the experiment, ng / ml.
Новыми признаками заявляемого способа являются:New features of the proposed method are:
- исследуемую культуру микроорганизмов выращивают на плотной питательной среде, из выросшей агаровой культуры готовят микробную взвесь;- the studied culture of microorganisms is grown on a solid nutrient medium, a microbial suspension is prepared from the grown agar culture;
- инкубируют микробную взвесь, приготовленную из агаровой культуры, с лактоферрином; параллельно с опытной пробой инкубируют контрольную пробу, приготовленную из жидкой питательной среды и лактоферрина;- incubate microbial suspension prepared from agar culture with lactoferrin; in parallel with the experimental sample, a control sample prepared from a liquid nutrient medium and lactoferrin is incubated;
- остаточную концентрацию лактоферрина в опытной и контрольной пробах определяют иммуноферментным анализом;- the residual concentration of lactoferrin in the experimental and control samples is determined by enzyme immunoassay;
- рассчитывают антилактоферриновую активность по формуле- calculate antilactoferrin activity according to the formula
АЛфА=Ск-Со,ALFA = Sk-Co,
где АЛфА - антилактоферриновая активность, нг инактивированного лактоферрина/мл супернатанта;where ALfa - antilactoferrin activity, ng inactivated lactoferrin / ml supernatant;
Ск - концентрация лактоферрина в контроле, нг/мл;Ck is the concentration of lactoferrin in the control, ng / ml;
Со - концентрация лактоферрина в опыте, нг/мл.Co is the concentration of lactoferrin in the experiment, ng / ml.
Новая совокупность признаков позволяет при осуществлении заявляемого изобретения получить новый технический результат, который состоит в том, что предлагаемый способ определения антилактоферриновой активности микроорганизмов позволяет за счет увеличения его чувствительности и повышения точности количественной оценки АЛфА микроорганизмов определять количественные значения данного признака у более широкого спектра микроорганизмов. Также способ позволяет по различию в уровне количественных значений АЛфА микроорганизмов осуществлять диагностику и прогнозирование заболеваний микробной этиологии, проводить эколого-эпидемиологические исследования, оценивать эффективность влияния лекарственных препаратов на данный признак.A new set of features allows the implementation of the claimed invention to obtain a new technical result, which consists in the fact that the proposed method for determining the antilactoferrin activity of microorganisms allows, by increasing its sensitivity and increasing the accuracy of the quantitative assessment of ALFA of microorganisms, to determine the quantitative values of this trait in a wider range of microorganisms. Also, the method allows for the difference in the level of quantitative values of ALFA of microorganisms to diagnose and predict diseases of microbial etiology, conduct environmental and epidemiological studies, evaluate the effectiveness of the influence of drugs on this trait.
Известно использование реагентов для количественного иммуноферментного определения лактоферрина в сыворотке крови [9].It is known to use reagents for the quantitative enzyme-linked immunosorbent assay for serum lactoferrin [9].
Использование реагентов для иммуноферментного определения лактоферрина с целью выявления АЛфА микроорганизмов в источниках патентной и научно-технической литературы не обнаружено.The use of reagents for enzyme immunoassay for the determination of lactoferrin in order to detect ALFA microorganisms in the sources of patent and scientific literature was not found.
Авторами экспериментально установлено, что при инкубировании лактоферрина с живыми культурами микроорганизмов определение АЛфА более достоверно по сравнению с тем, если инкубацию лактоферрина достоверно по сравнению с тем, если инкубацию лактоферрина проводить с их супернатантами.The authors experimentally established that when incubating lactoferrin with live cultures of microorganisms, the determination of ALphA is more reliable compared to if incubation of lactoferrin is reliable compared to incubation of lactoferrin with their supernatants.
Проводились следующие эксперименты.The following experiments were carried out.
В опытной серии первую партию культур микроорганизмов Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis, Salmonella enteritidis выращивали на мясопептонном агаре при температуре 37°С в течение 24 ч, готовили их взвесь в мясопептонном бульоне (109 КОЕ/мл). Далее первую партию взвесей в равных объемах смешивали с лактоферрином в концентрации 100 нг/мл. Вторую партию этих же культур одновременно с первой выращивали в мясопептонном бульоне в течение 24 ч при температуре 37°С, далее супернатант отделяли от бактериальных клеток центрифугированием в течение 20 мин (8000 об/мин) и смешивали с лактоферрином в концентрации 100 мг/мл. Параллельно и для первой и для второй партий культур микроорганизмов готовили контрольные пробы из питательного бульона и лактоферрина в той же концентрации, что использовали в опытных пробах. Опытные и контрольные пробы обеих партий исследуемых культур микроорганизмов инкубировали в течение суток при температуре 37°С и центрифугировали в течение 20 мин (8000 об/мин), получали бесклеточные супернатанты, в которых иммуноферментным анализом (ИФА) с использованием реагентов для количественного определения лактоферрина (ЗАО “Вектор-Бест”) с измерением оптической плотности (ОП492) фотометром Multiskan Labsystems (Финляндия) и последующим перерасчетом по калибровочному графику определяли концентрацию лактоферрина в опытных и контрольных пробах. По разнице концентраций лактоферрина в опыте и контроле определяли инактивацию лактоферрина и судили об антилактоферриновой активности микроорганизмов.In the experimental series, the first batch of cultures of Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis, Salmonella enteritidis microorganisms was grown on meat and peptone agar at 37 ° C for 24 h, and suspension was prepared in meat and peptone broth (10 9 CFU / ml). Next, the first batch of suspensions in equal volumes was mixed with lactoferrin at a concentration of 100 ng / ml. The second batch of the same cultures was grown simultaneously in the meat and peptone broth for 24 h at 37 ° C, then the supernatant was separated from the bacterial cells by centrifugation for 20 min (8000 rpm) and mixed with lactoferrin at a concentration of 100 mg / ml. In parallel, for the first and second lots of cultures of microorganisms, control samples were prepared from nutrient broth and lactoferrin in the same concentration that was used in the experimental samples. Experimental and control samples of both batches of the studied cultures of microorganisms were incubated during the day at 37 ° C and centrifuged for 20 min (8000 rpm), cell-free supernatants were obtained, in which enzyme immunoassay (ELISA) using reagents for quantitative determination of lactoferrin ( ZAO "Vector-Best") with the measurement of optical density (OD 492) photometer Multiskan Labsystems (Finland) and the subsequent recalculation of the calibration curve, the concentration of lactoferrin in test and control pro ah. The inactivation of lactoferrin was determined by the difference in the concentrations of lactoferrin in the experiment and control and the antilactoferrin activity of microorganisms was judged.
Определили, что инкубированная с лактоферрином живая культура Е.coli инактивировала 4,18±0,77 нг/мл лактоферрина, а при инкубации с лактоферрином супернатанта культуры Е.coli лактоферрин не инактивировался. Соответственно живая культура S.enteritidis инактивировала 7,92±1,06 нг/мл лактоферрина, а ее супернатант - 3,06±0,11 нг/мл лактоферрина. Живая культура S.epidermidis инактивировала 2,40±0,09 нг/мл лактоферрина, а ее супернатант не инактивировал лактоферрин.It was determined that the live E. coli culture incubated with lactoferrin inactivated 4.18 ± 0.77 ng / ml lactoferrin, while lactoferrin did not inactivate when incubated with lactoferrin the culture supernatant of E. coli. Accordingly, the living culture of S.enteritidis inactivated 7.92 ± 1.06 ng / ml of lactoferrin, and its supernatant 3.06 ± 0.11 ng / ml of lactoferrin. The live culture of S.epidermidis inactivated 2.40 ± 0.09 ng / ml lactoferrin, and its supernatant did not inactivate lactoferrin.
Это подтверждает то, что определение способности микроорганизмов к инактивации лактоферрина при инкубации лактоферрина с супернатантами микроорганизмов менее достоверно по сравнению с тем, если инкубацию лактоферрина проводить с живыми культурами микроорганизмов.This confirms that the determination of the ability of microorganisms to inactivate lactoferrin during incubation of lactoferrin with supernatants of microorganisms is less reliable compared to incubation of lactoferrin with live cultures of microorganisms.
Существуют различные методы определения лактоферрина в сыворотке крови человека, из которых наиболее часто используются ИФА [9] и иммунодиффузионные методы, в частности метод радиальной иммунодиффузии (РИД) по Манчини [10] с использованием, например, моноспецифической антисыворотки к лактоферрину, выпускаемой 000 “Микрофлора” при МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского (г.Москва). Однако по чувствительности метод РИД значительно уступает ИФА (соответственно 3 мкг/мл и 1 нг/мл) [10].There are various methods for the determination of lactoferrin in human blood serum, of which ELISA [9] and immunodiffusion methods are most often used, in particular, the Mancini method of radial immunodiffusion (RID) [10] using, for example, monospecific antisera to lactoferrin manufactured by 000 “Microflora ”At MNIIEM them. G.N.Gabrichevsky (Moscow). However, in sensitivity, the RID method is significantly inferior to ELISA (3 μg / ml and 1 ng / ml, respectively) [10].
Авторами были проведены исследования для сравнения способности к инактивации лактоферрина 11 культур микроорганизмов из коллекции Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН (г.Оренбург) с использованием метода ИФА и РИД для определения остаточной концентрации лактоферрина и расчета АЛфА. Результаты исследований приведены в таблице 1.The authors conducted studies to compare the ability to inactivate lactoferrin of 11 cultures of microorganisms from the collection of the Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences (Orenburg) using the ELISA and RID methods to determine the residual concentration of lactoferrin and to calculate ALFA. The research results are shown in table 1.
Как видно из табл.1, при использовании ИФА способность к инактивации лактоферрина была выявлена у 10 из 11 культур микроорганизмов (что составило 90,9%) и диапазон количественных изменений инактивированного лактоферрина составил 0-17,3 нг/мл. При использовании РИД у всех исследуемых культур не удалось обнаружить АЛфА из-за низкой, по сравнению с ИФА, чувствительности данного метода.As can be seen from Table 1, when using ELISA, the ability to inactivate lactoferrin was detected in 10 of 11 cultures of microorganisms (which amounted to 90.9%) and the range of quantitative changes in inactivated lactoferrin was 0-17.3 ng / ml. When using RID in all studied cultures, it was not possible to detect ALFA due to the low sensitivity of this method compared to ELISA.
Это подтверждает, что используемый авторами в заявляемом способе ИФА для определения остаточной концентрации лактоферрина и расчета АЛфА микроорганизмов благодаря уникальной специфичности иммунохимического анализа в сочетании с высокой чувствительностью детекции ферментативной метки [11] позволяет с высокой точностью количественно оценивать антилактоферриновую активность микроорганизмов.This confirms that the ELISA used by the authors in the claimed method for determining the residual concentration of lactoferrin and calculating ALFA of microorganisms due to the unique specificity of immunochemical analysis in combination with high sensitivity of the detection of the enzymatic label [11] allows highly accurate quantification of the antilactoferrin activity of microorganisms.
Антилактоферриновая активность микроорганизмов при различных методах выявления количества инактивированного лактоферринаTable 1.
Antilactoferrin activity of microorganisms with various methods for detecting the amount of inactivated lactoferrin
Авторами для инкубации микробной взвеси с лактоферрином использовалась концентрация лактоферрина 100 нг/мл. Выбор данной концентрации определялся тем, что наиболее воспроизводимые результаты в ИФА могут быть получены при использовании средних концентраций лактоферрина, определяемых с используемыми реагентами ИФА [11]. Учитывая, что диапазон определяемых концентраций лактоферрина с используемыми реагентами ИФА (ЗАО “Вектор-Бест”, Россия) составлял 0-120 нг/мл, то средние значения концентрации лактоферрина составляют 60-100 нг/мл. В дальнейшем авторами экспериментально была выбрана концентрация лактоферрина 100 нг/мл, которая не подавляет рост исследуемых микроорганизмов (таблица 2).The authors used a lactoferrin concentration of 100 ng / ml to incubate the microbial suspension with lactoferrin. The choice of this concentration was determined by the fact that the most reproducible results in ELISA can be obtained using average concentrations of lactoferrin determined with the ELISA used [11]. Given that the range of determined concentrations of lactoferrin with the ELISA used (Vector-Best CJSC, Russia) was 0-120 ng / ml, the average concentration of lactoferrin is 60-100 ng / ml. Further, the authors experimentally selected a concentration of lactoferrin of 100 ng / ml, which does not inhibit the growth of the studied microorganisms (table 2).
Как видно из таблицы 2, концентрации лактоферрина более высокие, чем 100 нг/мл оказывали бактериостатическое действие, а лактоферрин в концентрации 100 нг/мл и в меньших концентрациях не влиял на рост бактерий. Это подтверждает обоснованность выбора данной концентрации лактоферрина для изучения АЛфА микроорганизмов иммуноферментным анализом.As can be seen from table 2, the concentration of lactoferrin higher than 100 ng / ml had a bacteriostatic effect, and lactoferrin at a concentration of 100 ng / ml and in lower concentrations did not affect the growth of bacteria. This confirms the validity of the choice of a given concentration of lactoferrin for the study of ALFA microorganisms by enzyme immunoassay.
Чувствительность микроорганизмов к лактоферринуTable 2.
The sensitivity of microorganisms to lactoferrin
Для осуществления способа используется человеческий лактоферрин, кристаллический, производства фирмы "Fluka" (Швейцария), степень чистоты препарата (по данным гель-электорофореза) более 90%, растворимость 1 мг/мл Н2О, по каталогу №61326 [12].To implement the method, human lactoferrin, crystalline, manufactured by Fluka (Switzerland) is used, the purity of the preparation (according to gel electrophoresis) is more than 90%, solubility is 1 mg / ml H 2 O, according to catalog No. 61326 [12].
Способ осуществляется следующим образом.The method is as follows.
1. Исследуемые культуры микроорганизмов выращивают на плотной питательной среде при 37°С в течение 18-24 ч.1. The studied cultures of microorganisms are grown in solid nutrient medium at 37 ° C for 18-24 hours
2. Из выросшей агаровой культуры готовят взвесь микроорганизмов (10 ед. по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Л.А.Тарасовича) в жидкой питательной среде (для каждого вида микроорганизмов используется соответствующий тип питательной среды).2. A suspension of microorganisms is prepared from the grown agar culture (10 units according to the optical turbidity standard of the GISK named after L. Tarasovich) in a liquid nutrient medium (the corresponding type of nutrient medium is used for each type of microorganism).
3. Готовят раствор лактоферрина в концентрации 100 нг/мл на забуференном физиологическом растворе (Sigma, P4417. Состав: 0.01 М фосфатный буфер, 0.0027 М КСl, 0.137 М NaCl, pH 7,4 при 25°С).3. Prepare a solution of lactoferrin at a concentration of 100 ng / ml in buffered saline (Sigma, P4417. Composition: 0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M KCl, 0.137 M NaCl, pH 7.4 at 25 ° C).
4. Взвесь исследуемых культур микроорганизмов объемом 50 мкл вносят в лунки стерильного полистиролового планшета и смешивают с 50 мкл приготовленного раствора лактоферрина.4. A suspension of the investigated cultures of microorganisms with a volume of 50 μl is added to the wells of a sterile polystyrene tablet and mixed with 50 μl of the prepared lactoferrin solution.
5. Параллельно с опытной готовят контрольную пробу: в лунки полистиролового планшета вносят 50 мкл раствора лактоферрина и 50 мкл стерильной жидкой питательной среды.5. In parallel with the experimental, a control sample is prepared: 50 μl of a solution of lactoferrin and 50 μl of a sterile liquid nutrient medium are added to the wells of a polystyrene tablet.
6. Пробы инкубируют при 37°С в течение 18-24 ч.6. Samples are incubated at 37 ° C for 18-24 hours.
7. После инкубации содержимое лунок переносят в пластиковые пробирки, центрифугируют при 8000 об/мин в течение 20 мин, отбирают 50 мкл супернатанта в опытной и контрольной пробах.7. After incubation, the contents of the wells are transferred into plastic tubes, centrifuged at 8000 rpm for 20 minutes, 50 μl of the supernatant in the experimental and control samples are taken.
8. Рабочим раствором буфера опытную и контрольную пробы разводят в 5 раз (до объема 250 мкл).8. The test and control samples are diluted 5 times with a buffer solution (to a volume of 250 μl).
9. Проводят определение остаточной концентрации лактоферрина в супернатанте опытной и контрольной проб твердофазным иммуноферментным анализом с использованием реагентов ЗАО “ВЕКТОР-БЕСТ” (Россия) в соответствии с инструкцией по использованию реагентов. Измерение оптической плотности опытной и контрольной проб проводится на фотометре Multiskan Labsystems (Финляндия) при длине волны 492 нм, перерасчет концентрации лактоферрина осуществляется путем построения калибровочных графиков. Найденные по графику значения концентрации лактоферрина умножают на коэффициент разведения проб, т.е. на 5, и получают результат в нг/мл.9. Determine the residual concentration of lactoferrin in the supernatant of the experimental and control samples by enzyme-linked immunosorbent assay using reagents ZAO "VECTOR-BEST" (Russia) in accordance with the instructions for use of reagents. The optical density of the experimental and control samples is measured on a Multiskan Labsystems photometer (Finland) at a wavelength of 492 nm, the lactoferrin concentration is recalculated by constructing calibration plots. The lactoferrin concentrations found on the graph are multiplied by the dilution factor of the samples, i.e. by 5, and get the result in ng / ml.
10. Рассчитывают антилактоферриновую активность по формуле10. Calculate antilactoferrin activity according to the formula
АЛфА=Ск-Со,ALFA = Sk-Co,
где АЛфА - антилактоферриновая активность, нг инактивированного лактоферрина/мл супернатанта;where ALfa - antilactoferrin activity, ng inactivated lactoferrin / ml supernatant;
Ск - концентрация лактоферрина в контроле, нг/мл;Ck is the concentration of lactoferrin in the control, ng / ml;
Со - концентрация лактоферрина в опыте, нг/мл.Co is the concentration of lactoferrin in the experiment, ng / ml.
Антилактоферриновую активность выражают в нг инактивированного лактоферрина на мл супернатанта (нг/мл).Antilactoferrin activity is expressed in ng of inactivated lactoferrin per ml of supernatant (ng / ml).
Пример 1. У штамма Providencia rettgeri, выделенного от больного с парапроктитом, была изучена способность инактивировать лактоферрин. Для этого из суточной агаровой культуры была приготовлена взвесь 10 ед. по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича в жидкой питательной среде, 50 мкл взвеси культуры вносили в лунку стерильного полистиролового планшета, далее в лунку вносили 50 мкл раствора лактоферрина в концентрации 100 нг/мл. В контрольной пробе вместо культуры микроорганизма в лунку вносили 50 мкл жидкой питательной среды. После 18 ч инкубации при 37°С содержимое каждой лунки переносили в пластиковые пробирки, супернатант отделяли от бактериальных клеток центрифугированием в течение 20 мин (8000 об/мин). Далее из каждой пробы отбиралось по 50 мкл супернатанта и определялось в нем содержание лактоферрина иммуноферментным анализом согласно инструкции, прилагаемой к набору реагентов ЗАО “ВЕКТОР-БЕСТ” (Россия). Регистрацию результатов проводили фотометрически на фотометре Multiskan Labsystems (Финляндия) при длине волны 492 нм. Были получены следующие значения оптической плотности опытной пробы -0,144 и контрольной -0,350. Концентрацию лактоферрина в опытной и в контрольной пробах рассчитывали по калибровочному графику исходя из значений оптической плотности проб. Для построения его использовали бланк, прилагаемый к набору: ось абсцисс - концентрация ЛФ в калибровочных пробах (120 нг/мл, 60 нг/мл, 30 нг/мл, 15 нг/мл, 7,5 нг/мл, 0 нг/мл); ось ординат - соответствующее значение оптической плотности (ОП492). Были получены следующие значения концентрации лактоферрина в опытной пробе -15,12 нг/мл и в контрольной пробе - 36,75 нг/мл. Антилактоферриновую активность (АЛфА) рассчитывали по формулеExample 1. In a strain of Providencia rettgeri isolated from a patient with paraproctitis, the ability to inactivate lactoferrin was studied. For this, a suspension of 10 units was prepared from daily agar culture. according to the optical turbidity standard GISK im. L.A. Tarasevich in a liquid nutrient medium, 50 μl of a suspension of culture was introduced into a well of a sterile polystyrene tablet, then 50 μl of a solution of lactoferrin at a concentration of 100 ng / ml was added to the well. In the control sample, instead of the microorganism culture, 50 μl of a liquid nutrient medium was added to the well. After 18 h of incubation at 37 ° C, the contents of each well were transferred into plastic tubes, the supernatant was separated from the bacterial cells by centrifugation for 20 min (8000 rpm). Then, 50 μl of the supernatant was taken from each sample and the lactoferrin content in it was determined by enzyme immunoassay according to the instructions attached to the reagent kit of CJSC “VECTOR-BEST” (Russia). The results were recorded photometrically using a Multiskan Labsystems photometer (Finland) at a wavelength of 492 nm. The following absorbance values were obtained for the experimental sample —0.144 and the control —0.350. The concentration of lactoferrin in the experimental and control samples was calculated according to the calibration graph based on the values of the optical density of the samples. To build it, we used the form attached to the kit: abscissa axis — LF concentration in calibration samples (120 ng / ml, 60 ng / ml, 30 ng / ml, 15 ng / ml, 7.5 ng / ml, 0 ng / ml ); the ordinate axis is the corresponding value of optical density (OD 492 ). The following lactoferrin concentrations were obtained in the experimental sample — 15.12 ng / ml and in the control sample — 36.75 ng / ml. Antilactoferrin activity (ALPA) was calculated by the formula
АЛфА=36,75-15,12=21,63 нг/мл,ALPA = 36.75-15.12 = 21.63 ng / ml,
где 21,63 - антилактоферриновая активность, нг инактивированного лактоферрина/мл супернатанта;where 21.63 - antilactoferrin activity, ng of inactivated lactoferrin / ml supernatant;
36,75 - значение концентрации лактоферрина в нг/мл в контроле;36.75 - the value of the concentration of lactoferrin in ng / ml in the control;
15,12 - значение концентрации лактоферрина в нг/мл в опыте. Таким образом, антилактоферриновая активность штамма Providencia rettgeri составляет 21,63 нг/мл.15,12 - the value of the concentration of lactoferrin in ng / ml in the experiment. Thus, the antilactoferrin activity of the Providencia rettgeri strain is 21.63 ng / ml.
Пример 2. У 63 штаммов микроорганизмов из коллекции Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН (г.Оренбург) была определена антилактоферриновая активность с использованием заявляемого способа и способа-прототипа.Example 2. In 63 strains of microorganisms from the collection of the Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis, Ural Branch of the Russian Academy of Sciences (Orenburg), antilactoferrin activity was determined using the proposed method and the prototype method.
При использовании способа-прототипа исследуемые культуры микроорганизмов выращивали в жидкой питательной среде, выросшие культуры обрабатывали хлороформом, отделяли супернатант и смешивали его с лактоферрином, параллельно с опытной готовили две контрольные пробы, при этом в контроль 1 вместо супернатанта исследуемых культур микроорганизмов добавляли жидкую питательную среду, а контроль 2 готовили из забуференного физиологического раствора и жидкой питательной среды, опытную и контрольные пробы инкубировали, после инкубации добавляли тест-культуру Micrococcus luteus ГИСК №211001 и проводили первое измерение оптической плотности в опыте и контролях непосредственно по достижении режима термостатирования (37°С) и второе измерение через 24 ч инкубации, затем рассчитывали антилактоферриновую активность по изменению оптических плотностей в опыте и контролях. При использовании заявляемого способа исследуемые культуры микроорганизмов выращивали на плотной питательной среде, из выросших агаровых культур готовили микробную взвесь, смешивали ее с лактоферрином, параллельно готовили контроль, при этом в контроль вместо микробной взвеси добавляли жидкую питательную среду, опытную пробу и контроль инкубировали, отделяли супернатант от бактериальных клеток центрифугированием, определяли концентрацию лактоферрина в опытной и контрольной пробах иммуноферментным анализом и затем рассчитывали антилактоферриновую активность по разнице остаточной концентрации лактоферрина в опыте и контроле. Сравнительный анализ результатов определения АЛфА микроорганизмов данными способами представлен в таблице 3.Using the prototype method, the studied cultures of microorganisms were grown in a liquid nutrient medium, the grown cultures were treated with chloroform, the supernatant was separated and mixed with lactoferrin, two control samples were prepared in parallel with the experimental one, while in control 1, instead of the supernatant of the studied cultures of microorganisms, a liquid nutrient medium was added, and control 2 was prepared from buffered saline and liquid nutrient medium, the experimental and control samples were incubated, after incubation, adding whether the test culture of Micrococcus luteus GISK No. 2111001 and the first measurement of optical density in the experiment and controls was carried out immediately after reaching the temperature control mode (37 ° C) and the second measurement after 24 hours of incubation, then antilactoferrin activity was calculated by the change in optical densities in the experiment and controls. When using the proposed method, the studied cultures of microorganisms were grown on a solid nutrient medium, microbial suspension was prepared from the grown agar cultures, mixed with lactoferrin, a parallel control was prepared, while instead of a microbial suspension, a liquid nutrient medium was added to the control, the experimental sample and control were incubated, the supernatant was separated from bacterial cells by centrifugation, the concentration of lactoferrin in the experimental and control samples was determined by enzyme immunoassay and then tilactoferrin activity according to the difference in the residual concentration of lactoferrin in the experiment and control. A comparative analysis of the results of the determination of ALFA microorganisms by these methods is presented in table 3.
Как видно из таблицы 3, использование заявляемого способа позволило выявить АЛфА у 100% штаммов исследуемых микроорганизмов, а в способе-прототипе - только у 68,5% исследуемых штаммов.As can be seen from table 3, the use of the proposed method allowed to detect ALFA in 100% of the strains of the studied microorganisms, and in the prototype method, only 68.5% of the studied strains.
Кроме того, в заявляемом способе уровень выявляемой АЛфА микроорганизмов был выше, чем способом-прототипом: для штаммов S. aureus, не продуцирующих лизоцим - 35,6% в заявляемом способе против 24,3% в способе-прототипе; для Е.coli соответственно 59,65% против 44,7%; для К. pneumoniae соответственно 47,77% против 29,3%; для S. typhimurium соответственно 75,0% против 48,5%.In addition, in the claimed method, the level of detectable ALFA microorganisms was higher than the prototype method: for S. aureus strains not producing lysozyme - 35.6% in the present method versus 24.3% in the prototype method; for E. coli, respectively, 59.65% versus 44.7%; for K. pneumoniae, respectively, 47.77% versus 29.3%; for S. typhimurium, respectively, 75.0% versus 48.5%.
Сравнительный анализ чувствительности определения АЛФА микроорганизмов с использованием заявляемого способа и способа-прототипаTable 3.
A comparative analysis of the sensitivity of the determination of ALFA of microorganisms using the proposed method and the prototype method
Использование заявляемого способа позволило выявить и диапазон количественных значений лактоферрина, инактивированного исследуемыми микроорганизмами, и составивший 5,98-22,9 нг/мл (таблица 3), что невозможно определить способом-прототипом.Using the proposed method allowed to identify the range of quantitative values of lactoferrin inactivated by the studied microorganisms, and amounted to 5.98-22.9 ng / ml (table 3), which cannot be determined by the prototype method.
Пример 3.Example 3
У 12 штаммов S.enteritidis, выделенных от больных сальмонеллезом и у 8 штаммов S.enteritidis, выделенных от реконвалесцентных сальмонеллезных бактерионосителей была определена АЛфА заявляемым способом. Было установлено, что средний уровень количества инактивируемого лактоферрина у штаммов, выделенных от реконвалесцентных сальмонеллезных бактерионосителей, составил 9,52±0,98 нг/мл, а у штаммов, выделенных от больных сальмонеллезом -5,98±0,61 нг/мл. Это показывает, что от сальмонеллезных бактерионосителей выделяются штаммы с более высоким уровнем АЛфА, чем от больных сальмонеллезом.In 12 strains of S.enteritidis isolated from patients with salmonellosis and in 8 strains of S.enteritidis isolated from convalescent salmonella bacteria, ALfa was determined by the claimed method. It was found that the average level of the amount of inactivated lactoferrin in strains isolated from salvella salmonella bacteria was 9.52 ± 0.98 ng / ml, and in strains isolated from salmonella patients it was -5.98 ± 0.61 ng / ml. This shows that from salmonella bacteria carriers strains with a higher level of ALFA are distinguished than from patients with salmonellosis.
Тем самым заявляемый способ позволяет дифференцировать исследуемые культуры микроорганизмов по количественным значениям уровня АЛфА, что важно для установления этиологической значимости этого свойства микроорганизмов при патологических процессах.Thus, the inventive method allows to differentiate the studied cultures of microorganisms by quantitative values of the level of alpha, which is important for establishing the etiological significance of this property of microorganisms in pathological processes.
Таким образом, использование предлагаемого способа определения антилактоферриновой активности микроорганизмов позволяет за счет увеличения чувствительности способа и повышения точности количественной оценки определять ее у более широкого круга микроорганизмов и с большей точностью, что актуально при диагностике и прогнозировании заболеваний микробной этиологии, проведении эколого-эпидемиологических исследований.Thus, the use of the proposed method for determining the antilactoferrin activity of microorganisms allows, by increasing the sensitivity of the method and increasing the accuracy of quantitative assessment, to determine it in a wider range of microorganisms and with greater accuracy, which is relevant for the diagnosis and prognosis of diseases of microbial etiology, environmental and epidemiological studies.
Источники информацииSources of information
1. Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я. Бактерионосительство (медико-экологический аспект). - Екатеринбург: УрО РАН, 1996. - С.207.1. Bukharin OV, Usvyatsov B.Ya. Carrier carrier (medical-ecological aspect). - Yekaterinburg: Ural Branch of the Russian Academy of Sciences, 1996. - P.207.
2. Бухарин О.В. Усвяцов Б.Я. Карташова О.Л. Биология патогенных кокков. - М.: Медицина, 2002. - С.38-48.2. Bukharin OV Usvyatsov B.Ya. Kartashova O.L. Biology of pathogenic cocci. - M .: Medicine, 2002. - P.38-48.
3. Brock J.H. The physiology oflactoferrin //Biochem. Cell Biol. - 2002. - V.80, №1. - P.1-6.3. Brock J.H. The physiology oflactoferrin // Biochem. Cell Biol. - 2002. - V.80, No. 1. - P.1-6.
4. Патент РФ №2156807, МПК 7 С 12 Q 1/02, 1/04, публ.27.09.00 (прототип).4. RF patent No. 2156807, IPC 7 C 12 Q 1/02, 1/04, publ. 27.09.00 (prototype).
5. Бухарин О.В., Васильев H.В., Усвяцов Б.Я. Лизоцим микроорганизмов. - Томск: Изд-во Томского ун-та, 1984. - С.17.5. Bukharin O. V., Vasiliev H. V., Usvyatsov B. Ya. Lysozyme of microorganisms. - Tomsk: Publishing house of Tomsk University, 1984. - P.17.
6. Заявка №2001133150/13 от 06.12.01, МПК 7 С 12 Q 1/02, положительное решение от 30.09.02.6. Application No. 20011133150/13 dated 06.12.01, IPC 7 C 12 Q 1/02, positive decision dated 30.09.02.
7. Патент РФ №№2175673, МПК 7 C 12 Q 1/04, 1/14, публ. 10.11.01.7. RF patent No. 2175673, IPC 7 C 12 Q 1/04, 1/14, publ. 11/10/01.
8. Смирнов В.В., Киприанова Е.А. Бактерии рода Pseudomonas. -Киев: Наукова думка, 1990. - С.106-108.8. Smirnov V.V., Kiprianova E.A. Bacteria of the genus Pseudomonas. -Kiev: Naukova Dumka, 1990 .-- P.106-108.
9. Немцева Е.Р. и др. Иммуноферментный метод определения лактоферрина человека и его использование для диагностики гнойно-септических осложнений //Вопросы медицинской химии. 1995. Т.41. №3. - С.58-61.9. Nemtseva E.R. and other Immunoenzyme method for determining human lactoferrin and its use for the diagnosis of purulent-septic complications // Questions of medical chemistry. 1995.Vol. 41. No. 3. - S. 58-61.
10. Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник под редакцией В.В. Меньшикова. - М.: Медицина, 1987. - 365 с.10. Laboratory research methods in the clinic. Handbook edited by V.V. Menshikov. - M.: Medicine, 1987 .-- 365 p.
11. Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа. - М.: Высш. шк., 1991. - С.3.11. Egorov A.M., Osipov A.P., Dzantiev B.B., Gavrilova E.M. Theory and practice of enzyme immunoassay. - M .: Higher. Shk., 1991 .-- P.3.
12. Каталог фирмы "Fluka"(chemical company): Laboratory chemicals. - 2001/2002. - С.860.12. Catalog of the company "Fluka" (chemical company): Laboratory chemicals. - 2001/2002. - S.860.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2003106561/13A RU2245923C2 (en) | 2003-03-12 | 2003-03-12 | Method for determination of anti-lactoferrin activity in microorganisms |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2003106561/13A RU2245923C2 (en) | 2003-03-12 | 2003-03-12 | Method for determination of anti-lactoferrin activity in microorganisms |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2003106561A RU2003106561A (en) | 2003-08-10 |
| RU2245923C2 true RU2245923C2 (en) | 2005-02-10 |
Family
ID=35208985
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2003106561/13A RU2245923C2 (en) | 2003-03-12 | 2003-03-12 | Method for determination of anti-lactoferrin activity in microorganisms |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2245923C2 (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2126051C1 (en) * | 1997-01-27 | 1999-02-10 | Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения РАН | Method of determining antilysozyme activity of microorganisms |
| RU2132879C1 (en) * | 1998-04-27 | 1999-07-10 | Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения РАН | Method of determining anticarnosine activity of microorganisms |
| RU2156807C2 (en) * | 1999-08-16 | 2000-09-27 | Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН | Method of determination of antilactoferrin activity in microorganisms |
-
2003
- 2003-03-12 RU RU2003106561/13A patent/RU2245923C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2126051C1 (en) * | 1997-01-27 | 1999-02-10 | Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения РАН | Method of determining antilysozyme activity of microorganisms |
| RU2132879C1 (en) * | 1998-04-27 | 1999-07-10 | Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения РАН | Method of determining anticarnosine activity of microorganisms |
| RU2156807C2 (en) * | 1999-08-16 | 2000-09-27 | Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН | Method of determination of antilactoferrin activity in microorganisms |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Taylor-Robinson et al. | A colour test for the measurement of antibody to certain mycoplasma species based upon the inhibition of acid production | |
| ES2625632T3 (en) | Method for rapid determination of the susceptibility or resistance of bacteria to antibiotics | |
| Colomer-Winter et al. | Biofilm assays on fibrinogen-coated silicone catheters and 96-well polystyrene plates | |
| US20180195964A1 (en) | Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing Based on a Unique Spectral Intensity Ratio Analysis via Single Fluorescence Membrane Dye Staining and Flow Cytometry | |
| BR112019021943B1 (en) | Methods to simultaneously determine the antibiotic susceptibilities of a mixed population of bacteria in samples | |
| US10995358B2 (en) | Rapid antibiotic susceptibility test using membrane fluorescence staining and spectral intensity ratio improved by flow cytometry dead to live population ratio | |
| US20130316333A1 (en) | Method for Detecting and Quantifying Microorganisms | |
| WO1996028570A1 (en) | A rapid method of and diagnostic kit for the detection of microorganisms | |
| US11327079B2 (en) | Direct detection of the active form of beta-lactam-hydrolysing enzymes by using mass spectrophotometry | |
| RU2245923C2 (en) | Method for determination of anti-lactoferrin activity in microorganisms | |
| Ali et al. | Study of Phenotypic and Genotypic Factors of Staphylococcus aureus Clinical Local Isolates | |
| RU2156807C2 (en) | Method of determination of antilactoferrin activity in microorganisms | |
| Spink et al. | Para-aminobenzoic acid production by staphylococci | |
| RU2245922C2 (en) | Method for detecting hospital strains | |
| JP2010523120A (en) | Method and apparatus for detecting erythromycin-induced clindamycin resistance | |
| JP4777898B2 (en) | Rapid assay based on peptidoglycan for detection of contamination in platelets | |
| RU2761096C2 (en) | Maldi-tof mass spectrometric method for determining microorganism resistance to antibacterial preparations | |
| Shrestha et al. | In-vitro evaluation of biofilm and hemolysis activity of candida albicans isolated from oral cavity | |
| RU2287824C2 (en) | METHOD OF DETECTING NON-CULTIVATED CULTURES OF Vibrio cholerae O1 AND O139 SEROUS-GROUPS AND PREDICTING THEIR POTENTIAL CAPABILITY TO REVERSION | |
| Zaky et al. | Detection of methicillin resistance of Staphylococcus aureus among Minia University Hospital patients | |
| RU2686337C1 (en) | Method of determining antimicrobial activity of whole serum and fraction of its antimicrobial peptides | |
| Lertcanawanichakul et al. | In-vitro Anti-food poisoning bacteria and cytotoxic activities of bioactive compounds produced by Streptomyces sp. A10 isolated from fermented food | |
| RU2315113C2 (en) | Method for diagnosis of sensitivity of mycobacterium tuberculosis to antituberculosis preparations | |
| RU2236465C2 (en) | Method for assay of anti-immunoglobulin activity of microorganisms | |
| JPS60224068A (en) | Method for deciding pathogenic bacterium in opportunistic infection |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20050313 |