RU2241744C2 - Method for culturing microorganism serratia marcescens - producer of chitinase - Google Patents
Method for culturing microorganism serratia marcescens - producer of chitinaseInfo
- Publication number
- RU2241744C2 RU2241744C2 RU2003103160/13A RU2003103160A RU2241744C2 RU 2241744 C2 RU2241744 C2 RU 2241744C2 RU 2003103160/13 A RU2003103160/13 A RU 2003103160/13A RU 2003103160 A RU2003103160 A RU 2003103160A RU 2241744 C2 RU2241744 C2 RU 2241744C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- chitinase
- culturing
- cultivation
- yeast
- marcescens
- Prior art date
Links
- 102000012286 Chitinases Human genes 0.000 title claims abstract description 44
- 108010022172 Chitinases Proteins 0.000 title claims abstract description 44
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 title claims abstract description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 238000012258 culturing Methods 0.000 title abstract description 10
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title abstract description 8
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 21
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 21
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 238000005273 aeration Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000000337 buffer salt Substances 0.000 claims abstract 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- -1 1.5 Substances 0.000 abstract 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 20
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 15
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 14
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 10
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 9
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 4
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical class [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 2
- 241000238421 Arthropoda Species 0.000 description 2
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 2
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001794 chitinolytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000238424 Crustacea Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 244000286779 Hansenula anomala Species 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000012272 crop production Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 238000012994 industrial processing Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 235000003170 nutritional factors Nutrition 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- BHZOKUMUHVTPBX-UHFFFAOYSA-M sodium acetic acid acetate Chemical compound [Na+].CC(O)=O.CC([O-])=O BHZOKUMUHVTPBX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и касается способа культивирования штаммов бактерий Serratia marcescens, продуцентов хитиназы.The invention relates to microbiology and biotechnology and relates to a method for cultivating bacterial strains of Serratia marcescens, producers of chitinase.
Хитиназы (КФ 3.2.1.14) - ферменты, катализирующие гидролиз β -1,4 гликозидных связей в хитине - полисахариде, входящем в состав патогенных грибов и членистоногих. В связи с этим использование хитиназ перспективно для решения различных прикладных задач в растениеводстве и ветеринарии, связанных с защитой растений и животных от грибковых заболеваний и насекомых-вредителей, а также в рыбной промышленности для утилизации содержащих хитин отходов после промышленной переработки ракообразных [1]. Хитиназы обнаружены у самых разных групп организмов, включая бактерии, грибы, растения, членистоногие и позвоночные, но наиболее перспективными источниками этих ферментов являются микроорганизмы.Chitinases (EC 3.2.1.14) are enzymes that catalyze the hydrolysis of β -1,4 glycosidic bonds in chitin - a polysaccharide that is part of pathogenic fungi and arthropods. In this regard, the use of chitinases is promising for solving various applied problems in crop production and veterinary medicine related to the protection of plants and animals from fungal diseases and pests, as well as in the fishing industry for the disposal of waste containing chitin after industrial processing of crustaceans [1]. Chitinases have been found in a wide variety of organisms, including bacteria, fungi, plants, arthropods, and vertebrates, but microorganisms are the most promising sources of these enzymes.
Среди микроорганизмов, способных продуцировать хитиназу, энтеробактерии Serratia marcescens являются одними из самых эффективных [2]. Различные штаммы S.marcescens, в том числе и с искусственно измененным геномом, обладают способностью секретировать во внеклеточное пространство комплексы хитинолитических ферментов. Однако эти ферменты являются индуцируемыми и уровень их продукции зависит от условий культивирования и состава питательной среды [2, 3]. В связи с этим разработка способов культивирования S.marcescens с высоким выходом хитиназы является актуальной задачей.Among microorganisms capable of producing chitinase, enterobacteria Serratia marcescens are among the most effective [2]. Various strains of S. marcescens, including those with an artificially modified genome, have the ability to secrete complexes of chitinolytic enzymes into the extracellular space. However, these enzymes are inducible and the level of their production depends on the cultivation conditions and the composition of the nutrient medium [2, 3]. In this regard, the development of methods for culturing S.marcescens with a high yield of chitinase is an urgent task.
Известен способ культивирования мутантного штамма S.marcescens IMR-1E1 - суперпродуцента хитиназы [4]. Штамм выращивают на питательной среде, содержащей в качестве основных компонентов коллоидный хитин (1,5%) и дрожжевой экстракт (0,5 г/л), при 30° С в течение 5 суток. Выход хитиназы в культуральную жидкость составляет 0,36 Е/мл.A known method of culturing a mutant strain of S.marcescens IMR-1E1 - super producer of chitinase [4]. The strain is grown on a nutrient medium containing colloidal chitin (1.5%) and yeast extract (0.5 g / l) as main components, at 30 ° C for 5 days. The yield of chitinase in the culture fluid is 0.36 U / ml.
Существенными недостатками известного способа культивирования является нестабильность продуктивности по хитиназе, связанная с генетической природой мутации в штамме, сложность питательной среды, содержащей дорогостоящий коллоидный хитин, и длительность культивирования.Significant disadvantages of the known method of cultivation is the instability of productivity by chitinase associated with the genetic nature of the mutation in the strain, the complexity of the nutrient medium containing expensive colloidal chitin, and the duration of cultivation.
Наиболее близким к заявляемому способу культивирования - прототипом является способ культивирования стабильного мутантного штамма S.marcescens В-10 М-1 (ВКПМ В-3237) - суперпродуцента хитиназы [5] на питательной среде следующего состава, г/л:Closest to the claimed method of cultivation, the prototype is a method of cultivating a stable mutant strain S.marcescens B-10 M-1 (VKPM B-3237), a super producer of chitinase [5] on a nutrient medium of the following composition, g / l:
Хитин порошкообразный 10-30Chitin powder 10-30
Дрожжевой экстракт 5,0Yeast Extract 5.0
Сульфат аммония 0,1Ammonium Sulfate 0.1
Сульфат магния 0,3Magnesium Sulfate 0.3
Вода 1,0 лWater 1.0 L
рН питательной среды доводят до значения 8,0-8,4, добавляя буферную смесь одно- и двузамещенных фосфатов калия (1,5 г/л). Культивирование проводят на качалках со встряхиванием при температуре 28-30° С с аэрацией в течение 5-7 суток. Выход хитиназы в культуральную жидкость составляет 0,3-0,5 Е/мл.The pH of the nutrient medium was adjusted to a value of 8.0-8.4 by adding a buffer mixture of mono- and disubstituted potassium phosphates (1.5 g / l). Cultivation is carried out on a rocking chair with shaking at a temperature of 28-30 ° C with aeration for 5-7 days. The yield of chitinase in the culture fluid is 0.3-0.5 U / ml.
Существенными недостатками известного способа культивирования является длительность культивирования, недостаточно высокий уровень продукции хитиназы, а также сложность состава питательных факторов среды, включающих дорогостоящие порошкообразный хитин и дрожжевой экстракт, а также сульфаты аммония и магния.Significant disadvantages of the known method of cultivation is the duration of cultivation, the insufficiently high level of production of chitinase, as well as the complexity of the composition of nutrient factors of the environment, including expensive powdered chitin and yeast extract, as well as ammonium and magnesium sulfates.
Технической задачей изобретения является уменьшение длительности культивирования при увеличении выхода хитиназы, а также упрощение состава питательной среды.An object of the invention is to reduce the duration of cultivation with increasing yield of chitinase, as well as simplifying the composition of the nutrient medium.
Поставленная техническая задача достигается предлагаемым способом, заключающемся в следующем.The technical task is achieved by the proposed method, which consists in the following.
Для культивирования S.marcescens с целью получения хитиназы применяют питательную среду следующего состава, г/л (на сухое вещество):For the cultivation of S.marcescens in order to obtain chitinase, a nutrient medium of the following composition is used, g / l (per dry matter):
Дрожжи Saccharomyces cerevisiae 50-150Yeast Saccharomyces cerevisiae 50-150
Вода 1,0 лWater 1.0 L
рН питательной среды доводят до значения 8,0-8,4the pH of the nutrient medium is adjusted to a value of 8.0-8.4
добавляя буферную смесь одно- и двузамещенных фосфатов калия (1,5 г/л). Культивирование проводят на качалках со встряхиванием при температуре 28-30° С с аэрацией в течение 3-5 суток. Выход хитиназы составляет 0,77-1,02 Е/мл.adding a buffer mixture of mono- and disubstituted potassium phosphates (1.5 g / l). Cultivation is carried out on a rocking chair with shaking at a temperature of 28-30 ° C with aeration for 3-5 days. The yield of chitinase is 0.77-1.02 U / ml.
Концентрацию жизнеспособных клеток S.marcescens в культуральной жидкости определяют методом высева на чашки с мясопептонным агаром.The concentration of viable S.marcescens cells in the culture fluid is determined by plating on plates with meat peptone agar.
Активность хитиназы (ХА) определяют следующим образом. После окончания культивирования отделяют клетки и нерастворимые компоненты центрифугированием при 5000 об/мин в течение 30 мин. Культуральную жидкость собирают. К 0,3 мл суспензии коллоидного хитина (10 мг/мл) добавляют 0,1 мл 0,5 М натрий ацетата - уксусной кислоты (рН 5,5), аликвоту анализируемого образца культуральной жидкости, воду до конечного объема 1,0 мл и инкубируют при температуре 37° С в течение 15 мин. После этого реакционную смесь центрифугируют и в надосадочной жидкости определяют концентрацию N-ацетилглюкозамина с помощью динитросалицилового реагента [6]. За единицу ХА принимают такое количество фермента, которое в описываемых условиях реакции вызывает прирост концентрации N-ацетилглюкозамина на 1,0 мкмоль х мин-1· мл-1.Chitinase activity (HA) is determined as follows. After cultivation, cells and insoluble components are separated by centrifugation at 5000 rpm for 30 minutes. The culture fluid is collected. To 0.3 ml of a suspension of colloidal chitin (10 mg / ml) add 0.1 ml of 0.5 M sodium acetate-acetic acid (pH 5.5), an aliquot of the analyzed sample of the culture fluid, water to a final volume of 1.0 ml and incubated at a temperature of 37 ° C for 15 minutes After that, the reaction mixture is centrifuged and the concentration of N-acetylglucosamine is determined in the supernatant using a dinitrosalicylic reagent [6]. For a unit of CA, take such an amount of enzyme that under the described reaction conditions causes an increase in the concentration of N-acetylglucosamine by 1.0 μmol x min -1 · ml -1 .
На фиг.1 представлена зависимость роста клеток S.marcescens В-10 М-1 (столбцы) и выхода хитиназы (линия) от концентрации в питательной среде пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Время культивирования 3 суток. По оси Х - концентрация биомассы дрожжей (по сухому весу) в питательной среде, г/л. По левой оси Y - хитиназная активность в культуральной жидкости, Е/мл. По правой оси Y - концентрация клеток S. marcescens, 10 кл/мл.Figure 1 shows the dependence of S. marcescens B-10 M-1 cell growth (columns) and chitinase yield (line) on the concentration of baking yeast Saccharomyces cerevisiae in the nutrient medium. The cultivation time is 3 days. Along the X axis is the concentration of yeast biomass (by dry weight) in the nutrient medium, g / l. On the left axis Y is the chitinase activity in the culture fluid, E / ml. On the right Y axis is the concentration of S. marcescens cells, 10 cells / ml.
Из фиг.1 видно, что наибольший выход хитиназы наблюдается в диапазоне концентраций дрожжей 50-150 г/л с максимумом ХА=0,8 Е/мл при 90-150 г/л. При концентрации дрожжей ниже 50 г/л выход хитиназы снижается более чем на 25% от максимального. Увеличение концентрации дрожжей выше 150 г/л нецелесообразно, поскольку не приводит к дополнительному повышению выхода хитиназы.Figure 1 shows that the highest yield of chitinase is observed in the range of yeast concentrations of 50-150 g / l with a maximum of XA = 0.8 U / ml at 90-150 g / l. When the yeast concentration is below 50 g / l, the yield of chitinase is reduced by more than 25% of the maximum. An increase in the concentration of yeast above 150 g / l is impractical because it does not lead to an additional increase in the yield of chitinase.
На фиг.2 представлены зависимости выхода хитиназы от времени культивирования S.marcescens В-10 М-1 при использовании в качестве питательных факторов среды пекарских дрожжей (кривая 1) или приведенных в прототипе порошкообразного хитина, дрожжевого экстракта и сульфатов магния и аммония (кривая 2). Концентрация дрожжей 90 г/л, хитина 20 г/л. По оси Х - время культивирования, сут. По оси Y - хитиназная активность в культуральной жидкости, Е/мл.Figure 2 presents the dependence of the chitinase yield on the cultivation time of S.marcescens B-10 M-1 when using baker's yeast as a nutrient medium (curve 1) or the prototype powdered chitin, yeast extract, and magnesium and ammonium sulfates (curve 2 ) The yeast concentration is 90 g / l, chitin 20 g / l. On the X axis is the cultivation time, days. On the Y axis - chitinase activity in the culture fluid, E / ml.
Из фиг.2 видно, что культивирование заявляемым способом, по сравнению с прототипом, приводит к повышению продукции хитиназы и сокращению продолжительности культивирования. Уже на 3-и сутки роста выход хитиназы в два раза превышает соответствующий показатель при 6 сутках культивирования на порошкообразном хитине. После 5 суток роста накопление ХА замедляется, поэтому более длительное культивирование представляется нецелесообразным.Figure 2 shows that the cultivation of the claimed method, in comparison with the prototype, leads to an increase in the production of chitinase and a reduction in the duration of cultivation. Already on the 3rd day of growth, the yield of chitinase is two times higher than the corresponding indicator at 6 days of cultivation on powdered chitin. After 5 days of growth, the accumulation of CA slows down, so a longer cultivation seems inappropriate.
На фиг.3 представлены сравнительные данные по ХА в культуральной жидкости трех природных штаммов S.marcescens: В-10, HY+ и 209 при культивировании в течение 3-х суток на средах, содержащих 20 г/л хитина (столбцы серого цвета) и 90 г/л пекарских дрожжей (штрихованные столбцы). По оси Х - названия исследованных штаммов S.marcescens. По оси Y - хитиназная активность в культуральной жидкости, мЕ/мл.Figure 3 presents comparative data on HA in the culture fluid of three natural S.marcescens strains: B-10, HY + and 209 when cultured for 3 days on media containing 20 g / l chitin (gray columns) and 90 g / l baker's yeast (hatched columns). The X axis shows the names of the studied strains of S.marcescens. On the Y axis, chitinase activity in the culture fluid, mU / ml.
Из фиг.3 видно, что по сравнению с прототипом дрожжи в 5-30 раз сильнее стимулируют продукцию хитиназы клетками различных природных штаммов S.marcescens. Эти результаты подтверждают, что использование заявляемого способа культивирования универсально и применимо для увеличения продукции хитиназы различными штаммами S.marcescens как природного происхождения, так и мутантными.Figure 3 shows that, compared with the prototype, yeast 5-30 times stronger stimulate the production of chitinase by cells of various natural strains of S.marcescens. These results confirm that the use of the proposed method of cultivation is universal and applicable for increasing the production of chitinase by various strains of S. marcescens both of natural origin and mutant.
В таблице представлены сравнительные данные по ХА в культуральной жидкости мутантного штамма S.marcescens В-10 М-1 при культивировании в течение 3-х суток на средах, содержащих 20 г/л хитина и биомассу различных вариантов дрожжей Saccharomyces cerevisiae в концентрациях, эквивалентных 90 г/л (по сухому весу). Дополнительным исследуемым фактором было наличие или отсутствие в среде для культивирования дрожжевого экстракта.The table presents comparative data on CA in the culture fluid of the mutant strain S.marcescens B-10 M-1 when cultured for 3 days on media containing 20 g / l chitin and biomass of different variants of Saccharomyces cerevisiae yeast in concentrations equivalent to 90 g / l (dry weight). An additional factor studied was the presence or absence of yeast extract in the culture medium.
Из таблицы видно, что стимулирующими продукцию хитиназы свойствами обладают различные расы дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Индуцирующим эффектом обладают как высушенные клетки, так и влажная прессованная биомасса. Из таблицы также видно, что при использовании цельных клеток дрожжей необходимость в добавлении дрожжевого экстракта отпадает. Дрожжевой экстракт является широко распространенным компонентом питательных сред при культивировании различных микроорганизмов, содержащим водорастворимые аминокислоты, пептиды, витамины и углеводы дрожжевых клеток. Однако нерастворимые элементы клеточных стенок дрожжей в нем отсутствуют. Вероятно, используемые в заявляемом способе цельные дрожжевые клетки содержат в себе все необходимые для роста культуры S.marcescens питательные факторы, а непосредственным индуктором продукции хитиназы являются молекулы хитина, входящие в состав клеточных стенок дрожжей Saccharomyces cerevisiae [7]. Подтверждением такому предположению являются представленные в таблице данные о том, что сопоставимые уровни продукции хитиназы вызывают как цельные клетки дрожжей, так и их изолированные клеточные стенки. Однако в отличие от цельных клеток, клеточные стенки, так же как и порошкообразный хитин, проявляют индуцирующий эффект только в присутствии дрожжевого экстракта.The table shows that stimulating the production of chitinase properties have various races of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Both dried cells and moist pressed biomass have an inducing effect. The table also shows that when using whole yeast cells, the need to add yeast extract disappears. Yeast extract is a widespread component of culture media in the cultivation of various microorganisms containing water-soluble amino acids, peptides, vitamins and carbohydrates of yeast cells. However, insoluble elements of the cell walls of the yeast are absent in it. Probably, the whole yeast cells used in the claimed method contain all the nutritional factors necessary for the growth of S. marcescens culture, and the chitin molecules that make up the cell walls of Saccharomyces cerevisiae yeast are the direct inducer of chitinase production [7]. Confirmation of this assumption is the data presented in the table that comparable levels of chitinase production cause both whole yeast cells and their isolated cell walls. However, unlike whole cells, cell walls, like powdered chitin, exhibit an inducing effect only in the presence of a yeast extract.
Таким образом преимуществом заявляемого способа является сокращение продолжительности культивирования S.marcescens при увеличении выхода хитиназы. Дополнительным преимуществом является то, что пекарские дрожжи являются легко доступным и недорогим компонентом для питательной среды. Стоимость прессованной биомассы дрожжей для пищевого применения составляет около 0,02 рублей за грамм, что соответствует 5-10 рублей на 1 литр питательной среды. Для сравнения порошкообразный хитин, пригодный для применения в качестве компонента питательной среды, производится в ограниченных количествах и его стоимость у разных производителей колеблется от 5 до 50 долларов США за грамм, что соответствует затратам 3000-50000 рублям на 1 литр среды. Еще одним преимуществом заявляемого способа является то, что его применение позволяет исключить из среды для культивирования дрожжевой экстракт и сульфаты аммония и магния, что дополнительно упрощает и удешевляет способ культивирования S.marcescens.Thus, the advantage of the proposed method is to reduce the duration of cultivation of S.marcescens with an increase in chitinase yield. An additional advantage is that baker's yeast is an easily accessible and inexpensive component for a nutrient medium. The cost of pressed biomass of yeast for food use is about 0.02 rubles per gram, which corresponds to 5-10 rubles per 1 liter of nutrient medium. For comparison, powdered chitin, suitable for use as a component of a nutrient medium, is produced in limited quantities and its cost from different manufacturers varies from 5 to 50 US dollars per gram, which corresponds to the costs of 3000-50000 rubles per 1 liter of medium. Another advantage of the proposed method is that its use allows to exclude yeast extract and ammonium and magnesium sulfates from the culture medium, which further simplifies and cheapens the method of cultivation of S.marcescens.
Поскольку предлагаемый способ культивирования S.marcescens предложен впервые и никогда ранее не использовался для выделения хитиназы, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого способа критериям изобретения "новизна" и "изобретательский уровень".Since the proposed method for culturing S.marcescens was proposed for the first time and has never been used to isolate chitinase, we can conclude that the proposed method meets the criteria of the invention of "novelty" and "inventive step".
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.The invention is illustrated by the following examples of specific performance.
Пример 1Example 1
Культивирование штамма Serratia marcescens В-10 М-1 проводят на питательной среде, содержащей (г/л):The cultivation of the strain of Serratia marcescens B-10 M-1 is carried out on a nutrient medium containing (g / l):
Дрожжи пекарские прессованные 120Pressed baker's yeast 120
Вода 1,0лWater 1.0l
рН питательной среды доводят до значения 8,2, добавляя буферную смесь одно- и двузамещенных фосфатов калия (1,5 г/л). Культивирование проводят на качалках со встряхиванием при температуре 29° С с аэрацией в течение 5 суток. Выход хитиназы составляет 1,02 Е/мл.The pH of the nutrient medium was adjusted to a value of 8.2 by adding a buffer mixture of mono- and disubstituted potassium phosphates (1.5 g / l). Cultivation is carried out on a rocking chair with shaking at a temperature of 29 ° C with aeration for 5 days. The yield of chitinase is 1.02 U / ml.
Пример 2Example 2
Культивирование штамма Serratia marcescens В-10 М-1 проводят аналогично примеру 1, за исключением того, что содержание дрожжей в среде составляет 50 г/л, а продолжительность культивирования - 3 суток при температуре 28° С и рН 8,0. Выход хитиназы составляет 0,60 Е/мл.The cultivation of the strain of Serratia marcescens B-10 M-1 is carried out analogously to example 1, except that the yeast content in the medium is 50 g / l, and the cultivation time is 3 days at a temperature of 28 ° C and a pH of 8.0. The yield of chitinase is 0.60 U / ml.
Пример 3Example 3
Культивирование штамма Serratia marcescens В-10 М-1 проводят аналогично примеру 1, за исключением того, что содержание дрожжей в среде составляет 150 г/л, а продолжительность культивирования составляет 4 суток при температуре 30° С и рН 8,4. Выход хитиназы составляет 0,92 Е/мл.The cultivation of the strain of Serratia marcescens B-10 M-1 is carried out analogously to example 1, except that the yeast content in the medium is 150 g / l, and the cultivation time is 4 days at a temperature of 30 ° C and a pH of 8.4. The yield of chitinase is 0.92 U / ml.
Таким образом, разработан способ культивирования бактерий Serratia marcescens, продуцентов хитиназы, обладающий следующими преимуществами по сравнению с известным способом:Thus, a method of cultivating bacteria Serratia marcescens, producers of chitinase, has the following advantages compared with the known method:
- сокращенная продолжительность культивирования (в 2 раза).- reduced duration of cultivation (2 times).
- более высокий выход по хитиназе (более чем в 2 раза);- higher yield on chitinase (more than 2 times);
- сниженная стоимость среды для культивирования (более чем в 10 раз).- reduced cost of the medium for cultivation (more than 10 times).
Применение нового способа культивирования бактерий Serratia marcescens позволит повысить выход хитиназы, упростить ее выделение и уменьшить себестоимость.The use of a new method for the cultivation of bacteria Serratia marcescens will increase the yield of chitinase, simplify its isolation and reduce cost.
ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИSOURCES OF INFORMATION
1. Patil R.S., Ghormade V., Deshpande M.V. Chitinolytic enzymes: an exploration // Enzyme and microbial technology. 2000. V.26. P473-483.1. Patil R.S., Ghormade V., Deshpande M.V. Chitinolytic enzymes: an exploration // Enzyme and microbial technology. 2000. V.26. P473-483.
2. Monreal J., Reese E.T. The chitinase of Serratia marcescens II Canadian Journal of Microbiology. 1969. V.15. P.689-696.2. Monreal J., Reese E.T. The chitinase of Serratia marcescens II Canadian Journal of Microbiology. 1969. V. 15. P.689-696.
3. Watanabe Т., Kimura K., Sumiya Т., Nikaidou N., Suzuki K., Suzuki M., Taiyoji M., Ferrer S., Regue M. Genetic analysis of the chitinase system of Serratia marcescens 2170 //Journal of Bacteriology. 1997. V. 179. Р.7111-7117.3. Watanabe T., Kimura K., Sumiya T., Nikaidou N., Suzuki K., Suzuki M., Taiyoji M., Ferrer S., Regue M. Genetic analysis of the chitinase system of Serratia marcescens 2170 // Journal of Bacteriology. 1997. V. 179. P.7111-7117.
4. Reid J.D., Ogrydziak D.M. Chitinase-overproducing mutant of Serratia marcescens II Applied and Environmental Microbiology. 1981. V.41. P.664-669.4. Reid J.D., Ogrydziak D.M. Chitinase-overproducing mutant of Serratia marcescens II Applied and Environmental Microbiology. 1981. V.41. P.664-669.
5. Панфилова З.И., Дужак А.Б., Салганик Р.И. Штамм бактерий Serratia marcescens - продуцент хитиназы: Патент 2026348 РФ //Б.И. №1, 1995, С.174.5. Panfilova Z.I., Duzhak A.B., Salganik R.I. The bacterial strain Serratia marcescens - producer of chitinase: RF Patent 2026348 // B.I. No. 1, 1995, p. 174.
6. Miller G.L. Use of dinitrosalicilic acid reagent for determination of reducing sugar// Anal. Chem. 1959. V.31. P.426-428.6. Miller G.L. Use of dinitrosalicilic acid reagent for determination of reducing sugar // Anal. Chem. 1959. V.31. P.426-428.
7. Lipke P., Ovalle R. Yeast cell walls: new structures, new challenges //J.Bacteriol. 1998. V.180. P.3735-3740.7. Lipke P., Ovalle R. Yeast cell walls: new structures, new challenges // J. Bacteriol. 1998. V.180. P.3735-3740.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2003103160/13A RU2241744C2 (en) | 2003-02-03 | 2003-02-03 | Method for culturing microorganism serratia marcescens - producer of chitinase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2003103160/13A RU2241744C2 (en) | 2003-02-03 | 2003-02-03 | Method for culturing microorganism serratia marcescens - producer of chitinase |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2003103160A RU2003103160A (en) | 2004-08-10 |
| RU2241744C2 true RU2241744C2 (en) | 2004-12-10 |
Family
ID=34387559
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2003103160/13A RU2241744C2 (en) | 2003-02-03 | 2003-02-03 | Method for culturing microorganism serratia marcescens - producer of chitinase |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2241744C2 (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1730146A1 (en) * | 1990-02-05 | 1992-04-30 | Казанский государственный университет им.В.И.Ульянова-Ленина | Strain of bacteria serratia marcescens - a producer of chitinase |
| RU2026348C1 (en) * | 1992-08-05 | 1995-01-09 | Институт цитологии и генетики СО РАН | Strain of bacterium serratia marcencsens - a producer of chitinase |
| RU2061035C1 (en) * | 1993-10-14 | 1996-05-27 | Любовь Вячеславовна Римарева | Nutrient medium for micromycetes aspergillus oryzae cultivation - a producer of hydrolytic enzymes |
-
2003
- 2003-02-03 RU RU2003103160/13A patent/RU2241744C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1730146A1 (en) * | 1990-02-05 | 1992-04-30 | Казанский государственный университет им.В.И.Ульянова-Ленина | Strain of bacteria serratia marcescens - a producer of chitinase |
| RU2026348C1 (en) * | 1992-08-05 | 1995-01-09 | Институт цитологии и генетики СО РАН | Strain of bacterium serratia marcencsens - a producer of chitinase |
| RU2061035C1 (en) * | 1993-10-14 | 1996-05-27 | Любовь Вячеславовна Римарева | Nutrient medium for micromycetes aspergillus oryzae cultivation - a producer of hydrolytic enzymes |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| АКТУГАНОВ Г.Э., МЕЛЕНТЬЕВ А.И. Выделение, очистка и характеристика хитиназы Bacillus sp. 739. Прикладная биохимия и микробиология. - М.: НАУКА, 1999, Т.35, №6, с.624-628. * |
| Биосинтез микроорганизмами нуклеаз и протеаз. - М.: НАУКА, 1979, с.6-11. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kadokura et al. | Purification and characterization of Vibrio parahaemolyticus extracellular chitinase and chitin oligosaccharide deacetylase involved in the production of heterodisaccharide from chitin | |
| CN104450561B (en) | One plant of application produced chitinase bacterial strain and its chitinase is produced using crab shell fermentation | |
| MXPA04001186A (en) | N-acetyl-d-glucosamine and process for producing n-acetyl-d-glucosamine. | |
| Kim et al. | Novel Acinetobacter parvus HANDI 309 microbial biomass for the production of N-acetyl-β-d-glucosamine (GlcNAc) using swollen chitin substrate in submerged fermentation | |
| Sri et al. | Study of thermostable chitinase enzymes from Indonesian Bacillus K29-14 | |
| CN1150316C (en) | A New Chitinase Produced by Aspergillus fumigatus and Its Isolation and Purification Method | |
| RU2241744C2 (en) | Method for culturing microorganism serratia marcescens - producer of chitinase | |
| JP4434927B2 (en) | Method for producing γ-aminobutyric acid-containing food, and yeast having high γ-aminobutyric acid production ability | |
| CN106754829A (en) | A kind of method of utilization bacillus HS17 fermenting and producing chitosan enzymes and its application | |
| Zarei et al. | Chitinase isolated from water and soil bacteria in shrimp farming ponds | |
| CN110423711B (en) | Low-temperature chitinase-producing strain from Antarctic and fermentation method thereof | |
| Michael | Production of Chitinase from Chromobacterium violaceum Using Agro Industrial Residues under Solid State Fermentation. | |
| Kovaleva et al. | Characteristics of inulinases: methods for regulation and stabilization of their activity | |
| Aftab et al. | Production, kinetics and immobilization of microbial invertases for some commercial applications-a review | |
| Varbanets et al. | Marine actinobacteria–producers of enzymes with Α-l-rhamnosidase activity | |
| Agustiar et al. | Increasing chitinase activity of Serratia marcescens PT-6 through optimization of medium composition | |
| Binod et al. | Chitinases | |
| RU2026348C1 (en) | Strain of bacterium serratia marcencsens - a producer of chitinase | |
| Kovaleva et al. | Development of a Heterogenous Biocatalyst on the basis of Immobilized Inulinase Preparation from Kluyveromyces marxianus | |
| Yakimova et al. | Alpha-galactosidase and invertase from Penicillium chrysogenum sp. 23: purification, characteristics and hydrolysis of raffinose | |
| JP2707093B2 (en) | New microorganism | |
| JPH0660B2 (en) | Novel microorganism capable of degrading chitin | |
| Rameshaiah et al. | Enzymatic Depolymerization of Nano Chitin Particles into N-Acetylglucosamine | |
| Muslim et al. | Purification of levanase from Enterobacter aerogenes and using it as a prebiotic and antibacterial agent | |
| RU2041948C1 (en) | METHOD FOR PRODUCTION OF COMPLEX FERMENT PREPARATION WHICH CONTAINS β-1,3-GLUCANASE AND CHITINASE |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20100204 |