RU2136750C1 - МОДИФИЦИРОВАННАЯ ПРОТЕАЗА ТЕРМОЛИЗИН-ПОДОБНОЙ НЕЙТРАЛЬНОЙ МЕТАЛЛОПРОТЕАЗЫ, СПОСОБ СИНТЕЗА МЕТИЛОВОГО ЭФИРА БЕНЗИЛОКСИКАРБОНИЛ-α-L-АСПАРТИЛ-L-ФЕНИЛАЛАНИНА И СПОСОБ РАСЩЕПЛЕНИЯ МЕТИЛОВОГО ЭФИРА БЕНЗИЛОКСИКАРБОНИЛ-α-L-АСПАРТИЛ-L- ФЕНИЛАЛАНИНА - Google Patents
МОДИФИЦИРОВАННАЯ ПРОТЕАЗА ТЕРМОЛИЗИН-ПОДОБНОЙ НЕЙТРАЛЬНОЙ МЕТАЛЛОПРОТЕАЗЫ, СПОСОБ СИНТЕЗА МЕТИЛОВОГО ЭФИРА БЕНЗИЛОКСИКАРБОНИЛ-α-L-АСПАРТИЛ-L-ФЕНИЛАЛАНИНА И СПОСОБ РАСЩЕПЛЕНИЯ МЕТИЛОВОГО ЭФИРА БЕНЗИЛОКСИКАРБОНИЛ-α-L-АСПАРТИЛ-L- ФЕНИЛАЛАНИНА Download PDFInfo
- Publication number
- RU2136750C1 RU2136750C1 RU96115027A RU96115027A RU2136750C1 RU 2136750 C1 RU2136750 C1 RU 2136750C1 RU 96115027 A RU96115027 A RU 96115027A RU 96115027 A RU96115027 A RU 96115027A RU 2136750 C1 RU2136750 C1 RU 2136750C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- thermolysin
- plasmid
- benzyloxycarbonyl
- aspartyl
- modified protease
- Prior art date
Links
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 title claims abstract description 58
- 239000004365 Protease Substances 0.000 title claims abstract description 58
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 title claims abstract description 34
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 title claims abstract description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims abstract description 23
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 title claims abstract 10
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 title claims abstract 10
- LCGLNKUTAGEVQW-UHFFFAOYSA-N Dimethyl ether Chemical compound COC LCGLNKUTAGEVQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 title abstract 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims abstract description 18
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 14
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims abstract description 12
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims abstract description 12
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims abstract description 10
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims abstract description 9
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 claims description 15
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 12
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 3
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 2
- VSDUZFOSJDMAFZ-UHFFFAOYSA-N methyl 2-amino-3-phenylpropanoate Chemical compound COC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 VSDUZFOSJDMAFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 50
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 abstract description 5
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 68
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 32
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 32
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 23
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 23
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 22
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 22
- 101150017837 nprM gene Proteins 0.000 description 22
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 19
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 18
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 14
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 14
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 13
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 12
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 12
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 11
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 11
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 11
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 10
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 10
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 7
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 6
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 6
- 108090001109 Thermolysin Proteins 0.000 description 6
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 6
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 6
- 101100083742 Caenorhabditis elegans pmk-1 gene Proteins 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 5
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 5
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 5
- XYXYXSKSTZAEJW-VIFPVBQESA-N (2s)-2-(phenylmethoxycarbonylamino)butanedioic acid Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)OCC1=CC=CC=C1 XYXYXSKSTZAEJW-VIFPVBQESA-N 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 4
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 4
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 4
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 4
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 4
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 4
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 4
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 4
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 20-hydroxyecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@](C)(O)[C@H](O)CCC(C)(O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000193389 Bacillus thermoproteolyticus Species 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 101100369308 Geobacillus stearothermophilus nprS gene Proteins 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 3
- SWVMLNPDTIFDDY-FVGYRXGTSA-N methyl (2s)-2-amino-3-phenylpropanoate;hydrochloride Chemical compound Cl.COC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 SWVMLNPDTIFDDY-FVGYRXGTSA-N 0.000 description 3
- 239000005022 packaging material Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 3
- 108010011485 Aspartame Proteins 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IAOZJIPTCAWIRG-QWRGUYRKSA-N aspartame Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)OC)CC1=CC=CC=C1 IAOZJIPTCAWIRG-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- 239000000605 aspartame Substances 0.000 description 2
- 229960003438 aspartame Drugs 0.000 description 2
- 235000010357 aspartame Nutrition 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 2
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- LPLLVINFLBSFRP-UHFFFAOYSA-N 2-methylamino-1-phenylpropan-1-one Chemical compound CNC(C)C(=O)C1=CC=CC=C1 LPLLVINFLBSFRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 101100004280 Caenorhabditis elegans best-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 244000293323 Cosmos caudatus Species 0.000 description 1
- 235000005956 Cosmos caudatus Nutrition 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010020713 Tth polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 239000008122 artificial sweetener Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- UNXNGGMLCSMSLH-UHFFFAOYSA-N dihydrogen phosphate;triethylazanium Chemical compound OP(O)(O)=O.CCN(CC)CC UNXNGGMLCSMSLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- POSZUTFLHGNLHX-KSBRXOFISA-N tris maleate Chemical compound OCC(N)(CO)CO.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)\C=C/C(O)=O POSZUTFLHGNLHX-KSBRXOFISA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
- C07K5/06104—Dipeptides with the first amino acid being acidic
- C07K5/06113—Asp- or Asn-amino acid
- C07K5/06121—Asp- or Asn-amino acid the second amino acid being aromatic or cycloaliphatic
- C07K5/0613—Aspartame
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
- C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/582—Recycling of unreacted starting or intermediate materials
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Модифицированная протеаза термолизин-подобной нейтральной металлопротеазы имеет аминокислотную последовательность SEQ IDN:1, в которой 150-й остаток аспарагиновой кислоты замещен на триптофан. Возможно также проведение замещения 227-го остатка аспарагина на гистидин и/или 144-го остатка лейцина на серин. Модифицированная протеаза способна катализировать процесс синтеза и расщепления метилового эфира бензилоксикарбонил--α--L-аспартил-L-фенилаланина. 3 с. и 3 з.п.ф-лы, 13 ил., 1 табл.
Description
Настоящее изобретение относится к новым термолизин-подобным нейтральным металло-протеазам и их применению, особенно для получения метилового эфира бензилоксикарбонил -α- -L-аспартил-L-фенилаланина.
Термолизин представляет собой ценный энзим, выпускаемый промышленностью и находящий применение в большом числе различных областей, например, в детергентных композициях, в процессах обработки пищи и в косметических рецептурах. Он также используется в синтезе метилового эфира бензилоксикарбонил -α- -L-аспартил-L-фенилаланина (далее в тексте на это вещество кратко ссылаются, как на Z-APM), который представляет собой предшественник аспартама, искусственного подслащивающего агента.
Описание уровня техники
Термолизин впервые был обнаружен в культуральном бульоне Bacillus thermoproteolyticus (Endo, s (1962) J. Fermentation Tech., 40, 346 - 353) и на этом объекте был проведен ряд исследований. Так, например, была установлена его аминокислотная последовательность (Titani. K. с сотр., (1972) Nature New Biol. 238. 35 - 37) и трехмерная структура энзима (Holmes M.A. и Mattews, B. W. , (1982) J. Mol.Biol. 160, 623-639). Между тем протеазный ген был клонирован из Bacillus thermoproteolyticus (EP-A-0418625) и аминокислотная последовательность зрелого энзима, выведенная из нуклеотидной последовательности указанного гена оказалась отличной от оригинальной первичной структуры, установленной Titani, по двум положениям. Так например, было сообщено, что 37-ой (считая от аминоконца) аминокислотный остаток зрелого энзима не является аспарагиновой кислотой, а представляет собой аспарагин, а 119-ый остаток является не глютаминовой кислотой а глютамином. Такая аминокислотная последовательность идентична последовательности закодированной nprM, одним из протеазных генов клонированных из Bacillus thermoproteolyticsu (Kubo, M с сотр., (1988) Journal of General Microb 134, 1883 - 1892).
Термолизин впервые был обнаружен в культуральном бульоне Bacillus thermoproteolyticus (Endo, s (1962) J. Fermentation Tech., 40, 346 - 353) и на этом объекте был проведен ряд исследований. Так, например, была установлена его аминокислотная последовательность (Titani. K. с сотр., (1972) Nature New Biol. 238. 35 - 37) и трехмерная структура энзима (Holmes M.A. и Mattews, B. W. , (1982) J. Mol.Biol. 160, 623-639). Между тем протеазный ген был клонирован из Bacillus thermoproteolyticus (EP-A-0418625) и аминокислотная последовательность зрелого энзима, выведенная из нуклеотидной последовательности указанного гена оказалась отличной от оригинальной первичной структуры, установленной Titani, по двум положениям. Так например, было сообщено, что 37-ой (считая от аминоконца) аминокислотный остаток зрелого энзима не является аспарагиновой кислотой, а представляет собой аспарагин, а 119-ый остаток является не глютаминовой кислотой а глютамином. Такая аминокислотная последовательность идентична последовательности закодированной nprM, одним из протеазных генов клонированных из Bacillus thermoproteolyticsu (Kubo, M с сотр., (1988) Journal of General Microb 134, 1883 - 1892).
В связи с этим, в настоящем описании на протеазу закодированную таким nprM геном или геном из Bacillus thermoproteolyticus ссылаются, как на "термолизин-подобную нейтральную металло-протеазу дикого типа".
Об изменении удельной активности и устойчивости термолизин-подобной нейтральной металло-протеазы сообщалось (Kubo M. c сотр. (1992) Applied and Environmental Microbiology, 58, 3779-3783). В этой статье были описаны мутанты, которые отличаются одним или более аминокислотными остатками в первичной структуре, особенно в положениях 93, 110, 114, 115, 136, 137, 143, 151, 157, 193, 211, 217 и 221. Однако, в этой ссылке активность измеряли только методом казеинового переваривания. Однако, ни один из таких мутантов не демонстрировал сколь-нибудь значительно улучшенной активности в отношении синтеза или переваривания Z-APM. В настоящее время (как это показано в примерах заявки на Европейский патент авторов настоящего изобретения, заявка N 93200773.5) также было установлено, что активность казеинового переваривания не коррелирует с активностью в синтезе Z-APM: оказалось, что даже если удельная активность в отношении переваривания казеина увеличивается, удельная активность в отношении синтеза Z-APM увеличивается не всегда.
Кроме этого, авторы изобретения предварительно обнаружили, что ценные новые протеазы могут быть производными из термолизин-подобной нейтральной металло-протеазы, имеющей (дикий тип) аминокислотную последовательность SEQ 1D No:1, показанную ниже, в результате замены одного или более аминокислотных остатков в некоторых положениях другими аминокислотными остатками отличными от исходных.
(SEQ 1D No:1)
Заявители уже подали заявку на Европейский патент (Заявка N 93200773.5) на такие новые модифицированные протеазы, полученные из указанного дикого типа в результате замены, по крайней мере одного из следующих аминокислотных остатков на отличающиеся от них аминокислоты: 144-ый (лейцин), 150-ый (аспаргиновая кислота), 187-ой (глютаминовая кислота) и 227-ой (аспарагин) аминокислотные остатки.
Заявители уже подали заявку на Европейский патент (Заявка N 93200773.5) на такие новые модифицированные протеазы, полученные из указанного дикого типа в результате замены, по крайней мере одного из следующих аминокислотных остатков на отличающиеся от них аминокислоты: 144-ый (лейцин), 150-ый (аспаргиновая кислота), 187-ой (глютаминовая кислота) и 227-ой (аспарагин) аминокислотные остатки.
Удельная активность модифицированных энзимов, упомянутых в указанных более ранних заявках на патент (которые не опубликованы к дате подачи настоящей заявки), имеющих единственную аминокислотную замену в одном из положений 144, 150, 187 и 227, не более чем в два раза превышает активность энзима дикого типа в отношении синтеза или переваривания Z-APM.
На основании этих наблюдений и поскольку имеются различные проблемы в энзиматическом синтезе Z-APM, например такие, как относительно низкая активность энзима, его инактивация во время реакции конденсации и гидролиза Z-APM и исходного материала - метилового эфира L- или D, L-фенилаланина (PM), вследствие длительного времени реакции и/или неблагоприятных значений pH, существует необходимость в разработке усовершенствованных энзимов, обладающих повышенной активностью в синтезе Z-APM. Разумеется, что при упоминании PM в настоящей заявке могут подразумеваться и его соли.
Краткое изложение сущности изобретения
В настоящее время было неожиданно установлено, что усиление активности модифицированного энзима, имеющего триптофановый остаток в положении 150 в последовательности SEQ 1Д N: 1 во много раз превосходит такой эффект по сравнению с ранее описанными модифицированными протеазами.
В настоящее время было неожиданно установлено, что усиление активности модифицированного энзима, имеющего триптофановый остаток в положении 150 в последовательности SEQ 1Д N: 1 во много раз превосходит такой эффект по сравнению с ранее описанными модифицированными протеазами.
На основании этих наблюдений было реализовано настоящее изобретение, на базе которого обеспечиваются модифицированные протеазы, имеющие аминокислотную последовательность, указанную выше (SEQ 1Д N:1) но с заменой, по крайней мере, 150-го аминокислотного остатка аспаргиновой кислоты (дикий тип) на триптофан. Таким образом предусматривается существенное усиление активности Z-APM синтеза под действием термолизин-подобной нейтральной металло-протеазы, полученной из Bacillus stearothermophilus.
В связи с этим модифицированные протеазы согласно изобретению являются очень ценными веществами для крупномасштабного производства Z-APM.
Краткое описание чертежей
На рис. 1 показана схема, используемая для конструирования рекомбинантной плазмиды под названием pUCTZ37 из известной плазмиды pMK4.
На рис. 1 показана схема, используемая для конструирования рекомбинантной плазмиды под названием pUCTZ37 из известной плазмиды pMK4.
На рис. 2 показана схема, используемая для конструирования рекомбинантной плазмиды под названием pUCTZ47 из плазмиды pMK 4 и плазмиды pUCTZ37.
На рис. 3 показана схема, используемая для конструирования рекомбинантной плазмиды под названием pUBTZ1 из известной плазмиды pUCTZ47 и плазмиды pUB110.
На рис. 4 показана схема, используемая для конструирования рекомбинантной плазмиды под названием pUBTZ2 из плазмиды pUBTZ1.
На рис. 5 показана схема, используемая для конструирования рекомбинантной плазмиды под названием pUBTZ2 (D150W) из плазмиды pUBTZ2 и фрагмента мутантной ДНК, полученного полимеразной цепной реакцией.
На рис. 6 показана схема, используемая для конструирования рекомбинантной плазмиды под названием pUCTZ55 из известной плазмиды pMK1.
На рис. 7 показана схема, используемая для конструирования рекомбинантного M13 фага под названием M13TZSp-Bc из плазмиды pUCTZ55.
На рис. 8 показана схема, используемая для конструирования рекомбинантной плазмиды pUBTZ2 (N227H мутант) из плазмиды pUBTZ2 и M13TZSp-Bc (N227H мутант).
На рис. 9 показана схема, используемая для конструирования рекомбинантной плазмиды под названием pUBTZ2 (D150W - N227H) из плазмиды pUBTZ2 и фрагмента мутантной ДНК, полученного полимеразной цепной реакцией.
На рис. 10 показана схема, используемая для конструирования рекомбинантной плазмиды под названием pUBTZ2 (L144S) из плазмиды pUBTZ2 и фрагмента мутантной ДНК, полученного полимеразной цепной реакцией.
На рис. 11 показана схема, используемая для конструирования рекомбинатной плазмиды под названием UBTZ2 - (144S - D150W - N227H) из плазмиды pUBTZ2 (L144) и плазмиды pUBTZ2 (D150W N 227).
На рис. 12 показаны Z-APM синтетические активности модифицированных энзимов. Для аминокислот приняты однобуквенные сокращения. "D" в 150-ом аминокислотном остатке обозначает термолизин-подобную нейтральную металло-протеазу дикого типа. Энзиматическая активность, обеспечивающая синтез 1 моля Z-APM в секунду обозначена, как 1 катал (kat).
На рис. 13 представлены гидролитические активности модифицированных энзимов в отношении Z-APM.20.
Подробное описание изобретения
В упомянутой выше более ранней заявке на патент раскрываются модифицированные протеазы, в 150-ом положении которых аспаргиновая кислота заменена на аспарагин, гистидин и лизин. Активности таких модифицированных протеаз в сентезе или гидролизе Z-APM были в лучшем случае в 2 раза выше, чем активность термолизин-подобной нейтральной металло-протеазы дикого типа.
В упомянутой выше более ранней заявке на патент раскрываются модифицированные протеазы, в 150-ом положении которых аспаргиновая кислота заменена на аспарагин, гистидин и лизин. Активности таких модифицированных протеаз в сентезе или гидролизе Z-APM были в лучшем случае в 2 раза выше, чем активность термолизин-подобной нейтральной металло-протеазы дикого типа.
Новые модифицированные протеазы согласно настоящему изобретению представляют собой производные, имеющие триптофановой остаток вместо аспаргинокислотного остатка в 150-ом положении последовательности термолизин-подобной нейтральной металло-протеазы, SEQ 1Д N: 1 (Далее они обозначены, Как D150W). Главным образом такие новые протеазы обладают существенно усиленной активностью в синтезе и/или переваривании Z-APM. Пригодность протеаз, полученных согласно изобретению, может быть определена тестами на окончательную применимость. Обычно такое испытание проводится путем анализа активности в синтезе и/или переваривании Z-AMP и сравнения полученных активностей с активностью термолизин-подобной нейтральной металло-протеазы дикого типа, испытанной в аналогичных условиях. Такой метод описан в следующих ниже примерах.
Другие положения модифицированных протеаз (D150W) могут быть замены другими аминокислотными остатками. Так например, были синтезированы двух-сайтный мутант, в 150-ом положении которого была произведена замена аспаргиновой кислоты на триптофан, а в 227-ом положении - замена аспарагина на гистидин (D150W - N227H) и трех-сайтный мутант, в 114-ом положении которого лейцин заменяли на серин, в 150-ом положении аспаргиновую кислоту заменяли на триптофан, а в 227-ом положении аспарагин заменяли на гистидин (L144S - D150W - N227H) и было показано, что такие мутанты очень активны и стабильны в синтезе Z-AMP.
Модифицированные энзимы могут быть получены методами, известными perse специалистам в данной области.
Известны различные способы, которые могут использоваться для введения мутаций в клонированные ДНК. Так например, фрагменты мутантного nprM гена могут быть получены с использованием метода мутагенеза фаза M13 (Vandeyar с сотр. (1988) Gene, 65, 129).
Плазмидные и фаговые ДНК, используемые в качестве матриц в таком способе, могут быть производными известной плазмиды pMK1 (Kubo M., Imanaka T., (1989), J. Bacteriol, 171, 4080 - 4082). Некоторые рестриктазы могут использоваться для переваривания и клонирования фрагментов nprM гена в другую плазмиду или в фаговые векторы. Мутагенные праймеры должны быть комплементарны к одно-нитевой матричной ДНК, содержащей nprM ген, за исключением кодона (ов) для замененных аминокислотных остатков. Различные нуклеотидные последовательности также могут использоваться для таких целей. При использовании таких мутагеных праймеров, имеющих различные кодоны для замененных аминокислотных остатков, могут быть достигнуты любые желательные замены аминокислот.
С другой стороны, nprM ген может быть подвергнут мутации с помощью PCR техники (полимеразная цепная реакция) с использованием химически синтезированных праймеров (Higuchi R. , Krummel B., Saiki R. (1988), Nucleic Acids Res. 16, 7351 - 7367). В том случае, когда сайт рестрикционного энзима существует вблизи от сайта мутации, метод PCR оказывается особенно полезным. Поскольку, например, сайт расщепления для рестрикционного энзима Sphl находится вблизи кодона аспаргиновой кислоты в 150-ом положении термолизин-подобной нейтральной металло-протеазы дикого типа, мутагенные праймеры, содержащие такой Sphil сайт могут использоваться для продуцирования мутантов в 150-ом положении. Таким образом, мутагенный праймер используется в качестве смыслового праймера. В качестве обратно-направляющего праймера (антисмыслового) может использоваться олигонуклеотид, который комплиментарен nprM гену вправо, например, от сайта расщепления AatI nprM гена.
Два способа могут использоваться для осуществления мутагенеза на более, чем одном сайте. Один способ заключается в осуществлении одновременного мутагенеза на всех сайтах-мишенях, тогда как другой способ включает введение мутаций последовательно. Оба способа обеспечивают получение плазмид с мутациями на более, чем одном сайте.
Основной способ получения рекомбинантной термолизин-подобной нейтральной металло-протеазы описан в литературе (Kubo M., Imanaka T. (1989) J.Bacteriol, 171, 4080 - 4082) и он включает: вставку ДНК, кодирующий модифицированную термолизин-подобную нейтральную металло-протеазу, в вектор экспрессии, использование такого вектора для трансформации клетки-хозяина, культивирование трансформанта до аккумуляции модифицированной металло-протеазы в культуре и последующее отделение модифицированного энзима от культуры. Однако, плазмида pMK1, используемая в этой ссылке, имеет размер более 20 kb и поэтому довольно трудно трансформировать Escherichia coli с помощью указанной плазмиды. Кроме этого было обнаружено, что в случае Bacillus subtilis плазмида pMK1 в значительной мере выбирает на последней стадии культивирования.
В связи с этим, с целью снятия указанных проблем авторы изобретения сконструировали бифункциональные векторы, с помощью которых оба хозяина, Escherichia coli и Bacillus subtilis, способны подвергаться трансформации и которые способны экспрессировать nprM ген в этих хозяевах. Как показано на рис. 1 - 4 таким образом были сконструированы два бифункциональных вектора, содержащих nptM ген (pUBTZ1 и pUBTZ2). При их использовании для трансформации таких штаммов Escherichia coli, как HB101 и JM103, nprM ген экспрессируется в таких штаммах. Кроме того, трансформация таких штаммов разновидности Bacillus subtilis, как DB104, DB117 и MT-2, такими плазмидами приводит к успешной экспрессии nprM гена. Кроме этого, на последней стадии культивирования не наблюдалось их выхода из процесса.
Аналогичные результаты и преимущества использования таких бифункциональных векторов достигались при использовании модифицированных термолизин-подобных нейтральных металло-протеазных генов, вместо гена дикого типа.
Модифицированная термолизин-подобное нейтральная металло-протеаза может вырабатываться в рекомбинантных бактериях и секретироваться в культуральную среду. Такие протеазы могут быть извлечены осаждением с помощью сульфата аммония и очищены до гомогенности традиционными способами, например, хроматографией гидрофобного взаимодействия и/или гельфильтрацией.
Модифицированные протеазы могут использоваться для синтеза Z-AMP, являющегося предшественником аспартама, более эффективно, чем термолизин-подобная нейтральная металло-протеаза дикого типа. На этот факт указывает сравнение активностей таких модифицированных протеаз и энзимов дикого типа в переваривании Z-APM и синтезе Z-APM. Такие активности оказались значительно выше, чем у энзима дикого типа и у модифицированных протеаз, описанных в упомянутой выше заявке на Европейский патент (заявка N 93200773.5). Измеренные значения таких активностей будут приведены в следующих ниже примерах.
Как отмечалось выше, новые модифицированные протеазы согласно изобретению представляют собой термолизин-подобные нейтральные металло-протеазы с последовательностью SEQ 1D No:1, в которой 150-ый аспаргиновокислотный остаток заменен на триптофан (D150W).
Следует отметить, что активность казеинового переваривания не связана с активностью в синтезе или переваривании Z-APM. При сравнении активностей мутантных энзимов для казеина и Z-APM совершенно очевидно, что даже если активность в переваривании казеина понижается, то активность в синтезе и/или переваривании Z-APM может значительно увеличиваться. Следующие ниже примеры представлены лишь в целях иллюстрации настоящего изобретения и никоим образом не ограничивают его сферу.
Пример 1.
/Синтез модифицированной протеазы, в последовательности которой 150-ый кислотный остаток заменен с аспаргиновой кислоты на триптофан (D150W)/
a) Конструирование экспрессирующей плазмиды pUBTZ2, содержащей nprM ген дикого типа.
a) Конструирование экспрессирующей плазмиды pUBTZ2, содержащей nprM ген дикого типа.
Из плазмиды pMK4 (Yamada с сотр., (1991) Gene, 99, 109 - 114), фрагмент ДНК размером примерно 1,0 kb, содержащий часть nprM гена, который был получен расширением BcLI клонировали в BamHI-сайт плазмиды pUC9 с целью конструирования плазмиды pUCTZ37 (Рис. 1).
Плазмида pUCTZ37 была неполной и не содержала 5'-концевого участка nprM гена. Плазмиду pUCTZ37 расщепляли рестрикционной эндонуклеазой HindIII и HindIII фрагмент pMK4 размером 1,2 kb клонировали в более крупный фрагмент pUCTZ37 для конструирования плазмиды pUCTZ47 (Рис. 2). Рекомбинантная плазмида pUCTZ47 содержит последовательность nprM полной длины и его транскрипционную промоторную последовательность.
Для конструирования бифункциональных векторов для Escherichia coli и Bacillus subtilis, как pUCTZ47, так и pUB110 (Keggins K.M. с сотр., Proc, Natl. Ac. Sci USA (1978), 75, 1423 - 1427) расщепляли EcoRI и лигировали T4 ДНК лигазой с целью конструирования плазмиды pUBTZ1, как это показано на Рис. 3.
Наконец, фрагмент ДНК между рестрикционными сайтами Smal и Pvull подвергали делеции из плазмиды pUBTZ1, как это показано на рис. 4, с целью конструирования плазмиды pUBTZ2.
Плазмида pUBTZ2 имеет единственные BamHI, SphI и AatI рестрикционные сайты в nprM гене.
b) Мутагенез сайта 150 Trp
Олигонуклеотиды, используемые для мутагенеза, синтезировали с использованием ДНК синтезатора модели 380B, выпускаемого Апплайд Биосистемс Ко. Лтд. Нуклеотидная последовательность праймера мутагенеза была следующей
(SEQ 1D No:2)
Кроме этого синтезировали обратно-направляющий праймер с нуклеотидной последовательностью, показанной ниже.
Олигонуклеотиды, используемые для мутагенеза, синтезировали с использованием ДНК синтезатора модели 380B, выпускаемого Апплайд Биосистемс Ко. Лтд. Нуклеотидная последовательность праймера мутагенеза была следующей
(SEQ 1D No:2)
Кроме этого синтезировали обратно-направляющий праймер с нуклеотидной последовательностью, показанной ниже.
(SEQ 1D No:3)
5'-GAGATACCACTTTATTTCACCCCT-3'
1 нг плазмиды pUBTZ2 растворяли в 100 мкл реакционной смеси для PСR (67 мМ Трис-гидрохлорида (pH 8.8), 16,6 мМ сульфата аммония, 6.7 мМ MgCl2, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 0.05 мМ dATP, 0.05 мМ dTTP, 0.05 мМ dGTP, 0,05 мМ dCTP, 1 мкМ праймера мутагенеза, 1 мкМ обратно-направляющего праймера) и добавляли 1 единицу Tth ДНК-полимеразы. Раствор покрывали одной каплей минерального масла. Денатурацию в течение 1 минуты при 93oC, отжиг в течение 1 минуты при 45oC и удлинение в течение 45 секунд при 72oC повторяли 30 раз. После завершения реакции водный слой удаляли, экстрагировали фенолом и обрабатывали этанолом для выделения амплифицированной ДНК.
5'-GAGATACCACTTTATTTCACCCCT-3'
1 нг плазмиды pUBTZ2 растворяли в 100 мкл реакционной смеси для PСR (67 мМ Трис-гидрохлорида (pH 8.8), 16,6 мМ сульфата аммония, 6.7 мМ MgCl2, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 0.05 мМ dATP, 0.05 мМ dTTP, 0.05 мМ dGTP, 0,05 мМ dCTP, 1 мкМ праймера мутагенеза, 1 мкМ обратно-направляющего праймера) и добавляли 1 единицу Tth ДНК-полимеразы. Раствор покрывали одной каплей минерального масла. Денатурацию в течение 1 минуты при 93oC, отжиг в течение 1 минуты при 45oC и удлинение в течение 45 секунд при 72oC повторяли 30 раз. После завершения реакции водный слой удаляли, экстрагировали фенолом и обрабатывали этанолом для выделения амплифицированной ДНК.
20 мкл реакционной смеси (50 мМ Трис-гидрохлорида при pH 7.5, 10 мМ MgCl2, 0.1 M NaCl, 1 мМ ДТТ), содержащей половинное количество амплифицированной ДНК переваривали 5 единицами каждого из рестрикционных энзимов SphI и AatI при 37oC в течение 2 часов и инкубировали в течение 5 минут при 70oC. Мутированный SphI - AatI фрагмент лигировали с SphI - AatI фрагментом pUBTZ2 (7.6 kb) с использованием набора для лигирования ДНК Takara Shuzo. Лигирующую смесь использовали для трансформации Escherichia coli JM103, используя традиционный способ с получением трасформанта JM103/pUBTZ2 (D150W). Замещенные аминокислоты подтверждали путем определения нуклеотидной последовательности такой плазмиды.
c) Приготовление очищенного мутантного энзима из рекомбинантной Bacillus subtilis
Описанную выше плазмиду ДНК экстрагировали быстрым щелочным-SDS методом (Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook Jr., (1989), Молекулярное клонирование: лабораторное руководство (2-ое изд.) Колд Спринг Харбор Лаборатори Пресс, Колд Спринг Харбор, Н-Й. США. 1.25 - 1.28). Трансформацию Bacillus subtilis MT-2 штамма осуществляли способом компетентных клеток (Harby K. (1985) в: Glover D. , ред. Клонирование ДНК, т. 11 (1-е изд.), IRL) Пресс Лимитед. Оксфорд. Англия, 1 - 17).
Описанную выше плазмиду ДНК экстрагировали быстрым щелочным-SDS методом (Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook Jr., (1989), Молекулярное клонирование: лабораторное руководство (2-ое изд.) Колд Спринг Харбор Лаборатори Пресс, Колд Спринг Харбор, Н-Й. США. 1.25 - 1.28). Трансформацию Bacillus subtilis MT-2 штамма осуществляли способом компетентных клеток (Harby K. (1985) в: Glover D. , ред. Клонирование ДНК, т. 11 (1-е изд.), IRL) Пресс Лимитед. Оксфорд. Англия, 1 - 17).
Одну колонию полученного таким образом трансформанта Bacillus subtilis MT-2/pUBTZ2 (D150W) переносили в 5 мл LB среды, содержащей канамицин (5 мкг/мл) и инкубировали в течение ночи при 37oC. Культуру переносили в 500 мл 2 L среды (2% триптона Бакто, 1% дрожжевого экстракта, 0.5% NaCl), содержащей канамицин (5 мкг/мл) и инкубировали в течение 20 часов при 37oC. Культуральный бульон центрифугировали в течение 30 минут со скоростью 8000 об/мин для удаления бактерий, к супернатанту добавляли сульфат аммония до достижения 60% насыщения и смесь перемешивали в течение ночи при 4oC.
Осадок удаляли центрифугированием и растворяли в 10 мл буфера A (20 мМ Трис-гидрохлорида при pH 9.0 10 мМ CaCl2). Раствор наносили на 20 мл Butyl-Toyopearl, после чего элюировали буфером A при скорости потока 1,5 мл/мин. Активные фракции объединяли и обессоливали с помощью 60% насыщенного сульфата аммония. Осадок собирали центрифугированием в течение 30 минут со скоростью 15000 об/мин и растворяли в 5 мл буфера B (10 мМ Трис-гидрохлорида при pH 7,0, 0,1 M NaCl, 10 мМ CaCl2). Энзимный раствор дополнительно пропускали через гель-фильтрационную колонку (TSK Гель G2000( 21,5 x 300 мм)), с последующим элюированием буфером B с объемной скоростью 1 мл/мин. Активные фракции объединяли с получением очищенного энзима.
На рис. 5 показана схема, используемая для конструирования рекомбинантной плазмиды pUBTZ2 (D150W).
Пример 2
/Синтез модифицированной протеазы с двойной заменой на 150-ом аминокислотном остатке аспаргиновой кислоты на триптофан и на 227-ом аминокислотном остатке аспарагина на гистидин (D150W - N227H)/
D150W - N227H двух-сайтный мутант термолизин-подобной нейтральной металло-протеазы конструировали следующим образом:
а) мутагенез сайта 227 His
1 мкг плазмиды рМК1, содержащей термолизин-подобный нейтральный металло-протеазный ген nprM, производный из Bacillus stearothermophilus MK 232 (Kubo M. , и Imanaka T (1989) J. Becteriol 171, 4080 - 4082) переваривали 5 единицами каждого из рестрикционных энзимов Pst I и BamHI в 20 мкл реакционной смеси (50 мМ Трис-гидрохлорида при pH 7,5, 10 мМ MgCl2, 0,1 M NaCl, 1 мM ДДТ) при 37oC в течение 2 часов. Образец подвергали гельэлектрофорезу на 1% агарозе и фрагмент ДНК размером примерно 3,5 kb выделяли и очищали с помощью набора для очистки ДНК Био-101 Ген Клин.
/Синтез модифицированной протеазы с двойной заменой на 150-ом аминокислотном остатке аспаргиновой кислоты на триптофан и на 227-ом аминокислотном остатке аспарагина на гистидин (D150W - N227H)/
D150W - N227H двух-сайтный мутант термолизин-подобной нейтральной металло-протеазы конструировали следующим образом:
а) мутагенез сайта 227 His
1 мкг плазмиды рМК1, содержащей термолизин-подобный нейтральный металло-протеазный ген nprM, производный из Bacillus stearothermophilus MK 232 (Kubo M. , и Imanaka T (1989) J. Becteriol 171, 4080 - 4082) переваривали 5 единицами каждого из рестрикционных энзимов Pst I и BamHI в 20 мкл реакционной смеси (50 мМ Трис-гидрохлорида при pH 7,5, 10 мМ MgCl2, 0,1 M NaCl, 1 мM ДДТ) при 37oC в течение 2 часов. Образец подвергали гельэлектрофорезу на 1% агарозе и фрагмент ДНК размером примерно 3,5 kb выделяли и очищали с помощью набора для очистки ДНК Био-101 Ген Клин.
Отдельно, 1 мкг плазмиды pUC9 переваривали 5 единицами каждого из рестрикционных энзимов PstI и BamHI в 20 мкл такой же реакционной среды, что указана выше в течение 2 часов при 37oC.
PstI - BamHI фрагмент nprM гена лигировали с PstI - BamHI фрагментом pUC9 с использованием набора для лигирования ДНК Takara Shuzo. Лигирующую смесь использовали для трансформации Escherichia coli JM109 традиционным способом с получением рекомбинантной плазмиды (pUCTZ55), содержащей PstI - BamHI фрагмент nprM гена (рис. 6).
1 мкг рекомбинантной плазмиды pUCTZ55 переваривали 5 единицами каждого из SphI и BClI в 20 мкл реакционной смеси (50 мМ Трис-гидрохлорида при pH 7,5, 10 мМ MgCl2, 0,1 M NaCl, 1 мМ ДДТ) при 37oC в течение 2 часов. Образец подвергали гельэлектрофорезу на 1% агарозе и фрагмент ДНК размером примерно 550 bp выделяли и очищали с использованием набора для очистки ДНК Био-101 Ген Клин.
Отдельно, 1 мкг фагового вектора M13mp18 переваривали 5 единицами каждого из рестрикционных энзимов SphI и BamHI в 20 мкл такой же реакционной среды, что указана выше, в течение 2 часов при 37oC.
SphI - BclI фрагмент nprM гена лигировали с SphI - BamHI фрагментом M13mp18 с использованием набора для лигирования ДНК Takara Shuzo. Лигирующую смесь использовали для трансформации Esherichia coli JM109 традиционным способом с получением рекомбинантного фага (M13TZSp-Bc), содержащего SphI - BclI фрагмента nprM гена (рис. 7).
Однонитевую ДНК получали из M13TZSp-Bc традиционным способом и подвергали мутагенезу. Олигонуклеотиды, используемые для мутагенеза, получали с использованием ДНК-синтезатора фирмы Апплайд Биосистемс модель 380В.
Мутагенный олигонуклеотид, используемый для замены 227-го остатка (аспарагин на гистидин), показан ниже.
(SEQ 1Д No:4)
Мутагенез осуществляли с использованием USBT7-GEN in vitro мутагенного набора, после чего устанавливали последовательность ДНК для подтверждения мутации.
Мутагенез осуществляли с использованием USBT7-GEN in vitro мутагенного набора, после чего устанавливали последовательность ДНК для подтверждения мутации.
Двунитевую ДНК мутированной M13TZSp - Bc получали традиционным способом и 1 мкг двунитевой ДНК переваривали 5 единицами каждого из рестрикционных энзимов SphI и AatI в 20 мкл реакционной смеси (50 мМ Трис-гидрохлорида при pH 7,5, 10 мМ MgCl2, 0,1 М NaCl, 1 мМ ДДТ) в течение 2 часов при 37oC и подвергали электрофорезу на 1% агарозном геле. Фрагмент ДНК размером около 550 bp выделяли из M13TZSp - Bc переваров и фрагмент ДНК очищали с использованием набора для очистки ДНК Био-101 Ген Клин.
Плазмиду pUBTZ2 переваривали рестрикционными энзимами SphI и AatI и выделяли фрагмент размером 7,6 kb. Мутированный SphI и AatI фрагмент nprM гена (около 550 bp) лигировали с помощью полученного таким образом SphI и AatI фрагмента pUBTZ2 с использованием набора для лигирования ДНК Takara Shuzo. Лигирующую смесь использовали для трансформации Escherichia coli JM103 традиционным способом с получением рекомбинантной плазмиды pUBTZ2 (N227H) (рис. 8).
b) Мутагенез сайта 150 Trp и получение мутантного энзима (D150W - N 227H)
Плазмиду pUBTZ2 (N227H) использовали в качестве матрицы для полимеразной цепной реакции. Использовали мутагенезный праймер последовательности SEQ 1Д No:2 и обратно-направляющий праймер последовательности SEQ 1Д No:3.
Плазмиду pUBTZ2 (N227H) использовали в качестве матрицы для полимеразной цепной реакции. Использовали мутагенезный праймер последовательности SEQ 1Д No:2 и обратно-направляющий праймер последовательности SEQ 1Д No:3.
1 нг плазмиды pUBTZ2 (N227H) растворяли в 100 мкл реакционной смеси PCR (67 мМ Трис-гидрохлорида при pH 8,8, 16,6 мМ сульфата аммония, 6,7 мМ MgCl2, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 0,05 мМ dATP, 0,05 мМ dTTP, 0,05 мМ dGTP, 0,05 мМ dCTP, 1 мкМ мутагенезного праймера, 1 мкм обратно-направляющего праймера) и добавляли 1 единицу Thh ДНК полимеразы. Раствор покрывали одной каплей минерального масла. Денатурацию в течение 1 минуты при 93oC, отжиг в течение 1 минуты при 45oC и удлинение в течение 45 секунд при 72oC повторяли 30 раз. После завершения реакции водный слой удаляли, экстрагировали фенолом и обрабатывали этанолом для извлечения амплифицированной ДНК (D150W - N227H).
20 мкл реакционной среды (50 мМ Трис-гидрохлорида при pH 7,5, 10 мМ MgCl2, 100 мМ NaCl, 1 мМ ДДТ), содержащей половинное количество амплифицированной ДНК переваривали 5 единицами каждого из рестрикционных энзимов SphI и AatI при 37oC в течение 2 часов и инкубировали в течение 5 минут при 70oC. Мутированный SphI - AatI фрагмент лигировали с 7,6 kb SphI - AatI фрагментом pUBTZ2 с использованием набора для лигирования ДНК Takara Shuzo. Лигирующую смесь использовали для трансформации Escherichia coli JM103 традиционным способом с получением трансформанта JM103/pUBTZ2 (D150W - N227H). Замещенную аминокислоту подтверждали определением нуклеотидной последовательности такой плазмиды.
Плазмидную ДНК использовали для трансформации Bacillus subtilis MT-2 и модифицированную протеазу (D150W - N227H) получали тем же способом, что описан в примере 1.
На рис. 9 показана схема, используемая для конструирования рекомбинантной плазмиды pUBTZ2 (D150W - N227H).
Пример 3
/Синтез модифицированной протеазы с тройным замещением: лейцина на серин на 144-ом аминокислотном остатке, аспаргиновой кислоты на триптофан на 150-ом аминокислотном остатке и аспарагина на гистидин на 227-ом аминокислотном остатке (L144S - D 150W - N227H)/
Трех-сайтный мутант термолизин-подобный нейтральный металло-протеазы конструировали следующим образом.
/Синтез модифицированной протеазы с тройным замещением: лейцина на серин на 144-ом аминокислотном остатке, аспаргиновой кислоты на триптофан на 150-ом аминокислотном остатке и аспарагина на гистидин на 227-ом аминокислотном остатке (L144S - D 150W - N227H)/
Трех-сайтный мутант термолизин-подобный нейтральный металло-протеазы конструировали следующим образом.
a) Мутагенез сайта 144 Ser.
Мутагенный олигонуклеотид, используемый для замены 144-го остатка (лейцина на серин), показан ниже.
(SEQ 1Д No: 5)
Кроме этого синтезировали смысловой праймер с нуклеотидной последовательностью, показанной ниже.
Кроме этого синтезировали смысловой праймер с нуклеотидной последовательностью, показанной ниже.
(SEQ 1Д No: 6)
1 нг плазмиды pUBTZ2 растворяли в 100 мкл реакционной смеси для PCR (67 мМ Трис-гидрохлорида при pH 8,8, 16,6 мМ сульфата аммония, 6,7 мМ MgCl2, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 0,05 мМ dATP, 0,05 мМ dTTP, 0,05 мМ dGTP, 0,05 мМ dCTP, 1 мкМ мутагенезного праймера, 1 мкм смыслового праймера), и добавляли 1 единицу Tth ДНК полимеразы. Раствор покрывали одной каплей минерального масла. Денатурацию в течение 1 минуты при 93oC, отжиг в течение 1 минуты при 45oC и удлинение в течение 45 секунд при 72oC повторяли 30 раз. После завершения реакции водный слой удаляли, экстрагировали фенолом и обрабатывали этанолом для извлечения амплифицированной ДНК.
1 нг плазмиды pUBTZ2 растворяли в 100 мкл реакционной смеси для PCR (67 мМ Трис-гидрохлорида при pH 8,8, 16,6 мМ сульфата аммония, 6,7 мМ MgCl2, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 0,05 мМ dATP, 0,05 мМ dTTP, 0,05 мМ dGTP, 0,05 мМ dCTP, 1 мкМ мутагенезного праймера, 1 мкм смыслового праймера), и добавляли 1 единицу Tth ДНК полимеразы. Раствор покрывали одной каплей минерального масла. Денатурацию в течение 1 минуты при 93oC, отжиг в течение 1 минуты при 45oC и удлинение в течение 45 секунд при 72oC повторяли 30 раз. После завершения реакции водный слой удаляли, экстрагировали фенолом и обрабатывали этанолом для извлечения амплифицированной ДНК.
20 мкл реакционной смеси (50 мМ Трис-гидрохлорида при pH 7,5, 10 мМ MgCl2, 0,1 М NaCl, 1 мМ ДДТ), содержащей половинное количество амплифицированной ДНК, переваривали 5 единицами каждого из рестрикционных энзимов BamI и SphI при 37oC в течение 2 часов, после чего инкубировали в течение 5 минут при 70oC. Мутированный BamI - SphI фрагмент лигировали с BamI - SphI фрагментом pUBTZ2 (7,4 kb) с использованием набора для лигирования ДНК Takara Shuzo. Лигирующую смесь использовали для трансформации Escherichia coli JM103 традиционным методом с получением трансформанта JM103/pUBTZ2 (L144S). Замещенную аминокислоту подтверждали определением нуклеотидной последовательности такой плазмиды.
На рис. 10 приведена схема, используемая для конструирования рекомбинантной плазмиды .
b) Конструирование плазмиды pUBTZ2 (L144S - D150W - N227H)
20 мкл реакционной смеси (50 мМ Трис-гидрохлорида при pH 7,5, 10 мМ MgCl2, 0,1 М NaCl, 1 мМ ДДТ), содержащей 1 мкг pUBTZ2 (D150W - N227H), полученной в примере 2, переваривали 5 единицами каждого из рестрикционных энзимов SphI и AatI в течение 2 часов при 37oC и инкубировали в течение 5 минут при 70oC. Мутантный SphI - AatI фрагмент лигировали с 7,6 kb SphI - AatI фрагментом pUBTZ2 (L144S) с использованием набора для лигирования ДНК Takara Shuzo. Лигирующую смесь использовали для трансформации Escherichia coli JM103 традиционным способом с получением трансформанта JM103/pUBTZ2 (L144S - D150W - N227H). Замещенную аминокислоту подтверждали определением нуклеотидной последовательности такой плазмиды.
20 мкл реакционной смеси (50 мМ Трис-гидрохлорида при pH 7,5, 10 мМ MgCl2, 0,1 М NaCl, 1 мМ ДДТ), содержащей 1 мкг pUBTZ2 (D150W - N227H), полученной в примере 2, переваривали 5 единицами каждого из рестрикционных энзимов SphI и AatI в течение 2 часов при 37oC и инкубировали в течение 5 минут при 70oC. Мутантный SphI - AatI фрагмент лигировали с 7,6 kb SphI - AatI фрагментом pUBTZ2 (L144S) с использованием набора для лигирования ДНК Takara Shuzo. Лигирующую смесь использовали для трансформации Escherichia coli JM103 традиционным способом с получением трансформанта JM103/pUBTZ2 (L144S - D150W - N227H). Замещенную аминокислоту подтверждали определением нуклеотидной последовательности такой плазмиды.
Плазмидную ДНК использовали для трансформации Bacillus subtilis MT-2 и модифицированную протеазу (L144S - D150W - N227H) получали тем же способом, что описан в примере 1.
На рис. 11 приведена схема, используемая для конструирования рекомбинантной плазмиды pUBTZ2 (L144S - D150W - N227H).
Пример 4.
/Определение активности модифицированных протеаз/
(1) Активность в синтезе Z-APM
Z-APM синтетическую активность определяли методом жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC) после реакции конденсации бензилоксикарбонил-L-аспаргиновой кислоты (Z-Asp) с гидрохлоридом метилового эфира L-фенилаланина (L-PM). Мутантную протеазу инкубировали с 0,1 M Z-Asp и 0,1 M L-PM в 0,1 M Трис-малеатном буфере (pH 6 и 7) при 35oC в течение 30 минут. Реакцию обрывали добавлением равного объема 0,125 М ЕДТА. Количество синтезированной Z-APM определяли методом HPLC на колонке с космосил C-18 (Nakalai tesgue). HPLC осуществляли с помощью 60 мМ Триэтиламин-фосфатного буфера (pH 3,0), содержащего 40% ацетонитрила в качестве элюента, при скорости потока 1,0 мл/мин. и элюированный Z-APM определяли по поглощению при длине волны 224 нм. Активность синтеза 1 моля Z-APM в секунду определяли, как 1 катал (kat).
(1) Активность в синтезе Z-APM
Z-APM синтетическую активность определяли методом жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC) после реакции конденсации бензилоксикарбонил-L-аспаргиновой кислоты (Z-Asp) с гидрохлоридом метилового эфира L-фенилаланина (L-PM). Мутантную протеазу инкубировали с 0,1 M Z-Asp и 0,1 M L-PM в 0,1 M Трис-малеатном буфере (pH 6 и 7) при 35oC в течение 30 минут. Реакцию обрывали добавлением равного объема 0,125 М ЕДТА. Количество синтезированной Z-APM определяли методом HPLC на колонке с космосил C-18 (Nakalai tesgue). HPLC осуществляли с помощью 60 мМ Триэтиламин-фосфатного буфера (pH 3,0), содержащего 40% ацетонитрила в качестве элюента, при скорости потока 1,0 мл/мин. и элюированный Z-APM определяли по поглощению при длине волны 224 нм. Активность синтеза 1 моля Z-APM в секунду определяли, как 1 катал (kat).
В целях сравнения авторы изобретения также синтезировали и исследовали все другие D150 мутанты с использованием случайного мутагенезного праймера.
Нуклеотидная последовательность случайного мутагенезного праймера была следующей:
Кодон 150-ой аминокислоты где каждый Х, независимо друг от друга, представляет собой G, A, T или C.
Кодон 150-ой аминокислоты где каждый Х, независимо друг от друга, представляет собой G, A, T или C.
Такой праймер имеет изменчивость на команде 150-го аминокислотного остатка и может вводить все 20 аминокислотных остатков в 150-е положение. Авторы изобретения ввели различные мутации в 150-е положение с использованием мутагенезного праймера и изучили их все, за исключением триптофана.
1 нг плазмиды pUBTZ2 растворили в 100 мкл реакционной смеси PCR (67 мМ трис-гидрохлорида при pH 8,8, 16,6 мМ сульфата аммония, 6,7 мМ MgCl2, 10 мМ 2-меркаптоэтанола. 0,05 мМ dATP 0,05 мМ dTTP, 0,05 мМ dGTP, 0,05 dCTP, 1 мкМ мутагенезного праймера, 1 мКм обратно-направляющего праймера) и добавляли 1 единицу Tth ДНК полимеразы. Раствор покрывали одной каплей минерального масла. Денатурацию в течение 1 минуты при 93oC, отжиг в течение 1 минуты при 45oC и удлинение в течение 45 секунд при 72oC повторяли 30 раз. После завершения реакции водный слой удаляли, экстрагировали фенолом и обрабатывали этанолом для извлечения амплифицированной ДНК.
20 мкл реакционной смеси (50 мМ Трис-гидрохлорида при pH 7,5, 10 мМ MgCl2, 0,1 M NaCl, 1 мМ ДТТ), содержащей половинное количество амплифицированной ДНК, переваривали 5 единицами каждого из SphI и AatI при 37oC в течение 2 часов и инкубировали в течение 5 минут при 70oC. Мутантный SphI - AatI фрагмент лигировали с 7,6 kb SphI - AatI фрагментом pUBTZ2 с использованием набора для лигирования ДНК Takara Shuzo. Лигирующую смесь использовали для трансформации Escherichia coli Jm103 традиционным способом с получением трансформанта JM103/pUBTZ2. Замещенную аминокислоту подтверждали определением нуклеотидной последовательности плазмиды.
Плазмидную ДНК, за исключением D150W мутанта, выделяли быстрым щелочным - SDS методом. Трансформацию штамма Bacillus subtilis МТ-2 проводили способом компетентных клеток.
Одну колонию каждого различного Bacillus subtilic МТ-2/pUBTZ2 (мутантного) трансформанта инокулировали в 5 мл LB среды, содержащей канамицин (5 мкг/мл), и инкубировали при 37oC в течение ночи. Культуру переносили в 500 мл 2L среды (2% Бакто триптона, 1% дрожжевого экстракта, 0,5% NaCl), содержащей канамицин (5 мкг/мл), и инкубировали при 37oC в течение 20 часов. Культуральный бульон центрифугировали со скоростью 8000 об/мин в течение 30 минут для удаления бактерий, к супернатанту добавляли сульфат аммония до достижения 60% насыщения и смесь перемешивали в течение ночи при 4oC.
Осадок извлекали центрифугированием и растворяли в 10 мл буфера A (20 мМ Трис-гидрохлорида при pH 9,0,10 мМ CaCl2). Энзимный раствор наносили на 20 мл Butil-Toypearl с последующим элюированием буфером A при скорости потока 1,5 мл/мин. Активные фракции объединяли и подвергали обработке 60% насыщенным сульфатом аммония. Осадок собирали центрифугированием со скоростью 15000 об/мин в течение 30 минут и растворяли в 5 мл буфера B (20 мМ Трис-гидрохлорида при pH 7,5, 10 мМ CaCl2). Энзимный раствор дополнительно пропускали через гель-фильтрационную колонку (TSK Гель G2000SW (21,5х300 мМ)), с последующим элюированием буфером B при скорости потока 1 мл/мин. Активные фракции объединяли с получения каждого очищенного энзима.
Синтетические активные модифицированных протеаз в которых 150-ый аспаргиново-кислотный остаток заменен на другие аминокислотные остатки (D150W мутанты) показаны на рис. 12. Мутант, у которого 150-ый аспаргиновокислотный остаток заменен на триптофан (D150W) проявляет явно более высокую удельную активность примерно в 4 раза более высокую, чем активность термолизина дикого типа (D), при этом большинство других мутантов проявляет более высокие активности, чем термолизин дикого типа (D), однако, эти активности значительно ниже, чем активность D150W. Совершенство очевидно, что триптофановый мутант обладает наивысшей активностью.
Активность, определенная для двух дополнительных мультисайтных мутантов, а именно, 2-сайтного мутанта D150W - N227H (т.е. при замене аспаргиновой кислоты на триптофан в положении 150 и аспарагина на гистидин в положении 227), а также 3-сайтного мутанта L144S - D150W - N227H (т.е. при замене лейцина на серин в положении 144, аспаргиновой кислоты на триптофан в положении 150 и аспарагина на гистидин в положении 227) еще выше, как это следует из данных, представленных в таблице 1. (2) Z-APM гидролитическая активность.
Гидролиз Z-APM в Z-Asp и PM в присутствии модифицированных протеаз измеряли, наблюдая уменьшение поглощения при длине волны 224 нм в соответствии с методом Inoue (Inoue K., (1992), J. Biochem 112, 335-340). Три мл 1 мМ Z-APM, растворенного в 0,1 М Трис-гидрохлоридном буфере (pH 7,0), инкубировали в присутствии модиицированных протеаз при 35oC и регистрировали уменьшение оптического спектрального поглощения при длине волны 224 нм. Количество гидролизованного Z-APM определяли по разнице в молярном коэффициенте поглощения Δε 224, которая согласно расчету составила - 493 (М-1. см-1).
Активности D150 мутантов показаны на рис. 13. D150W мутант обладает весьма высокой активностью, которая примерно в 4 раза выше активности термолизина дикого типа. Большинство других мутантов обладают активностями в гидролизе Z-APM, которые лишь в 1-3 раза выше активности термолизина дикого типа (D). Триптофановый мутант обладает явно более высокой активностью.
Активности D150W - N227H и L144S - D150W - Т227H также указаны в таблице 1. Их активности в отношении гидролиза Z-PMA в 6-7 раз и в 9-10 раз выше чем активность дикого типа.
Claims (6)
1. Модифицированная протеаза термолизин-подобной нейтральной металлопротеазы, имеющая аминокислотную последовательность SEQID N : 1, в которой 150-ый остаток аспарагиновой кислоты заменен на триптофан.
2. Модифицированная протеаза термолизин-подобной нейтральной металлопротеазы по п. 1, отличающаяся тем, что в указанной модифицированной протеазе дополнительно 227-ой остаток аспарагина заменен на гистидин.
3. Модифицированная протеаза термолизин-подобной нейтральной металлопротеазы по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что в указанной модифицированной протеазе дополнительно 144-ый лейциновый остаток заменен на серин.
4. Модифицированная протеаза термолизин-подобной нейтральной металлопротеазы по любому из пп.1 - 3, отличающаяся тем, что модификация обеспечивает применение ее для синтеза или расщепления метилового эфира бензилоксикарбонил-α-L-аспартил L-фенилаланина.
5. Способ синтеза метилового эфира бензолоксикарбонил-α-L-аспартил-L-фенилаланина, включающий контактирование раствора-субстрата, содержащего бензилоксикарбонил-α-L-аспарагиновую кислоту и метиловый эфир L- или D, L-фенилаланина, с нейтральной металлопротеазой, отличающийся тем, что металлопротеаза представляет собой модифицированную протеазу по любому из пп.1 - 3.
6. Способ расщепления метилового эфира бензилоксикарбонил-α-L-аспартил-L-фенилаланина, включающий контактирование раствора-субстрата, содержащего бензилокси-карбонил-α-L-аспарагиновую кислоту и метиловый эфир L- или D, L-фенилаланина, с нейтральной металлопротеазой, отличающийся тем, что металлопротеаза представляет собой модифицированную протеазу по любому из пп.1 - 3.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5-306508 | 1993-12-07 | ||
| JP30650893 | 1993-12-07 | ||
| PCT/JP1994/002050 WO1995016029A1 (en) | 1993-12-07 | 1994-12-06 | Mutants of a thermostable neutral protease from bacillus |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU96115027A RU96115027A (ru) | 1998-10-20 |
| RU2136750C1 true RU2136750C1 (ru) | 1999-09-10 |
Family
ID=17957875
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU96115027A RU2136750C1 (ru) | 1993-12-07 | 1994-12-06 | МОДИФИЦИРОВАННАЯ ПРОТЕАЗА ТЕРМОЛИЗИН-ПОДОБНОЙ НЕЙТРАЛЬНОЙ МЕТАЛЛОПРОТЕАЗЫ, СПОСОБ СИНТЕЗА МЕТИЛОВОГО ЭФИРА БЕНЗИЛОКСИКАРБОНИЛ-α-L-АСПАРТИЛ-L-ФЕНИЛАЛАНИНА И СПОСОБ РАСЩЕПЛЕНИЯ МЕТИЛОВОГО ЭФИРА БЕНЗИЛОКСИКАРБОНИЛ-α-L-АСПАРТИЛ-L- ФЕНИЛАЛАНИНА |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5728544A (ru) |
| EP (1) | EP0728196B1 (ru) |
| KR (1) | KR100344204B1 (ru) |
| CN (1) | CN1141649A (ru) |
| AU (1) | AU1121495A (ru) |
| CA (1) | CA2177381A1 (ru) |
| DE (1) | DE69432599D1 (ru) |
| RU (1) | RU2136750C1 (ru) |
| WO (1) | WO1995016029A1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2536255C2 (ru) * | 2007-11-01 | 2014-12-20 | ДАНИСКО ЮЭс ИНК. | Продуцирование термолизина и его вариантов и его использование в жидких детергентах |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0896056A4 (en) * | 1995-12-11 | 2001-08-29 | Sagami Chem Res | NEW THERMOLYSIN-LIKE PROTEASE AND THEIR USE. |
| US6521440B1 (en) * | 1997-09-15 | 2003-02-18 | Genencor International, Inc. | Proteases from gram-positive organisms |
| RU2433182C2 (ru) * | 2005-10-12 | 2011-11-10 | Джененкор Интернэшнл, Инк. | Применение и получение стабильной при хранении нейтральной металлопротеиназы |
| US9828597B2 (en) | 2006-11-22 | 2017-11-28 | Toyota Motor Engineering & Manufacturing North America, Inc. | Biofunctional materials |
| US9121016B2 (en) | 2011-09-09 | 2015-09-01 | Toyota Motor Engineering & Manufacturing North America, Inc. | Coatings containing polymer modified enzyme for stable self-cleaning of organic stains |
| US8796009B2 (en) | 2010-06-21 | 2014-08-05 | Toyota Motor Engineering & Manufacturing North America, Inc. | Clearcoat containing thermolysin-like protease from Bacillus stearothermophilus for cleaning of insect body stains |
| US9388370B2 (en) | 2010-06-21 | 2016-07-12 | Toyota Motor Engineering & Manufacturing North America, Inc. | Thermolysin-like protease for cleaning insect body stains |
| US10988714B2 (en) | 2010-06-21 | 2021-04-27 | Regents Of The University Of Minnesota | Methods of facilitating removal of a fingerprint from a substrate or a coating |
| US11015149B2 (en) | 2010-06-21 | 2021-05-25 | Toyota Motor Corporation | Methods of facilitating removal of a fingerprint |
| CN111944790B (zh) * | 2020-07-01 | 2022-09-09 | 深圳润康生态环境股份有限公司 | 中性蛋白酶基因、中性蛋白酶及其制备方法和应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1731814A1 (ru) * | 1990-05-17 | 1992-05-07 | Саратовский филиал Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленныхмикроорганизмов | Штамм бактерий RноDососсUS RноDоснRоUS - продуцент нитрилгидратазы |
| EP0616033A1 (en) * | 1993-03-17 | 1994-09-21 | Holland Sweetener Company V.O.F. | Mutants of a thermostable neutral protease from Bacillus |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH04349883A (ja) * | 1991-05-28 | 1992-12-04 | Tosoh Corp | 修飾サ−モリシン様酵素及びこの酵素を用いるアルファ−ｌ−アスパラチル−ｌ−フェニルアラニンメチルエステル前駆体の合成方法 |
| US5496710A (en) * | 1992-06-08 | 1996-03-05 | Sagami Chemical Research Center | Protease |
| CA2093199A1 (en) * | 1992-06-08 | 1993-12-09 | Hiromasa Nagao | Protease |
-
1994
- 1994-12-06 US US08/656,349 patent/US5728544A/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-12-06 AU AU11214/95A patent/AU1121495A/en not_active Abandoned
- 1994-12-06 KR KR1019960703069A patent/KR100344204B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1994-12-06 CN CN94194851A patent/CN1141649A/zh active Pending
- 1994-12-06 DE DE69432599T patent/DE69432599D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-12-06 RU RU96115027A patent/RU2136750C1/ru active
- 1994-12-06 EP EP95902309A patent/EP0728196B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-12-06 CA CA002177381A patent/CA2177381A1/en not_active Abandoned
- 1994-12-06 WO PCT/JP1994/002050 patent/WO1995016029A1/en not_active Ceased
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1731814A1 (ru) * | 1990-05-17 | 1992-05-07 | Саратовский филиал Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленныхмикроорганизмов | Штамм бактерий RноDососсUS RноDоснRоUS - продуцент нитрилгидратазы |
| EP0616033A1 (en) * | 1993-03-17 | 1994-09-21 | Holland Sweetener Company V.O.F. | Mutants of a thermostable neutral protease from Bacillus |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| T.Jmanaka et al. "A new way of enhancing the thermostability of proteases" Nature, 1986, v. 324, N 6098, pp. 695 - 697. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2536255C2 (ru) * | 2007-11-01 | 2014-12-20 | ДАНИСКО ЮЭс ИНК. | Продуцирование термолизина и его вариантов и его использование в жидких детергентах |
| RU2733541C2 (ru) * | 2007-11-01 | 2020-10-05 | ДАНИСКО ЮЭс ИНК. | Продуцирование термолизина и его вариантов и его использование в жидких детергентах |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5728544A (en) | 1998-03-17 |
| EP0728196B1 (en) | 2003-05-02 |
| KR100344204B1 (ko) | 2002-11-30 |
| AU1121495A (en) | 1995-06-27 |
| CN1141649A (zh) | 1997-01-29 |
| WO1995016029A1 (en) | 1995-06-15 |
| EP0728196A1 (en) | 1996-08-28 |
| DE69432599D1 (de) | 2003-06-05 |
| CA2177381A1 (en) | 1995-06-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3471797B2 (ja) | 安定化酵素及び洗剤 | |
| US5316935A (en) | Subtilisin variants suitable for hydrolysis and synthesis in organic media | |
| AU614929B2 (en) | Non-human carbonyl hydrolase mutants,DNA sequences and vectors encoding same and hosts transformed with vectors | |
| US5801039A (en) | Enzymes for detergents | |
| US5543302A (en) | Proteases of altered stability to autolytic degradation | |
| RU2136750C1 (ru) | МОДИФИЦИРОВАННАЯ ПРОТЕАЗА ТЕРМОЛИЗИН-ПОДОБНОЙ НЕЙТРАЛЬНОЙ МЕТАЛЛОПРОТЕАЗЫ, СПОСОБ СИНТЕЗА МЕТИЛОВОГО ЭФИРА БЕНЗИЛОКСИКАРБОНИЛ-α-L-АСПАРТИЛ-L-ФЕНИЛАЛАНИНА И СПОСОБ РАСЩЕПЛЕНИЯ МЕТИЛОВОГО ЭФИРА БЕНЗИЛОКСИКАРБОНИЛ-α-L-АСПАРТИЛ-L- ФЕНИЛАЛАНИНА | |
| EP0516200A1 (en) | Detergent compositions containing stabilized enzymes | |
| Van den Burg et al. | A highly thermostable neutral protease from Bacillus caldolyticus: cloning and expression of the gene in Bacillus subtilis and characterization of the gene product | |
| US5496710A (en) | Protease | |
| EP0616033B1 (en) | Mutants of a thermostable neutral protease from Bacillus | |
| EP0416967B1 (en) | Novel alkaline protease | |
| JP2001510037A (ja) | グラム陽性微生物からのプロテアーゼ | |
| WO1994019371A1 (en) | Novel peptide having elastase inhibitor activity and process for producing the same | |
| KR0180749B1 (ko) | 프로테아제 및 그 이용방법 | |
| US20020103100A1 (en) | Nucleic acids encoding polypeptides having proteolytic activity | |
| EP0896056A1 (en) | Novel thermolysin-like protease and use thereof | |
| JPH06181761A (ja) | 新規プロテアーゼ | |
| JPH11501501A (ja) | バチルス由来の熱安定中性プロテアーゼの変異体 | |
| JPH11137254A (ja) | バチルス属細菌由来のトランスグルタミナーゼの製造法 | |
| JP3463951B2 (ja) | 耐熱性ピログルタミルペプチダーゼ及びその遺伝子 | |
| JPH09255A (ja) | 変異型サーモリシンｙｔ７３及びその遺伝子 | |
| US5646044A (en) | Expression systems for the production of target proteins in bacillus | |
| JPH05184363A (ja) | 新規プロテア−ゼ及びその製造方法 | |
| JPH05199873A (ja) | 新規プロテア−ゼ | |
| JP4050654B6 (ja) | 安定化酵素及び洗剤 |