RU2136278C1

RU2136278C1 - Antitumor agent

Info

Publication number: RU2136278C1
Application number: RU98106741/14A
Authority: RU
Inventors: В.И. Масычева; Н.М. Пустошилова; В.П. Романов; Е.Д. Даниленко; Г.М. Сысоева; С.Г. Гамалей; нова А.В. Емель; А.В. Емельянова; А.П. Огиренко; А.Н. Денисов
Original assignee: Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор"
Priority date: 1998-04-07
Filing date: 1998-04-07
Publication date: 1999-09-10

Abstract

FIELD: medicine, oncology. SUBSTANCE: invention relates to an antitumor therapy and proposes an antitumor preparation containing synergetically acting the tumor necrosis alpha-factor and hematoporphyrin derivative at their molar ratio = 1:1. The proposed complex preparation shows the enhanced antitumor activity and affinity to malignant tissue and decreased toxicity as compared its individual components. EFFECT: enhanced antitumor activity of an agent. 4 dwg, 4 ex

Description

Изобретение относится к области медицины, конкретно к противоопухолевой терапии. The invention relates to medicine, specifically to antitumor therapy.

Поиск средств и способов лечения злокачественных новообразований по-прежнему не теряет своей актуальности, что связано как с особенностями течения данного заболевания (гистологической гетерогенностью опухолей, их разной чувствительностью к химиопрепаратам, индивидуальными характеристиками функционирования иммунной системы больных, степенью продвинутости заболевания), так и ограниченностью арсенала эффективных химиотерапевтических средств. The search for means and methods of treating malignant neoplasms still does not lose its relevance, which is associated both with the peculiarities of the course of the disease (histological heterogeneity of the tumors, their different sensitivity to chemotherapy, individual characteristics of the functioning of the immune system of patients, the degree of advancement of the disease), and the limited arsenal effective chemotherapeutic agents.

В настоящее время не вызывает сомнений тот факт, что защита организма от злокачественных клеток осуществляется иммунной системой. Важную роль в осуществлении этой функции играют цитокины, к которым относится, в частности, фактор некроза опухоли альфа (ФНО-альфа). Показано, что ФНО-альфа является высокоселективным противоопухолевым агентом, который вызывает торможение роста и лизис трансформированных клеток [1]. Одним из механизмов противоопухолевой активности ФНО-альфа является его воздействие на клетки сосудистой системы опухоли, заключающееся в стимуляции секреции эндотелиальными клетками факторов адгезии и хемотаксиса [2], привлечении в очаг цитотоксических полиморфноядерных лейкоцитов [3], а также повышении внутрисосудистой свертываемости крови [4], следствием чего является повреждение сосудов опухоли и ее геморрагический некроз. Иммуномодулирующие эффекты ФНО-альфа, такие как ускорение созревания естественных киллеров, активация фагоцитов и повышение АТ-зависимой клеточной цитотоксичности нейтрофилов [5, 6], также могут вносить свой вклад в обеспечение противоопухолевых эффектов ФНО-альфа. Currently, there is no doubt that the body is protected from malignant cells by the immune system. An important role in the implementation of this function is played by cytokines, which include, in particular, tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha). It was shown that TNF-alpha is a highly selective antitumor agent that causes inhibition of growth and lysis of transformed cells [1]. One of the mechanisms of antitumor activity of TNF-alpha is its effect on the cells of the vascular system of the tumor, which consists in stimulating the secretion of adhesion and chemotaxis factors by endothelial cells [2], attracting cytotoxic polymorphonuclear leukocytes into the focus [3], as well as increasing intravascular coagulation [4] , the consequence of which is damage to the vessels of the tumor and its hemorrhagic necrosis. The immunomodulatory effects of TNF-alpha, such as accelerated maturation of natural killers, activation of phagocytes and increased AT-dependent cellular cytotoxicity of neutrophils [5, 6], can also contribute to the antitumor effects of TNF-alpha.

Если цитотоксический эффект данного цитокина в отношении опухолевых клеток отличается избирательностью, то сосудистые и иммуномодулирующие свойства ФНО-альфа универсальны и, следовательно, являются причиной его токсического воздействия на нормальные ткани. В ходе клинических испытаний препарата было показано, что в диапазоне доз от 1 до 400 мкг/кв.м/день ФНО-альфа вызывает лихорадочные явления, тахикардию, повышение давления, головную боль, тошноту, преходящие нейтрофилез и лимфопению, повышение содержания сывороточных триглицеридов, снижение альбумина и холестерина [7]. Выраженные побочные эффекты препарата, незначительная величина терапевтического индекса ФНО-альфа являются основным препятствием для его широкого применения в медицине [8]. If the cytotoxic effect of this cytokine in relation to tumor cells is selective, then the vascular and immunomodulating properties of TNF-alpha are universal and, therefore, cause its toxic effect on normal tissues. During clinical trials of the drug, it was shown that in the range of doses from 1 to 400 μg / m2 / day, TNF-alpha causes febrile events, tachycardia, increased pressure, headache, nausea, transient neutrophilia and lymphopenia, increased serum triglycerides, decrease in albumin and cholesterol [7]. Pronounced side effects of the drug, a small therapeutic index of TNF-alpha are the main obstacle to its widespread use in medicine [8].

В связи с этим, в течение ряда лет предпринимались многочисленные попытки снижения системной токсичности ФНО-альфа. Одним из наиболее распространенных методических приемов, используемых для этих целей, является создание мутантных вариантов ФНО-альфа. В ходе этих работ было показано, что замещение кислых аминокислот на основные на N-концевом участке пептидной цепи приводит к уменьшению токсичности препарата при сохранении его противоопухолевых свойств [9]. Делеция 7 N-концевых аминокислот и замена Pro8-Ser9-Asp10 на Arg8-Lys9-Arg10 приводит к 6-кратному повышению цитотоксичности в отношении трансформированных клеток в клеточной культуре [10]. In this regard, over the years, numerous attempts have been made to reduce the systemic toxicity of TNF-alpha. One of the most common methodological techniques used for these purposes is the creation of mutant variants of TNF-alpha. In the course of these studies, it was shown that the substitution of acidic amino acids for essential amino acids at the N-terminal portion of the peptide chain leads to a decrease in the toxicity of the drug while maintaining its antitumor properties [9]. Deletion of 7 N-terminal amino acids and the replacement of Pro8-Ser9-Asp10 with Arg8-Lys9-Arg10 leads to a 6-fold increase in cytotoxicity against transformed cells in cell culture [10].

Повышение противоопухолевой активности препарата удается достичь получением химерных вариантов ФНО-альфа с α₁ -тимозином [11], лейкокинином [12], а также его конъюгированием с полиэтиленгликолем [13]. Конъюгат белка с монометоксиполиэтиленгликолем отличается более длительным по сравнению с ФНО-альфа периодом выведения из крови экспериментальных животных, повышением противоопухолевой активности в отношении трансплантированных опухолей Meth фибросаркомы и снижением интенсивности токсических проявлений [14].An increase in the antitumor activity of the drug can be achieved by obtaining chimeric variants of TNF-alpha with α ₁ -thymosin [11], leukokinin [12], as well as its conjugation with polyethylene glycol [13]. The conjugate of protein with monomethoxypolyethylene glycol has a longer period of elimination from the blood of experimental animals compared to TNF-alpha, an increase in antitumor activity against transplanted Meth fibrosarcoma tumors, and a decrease in the intensity of toxic manifestations [14].

Однако существенным недостатком мутантных и химерных форм ФНО-альфа является их высокая антигенность, ограничивающая возможность длительного курсового или многократного применения этих препаратов. However, a significant drawback of mutant and chimeric forms of TNF-alpha is their high antigenicity, limiting the possibility of prolonged course or repeated use of these drugs.

Перспективным направлением является использование ФНО-альфа в комплексной терапии с цитокинами и другими модификаторами биологических реакций либо создание комплексных препаратов на основе этих биологически активных веществ. Среди соединений, которые используются в качестве биологически активных добавок, можно выделить две группы препаратов, различающихся по механизму их действия на организм. A promising area is the use of TNF-alpha in complex therapy with cytokines and other biological reaction modifiers or the creation of complex drugs based on these biologically active substances. Among the compounds that are used as dietary supplements, two groups of drugs can be distinguished that differ in the mechanism of their action on the body.

К первой группе относятся вещества-синергисты ФНО-альфа. Среди них интерфероны разных типов (α,β- и γ) [15, 16], трансформирующий ростовой фактор бета [17]. Предложен препарат для ингибирования роста опухолей, действующим началом которого, помимо ФНО-альфа, является соединение, блокирующее систему белка С (антитела против белка C и S, C4 δ- связывающий белок) [18]. O'Conner с соавторами [19] был предложен противоопухолевый препарат, содержащий эффективное количество фактора некроза опухоли человека и C-реактивного белка, усиливающего антибластоидную активность ФНО-альфа. The first group includes TNF-alpha synergistic substances. Among them are interferons of various types (α, β- and γ) [15, 16], which transforms the growth factor beta [17]. A drug has been proposed for inhibiting tumor growth, the active principle of which, in addition to TNF-alpha, is a compound that blocks the protein C system (antibodies against protein C and S, C4 δ-binding protein) [18]. O'Conner et al. [19] proposed an antitumor drug containing an effective amount of human tumor necrosis factor and C-reactive protein that enhances the anti-blastoid activity of TNF-alpha.

Препараты второй группы характеризуются наличием в своем составе биологически активных соединений, снижающих побочные эффекты ФНО-альфа. Для предотвращения повреждений клеток, вызванных цитотоксическим действием лимфокинов, используются акцеторы свободных радикалов или метаболические ингибиторы (мочевая кислота, бутионинсульфоксиамин, витамин C и др.) [20]. Для снижения или подавления токсического действия высоких доз ФНО, применяемых при лечении злокачественных новообразований, предложено введение в состав комплексного препарата нестероидных противовоспалительных средств, таких как индометацин, ибупрофен [21]. The drugs of the second group are characterized by the presence in their composition of biologically active compounds that reduce the side effects of TNF-alpha. To prevent damage to cells caused by the cytotoxic effect of lymphokines, free radical accentors or metabolic inhibitors (uric acid, butionine sulfoxyamine, vitamin C, etc.) are used [20]. To reduce or suppress the toxic effects of high doses of TNF used in the treatment of malignant neoplasms, the introduction of non-steroidal anti-inflammatory drugs such as indomethacin, ibuprofen has been proposed in the complex preparation [21].

При всех несомненных достоинствах данного подхода следует отметить, что введение в состав препарата биологического модификатора направлено, как правило, на решение лишь одной из проблем: усиления противоопухолевой активности ФНО либо снижения выраженности его побочного действия. With all the undoubted advantages of this approach, it should be noted that the introduction of a biological modifier in the composition of the drug is aimed, as a rule, at solving only one of the problems: enhancing the antitumor activity of TNF or reducing the severity of its side effects.

Анализ патентной и литературной информации показал, что существуют многочисленные данные об эффективности лечения онкологических заболеваний методами фотодинамической терапии (ФДТ), которая основана на сенсибилизированном красителями фотоокислении клетки-мишени [22] . Специфические красители (фотосенсибилизаторы) могут быть естественными компонентами клеток, как, например, производные гематопорфиринов (ПГП). Преимуществом данного метода лечения перед традиционными является относительная селективность накопления красителя в ткани опухоли и, как следствие, противоопухолевая эффективность при низкой токсичности [23]. Установлено, что практически все типы опухолей, за исключением меланомы, являются чувствительными к этому типу воздействия [24]. An analysis of patent and literature information showed that there are numerous data on the effectiveness of the treatment of cancer with photodynamic therapy (PDT) methods, which is based on dye sensitized photooxidation of the target cell [22]. Specific dyes (photosensitizers) can be natural components of cells, such as derivatives of hematoporphyrins (GWP). The advantage of this treatment method over the traditional ones is the relative selectivity of dye accumulation in the tumor tissue and, as a result, antitumor efficacy with low toxicity [23]. It has been established that almost all types of tumors, with the exception of melanoma, are sensitive to this type of exposure [24].

Недостаток данного метода лечения заключается в использовании высоких доз фотосенсибилизатора, что приводит к значительному накоплению красителя, помимо опухолевых, в нормальных тканях организма (печень, почки, кожа) [22, 23]. The disadvantage of this treatment method is the use of high doses of a photosensitizer, which leads to a significant accumulation of dye, in addition to tumor, in normal body tissues (liver, kidneys, skin) [22, 23].

Обращает на себя внимание сходство механизмов противоопухолевого действия ФНО-альфа и фотосенсибилизатора в сочетании с облучением. Как в том, так и другом случае основным патогенетическим фактором является нарушение кровоснабжения опухоли, приводящее к геморрагическому некрозу опухоли [25]. Noteworthy is the similarity of the mechanisms of the antitumor effect of TNF-alpha and a photosensitizer in combination with radiation. In both cases, the main pathogenetic factor is a violation of the blood supply to the tumor, leading to hemorrhagic necrosis of the tumor [25].

Авторами работы [26] была продемонстрирована возможность снижения эффективной дозы красителя при ФДТ в условиях его сочетанного применения с ФНО-альфа. Однократное внутривенное введение рекомбинантного ФНО-альфа (3,2 мкг) мышам DBA/2 с трансплантированной аденокарциномой SMT-F через 21-24 часа после инъекции фотосенсибилизатора Фотофрина II (2,5 мг) на фоне облучения вызывало тот же эффект торможения роста опухоли, который был отмечен в группе облученных животных после введения фотосенсибилизатора в дозе 5 мг. Важно отметить, что облучение мышей-опухоленосителей после введения Фотофрина II в дозе 2,5 мг без ФНО-альфа не вызывало достоверно выраженного торможения опухолевого процесса. Следовательно, в условиях ФДТ препараты ФНО-альфа и ПГП оказывают синергичное действие на клетки опухоли. The authors of [26] demonstrated the possibility of reducing the effective dye dose in PDT under conditions of its combined use with TNF-alpha. A single intravenous administration of recombinant TNF-alpha (3.2 μg) to DBA / 2 mice with transplanted SMT-F adenocarcinoma 21-24 hours after the injection of Photofrin II photosensitizer (2.5 mg) during irradiation caused the same tumor growth inhibition effect, which was noted in the group of irradiated animals after administration of a photosensitizer in a dose of 5 mg. It is important to note that irradiation of tumor-bearing mice after administration of Photofrin II at a dose of 2.5 mg without TNF-alpha did not cause significantly inhibited tumor process. Therefore, under PDT conditions, TNF-alpha and GWP drugs have a synergistic effect on tumor cells.

При всех достоинствах предложенного способа сочетанного применения ФДТ с ФНО-альфа недостатком этого метода является необходимость облучения, следствием чего могут быть лучевые осложнения. With all the advantages of the proposed method for the combined use of PDT with TNF-alpha, the disadvantage of this method is the need for radiation, which may result in radiation complications.

Технической задачей изобретения является разработка противоопухолевого препарата, исключающего необходимость облучения, содержащего в своем составе синергически действующие ФНО-альфа и ПГП, который отличается более низкой эффективной дозой, сниженной по сравнению с ФНО-альфа токсичностью, а также повышенной тропностью к клеткам опухоли. An object of the invention is to develop an antitumor drug that eliminates the need for radiation, which contains synergistically active TNF-alpha and GWP, which has a lower effective dose, lower toxicity compared to TNF-alpha, and increased tropism to tumor cells.

Поставленная задача решается путем создания комплекса ПГП с ФНО-альфа, в котором сочетается свойство ПГП к селективному накоплению в ткани опухоли и цитотоксические свойства ФНО-альфа. Компоненты комплексного препарата находятся в молярном соотношении 1:1. The problem is solved by creating a complex of GWP with TNF-alpha, which combines the property of GWP to selective accumulation in tumor tissue and the cytotoxic properties of TNF-alpha. The components of the complex preparation are in a 1: 1 molar ratio.

Для изучения физических характеристик комплексного препарата ФНО-альфа и ПГП снимают его инфракрасные (ИК) спектры. Для этого неразбавленный раствор комплекса высушивают в сублимационной сушилке и растворяют в минимальном объеме воды. ИК-спектры снимают на спектрометре IFS 66 (Bruker, Германия). To study the physical characteristics of the complex preparation, TNF-alpha and GWP remove its infrared (IR) spectra. For this, the undiluted solution of the complex is dried in a freeze dryer and dissolved in a minimum volume of water. IR spectra were recorded on an IFS 66 spectrometer (Bruker, Germany).

Данные, представленные на фиг. 1, показывают наличие пика абсорбции (1722 см^-1) в ИК-спектре комплекса, соответствующего валентной карбонильной группе, в отличие от спектров ПГП и ФНО-альфа. Появление пика абсорбции объясняется, вероятно, взаимодействием порфириновых компонентов ПГП с белком, при котором происходит изменение конформации белковой молекулы таким образом, что одна из карбоксильных групп ФНО-альфа становится доступной окружению. Данный факт свидетельствует о возникновении связи между белком и ПГП и, следовательно, об образовании сложного комплексного соединения ФНО-альфа и ПГП.The data presented in FIG. 1, show the presence of an absorption peak (1722 cm ⁻¹ ) in the IR spectrum of the complex corresponding to the valence carbonyl group, in contrast to the spectra of GWP and TNF-alpha. The appearance of the absorption peak is probably due to the interaction of the porphyrin components of the GWP with the protein, in which the conformation of the protein molecule changes in such a way that one of the carboxyl groups of TNF-alpha becomes accessible to the environment. This fact indicates the emergence of a relationship between protein and GWP and, therefore, the formation of a complex complex compound of TNF-alpha and GWP.

Сущность изобретения заключается в том, что препараты ФНО-альфа и ПГП в составе комплекса могут взаимно свои потенцировать эффекты на злокачественные клетки и в отсутствии облучения. The essence of the invention lies in the fact that the preparations of TNF-alpha and GWP in the complex can mutually potentiate the effects on malignant cells in the absence of radiation.

Исследование противоопухолевой активности комплексного препарата ПГП с ФНО-альфа в экспериментах на животных с трансплантированной опухолью аденокарциномы Кребса-2 и аденокарциномы Эрлиха показало, что он обладает повышенной способностью ингибировать рост опухоли по сравнению с составляющими его компонентами. Эффективная доза препарата в 10-100 раз ниже по сравнению с терапевтическими дозами входящего в его состав ФНО-альфа. A study of the antitumor activity of the complex preparation of GWP with TNF-alpha in experiments on animals with a transplanted tumor of Krebs-2 adenocarcinoma and Ehrlich adenocarcinoma showed that it has an increased ability to inhibit tumor growth compared to its constituent components. The effective dose of the drug is 10-100 times lower compared to therapeutic doses of TNF-alpha included in it.

Установлено, что накопление ПГП в ткани опухоли при введении комплексного препарата в первые часы после введения в 1,8-2,4 раза превышает его уровень, наблюдавшийся при введении индивидуального препарата ПГП и в 1,3-2,6 раз выше, чем в случае сочетанного введения ПГП и ФНО-альфа. Уровень ПГП в ткани кожи, мышце, сыворотке крови и печени животных, которым вводили комплексный препарат, не превышал фонового уровня эндогенных ГП. На основании этих данных можно заключить, что комплексный препарат отличается повышенной тропностью к ткани опухоли, но менее интенсивно накапливается в нормальных тканях организма. It was found that the accumulation of GWP in the tumor tissue during the administration of the complex drug in the first hours after administration is 1.8-2.4 times higher than that observed with the introduction of the individual drug GWP and is 1.3-2.6 times higher than case of combined administration of GWP and TNF-alpha. The level of GWP in the skin tissue, muscle, blood serum and liver of animals that were injected with the complex preparation did not exceed the background level of endogenous GP. Based on these data, we can conclude that the complex preparation is characterized by increased tropism for tumor tissue, but less intensively accumulates in normal body tissues.

Препарат ПГП-ФНО-альфа отличался более низким уровнем токсичности по сравнению с ФНО-альфа. Уровень среднесмертельной дозы комплексного препарата в 2,5 раза превышал его значения, полученные для ФНО-альфа. The preparation PGP-TNF-alpha was characterized by a lower level of toxicity compared to TNF-alpha. The level of the lethal dose of the complex drug was 2.5 times higher than its values obtained for TNF-alpha.

Следовательно, комплексный препарат ПГП с ФНО-альфа в дозах 3-30 нг/20 г (10²-10³ E) обладает более высокой противоопухолевой активностью, повышенной тропностью к ткани опухоли и сниженной токсичностью по сравнению с составляющими его компонентами.Consequently, the complex preparation of GWP with TNF-alpha in doses of 3-30 ng / 20 g (10 ² -10 ³ E) has a higher antitumor activity, increased tropism for tumor tissue and reduced toxicity compared to its constituent components.

Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами. The invention is illustrated by the following graphic materials.

Фиг. 1. Фрагменты ИК-спектров препаратов в области 1500-2000 см^-1.FIG. 1. Fragments of the IR spectra of the preparations in the region of 1500-2000 cm ^-1 .

По оси абсцисс - длина волны, см^-1, по оси ординат - интенсивность поглощения, опт.ед.The abscissa axis is the wavelength, cm ^-1 , the ordinate axis is the absorption intensity, opt.

Темные кружки - ИК-спектр ПГП, светлые - ИК-спектр ФНО-альфа, сплошная линия - ИК-спектр препарата ПГП-ФНО-альфа. The dark circles are the infrared spectrum of GWP, the light circles are the infrared spectrum of TNF-alpha, the solid line is the IR spectrum of the preparation PGP-TNF-alpha.

Фиг. 2. Содержание производных гематопорфирина в ткани аденокарциномы Эрлиха в первые часы после введения препаратов ПГП-ФНО-альфа, ПГП и ФНО-альфа мышам-опухоленосителям. FIG. 2. The content of hematoporphyrin derivatives in the Ehrlich adenocarcinoma tissue in the first hours after administration of the preparations PGP-TNF-alpha, PGP and TNF-alpha to tumor-bearing mice.

По оси абсцисс - время после введения, ч; по оси ординат - концентрация ПГП в ткани опухоли, мкг/г, при введении ПГП-ФНО-альфа (светлые столбики), ПГП (темные столбики), ПГП и ФНО-альфа (столбики со штриховкой). On the abscissa axis is the time after administration, h; along the ordinate axis is the concentration of GWP in the tumor tissue, μg / g, with the introduction of GWP-TNF-alpha (light bars), GWP (dark bars), GWP and TNF-alpha (bars with hatching).

Фиг. 3. Влияние препаратов ПГП-ФНО-альфа и ФНО-альфа на рост перевивной опухоли Кребса-2. FIG. 3. The effect of the preparations PGP-TNF-alpha and TNF-alpha on the growth of the transplantable tumor Krebs-2.

По оси абсцисс - доза ФНО-альфа, нг; по оси ординат - торможение роста опухоли, %, при введении препарата ПГП-ФНО-альфа (светлые столбики) и ФНО-альфа (столбики со штриховкой). On the abscissa axis is the dose of TNF-alpha, ng; along the ordinate axis - inhibition of tumor growth,%, with the introduction of the drug PGP-TNF-alpha (light bars) and TNF-alpha (bars with hatching).

Фиг. 4. Влияние препаратов ПГП, ФНО-альфа и комплексного препарата ПГП-ФНО-альфа на рост перевивной опухоли аденокарциномы Эрлиха. FIG. 4. The effect of preparations of GWP, TNF-alpha and the complex preparation of GWP-TNF-alpha on the growth of a transplantable tumor of Ehrlich adenocarcinoma.

По оси абсцисс - доза препаратов, нг; по оси ординат - торможение роста опухоли, %, при введении ФНО-альфа (столбики со штриховкой), ПГП (темные столбики) и ПГП-ФНО-альфа (светлые столбики). On the abscissa axis is the dose of drugs, ng; along the ordinate axis - inhibition of tumor growth,%, with the introduction of TNF-alpha (bars with hatching), GWP (dark bars) and GWP-TNF-alpha (light bars).

Для лучшего понимания сущности изобретения ниже следуют примеры его осуществления. For a better understanding of the invention, the following are examples of its implementation.

Пример 1. Получение комплексного препарата ФНО-альфа и ПГП. Example 1. Obtaining a complex preparation of TNF-alpha and GWP.

Для получения комплекса к 100 мкл раствора ФНО-альфа (4,8*•10⁷ Е/мл, 1,6 мг/мл) в PBS (10 мМ Na-фосфат, 100 мМ NaCl, pH 7,4) добавляют 160 мкл раствора ПГП (1 мг/мл) в PBS. Смесь инкубируют при комнатной температуре 30 мин. Полученный раствор комплекса разбавляют добавлением 9,74 мл PBS и замораживают при минус 15^oC.To obtain the complex, 160 μl is added to 100 μl of a solution of TNF-alpha (4.8 * • 10 ⁷ U / ml, 1.6 mg / ml) in PBS (10 mm Na-phosphate, 100 mm NaCl, pH 7.4) a solution of GWP (1 mg / ml) in PBS. The mixture was incubated at room temperature for 30 minutes. The resulting solution of the complex is diluted by adding 9.74 ml of PBS and frozen at minus 15 ^o C.

Пример 2. Исследование фармакокинетических особенностей комплексного препарата ПГП с ФНО-альфа. Эксперименты проводят на белых беспородных мышах ICR, самцах, массой 25-30 г, с перевивной опухолью аденокарциномы Эрлиха. Трансплантацию разрозненных опухолевых клеток проводят подкожно, в область подмышечной впадины, в дозе 10⁵ клеток на животное. Комплексный препарат ПГП с ФНО-альфа вводят в дозе 3 мкг/20 г веса тела животных (10⁵ Е по ФНО-альфа) подкожно, в область опухолевого узла. В качестве групп сравнения используют группы мышей, которым вводят ПГП, а также ПГП и ФНО-альфа раздельно, в дозах, эквивалентных используемым в составе комплексного препарата. Через 0,5 и 3 часа после инъекции забирают на анализ кровь, образцы опухолевой ткани, бедренной мышцы, кожи, печени.Example 2. The study of the pharmacokinetic features of the complex preparation of GWP with TNF-alpha. The experiments were carried out on white outbred ICR mice, males weighing 25-30 g, with a transplantable tumor of Ehrlich adenocarcinoma. Transplantation of scattered tumor cells is carried out subcutaneously, in the armpit, at a dose of 10 ⁵ cells per animal. The complex preparation of GWP with TNF-alpha is administered at a dose of 3 μg / 20 g of animal body weight (10 ⁵ U in TNF-alpha) subcutaneously, in the area of the tumor node. As comparison groups, use groups of mice that are treated with GWP, as well as GWP and TNF-alpha separately, in doses equivalent to those used in the complex preparation. 0.5 and 3 hours after the injection, blood, samples of tumor tissue, femoral muscle, skin, and liver are taken for analysis.

Определение содержания производных гематопорфирина в ткани внутренних органов и сыворотке крови проводят по методу, описанному Pantilides et.al. [27] . Флуоресценцию мономерных форм гематопорфирина измеряют на спектрофлуориметре "Hitachi" (Япония) с длиной волны возбуждения 404 нм и эмиссии 599 нм. The determination of the content of hematoporphyrin derivatives in the tissue of internal organs and blood serum is carried out according to the method described by Pantilides et.al. [27]. Fluorescence of monomeric forms of hematoporphyrin is measured on a Hitachi spectrofluorimeter (Japan) with an excitation wavelength of 404 nm and an emission of 599 nm.

Распределение производных гематопорфирина по тканям исследуют у каждого животного индивидуально. Данные экспериментов обрабатывают статистически, с использованием пакета программ "Statgraf". The distribution of hematoporphyrin derivatives in tissues is examined individually in each animal. The experimental data are processed statistically using the Statgraf software package.

Данные, представленные на фиг. 2, свидетельствуют о значительном повышении уровня ПГП в опухолевых клетках животных, которым вводили комплексный препарат, по сравнению с его концентрацией в образцах опухоли, взятой у мышей после введения индивидуального препарата ПГП. Через 30 мин после инъекции комплекса концентрация флуоресцирующих производных гематопорфирина в опухоли была в 2,4 раза выше, чем при введении препарата ПГП. Высокий уровень данного показателя сохранялся, по меньшей мере, в течение трех часов наблюдения, чего не наблюдалось у животных других опытных групп. The data presented in FIG. 2, indicate a significant increase in the level of GWP in the tumor cells of animals that were injected with the complex drug, compared with its concentration in tumor samples taken from mice after administration of the individual drug GWP. 30 minutes after the injection of the complex, the concentration of fluorescent hematoporphyrin derivatives in the tumor was 2.4 times higher than with the introduction of the drug GWP. A high level of this indicator was maintained for at least three hours of observation, which was not observed in animals of other experimental groups.

Уровень ПГП в ткани кожи, мышце, сыворотке крови и печени животных через 30 мин после инъекции препаратов не превышал фонового уровня эндогенных гематопорфиринов. The level of GWP in the skin tissue, muscle, blood serum and liver of animals 30 minutes after injection of the preparations did not exceed the background level of endogenous hematoporphyrins.

Следовательно, введение комплексного препарата ПГП с ФНО-альфа приводило к повышению накопления фотосенсибилизатора в ткани опухоли по сравнению с индивидуальным препаратом ПГП. Повышение coдepжaния ПГП в опухолевой ткани после введения комплекса было более выраженным и сохранялось в течение более длительного времени, чем в группах животных, которым ПГП и ФНО-альфа вводили раздельно. Введение комплексного препарата в дозе 3 мкг/20 г веса тела не способствовало аккумуляции ПГП нормальными тканями организма (кожа, мышца, печень, кровь), что является благоприятным фактором для снижения побочных эффектов препарата. Therefore, the introduction of the complex preparation of GWP with TNF-alpha led to an increase in the accumulation of the photosensitizer in the tumor tissue compared to the individual preparation of GWP. The increase in the content of GWP in the tumor tissue after administration of the complex was more pronounced and persisted for a longer time than in groups of animals to which GWP and TNF-alpha were administered separately. The introduction of a complex drug at a dose of 3 μg / 20 g of body weight did not contribute to the accumulation of GWP by normal body tissues (skin, muscle, liver, blood), which is a favorable factor for reducing side effects of the drug.

Пример 3. Изучение противоопухолевой активности комплексного препарата ПГП с ФНО-альфа. Example 3. The study of the antitumor activity of the complex preparation of GWP with TNF-alpha.

Влияние препарата ПГП-ФНО -α на развитие опухоли изучают на белых беспородных мышах ICR, самцах, с трансплантированной опухолью аденокарциномы Кребса-2 и Эрлиха. Клетки опухолей перевивают асцитической жидкостью, подкожно, в дозе 10⁵ клеток на животное.The effect of the drug PGP-TNF-α on the development of the tumor is studied on white outbred ICR mice, males, with a transplanted tumor of Krebs-2 and Ehrlich adenocarcinoma. Tumor cells are inoculated with ascitic fluid, subcutaneously, at a dose of 10 ⁵ cells per animal.

Процент торможения роста опухоли на фоне введения препаратов оценивают по изменению массы опухолевого узла. Вычисление проводят по следующей формуле
ТРО (%) = (B_к - B_о)•100/B_к,
где B_к - средний показатель роста опухоли в контрольной группе;
B_о - средний показатель опытной группы.The percentage of inhibition of tumor growth during administration of drugs is estimated by the change in the mass of the tumor node. The calculation is carried out according to the following formula
SRW (%) = (B _to - B _about ) • 100 / B _to ,
where B _to - the average tumor growth in the control group;
B _about - the average indicator of the experimental group.

Комплексный препарат ПГП-ФНО-альфа вводят подкожно, в диапазоне доз от 3 до 300 нг (10² - 10⁴ Е/20 г). В качестве препаратов сравнения используют ФНО-альфа и препарат ПГП в эквивалентных дозах. Инъекции тестируемых препаратов проводят трехкратно, с интервалом в один день, курс инъекций начинают на 4 день после трансплантации опухолевых клеток. Массу опухолевого узла оценивают на 11-12 сутки.The complex drug PGP-TNF-alpha is administered subcutaneously, in the dose range from 3 to 300 ng (10 ² - 10 ⁴ U / 20 g). As comparison drugs, TNF-alpha and the preparation of GWP in equivalent doses are used. Injections of the tested drugs are carried out three times, with an interval of one day, the course of injections begins on day 4 after transplantation of tumor cells. The mass of the tumor node is estimated at 11-12 days.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводят с помощью пакета программ "Statgraf". Достоверность различий оценивают с использованием t-критерия Стьюдента. Результаты исследования комплексного препарата ФНО-α-ПГП в сравнении с препаратом ФНО- α представлены на фиг 3. Установлено, что введение ФНО -α в дозе 10² Е/20 г не вызывало торможения роста опухоли Кребса-2. Препарат в более высоких дозах (10³-10⁴ Е/20 г) замедлял рост опухолевого узла на 63,3-73,3% по сравнению с показателями контроля.Statistical processing of experimental data is carried out using the software package "Statgraf". The significance of differences was evaluated using Student's t-test. The results of the study of the complex preparation of TNF-α-GWP in comparison with the preparation of TNF-α are shown in Fig. 3. It was found that the administration of TNF-α at a dose of 10 ² U / 20 g did not cause inhibition of the growth of Krebs-2 tumor. The drug at higher doses (10 ³ -10 ⁴ U / 20 g) slowed the growth of the tumor node by 63.3-73.3% compared with the control parameters.

Введение в состав препарата производных гематопорфирина приводило к повышению его противоопухолевого эффекта. Препарат ФНО-альфа-ПГП, содержащий в своем составе 10² Е ФНО-альфа и 3 нг ПГП, вызывал торможение роста опухоли на 63,3%, что в 4,8 раза выше, чем при введении ФНО-альфа в той же дозе, и соответствовало уровню, достигаемому при введении данного белка в дозах 10³-10⁴ Е/20 г.The introduction of hematoporphyrin derivatives into the preparation led to an increase in its antitumor effect. The preparation of TNF-alpha-GWP, containing 10 ² E TNF-alpha and 3 ng of GWP, inhibited tumor growth by 63.3%, which is 4.8 times higher than with the introduction of TNF-alpha in the same dose , and corresponded to the level achieved with the introduction of this protein in doses of 10 ³ -10 ⁴ U / 20 g.

Аналогичные закономерности были обнаружены на мышах с перевивной опухолью аденокарциномы Эрлиха. Было показано, что трехкратное введение препарата ФНО-альфа-ПГП в дозе 30 нг/20 г (10³ Е/20 г) вызывало достоверное торможение роста опухоли. Средний вес опухолевого узла в опытной группе животных был на 38% ниже контрольного показателя (различия достоверны, p<0,05) (фиг. 4). Курс инъекций индивидуальных препаратов ФНО- α и ПГП в тех же дозах не приводил к сколько-нибудь значительному ингибированию опухолевого процесса.Similar patterns were found in mice with transplanted Ehrlich adenocarcinoma tumor. It was shown that triple administration of the drug TNF-alpha-GWP at a dose of 30 ng / 20 g (10 ³ U / 20 g) caused significant inhibition of tumor growth. The average weight of the tumor node in the experimental group of animals was 38% lower than the control indicator (differences were significant, p <0.05) (Fig. 4). The course of injections of individual preparations of TNF-α and GWP in the same doses did not lead to any significant inhibition of the tumor process.

Таким образом, на двух экспериментальных опухолевых моделях было показано, что ФНО-альфа и ПГП в составе комплексного препарата оказывают синергидный ингибирующий эффект на развитие опухоли. Торможение роста опухоли при введении комплекса наблюдалось в более низких дозах, чем при инъекции препарата ФНО-альфа. Thus, in two experimental tumor models, it was shown that TNF-alpha and GWP as part of a complex preparation have a synergistic inhibitory effect on tumor development. Inhibition of tumor growth upon administration of the complex was observed at lower doses than upon injection of TNF-alpha.

Пример 4. Исследование токсических свойств комплексного препарата ПГП-ФНО-альфа. Example 4. The study of the toxic properties of the complex drug PGP-TNF-alpha.

Уровень токсичности комплексного препарата определяют в экспериментах на белых беспородных мышах ICR, самцах в сравнении с ФНО-альфа. Параметры летальных доз и максимально-переносимую дозу препаратов рассчитывают экспресс-методом по Прозоровскому [28]. The toxicity level of the complex drug is determined in experiments on white outbred ICR mice, males, in comparison with TNF-alpha. The parameters of lethal doses and the maximum tolerated dose of drugs are calculated by the express method according to Prozorovsky [28].

Тестируемые препараты растворяют в 0,9% растворе хлористого натрия и вводят внутрибрюшинно в объеме 0,2 мл на 20 г массы тела животных. Подсчет павших животных и появление клинических признаков отравления проводят в течение суток после введения препаратов. The test drugs are dissolved in a 0.9% sodium chloride solution and injected intraperitoneally in a volume of 0.2 ml per 20 g of animal body weight. Counting dead animals and the appearance of clinical signs of poisoning is carried out within a day after the administration of drugs.

Исследование показало, что значения LD₅₀ для разных партий препарата ФНО-альфа составляли 11,2-13,0 мг/кг, максимально переносимая доза - 6,0 мг/кг. Уровень среднесмертельной дозы комплекса был равен 28,2 мг/кг (23-34 мг/кг), максимально переносимая доза составляла 20 мг/кг веса тела.The study showed that the LD ₅₀ values for different batches of TNF-alpha were 11.2-13.0 mg / kg, the maximum tolerated dose was 6.0 mg / kg. The level of the lethal dose of the complex was 28.2 mg / kg (23-34 mg / kg), the maximum tolerated dose was 20 mg / kg of body weight.

Таким образом, результаты токсикологических экспериментов свидетельствуют о том, что комплексный препарат ПГП-ФНО-альфа отличается более низким уровнем токсичности по сравнению с препаратом ФНО-альфа. Thus, the results of toxicological experiments indicate that the complex preparation of PGP-TNF-alpha is characterized by a lower level of toxicity compared with the preparation of TNF-alpha.

Список использованной литературы
1. Carswell Е.А., Old L.J., Kassel R.L. et al.//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1975. - Vol. 72. - P. 3666-3670.List of references
1. Carswell E.A., Old LJ, Kassel RL et al.//Proc. Natl. Acad Sci. USA - 1975 .-- Vol. 72. - P. 3666-3670.

2. Dinarello C.A.//Immunol. Lett. - 1987. - Vol. l6. - P. 227-232. 2. Dinarello C.A.//Immunol. Lett. - 1987. - Vol. l6. - P. 227-232.

3. Butler В. , Cerami A. //Ann. Rev. lmmunol. - 1989. - Vol. 7. - P. 625-655. 3. Butler B., Cerami A. // Ann. Rev. lmmunol. - 1989. - Vol. 7. - P. 625-655.

4. Fransen L., Van der Heyden J., Ruysschaert R., Fiers W.// Eur.J.Cancer clin.Oncol. - 1986. - Vol. 22. - P. 419-426. 4. Fransen L., Van der Heyden J., Ruysschaert R., Fiers W. // Eur. J. Cancer clin. Oncol. - 1986. - Vol. 22. - P. 419-426.

5. Shalaby M.R., Aggarwal B.B., Rinderknecht E. et al.// J. Immunol. - 1985. - Vol. l35. - P. 2069-2073. 5. Shalaby M.R., Aggarwal B. B., Rinderknecht E. et al. // J. Immunol. - 1985. - Vol. l35. - P. 2069-2073.

6. Klebanoff S.J., Vadas M.A., Harlan J.M. et al.// J.lmmumol. - 1986. - Vol. 136. - P. 4220-4224. 6. Klebanoff S.J., Vadas M.A., Harlan J.M. et al. // J. lmmumol. - 1986. - Vol. 136.- P. 4220-4224.

7. Fiers W. // The Natural Immune System: Humoral Factors/ Ed. S.Sim. Oxford:IRL Press, 1993. - P. 65-119. 7. Fiers W. // The Natural Immune System: Humoral Factors / Ed. S.Sim. Oxford: IRL Press, 1993 .-- P. 65-119.

8. Bevilacqua M. P. , Pober J.S., Majean G. et al.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1986. - Vol. 83. - P. 4533-4537. 8. Bevilacqua M. P., Pober J.S., Majean G. et al. // Proc. Natl. Acad Sci. USA - 1986. - Vol. 83. - P. 4533-4537.

9. Международная заявка (WO) N 88/06625, кл. 4 C 12 N 15/00, 1988 г. 9. International application (WO) N 88/06625, cl. 4 C 12 N 15/00, 1988

10. Me Sagi Т., Kato A., Kitai K. et al.//Jpn.J.Cancer Res. - 1995. - Vol. 86. - P. 72-80. 10. Me Sagi T., Kato A., Kitai K. et al.//Jpn.J. Cancer Res. - 1995. - Vol. 86. - P. 72-80.

11. Патент РФ (RU) N 2058390, кл. 6 C 12 N 15/28, 1996 г. 11. Patent of the Russian Federation (RU) N 2058390, cl. 6 C 12 N 15/28, 1996

12. Международная заявка (WO) N 91/01998, кл. 5 C 07 К 13/00, 1991 г. 12. International application (WO) N 91/01998, cl. 5 C 07 K 13/00, 1991

13. Tsuysumn Y., Kihira Т., Tsunoda S.//Br.J.Cancer. - 1995. - Vol. 71. - P. 963-968. 13. Tsuysumn Y., Kihira T., Tsunoda S.//Br.J. Cancer. - 1995. - Vol. 71. - P. 963-968.

14. Tsutsumi Y. , Kihira Т., Tsunoda S. et al.//Br.J.Cancer. - 1995. - Vol. 71. - P. 963- 968. 14. Tsutsumi Y., Kihira T., Tsunoda S. et al.//Br.J. Cancer. - 1995. - Vol. 71. - P. 963-968.

15. Kirsch M., Fisher H., Schackert G.//J.Neurooncol. - 1994. - Vol. 20. - P. 35-45. 15. Kirsch M., Fisher H., Schackert G. // J. Neurooncol. 1994. Vol. 20. - P. 35-45.

16. Заявка Венгрии (HU) N T/37891, кл. 4 A 61 K 37/00, 1986 г. 16. Application of Hungary (HU) N T / 37891, cl. 4 A 61 K 37/00, 1986

17. Заявка ЕПВ (ЕР) N 325471, кл. 4 A 61 K 37/36, 1989 г. 17. Application EPO (EP) N 325471, cl. 4 A 61 K 37/36, 1989

18. Международная заявка (WO) N 91/01753, кл. 5 A 61 K 39/395, 1991 г. 18. International application (WO) N 91/01753, cl. 5 A 61 K 39/395, 1991

19. Патент США (US) N 4857314, кл. 4 A 61 K 37/02, 1989 г. 19. US patent (US) N 4857314, CL. 4 A 61 K 37/02, 1989

20. Заявка ЕПВ (ЕР) N 269017, кл. 4 A 61 K 45/06, 1988 г. 20. Application EPO (EP) N 269017, cl. 4 A 61 K 45/06, 1988

21. Международная заявка (WO) N 8802632, кл. 4 A 61 K 37/02, 1988 г. 21. International application (WO) N 8802632, cl. 4 A 61 K 37/02, 1988

22. Dougherty T. J. , Kaufman J.E., Goldfarb A. et al.//Cancer Res. - 1978. - Vol. 38. - P. 2628-2635. 22. Dougherty T. J., Kaufman J.E., Goldfarb A. et al. // Cancer Res. - 1978. - Vol. 38. - P. 2628-2635.

23. Henderson B.W., Dougherty T.J.//Photochem.Photobiol. - 1992. - Vol. 55. - P. 145-157. 23. Henderson B.W., Dougherty T.J.//Photochem.Photobiol. - 1992. - Vol. 55. - P. 145-157.

24. Dougherty T.J.// Photochem.Photobiol. - 1987. - Vol. 45. - P. 879-889. 24. Dougherty T.J. // Photochem.Photobiol. - 1987. - Vol. 45. - P. 879-889.

25. Henderson B.W.//Photodermatology. - 1989. - Vol. 6. - P. 200-211. 25. Henderson B.W. // Photodermatology. - 1989. - Vol. 6. - P. 200-211.

26. Bellneir D.A.//J.Photochem.Photobiol. B:Biol. - 1991. - Vol. 8. - P. 203-210. 26. Bellneir D.A. // J.Photochem.Photobiol. B: Biol. - 1991. - Vol. 8. - P. 203-210.

27. Pantelides M. L. , Moore J.W., Black N.J.// Photochem.Photobiol. - 1989. - Vol. 49. - P. 67-70. 27. Pantelides M. L., Moore J.W., Black N.J. // Photochem.Photobiol. - 1989. - Vol. 49. - P. 67-70.

28. Прозоровский В. Б., Прозоровская Н.П., Демченков В.И.//Фармакол. и токсикол. - 1978. - N 4. - С. 497-501. 28. Prozorovsky V. B., Prozorovskaya N.P., Demchenkov V.I. // Farmakol. and toxicol. - 1978. - N 4. - S. 497-501.

Claims

An antitumor agent, which is a complex preparation of hematoporphyrin derivatives and tumor necrosis factor alpha in a 1: 1 molar ratio.