RU2244004C2 - Способ получения инозина и 5'-инозиновой кислоты, штамм escherichia coli - продуцент инозина - Google Patents
Способ получения инозина и 5'-инозиновой кислоты, штамм escherichia coli - продуцент инозина Download PDFInfo
- Publication number
- RU2244004C2 RU2244004C2 RU2002104464/13A RU2002104464A RU2244004C2 RU 2244004 C2 RU2244004 C2 RU 2244004C2 RU 2002104464/13 A RU2002104464/13 A RU 2002104464/13A RU 2002104464 A RU2002104464 A RU 2002104464A RU 2244004 C2 RU2244004 C2 RU 2244004C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- inosine
- protein
- bacterium
- escherichia coli
- activity
- Prior art date
Links
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 title claims abstract description 53
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 title claims abstract description 53
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 title claims abstract description 53
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims abstract description 27
- GRSZFWQUAKGDAV-KQYNXXCUSA-N IMP Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 GRSZFWQUAKGDAV-KQYNXXCUSA-N 0.000 title claims abstract description 17
- GRSZFWQUAKGDAV-UHFFFAOYSA-N Inosinic acid Natural products OC1C(O)C(COP(O)(O)=O)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 GRSZFWQUAKGDAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 16
- 235000013902 inosinic acid Nutrition 0.000 title claims abstract description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 89
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 55
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 26
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 39
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 33
- HRYKDUPGBWLLHO-UHFFFAOYSA-N 8-azaadenine Chemical compound NC1=NC=NC2=NNN=C12 HRYKDUPGBWLLHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 16
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 14
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 10
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 7
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 claims description 7
- 230000000865 phosphorylative effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000007792 addition Methods 0.000 claims description 5
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 claims description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 18
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 abstract description 2
- 101100052574 Bacillus subtilis (strain 168) ydeD gene Proteins 0.000 abstract 1
- 101100117976 Escherichia coli (strain K12) eamA gene Proteins 0.000 abstract 1
- 230000003028 elevating effect Effects 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 46
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 21
- 101150005558 ydeD gene Proteins 0.000 description 21
- 239000002212 purine nucleoside Substances 0.000 description 20
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 19
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 17
- MRWXACSTFXYYMV-FDDDBJFASA-N nebularine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC=C2N=C1 MRWXACSTFXYYMV-FDDDBJFASA-N 0.000 description 13
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 11
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical class N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 9
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 7
- -1 trialose Chemical compound 0.000 description 7
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 6
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 6
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 6
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 108010011356 Nucleoside phosphotransferase Proteins 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 4
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 4
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 4
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 4
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 4
- PQGCEDQWHSBAJP-TXICZTDVSA-N 5-O-phosphono-alpha-D-ribofuranosyl diphosphate Chemical compound O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)O[C@@H]1COP(O)(O)=O PQGCEDQWHSBAJP-TXICZTDVSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 3
- QQXCTYKJKDIJTK-HHNQKGMTSA-N C[C@H]1CN[C@]2(C[C@H]3O[C@]4(CC(=C)[C@H]5O[C@](O)(C[C@H](O)[C@@H]5C)[C@H](O)[C@@H]5C[C@H]6O[C@@]7(CC[C@]8(CC(C)=C[C@H](O8)\C=C\CCC(O)=O)O7)[C@H](C)C[C@H]6O5)C[C@@H](C)C[C@@H](O4)[C@H]3O2)[C@@H](C)C1 Chemical compound C[C@H]1CN[C@]2(C[C@H]3O[C@]4(CC(=C)[C@H]5O[C@](O)(C[C@H](O)[C@@H]5C)[C@H](O)[C@@H]5C[C@H]6O[C@@]7(CC[C@]8(CC(C)=C[C@H](O8)\C=C\CCC(O)=O)O7)[C@H](C)C[C@H]6O5)C[C@@H](C)C[C@@H](O4)[C@H]3O2)[C@@H](C)C1 QQXCTYKJKDIJTK-HHNQKGMTSA-N 0.000 description 3
- UBORTCNDUKBEOP-UHFFFAOYSA-N L-xanthosine Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC(=O)NC2=O)=C2N=C1 UBORTCNDUKBEOP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101800000628 PDH precursor-related peptide Proteins 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UBORTCNDUKBEOP-HAVMAKPUSA-N Xanthosine Natural products O[C@@H]1[C@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1N1C(NC(=O)NC2=O)=C2N=C1 UBORTCNDUKBEOP-HAVMAKPUSA-N 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 3
- RQFCJASXJCIDSX-UUOKFMHZSA-N guanosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O RQFCJASXJCIDSX-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 3
- 235000013928 guanylic acid Nutrition 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 3
- 101150076045 purF gene Proteins 0.000 description 3
- 101150106935 purR gene Proteins 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- UBORTCNDUKBEOP-UUOKFMHZSA-N xanthosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(NC(=O)NC2=O)=C2N=C1 UBORTCNDUKBEOP-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 3
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 2
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N D-gluconic acid Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- 108010001139 Inosine kinase Proteins 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 101150072043 deoD gene Proteins 0.000 description 2
- 101150090240 edd gene Proteins 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000001320 lysogenic effect Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 2
- 101150053253 pgi gene Proteins 0.000 description 2
- RLOWWWKZYUNIDI-UHFFFAOYSA-N phosphinic chloride Chemical compound ClP=O RLOWWWKZYUNIDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150002764 purA gene Proteins 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000002213 purine nucleotide Substances 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- IJROUPFSQHMOBK-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidine 2-nitrosoguanidine Chemical compound NC(=N)NN=O.O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O IJROUPFSQHMOBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WTLKTXIHIHFSGU-UHFFFAOYSA-N 2-nitrosoguanidine Chemical compound NC(N)=NN=O WTLKTXIHIHFSGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710169336 5'-deoxyadenosine deaminase Proteins 0.000 description 1
- BIRSGZKFKXLSJQ-SQOUGZDYSA-N 6-Phospho-D-gluconate Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O BIRSGZKFKXLSJQ-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 1
- 102000055025 Adenosine deaminases Human genes 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 101100052578 Bacillus subtilis (strain 168) ydeF gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000736839 Chara Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N D-gluconic acid Natural products OCC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 1
- 101100248359 Escherichia coli (strain K12) rhtA gene Proteins 0.000 description 1
- 101100052577 Escherichia coli (strain K12) ydeE gene Proteins 0.000 description 1
- 241000660147 Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655 Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- 102000005731 Glucose-6-phosphate isomerase Human genes 0.000 description 1
- 108010070600 Glucose-6-phosphate isomerase Proteins 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000588772 Morganella morganii Species 0.000 description 1
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-N Nitrous acid Chemical compound ON=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 1
- 101710101148 Probable 6-oxopurine nucleoside phosphorylase Proteins 0.000 description 1
- 102000030764 Purine-nucleoside phosphorylase Human genes 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108010045605 Xanthosine phosphorylase Proteins 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- LIPOUNRJVLNBCD-UHFFFAOYSA-N acetyl dihydrogen phosphate Chemical compound CC(=O)OP(O)(O)=O LIPOUNRJVLNBCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- OFBHPPMPBOJXRT-VWJPMABRSA-N adenylosuccinic acid Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O)=C2N=C1 OFBHPPMPBOJXRT-VWJPMABRSA-N 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940045686 antimetabolites antineoplastic purine analogs Drugs 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- 210000003578 bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000001530 fumaric acid Substances 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000000174 gluconic acid Substances 0.000 description 1
- 235000012208 gluconic acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 229910001410 inorganic ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052816 inorganic phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 101150074910 isdH gene Proteins 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 229910001437 manganese ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 description 1
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 description 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229940076266 morganella morganii Drugs 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229940083251 peripheral vasodilators purine derivative Drugs 0.000 description 1
- CMPQUABWPXYYSH-UHFFFAOYSA-N phenyl phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=CC=C1 CMPQUABWPXYYSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920000137 polyphosphoric acid Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 101150042478 punA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 101150117659 rhtA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 description 1
- BRBKOPJOKNSWSG-UHFFFAOYSA-N sulfaguanidine Chemical compound NC(=N)NS(=O)(=O)C1=CC=C(N)C=C1 BRBKOPJOKNSWSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004257 sulfaguanidine Drugs 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 101150074058 tarB gene Proteins 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Инозин, а также 5’-инозиновую кислоту получают с использованием бактерий Escherichia coli, при этом продукция инозина указанными бактериями увеличена за счет увеличения активности белка, кодируемого геном ydeD. Данное изобретение позволяет увеличить выход инозина и 5’-инозиновой кислоты. 3 с. и 5 з.п. ф-лы, 2 табл., 3 ил.
Description
Область техники.
Настоящее изобретение относится к способу получения инозина, являющегося важным исходным реагентом для синтеза 5'-инозиновой кислоты (инозин-5’-фосфата) и к новому микроорганизму, используемому для его продукции.
Предшествующий уровень техники
Традиционно нуклеозиды получают в промышленном масштабе методом ферментации с использованием штаммов микроорганизмов, ауксотрофных по аденину, или этих штаммов, которым дополнительно придана устойчивость к различным соединениям, таким как аналоги пуринов и сульфагуанидин, при этом указанные штаммы принадлежат к роду Bacillus (патентные заявки Японии №38-23039 (1963), 54-17033 (1979), 55-2956 (1980) и 55-45199 (1980), выложенная патентная заявка Японии 56-162998 (1981), патентные заявки Японии 57-14160 (1982) и 57-41915 (1982), выложенная патентная заявка Японии 59-42895 (1984), к роду Brevibacterium (патентные заявки Японии №51-5075 (1976) и 58-17592 (1983), и Agric. Biol. Chem., 42, 399 (1978)), к роду Escherichia (заявка РСТ WO 9903988) и подобные им.
Получение указанных мутантных штаммов обычно состоит из обработки микроорганизмов с целью получения мутаций, такой как облучение УФ-излучением или обработка нитрозогуанидином (N-метил-N’-нитро-N-нитрозогуанидин) с последующей селекцией нужного штамма на подходящей питательной среде для селекции. С другой стороны, также практикуется выращивание мутантных штаммов, принадлежащих к роду Bacillus (выложенные патентные заявки Японии №58-158197 (1983), 58-175493 (1983), 59-28470 (1984), 60-156388 (1985), 1-27477 (1989), 1-174385 (1989), 3-58787 (1991), 3-164185 (1991), 5-84067 (1993) и 5-192164(1993)) к роду Brevibacterium (выложенная патентная заявка Японии 63-248394 (1988)) и к роду Escherichia (заявка WO 9903988), полученных с использованием методов генной инженерии.
Продуктивность штаммов - продуцентов инозина далее может быть улучшена путем увеличения способности к экскреции инозина. В настоящее время общепризнанно, что проникновение метаболитов через цитоплазматическую мембрану обычно происходит с участием более или менее специфических транспортных белков, осуществляющих их выброс (Рао et al, 1998, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 62, 1-34; Paulsen et al, 1998, J. Mol. Biol., 277, 573-592; Saier et al, 1999, J. Mol. Microbiol. Biotechnol., 1, 257-279). Ранее авторы настоящего изобретения показали, что штаммы - продуценты инозина или ксантозина, принадлежащие к роду Escherichia и к роду Bacillus и обладающие повышенной активностью белка RhtA, кодируемого геном rhtA (ybiF), продуцировали больше инозина или ксантозина, чем родительские штаммы (патентная заявка РФ №2002101666).
Ранее было показано, что ген ydeD вовлечен в выброс из клеток метаболитов пути биосинтеза цистеина (DaBler et al., Mol. Microbiol., 36, 1101-1112, 2000; US 5972663). Ген ydeD известен как предполагаемая трансмембранная субъединица, кодирующая белок с неизвестной функцией (нуклеотиды с 1618262 по 1619062 в последовательности с инвентарным номером NC_000913, gi: 16129492 в базе данных GenBank).
Описание изобретения
Целью настоящего изобретения является увеличение продуктивности инозина штаммами-продуцентами инозина и предоставление способа получения инозина и 5’-инозиновой кислоты с использованием указанных штаммов.
Данная цель была достигнута путем установления того факта, что ген ydeD, предположительно кодирующий мембранный белок, не вовлеченный в пути биосинтеза пуриновых нуклеозидов, придает устойчивость к аналогу пуриновых оснований, 8-азааденину, в случае, когда природный аллель указанного гена введен в клетки штамма на многокопийной плазмиде. Более того, ген ydeD может увеличивать продукцию нуклеозидов в случае, когда его дополнительные копии введены в клетки соответствующих продуцентов инозина, принадлежащих к роду Escherichia. Таким образом было совершено настоящее изобретение.
Таким образом, настоящее изобретение предоставляет микроорганизм, принадлежащий к роду Escherichia, обладающий способностью к продукции инозина.
В частности, настоящее изобретение предоставляет микроорганизм с повышенной способностью к продукции инозина, основанной на повышении активности белка, вовлеченного, как предполагается, в транспорт пуриновых нуклеозидов из клетки указанного микроорганизма. Более конкретно, настоящее изобретение предоставляет микроорганизм с повышенной способностью к продукции инозина, основанной на повышении экспрессии гена, кодирующего белок, вовлеченный в процесс экскреции пуриновых нуклеозидов.
Далее настоящее изобретение предоставляет способ получения пуринового нуклеозида методом ферментации, включающим стадии выращивания указанного выше микроорганизма в питательной среде с целью продукции и накопления пуринового нуклеозида в питательной среде и выделения пуринового нуклеозида из культуральной жидкости.
Далее настоящее изобретение предоставляет способ получения 5’-инозиновой кислоты, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде, фосфорилирования полученного и накопленного инозина и выделения полученной и накопленной 5’-инозиновой кислоты.
Настоящее изобретение включает в себя следующее:
Изобретение 1. Бактерия, принадлежащая к роду Escherichia, обладающая способностью к продукции инозина, в которой активность белка, описанного в пунктах (А) или (В), в клетке упомянутой бактерии повышена:
(A) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, приведенной в списке последовательностей под номером 2;
(B) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в аминокислотную последовательность, приведенную в списке последовательностей под номером 2, и который обладает активностью, придающей бактерии повышенную устойчивость к 8-азааденину (здесь и далее белки, описанные в пунктах (А) и (В), упоминаются как “белки согласно настоящему изобретению”).
Изобретение 2. Бактерия в соответствии с Изобретением 1, в которой активности белков, описанных в пунктах (А) или (В), повышены путем трансформации бактерии с помощью ДНК, кодирующей белки, описанные в пунктах (А) или (В), или путем изменения регуляции экспрессии указанной ДНК в хромосоме упомянутой бактерии.
Изобретение 3. Бактерия в соответствии с Изобретением 2, в которой трансформация осуществляется с использованием многокопийного вектора.
Изобретение 4. Способ получения пуринового нуклеозида, включающий стадии выращивания бактерии в соответствии с любым из Изобретений 1-3 в питательной среде и выделения из культуральной жидкости полученного и накопленного в ней инозина.
Изобретение 5. Способ в соответствии с Изобретением 4, в котором бактерия обладает повышенной экспрессией генов биосинтеза пуриновых нуклеозидов.
Изобретение 6. Способ получения 5’-инозиновой кислоты, включающий стадии выращивания бактерии в соответствии с любым из Изобретений 1-3 в питательной среде, фосфорилирования полученного и накопленного инозина и выделения полученной и накопленной 5’-инозиновой кислоты.
Изобретение 7. Способ в соответствии с Изобретением 6, в котором бактерия модифицирована с целью повышения экспрессии генов биосинтеза пуриновых нуклеозидов.
Настоящее изобретение более детально будет описано ниже.
1. Бактерия согласно настоящему изобретению.
Вышеуказанной бактерией согласно настоящему изобретению является бактерия, принадлежащая к роду Escherichia, обладающая способностью к продукции инозина, в которой активность белка, описанного в пунктах (А) или (В), в клетке упомянутой бактерии повышена: (А) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, приведенной в списке последовательностей под номером 2; (В) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в аминокислотную последовательность, приведенную в списке последовательностей под номером 2, и который обладает активностью, придающей бактерии устойчивость к 8-азааденину.
Термин “бактерия, принадлежащая к роду Escherichia” означает, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, использованного в настоящем изобретении, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (E.соli).
Использованный здесь термин “способность к продукции инозина” означает способность к продукции и накоплению инозина в питательной среде. Термин “обладающая способностью к продукции инозина” означает то, что микроорганизм, принадлежащий к роду Escherichia, обладает способностью к продукции и накоплению в питательной среде инозина в количестве большем, чем природный штамм Е.coli, такие как штаммы Е.coli W3110 и MG1655, и предпочтительно означает, что микроорганизм способен к продукции и накоплению в питательной среде в количестве не менее чем 10 мг/л, более предпочтительно не менее чем 50 мг/л инозина.
Термин “активность белка, описанного в пунктах (А) или (В), в клетке упомянутой бактерии повышена” означает, что количество молекул указанного белка в клетке повышено или сама активность в пересчете на белок повышена. Термин “активность” означает активность, придающую бактерии устойчивость к 8-азааденину.
К белкам согласно настоящему изобретению относятся белки, описанные в следующих пунктах (А) или (В):
(А) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, приведенной в списке последовательностей под номером 2;
(В) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в аминокислотную последовательность, приведенную в списке последовательностей под номером 2 и который обладает активностью, придающей бактерии устойчивость к 8-азааденину.
Белок, который представлен аминокислотной последовательностью, приведенной в списке последовательностей под номером 2, является белком YdeD. Белок YdeD является сильно гидрофобным белком, состоящим из 266 аминокислот, содержащим 10 предполагаемых трансмембранных сегментов и обладающим неизвестной функцией. Белок YdeD кодируется геном ydeD. Ген ydeD (нуклеотиды с 1618262 по 1619062 в последовательности с инвентарным номером NC_000913, gi: 16129492 в базе данных GenBank) расположен в хромосоме Е.coli между генами tаrВ и ydeF. Ген ydeD кодирует белок с неизвестной функцией.
Количество “нескольких” аминокислот различается в зависимости от положения и типа аминокислотного остатка в трехмерной структуре белка. Оно может быть от 2 до 27, предпочтительно от 2 до 15 и более предпочтительно от 2 до 5 для белка (А).
Термин “устойчивость к 8-азааденину” означает способность бактерии к росту на минимальной питательной среде, содержащей 8-азааденин в концентрации, при которой штамм дикого типа или родительский штамм не может расти, или способность бактерии расти на питательной среде, содержащей 8-азааденин, с большей скоростью, чем штамм дикого типа или родительский штамм. Упомянутая выше концентрация 8-азааденина составляет обычно от 50 до 5000 мкг/мл, предпочтительно от 100 до 1000 мкг/мл.
Методы увеличения активности белка согласно настоящему изобретению, в особенности методы увеличения количества молекул указанного белка в клетке, включают методы изменения последовательности, регулирующей экспрессию ДНК, кодирующей белок согласно настоящему изобретению, и методы увеличения числа копий гена, но не ограничиваются ими.
Изменение последовательности, регулирующей экспрессию ДНК, кодирующей белок согласно настоящему изобретению, может быть достигнуто путем помещения ДНК, кодирующей белок согласно настоящему изобретению, под контроль сильного промотора. В качестве сильных промоторов известны, например, lac промотор, trp промотор, trc промотор, PL промотор фага лямбда. С другой стороны, промотор может быть усилен, например, путем введения мутации в указанный промотор с целью увеличения уровня транскрипции гена, расположенного после промотора. Далее известно, что замена нескольких нуклеотидов в участке между местом связывания рибосомы (RBS) и старт кодоном, а в особенности в последовательности непосредственно перед старт кодоном, в значительной степени влияет на транслируемость мРНК. Например, было обнаружено 20-кратное изменение уровня экспрессии в зависимости от природы трех нуклеотидов, предшествующих старт кодону (Gold et al., Annu. Rev. Microbiol, 35, 365-403, 1981; Hui et al, EMBO J, 3, 623-629, 1984).
Более того, некий “энхансер” может быть дополнительно введен с целью увеличения уровня транскрипции указанного гена. Введение ДНК, содержащей либо ген, либо промотор в хромосомную ДНК, описано, например, в выложенной патентной заявке Японии №1-215280 (1989).
В качестве альтернативы число копий гена может быть увеличено путем введения гена в многокопийный вектор с образованием рекомбинантной ДНК, с последующим введением такой рекомбинантной ДНК в микроорганизм. Примерами векторов, использующихся для введения рекомбинантной ДНК, являются плазмидные векторы, такие как pMW118, pBR322, pUC19, pBluescript KS+ pACYC177, pACYC184, pAYC32, pMW119, pET22b и подобные им, фаговые векторы, такие как 11059, 1BF101, M13mp9, фаг Mu (выложенная патентная заявка Японии №2-109985) и подобные им, и транспозоны (Berg, D.E. and Berg, C.M., Bio/Technol., 1417 (1983)), такие как Mu, Tn10, Tn5 и подобные им. Кроме того, усиление экспрессии гена может быть достигнуто путем интеграции гена в бактериальную хромосому методом гомологичной рекомбинации или подобным.
Методы использования сильного промотора или “энхансера” могут быть скомбинированы с методами увеличения числа копий гена.
Методами получения хромосомной ДНК, гибридизации, полимеразной цепной реакции (ПЦР), получения плазмидной ДНК, расщепления и лигирования ДНК, трансформации, выбора олигонуклеотидов в качестве затравок и подобными методами могут являться традиционные методы, хорошо известные специалисту в данной области. Эти методы описаны в книге Sambrook, J. and Russell D. "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Third Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) и других подобных изданиях.
Для выведения микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia и обладающего повышенной экспрессией гена, кодирующего белок согласно настоящему изобретению, необходимые участки генов могут быть получены с помощью ПЦР на основе уже доступной информации о генах Е.coli. Например, ген ydeD, который, как предполагается, кодирует транспортер, может быть клонирован из хромосомной ДНК штаммов Е.coli К 12 W3110 и Е.coli MG1655 с использованием метода ПЦР. Хромосомная ДНК, используемая для этого, также может быть получена из любого другого штамма Е.coli.
К белкам согласно настоящему изобретению относятся мутанты и варианты белка YdeD, которые могут существовать вследствие природного разнообразия, при условии, что указанные мутанты и варианты демонстрируют функциональные свойства белка YdeD, по крайней мере устойчивость к 8-азааденину. ДНК, кодирующая указанные мутанты и варианты, может быть получена путем выделения ДНК, которая гибридизуется с геном ydeD (SEQ ID NO:1) или частью указанного гена в жестких условиях и которая кодирует белок, увеличивающий продукцию пуриновых нуклеотидов. Термин “жесткие условия”, упомянутый здесь, означает условия, при которых образуются так называемые специфические гибриды, а неспецифические - не образуются. Например, к жестким условиям относятся условия, при которых гибридизуются ДНК, обладающие высокой степенью гомологии, к примеру, ДНК, обладающие гомологией не менее 70% друг относительно друга. В качестве варианта примером жестких условий являются условия соответствующие условиям отмывки при гибридизации по Саузерну, например, 60° С, 1× SSC, 0.1% SDS, предпочтительно 0.1× SSC, 0.1% SDS. В качестве зонда для ДНК, кодирующей варианты и гибридизующейся с геном ydeD, также может быть использована часть нуклеотидной последовательности под номером 1. Зонд подобного рода может быть получен в результате ПЦР с использованием в качестве затравок олигонуклеотидов, полученных на основе нуклеотидной последовательности под номером 1, и фрагмента ДНК, содержащего нуклеотидную последовательность под номером 1, в качестве матрицы. В случае, когда в качестве зонда используется фрагмент ДНК длиной около 300 пар оснований, условия отмывки при гибридизации соответствуют, например, 50° C, 2× SSC и 0.1%SDS.
Бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем введения вышеуказанных ДНК в бактерию, уже обладающую способностью к продукции пуриновых нуклеозидов. С другой стороны, бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем придания бактерии, уже содержащей указанные ДНК, способности к продукции пуриновых нуклеозидов.
В качестве родительского штамма - продуцентов инозина, в которым активности белков согласно настоящему изобретению будут повышены, может быть использован штамм Е.coli AJ13732 (FADRaddeddyicPpgixapA(pMWKQ)) (WO 9903988). Указанный штамм является производным от известного штамма W3110, содержащего мутации, введенные в ген purF, кодирующий PRPP амидотрансферазу, ген purR, кодирующий репрессор биосинтеза пуринов, ген deoD, кодирующий фосфорилазу пуриновых нуклеозидов, ген рurА, кодирующий сукцинил-АМР-синтазу, ген add, кодирующий аденозиндеаминазу, ген edd, кодирующий 6-фосфоглюконатдегидразу, ген pgi, кодирующий фосфоглюкозоизомеразу, ген харА, кодирующий ксантозинфосфорилазу (purF-, purA-, deoD-, purR-, add-, edd-, pgi-, харА-), а также содержащего плазмиду pMWKQ - производную от вектора pMW218, в которой находятся гены purFKQ, кодирующие PRPP амидотрансферазу, нечувствительную к гуанозин монофосфату (GMP) (WO 9903988).
Чтобы увеличить саму активность в пересчете на белок согласно настоящему изобретению, также возможно ввести мутацию в структурную часть гена, кодирующего белок, чтобы увеличить активность белка. Для того чтобы ввести мутацию в ген, могут быть использованы сайт-специфический мутагенез (Kramer, W. and Frits, H.J., Methods in Enzymology, 154, 350 (1987)), методы рекомбинантной ПЦР (PCR Technology, Stockton Press (1989)), химический синтез специфических участков ДНК, обработка нужного гена с помощью гидроксиламина, обработка микробных штаммов, содержащей нужный ген, с помощью УФ-излучения или химического реагента, такого как нитрозогуанидин или азотистая кислота, или подобным методом. Микроорганизм, в котором активность указанного белка повышена, может быть отобран как штамм, растущий на минимальной среде, содержащей 8-азааденин.
Бактерия согласно настоящему изобретению может быть в дальнейшем улучшена за счет увеличения экспрессии одного или нескольких генов, вовлеченных в биосинтез пуринов. Примерами таких генов являются гены риг регулона из Е.coli (Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C.Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996). Описан штаммом Е.coli - продуцент инозина, содержащий мутантный ген purF, кодирующий PRPP амидотрансферазу, свободную от ингибирования GMP и АМР по типу обратной связи, инактивированный ген purR, кодирующий репрессор биосинтеза пуринов (WO 9903988).
Механизмом, увеличивающим продукцию пуриновых нуклеозидов бактерией путем увеличения активности белков согласно настоящему изобретению, является, как можно предположить, повышенная экскреция целевого пуринового нуклеозида из клетки бактерии.
2. Способ получения пуриновых нуклеозидов.
К способам согласно настоящему изобретению относится способ получения инозина, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления инозина в питательной среде и выделения инозина из культуральной жидкости.
Согласно настоящему изобретению выращивание, выделение и очистка пуринового нуклеозида из культуральной или подобной ей жидкости может быть осуществлена способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых пуриновый нуклеозид продуцируется с использованием микроорганизма. Питательная среда, используемая для выращивания, может быть как синтетической, так и натуральной, при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, неорганические ионы и другие необходимые органические компоненты. К источникам углерода относятся различные углеводы, такие как глюкоза, лактоза, галактоза, фруктоза, арабиноза, мальтоза, ксилоза, трехалоза, рибоза и гидролизат крахмала; спирты, такие как глицерин, маннитол и сорбитол; различные органические кислоты, такие как глюконовая кислота, фумаровая кислота, лимонная кислота и янтарная кислота и подобные им. В качестве источника азота могут использоваться различные неорганические соли аммония, такие как сульфат аммония, хлорид аммония и фосфат аммония, органические источники азота, такие как гидролизат соевых бобов; газообразный аммиак, раствор аммония и подобные соединения. Желательно, чтобы подходящие небольшие количества витаминов, таких как витамин Bi, и других необходимых веществ, например, нуклеиновых кислот, таких как аденин и РНК, или дрожжевой экстракт и подобные соединения присутствовали в питательной среде в качестве органических питательных компонент. Кроме того, небольшие количества фосфата кальция, сульфата магния, ионов железа, ионов марганца и подобных соединений могут быть добавлены, если необходимо.
Выращивание осуществляется предпочтительно в аэробных условиях в течение 16-72 часов, температура при выращивании поддерживается в пределах от 30 до 45° С и рН в пределах от 5 до 8. рН среды может регулироваться неорганическими или органическими кислотными или щелочными веществами, а также газообразным аммиаком.
После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрацией через мембрану, а затем целевой пуриновый нуклеозид может быть выделен из культуральной жидкости любым из традиционных методов или любой комбинацией этих методов, таким как ионообменная хроматография и осаждение.
3. Способ получения 5’-инозиновой кислоты.
К способам согласно настоящему изобретению также относится способ получения 5’-инозиновой кислоты, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде, фосфорилирования полученного и накопленного инозина и выделения полученной и накопленной 5'-инозиновой кислоты.
Согласно настоящему изобретению выращивание, выделение и очистка инозина из культуральной или подобной ей жидкости может быть осуществлена способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых инозин продуцируется с использованием микроорганизма. Далее согласно настоящему изобретению фосфорилирование полученного и накопленного инозина, а также выделение полученной и накопленной 5’-инозиновой кислоты может быть осуществлено методом, подобным традиционным методам, в которых пуриновые нуклеотиды, такие как 5’-инозиновая кислота, получается из пуринового нуклеозида, такого как инозин.
Фосфорилирование пуринового нуклеозида может быть осуществлено ферментативно с использованием различных фосфатаз, нуклеозидкиназ и нуклеозидфосфотрансфераз, или химически с использованием фосфорилирующих агентов, таких как РОСl3 или подобным им. Могут быть использованы фосфатаза, способная к катализу селективного переноса фосфорильной группы пирофосфата в 5’-положение нуклеозида (Mihara et. al, Phosphorylation of nucleosides by the mutated acid phosphatase from Morganella morganii. Appl. Environ. Microbiol. 2000, 66:2811-2816), или кислая фосфатаза, использующая полифосфорные кислоты (их соли), фенилфосфорную кислоту (ее соли) или карбамилфосфорную кислоту (ее соли) в качестве донора фосфорной кислоты (WO 9637603 A1) или подобные им. Также в качестве примера фосфатазы может быть приведена фосфатаза, способная к каталитическому переносу фосфорильной группы в 2’, 3’, 5’-положение нуклеозида с использованием в качестве субстрата п-нитрофенилфосфата (Mitsugi, К., et al, Agric. Biol. Chem. 1964, 28, 586-600), неорганического фосфата (JP42-1186), или ацетил фосфата (JP61-41555), или подобная ей. В качестве примера нуклеозидкиназы может быть приведена гуанозин-инозинкиназа из Е.coli (Mori et. al. Cloning of a guanosine-inosine kinase gene of Escherichia coli and characterization of the purified gene product. J. Bacteriol. 1995. 177:4921-4926; WO9108286) или подобная ей. В качестве примера нуклеозидфосфотрансферазы может быть приведена нуклеозидфосфотрансфераза, описанная Hammer-Jespersen, К. (Nucleoside catabolism, p.203-258. In A Munch-Petesen (ed.), Metabolism of nucleotides, nucleosides and nucleobases in microorganism. 1980, Academic Press, New York) или подобная ей. Химическое фосфорилирование нуклеозидов может быть осуществлено с использованием фосфорилирующего агента, такого как РОСl3 (Yoshikawa et. al. Studies of phosphorylation. III. Selective phosphorylation of unprotected nucleosides. Bull. Chem. Soc. Jpn. 1969, 42:3505-3508) или подобного ему.
В способе согласно настоящему изобретению бактерия согласно настоящему изобретению может быть модифицирована с целью увеличения экспрессии генов биосинтеза пуриновых нуклеозидов.
Подписи к чертежам
Фиг.1. Схема хромосомного фрагмента ДНК, содержащегося в фазмиде pAZA10, который придавал клеткам устойчивость к 8-азааденину.
На Фиг.2 показана структура плазмиды pYDED1.
На Фиг.3 показана структура плазмиды pYDED3.
Наилучший способ осуществления изобретения
Пример 1. Клонирование генов, которые придают устойчивость к аналогам пуриновых оснований, из Е.coli в фазмиду mini-Mu.
Гены из E.coli, которые обуславливают устойчивость к аналогам пуриновых оснований, были изначально клонированы in vivo с использованием фазмиды mini-Mu d5005 (Groisman, E.A., et al., J. Bacteriol., 168, 357-364 (1986)). Штамм MG1655, лизогенный по фагу МuСts62, был использован в качестве донора. Свежеприготовленные лизаты были использованы для инфицирования лизогенного по фагу MuCts производного этого штамма. Полученные клетки высевались на минимальную среду М9 с глюкозой, содержащую канамицин (40 мкг/мл) и 8-азааденин (200 мг/мл). Были отобраны колонии, появившиеся после 48 часов культивирования, из колоний была выделена плазмидная ДНК и использована для трансформации штамма MG1655 стандартными методами. Трансформанты были отобраны на чашках с агаризованным L-бульоном, содержащим канамицин, как указано выше. Из трансформантов, устойчивых к 200 мкг/мл 8-азааденина, была выделена плазмидная ДНК. Нуклеотидная последовательность концов хромосомных ДНК вставок определялась с использованием затравок, приведенных в Списке последовательностей под номерами 3 и 4 (SEQ ID NO:3 и 4) соответственно для левого и правого участков присоединения фага Ми. Полная нуклеотидная последовательность генома штамма Е.coli K-12 определена (Science, 277, 1453-1474, 1997). Поэтому полученные данные о нуклеотидной последовательности были сравнены с информацией из GenBank и таким образом были идентифицированы клонированные фрагменты.
Оказалось, что были клонированы несколько типов вставок, принадлежащих к различным участкам хромосомы. Одна из них, AZA-10, являющаяся хромосомной вставкой (8861 т.п.о.) в фазмиду pAZA10, показана на Фиг.1.
Пример 2. Идентификация гена ydeD, придающего устойчивость к 8-азааденину.
Клонирование гена ydeD в вектор pAYCTER3.
Фрагмент AZA-10 содержал по крайней мере 10 генов. Для того чтобы идентифицировать ген, придающий устойчивость к 8-азааденину, каждый из генов был субклонирован в многокопийный вектор pUC21 и проверен на способность придавать устойчивость к указанному реагенту. Более конкретно, ген ydeD, содержащий примерно 250 п.о. перед предполагаемым старт-кодоном, был вырезан из фрагмента AZA-10 с использованием ферментов рестрикции PvuII и VspI и вставлен в вектор pUC21, предварительно обработанный ферментами рестрикции Есо22I и NdeI. Так была получена плазмида pYDED1, содержащая ген ydeD (Фиг.2). Клетки Е. coli, содержащие эту многокопийную плазмиду, на минимальной среде росли плохо. Поэтому ген ydeD был переклонирован из плазмиды pUC21 по сайтам SmaI и ХbаI вектора pAYCTER3, производного от pAYC32. Таким образом была получена плазмида pYDEDS (Фиг.3). Вектор pAYCTER3 является очень стабильным среднекопийным вектором, сконструированным на основе плазмиды RSF1010 (Christoserdov A.Y., Tsygankov Y.D, Plasmid, 1986, v.16, pp.161-167) путем введения в плазмиду pAYC32 полилинкера из плазмиды pUC19 и сильного терминатора гена rrb.
Пример 3. Влияние амплификации гена ydeD на устойчивость штамма Е.coli TG1 к 8-азааденину.
Плазмида pYDED3, а также вектор pAYCTER3 были введены в штамм Е. coli TG1. Так были получены штаммы TG1(pYDED3) и TG1 (pAYCTER3). Затем была определена способность этих штаммов расти в присутствии 8-азааденина на чашках с минимальной агаризованной средой М9 с глюкозой, содержащей ступенчатые концентрации ингибитора. Чашки были засеяны клетками (от 105 до 106) ночной культуры, выращенной на минимальной среде, содержащей 100 мг/мл ампициллина в случае штаммов с плазмидами. Степень роста была оценена после инкубации в течение 44 часов при 37° С. Результаты представлены в Таблице 1.
| Таблица 1 | |||||
| Штамм | Рост на минимальной среде | ||||
| содержащей 8-азааденин, мкг/мл | |||||
| не содержащей | 100 | 300 | 500 | 1000 | |
| добавок | |||||
| TG1 | + | - | - | - | - |
| TG1 (pAYCTER3) | + | - | - | - | - |
| TG1 (pYDED3) | + | + | + | + | ± |
| Пояснения. +: хороший рост; ±: плохой рост; -: отсутствие роста. | |||||
Как видно из Таблицы 1, амплификация гена ydeD в значительной степени увеличила устойчивость клеток к 8-азааденину. Известно, что ген ydeD кодирует белок, вовлеченный в выброс из клеток метаболитов пути биосинтеза цистеина (DaBler et al., Mol. MicrobioL, 36, 1101-1112, 2000; US 5972663). Поэтому можно предположить, что ген ydeD обладает широкой специфичностью и также вовлечен в процесс экскреции производных пуринов.
Пример 4. Влияние амплификации гена ydeD на продукцию инозина штаммом Е.coli - продуцентом инозина.
Штамм AJ13732(pMWKQ) - продуцент инозина был трансформирован вектором pAYCTER3 и плазмидой pYDED3. Так были получены штаммы AJ13732(pMWKQ, pAYCTER3) и AJ13732(pMWKQ, pYDED3). Каждый из этих штаммов выращивался при 37° С в течение 18 часов в L-бульоне, содержащем 100 мг/л ампициллина и 75 мг/л канамицина, и 0.3 мл полученной культуры было перенесено в 3 мл питательной среды для ферментации, содержащей 100 мг/л ампициллина и 75 мг/л канамицина, в пробирке 20× 200 мм и инкубировалось при 37° С в течение 72 часов на роторной качалке.
Состав питательной среды для ферментации (г/л):
Глюкоза 40.0
(NH4)2SO4 16.0
КН2РO4 1.0
MgSO4· 7H2O 1.0
FeSO4· 7H2O 0.01
MnSO4· 5H2O 0.01
Дрожжевой экстракт 8.0
СаСО3 30.0
Глюкоза и сульфат марганца стерилизовались раздельно. СаСО3 стерилизовали нагреванием при 180° С в течение 2 часов. рН поддерживали в районе 7.0. Антибиотики добавляли в среду после стерилизации.
После выращивания количество инозина, накопленное в среде, определялось методом ВЭЖХ. Образец культуральной жидкости (500 мкл) был отцентрифугирован при 1500 об/мин в течение 5 мин, супернатант был разбавлен водой в 4 раза и проанализирован с помощью ВЭЖХ.
Условия для анализа с помощью ВЭЖХ:
Колонка: Luna С18(2) 250× 3 мм, 5 u (Phenomenex, USA). Буфер: 2% v/v C2H5OH; 0.8% v/v триэтиламин, 0.5% v/v уксусная кислота (ледяная), рН 4.5. Температура: 30° С. Скорость потока: 0.3 мл/мин. Объем пробы: 5 мкл. УФ-детектор: 250 нм.
Время удерживания (мин):
Ксантозин 13.7
Инозин 9.6
Гипоксантин 5.2
Гуанозин 11.4
Аденозин 28.2
Результаты представлены в Таблице 2.
| Таблица 2. | ||
| Штамм | OD540 | Инозин, г/л |
| AJ13732(pMWKQ) | 5.5 | 6.3 |
| AJ13732 (pMWKQ, pAYCTER3) | 5.6 | 5.8 |
| AJ13732 (pMWKQ, pYDED3) | 5.3 | 6.7 |
Как видно из Таблицы 2, амплификация гена ydeD увеличивала продукцию инозина штаммом AJ13732 (pMWKQ).
Claims (8)
1. Способ получения инозина, включающий стадии выращивания бактерии Escherichia coli в питательной среде и выделения из культуральной жидкости полученного и накопленного в ней инозина, отличающийся тем, что используют бактерию Escherichia coli, способность к продукции инозина которой увеличена за счет повышения активности белков, выбранных из группы (А) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, приведенной в списке последовательностей под номером 2 (SEQ ID NO:2); (В) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аимнокислот в аминокислотную последовательность, приведенную в списке последовательностей под номером 2 (SEQ ID NO:2), и который обладает активностью, придающей бактерии повышенную устойчивость к 8-азааденину.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что активности белков, описанных в пунктах (А) или (В), повышены путем трансформации бактерии с помощью ДНК, кодирующей белки, описанные в пунктах (А) или (В), или путем изменения регуляции экспрессии указанной ДНК в хромосоме упомянутой бактерии.
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что трансформация осуществляется с использованием многокопийного вектора.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что у указанной бактерии экспрессия генов биосинтеза инозина повышена.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве продуцента инозина используют штамм Escherichia coli AJ3732 (рMWKQ, pYDED3).
6. Способ получения 5’-инозиновой кислоты, включающий стадии выращивания бактерии Escherichia coli в питательной среде, фосфорилирования полученного и накопленного инозина и выделения полученной 5’-инозиновой кислоты, отличающийся тем, что используют бактерию Escherichia coli, способность к продукции инозина которой увеличена за счет повышения активности белков, выбранных из группы (А) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, приведенной в списке последовательностей под номером 2 (SEQ ID NO:2); (В) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в аминокислотную последовательность, приведенную в списке последовательностей под номером 2 (SEQ ID NO:2), и который обладает активностью, придающей бактерии повышенную устойчивость к 8-азааденину.
7. Способ по п.6, отличающийся тем, что у указанной бактерии экспрессия генов биосинтеза инозина повышена.
8. Штамм Escherichia coli AJ13732 (pMWKQ, pYDED3)- продуцент инозина.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2002104464/13A RU2244004C2 (ru) | 2002-02-21 | 2002-02-21 | Способ получения инозина и 5'-инозиновой кислоты, штамм escherichia coli - продуцент инозина |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2002104464/13A RU2244004C2 (ru) | 2002-02-21 | 2002-02-21 | Способ получения инозина и 5'-инозиновой кислоты, штамм escherichia coli - продуцент инозина |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2002104464A RU2002104464A (ru) | 2003-08-27 |
| RU2244004C2 true RU2244004C2 (ru) | 2005-01-10 |
Family
ID=34880666
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2002104464/13A RU2244004C2 (ru) | 2002-02-21 | 2002-02-21 | Способ получения инозина и 5'-инозиновой кислоты, штамм escherichia coli - продуцент инозина |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2244004C2 (ru) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8034767B2 (en) | 2006-12-22 | 2011-10-11 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing purine nucleosides and nucleotides by fermentation using a bacterium belonging to the genus Escherichia or Bacillus |
| WO2015060391A1 (ja) | 2013-10-23 | 2015-04-30 | 味の素株式会社 | 目的物質の製造法 |
| WO2020071538A1 (en) | 2018-10-05 | 2020-04-09 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing target substance by bacterial fermentation |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1733038B1 (en) | 2004-03-31 | 2015-06-03 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing purine nucleosides and nucleotides by fermentation using bacterium belonging to the genus bacillus or escherichia |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1060428A (en) * | 1963-04-10 | 1967-03-01 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | Process for the manufacture of 5'-purine nucleotides by a fermentation method |
| RU1755583C (ru) * | 1990-10-31 | 1994-08-30 | ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов | Способ получения инозина |
| SU1827102A3 (ru) * | 1990-11-26 | 1995-09-10 | Пензенский филиал Всесоюзного научно-исследовательского института антибиотиков | Способ получения 5′ -инозиновой кислоты |
-
2002
- 2002-02-21 RU RU2002104464/13A patent/RU2244004C2/ru active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1060428A (en) * | 1963-04-10 | 1967-03-01 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | Process for the manufacture of 5'-purine nucleotides by a fermentation method |
| RU1755583C (ru) * | 1990-10-31 | 1994-08-30 | ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов | Способ получения инозина |
| SU1827102A3 (ru) * | 1990-11-26 | 1995-09-10 | Пензенский филиал Всесоюзного научно-исследовательского института антибиотиков | Способ получения 5′ -инозиновой кислоты |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8034767B2 (en) | 2006-12-22 | 2011-10-11 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing purine nucleosides and nucleotides by fermentation using a bacterium belonging to the genus Escherichia or Bacillus |
| WO2015060391A1 (ja) | 2013-10-23 | 2015-04-30 | 味の素株式会社 | 目的物質の製造法 |
| WO2020071538A1 (en) | 2018-10-05 | 2020-04-09 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing target substance by bacterial fermentation |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2365622C2 (ru) | СПОСОБ ПРОДУКЦИИ ПУРИНОВЫХ НУКЛЕОЗИДОВ И НУКЛЕОТИДОВ МЕТОДОМ ФЕРМЕНТАЦИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ, ПРИНАДЛЕЖАЩИХ К РОДУ Escherichia ИЛИ Bacillus | |
| US8298791B2 (en) | Purine-derived substance-producing bacterium and a method for producing purine-derived substance | |
| RU2482178C1 (ru) | МИКРООРГАНИЗМЫ Corynebacterium С ПОВЫШЕННОЙ ПРОДУКЦИЕЙ 5'- ИНОЗИНОВОЙ КИСЛОТЫ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ С ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ | |
| RU2239656C2 (ru) | Способ получения пуриновых нуклеозидов и нуклеотидов, штамм-продуцент пуриновых нуклеозидов (варианты) | |
| RU2276688C2 (ru) | БАКТЕРИЯ, ПРИНАДЛЕЖАЩАЯ К РОДУ Escherichia,- ПРОДУЦЕНТ L-ГИСТИДИНА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ГИСТИДИНА | |
| JP5488594B2 (ja) | プリンリボヌクレオシド及びリボヌクレオチドの製造方法 | |
| JP4760711B2 (ja) | バチルス属又はエシェリヒア属に属する細菌を使用した発酵によるプリンヌクレオシド及びヌクレオチドの製造方法 | |
| CN104342397B (zh) | 嘌呤类物质的制备方法 | |
| KR20060136477A (ko) | 바실러스 또는 에스케리키아 속에 속하는 세균을 사용하여발효에 의해 퓨린 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드를제조하는 방법 | |
| JP4352716B2 (ja) | バチルス属に属するイノシン生産菌及びイノシンの製造法 | |
| RU2260040C2 (ru) | Способ получения инозина и инозин 5'-монофосфата, штамм бактерии, принадлежащей к роду bacillus - продуцент инозина (варианты) | |
| RU2271391C2 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНОЗИНА И 5'-ИНОЗИНОВОЙ КИСЛОТЫ МЕТОДОМ ФЕРМЕНТАЦИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ, ПРИНАДЛЕЖАЩИХ К РОДУ Escherichia | |
| RU2244004C2 (ru) | Способ получения инозина и 5'-инозиновой кислоты, штамм escherichia coli - продуцент инозина | |
| RU2244003C2 (ru) | Способ получения инозина и 5'-инозиновой кислоты, штамм escherichia coli - продуцент инозина | |
| CN101120090B (zh) | 用属于芽孢杆菌属或埃希氏菌属的细菌通过发酵制备嘌呤核苷和核苷酸的方法 | |
| RU2294962C2 (ru) | БЕЛОК YdhL ИЗ Bacillus amyloliquefaciens, ФРАГМЕНТ ДНК, БАКТЕРИЯ, ПРИНАДЛЕЖАЩАЯ К РОДУ Escherichia ИЛИ Bacillus, - ПРОДУЦЕНТ ПУРИНОВЫХ НУКЛЕОЗИДОВ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПУРИНОВЫХ НУКЛЕОЗИДОВ И НУКЛЕОТИДОВ | |
| CN117802187A (zh) | 嘌呤类物质的制造方法 |