RU2130069C1 - Способ концентрирования вируса - Google Patents
Способ концентрирования вируса Download PDFInfo
- Publication number
- RU2130069C1 RU2130069C1 RU97103958A RU97103958A RU2130069C1 RU 2130069 C1 RU2130069 C1 RU 2130069C1 RU 97103958 A RU97103958 A RU 97103958A RU 97103958 A RU97103958 A RU 97103958A RU 2130069 C1 RU2130069 C1 RU 2130069C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- virus
- sorbent
- bioaffinity
- immobilized
- antibodies
- Prior art date
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 62
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 claims abstract description 48
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 claims abstract description 22
- 239000000495 cryogel Substances 0.000 claims abstract description 22
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 claims abstract description 22
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims abstract description 14
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims abstract description 9
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000003795 desorption Methods 0.000 claims abstract description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 8
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 abstract description 12
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 abstract description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 abstract description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 2
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 abstract 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 13
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 13
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 13
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 11
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 7
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 6
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 5
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 4
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 4
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 241000711386 Mumps virus Species 0.000 description 3
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 3
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000009144 enzymatic modification Effects 0.000 description 3
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 3
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 3
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000712079 Measles morbillivirus Species 0.000 description 2
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 description 2
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 2
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 2
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000010884 Bursa disease Diseases 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- BRLQWZUYTZBJKN-UHFFFAOYSA-N Epichlorohydrin Chemical compound ClCC1CO1 BRLQWZUYTZBJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 208000005647 Mumps Diseases 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 239000000645 desinfectant Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 208000010805 mumps infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000007425 progressive decline Effects 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 238000007693 zone electrophoresis Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к прикладной вирусологии, конкретно к процессам выделения, очистки, модификации вирусов и вирусных препаратов, т.е. к процессам, связанным с концентрированием вирусов. При концентрировании вируса путем его связывания биоаффинным сорбентом, содержащим антитела к вирусу, иммобилизованные на полимерной основе, промывки и последующей десорбции, в качестве полимерной основы биоаффинного сорбента используют криогель поливинилового спирта с размером пор 0,04 - 2,0 мкм. Кроме того, биоаффинный сорбент может, согласно данному изобретению, содержать наряду с антителами иммобилизованные ферменты, модифицирующие вирус. Предлагаемый способ обладает преимуществами по сравнению с аналогами и прототипом; а) повышена эффективность способа; б) повышена универсальность. Изобретение может быть использовано как в научных исследованиях, так и при производстве вакцин и диагностикумов, а также в медицинской практике. 1 з.п. ф-лы.
Description
Изобретение относится к прикладной вирусологии, конкретно к процессам выделения, очистки, идентификации, модификации вирусов и вирусных препаратов, т. е. к процессам, связанным с концентрированием вирусов. Изобретение может быть использовано как в научных исследованиях, так и при производстве вакцин и диагностикумов, а также в медицинской практике.
Известными методами концентрирования вирусных частиц в современной вирусологии являются многоступенчатые операции длительного высокоскоростного центрифугирования в градиенте плотности сахарозы или глицерина, а также зонного электрофореза и др. [1], кроме того используется концентрирование вирусов с помощью биоаффинных сорбентов, содержащих иммобилизованные антитела к вирусу [2]. Последний подход характеризуется большей эффективностью и технологическими удобствами.
Так, известен способ биоаффинной очистки вируса кори, где используют носитель, содержащий иммуноглобулины сыворотки крови обезьян, ковалентно пришитые к поверхности модифицированных стеклянных бусинок [3]. Способ включает пропускание вирусосодержащей жидкости через хроматографическую колонку, заполненную биоаффинным сорбентом с иммуноглобулинами, ковалентно-пришитыми к стеклянному носителю, с последующей промывкой колонки 0,14М раствором NaCl и элюированием вируса 0,1М глициновым буфером при pH 2,3.
Недостатками такого способа является низкая биоспецифическая емкость используемого носителя (работает только поверхность стеклянных гранул), неспецифическая адсорбция стеклом посторонних примесей и хрупкость, характерные для стеклянных носителей вообще.
Известен способ биоаффинной очистки вирусов разных размеров, где для очистки вируса используется силикагель с контролируемыми размерами пор (0,05 - 1,0 мкм) с привитыми аффинными лигандами [4]. Способ состоит из аналогичных операций хроматографической очистки целевого продукта, что и в предыдущем случае, только для промывания используют 0,1М Na-фосфатный буфер (pH 7,0), а для элюирования применяют 0,05М Na-цитратный буфер (pH 3,0).
Недостатками этого способа являются сложность получения иммуносорбента, связанная с многостадийной схемой модификации неорганического носителя, а также характерная для таких материалов хрупкость. Кроме того, в рабочих жидкостях даже со слабощелочной реакцией среды (pH 7,5-8,5) кремнеземные матрицы гидролитически нестабильны, что приводит к растворению активной поверхности и прогрессивному снижению биоспецифической емкости.
Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности является выбранный в качестве прототипа способ очистки вируса сумчатой болезни цыплят путем его сорбционного концентрирования при пропускании вирусосодержащих суспензий через колонку с иммуносорбентом, представляющим собой нерастворимый носитель - гранулированный агарозный гель (коммерческое название - сефароза-4B), к которому после активации бромцианом ковалентно пришиты иммуноглобулины [5] . Такой биоаффинный сорбент используют для чистки не очень крупных вирусов, размеры которых ее превышают 0,08 мкм.
Однако указанный способ концентрирования вируса малоэффективен при работе с крупными (0,1-0,5 мкм) вирусами. Кроме того, гранулированные агарозные гели, в частности сефароза, имеют высокую стоимость и поэтому не могут найти крупномасштабного применения. Бромциан, используемый для активации данного носителя является высокотоксичным соединением, работа с ним представляет опасность для персонала.
Задача предлагаемого изобретения - разработка эффективного, универсального и технологически упрощенного способа концентрирования различных вирусов, в том числе и самых крупных вирусов с размером частиц до 0,5 мкм.
Решение этой задачи достигается тем, что при концентрировании вируса путем его связывания биоаффинным сорбентом, содержащим антитела к вирусу, иммобилизованные на полимерной основе, промывку и последующую десорбцию, в качестве полимерной основы биоаффинного сорбента используют криогель поливинилового спирта с размером пор 0,04 - 2,0 мкм. Кроме того, биоаффинный сорбент может, согласно данному изобретению, содержать, наряду с антителами, иммобилизованные ферменты, модифицирующие вирус.
Оказалось, что выбор криогеля поливинилового спирта (ПВС) в качестве полимерной основы биоаффинного сорбента обеспечивает возможность технологического упрощения способа концентрирования вируса, повышение эффективности способа в целом, его универсальности, в том числе и в отношении самых крупных вирусов с размером частиц до 0,5 мкм.
Весьма важными свойствами криогелей ПВС является их биосовместимость, отсутствие токсичности, а также его доступностью и относительная дешевизна. Криогели ПВС образуются в результате замораживания концентрированных водных растворов ПВС, их выдерживания в замороженном состоянии в течение определенного времени и последующего оттаивания [6]. Сформированный таким образом макропористый криогель устойчив при температурах до 60-65oC и имеет температуру плавления 80-100oC. Он обладает выраженной макропористостью [6], т.е. отвечает одному из основных требований, предъявляемых к носителям, предназначенным для работы с вирусами. Согласно предлагаемому изобретению в качестве полимерной основы биоафинного сорбента предусматривается использование криогеля ПВС, имеющего поры размером 0,05-2,0 мкм. Такие поры обеспечивают свободное проникновение даже самых крупных вирусов внутрь гранул носителя, т. е. в связывании с вирусами участвуют аффинные лиганды всего объема носителя.
Кроме того, в противоположность хрупким макропористым неорганическим матрицам (макропористые стекла, кремнеземы, диатомит и др.) криогели ПВС являются нехрупкими вязкоупругими физическими телами, мало подверженными абразивному износу даже при интенсивном перемешивании. Таким образом, криогели ПВС наряду с макропористостью удовлетворяют и требованию операционной стабильности. И, наконец, криогели ПВС могут, в случае необходимости, подвергаться стерилизации, например, промывке дезинфицирующими растворами, облучению или (для уничтожения отработанного материала) автоклавированию.
Способ осуществляют следующим образом: вирусосодержащую жидкость инкубируют с биоаффинным сорбентом, содержащим специфические антитела, иммобилизованные на активированной матрице криогеля ПВС, отмывают несвязавшиеся посторонние компоненты и освобождают адсорбированный вирус из комплекса с биоаффинным сорбентом. Для модификации вируса используют биоаффинный сорбент, содержащий соиммобилизованные специфические антитела и фермент (ферменты), способные вызвать модификацию вирусных частиц. Конкретная реализация предлагаемого изобретения иллюстрируется следующими примерами:
Пример 1.
Пример 1.
Для концентрирования вируса гриппа (тип A, H1N1, размер вирусных частиц 0,1 мкм) используют биоаффинный сорбент, представляющий собой криогель ПВС с максимальным диаметром пор 1,0 мкм, активированный глутаровым альдегидом при pH 1,0, к которому ковалентно пришиты специфические антитела, полученные из сыворотки крови кроликов, иммунизированных соответствующим антигеном (емкость сорбента по иммобилизованным антителам 0,7 - 1,2 мг/г). Навеску (0,5 г) биоаффинного сорбента перемешивают с 2,0 мл вирусосодержащей жидкостью в течение 20 часов при +5oC, затем промывают несвязавшиеся компоненты 0,1М PBS (контроль - нулевые значения оптической плотности при 260 нм и 280 нм, а также отрицательная реакция гемаглютинации (РГА)), и далее проводят десорбцию вируса 0,65 NaCl в 0,05М трис-HCl (pH 7,4) порциями по 1,0 мл в течение трех часов до полного удаления вируса. Емкость биоаффинного сорбента по десорбированному антигену - 1400 ГАЕ/г носителя. (ГАЕ - произведение обратного титра на объем пробы). Специфичность полученного биоафинного сорбента (с иммобилизованными антителами к вирусу гриппа A, H1N1) проверяют с помощью вируса гриппа A, H3N2. Антигенную активность определяют по реакции прямой гемагглютинации (РГА). Полученные результаты показывают, что на данном иммуносорбенте неспецифические антигены (H3N2) не сорбируется, т.е. наблюдается только биоспецифическая сорбция (концентрирование) антигенов.
Пример 2.
Для концентрирования вируса гриппа (тип A, H1N1, размер вирусных частиц 0,1 мкм) используют биоаффинный сорбент, представляющий собой криогель ПВС с максимальным диаметром пор 0,5 мкм, активированный эпихлоргидрином при pH 13, к которому ковалентно пришиты специфические антитела, полученные из сыворотки крови кроликов, иммунизированных соответствующим антигеном (емкость сорбента по иммобилизованным антителам 0,5 - 0,6 мг/г), а элюцию сконцентрированного вируса осуществляют в колоночном режиме с использованием 2,5М MgCl2 в 0,05М трис-HCl (pH 7,4). Количество десорбированного вируса составляет 800 ГАЕ/г носителя.
Пример 3.
Для концентрирования вируса гриппа (тип A, H3N2, размер вирусных частиц 0,12 мкм) используют биоаффинный сорбент, представляющий собой криогель ПВС с максимальным диаметром пор 0,7 мкм, активированный бромцианом при pH 11,5, к которому ковалентно пришиты специфические антитела, полученные из сыворотки крови кроликов, иммунизированных соответствующим антигенам (емкость сорбента по иммобилизованным антителам 1,5 мг/г), а элюцию сконцентрированного вируса проводят с помощью 0,65 М NaCl в 0,5М трис-HCl (pH 7,4). Количество десорбированного вируса составляет 2000 ГАЕ/г носителя.
Пример 4.
Для концентрирования вируса парагриппа ГП6 (размер вирусных частиц 0,15 мкм) используют биоаффинный сорбент, представляющий собой криогель ПВС с максимальным диаметром пор 1,5 мкм, активированный глутаровым альдегидом при pH 0,5, к которому ковалентно пришиты специфические антитела, полученные из сыворотки крови морских свинок, иммунизированных соответствующим антигеном (емкость сорбента по иммобилизованным антителам 0,5 - 0,7 мг/г), а элюцию сконцентрированного вируса проводят с помощью 0,65 NaCl в 0,05М трис-HCl (pH 7,4). Титр очищенного антигена (вирус парагриппа ГП6) определяют методом непрямого иммуноферментного анализа (ИФА). Емкость биоаффинного сорбента в отношении данного вируса составляет 1266 единиц антигенной активности на 1 г носителя.
Пример 5.
Для концентрирования вируса оспы (размер вирусных частиц 0,4 х 0,2 мкм) используют биоаффинный сорбент, представляющий собой криогель ПАВ с максимальным диаметром пор до 2 мкм, активированный глутаровым альдегидом при pH 1,2, к которому ковалентно пришиты специфические антитела, полученные из сыворотки крови кроликов, иммунизированных соответствующим антигеном (емкость сорбента по иммобилизованным антителам 0,8 мг/г), а элюцию сконцентрированного вируса проводят с помощью 0,75 NaCl в 0,05 трис-HCl (pH 7,8). Титр очищенного антигена (вирус оспы) определяют в непрямом варианте ИФА. Емкость биоаффинного сорбента в отношении данного вируса составляет 2048 единиц антигенной активности на 1 г носителя.
Пример 6.
Для концентрирования и ферментативной модификации вируса ящура (размер вирусных частиц 0,02 мкм) навеску (0,5 г) биоаффинного сорбента, представляющего собой криогель ПВС с максимальным диаметром пор до 0,04 мкм, активированный глутаровым альдегидом при pH 1,0, к которому ковалентно пришиты специфические антитела к вирусу ящура (получены из сыворотки крови телят, иммунизированных соответствующим антигеном) и модифицирующий фермент - папаин (емкость сорбента по иммобилизованным антителам - 0,4 мг/г, по папаину - 0,2 мг/г) перемешивают с 2,0 мл вирусосодержащей жидкости в течение 12 часов при +5oC. Аналогичным образом поступают с контрольным биоаффинным сорбентом, у которого иммобилизованный папаин содержит блокированную тиольную группу активного центра. Далее проводят десорбцию вируса 0,5М NaCl в 0,05М трис -HCl (pH 7,4) порциями по 1,0 мл в течение трех часов. Емкость контрольного биоаффинного сорбента по десорбированному вирусу составляет 780 БОЕ/г носителя (БОЕ - бляшкообразующие единицы), носителя с активным папаином - 32 БОЕ/г носителя, т.е. в 24,3 раза меньше, что является результатом действия иммобилизованной протеазы на вирус ящура, сконцентрированный в фазе биоаффинного сорбента за счет взаимодействия с иммобилизованными антителами (факт подобного концентрирования доказывают результаты эксперимента с контрольным биоаффинным сорбентом), что в итоге приводит к значительному снижению вирулентной активности вируса.
Пример 7.
Для концентрирования и ферментативной модификации вируса паротита (размер вирусных частиц 0,14 мкм) навеску (0,5 г) биоаффинного сорбента, представляющего собой криогель ПВС с максимальным диаметром пор до 1,4 мкм, активированный глутаровым альдегидом при pH 1,0, к которому ковалентно пришиты специфические антитела к вирусу паротита (получены из сыворотки крови хомяков, иммунизированных соответствующим антигеном) и модифицирующие ферменты - нейраминидазу и рибонуклеазу (емкость сорбента по иммобилизованным антителам - 0,3 мг/г, по нейраминидазе - 0,15 мг/г, по РНК-азе 0,2 мг/г), инкубируют с 2,0 мл вирусосодержащей жидкости в течение 12 часов при +5oC. Аналогичным образом поступают с контрольным биоаффинным сорбентом, представляющим собой препарат, в котором иммобилизованы на носителе только антитела, специфические к вирусу паротита (емкость контрольного биоаффинного сорбента по антителам - 0,7 мг/г носителя). Затем отмывают несвязавшиеся компоненты 0,1М PBS (контроль - нулевые значения оптической плотности при 280 и 260 нм) и далее проводят десорбцию вируса 0,5 NaCl в 0,05М трис-HCl (pH 7,4) порциями по 1,0 мл в течение трех часов. Емкость контрольного биоаффинного сорбента по десорбированному вирусу составляет 650 ГАЕ/г носителя, для сорбента с модифицирующими ферментами вирусологической активности не зафиксировано, что связано с действием иммобилизованной нейраминидазы на белковый капсид вируса паротита и последующего воздействия иммобилизованной РНК-азы на освобождающуюся из вириона рибонуклеиновую кислоту, результатом чего является отсутствие вирулентной активности вируса.
Предлагаемый способ концентрирования вируса обладает следующими преимуществами по сравнению с аналогами и прототипом:
- повышена эффективность способа, т.к. в противоположность способам-аналогам в заявляемом способе применяется биоаффинный сорбент на основе вязкоупругого нехрупкого и гидролитически стабильного криогеля ПВС, поэтому появляется возможность проводить концентрирование вируса не только в хроматографическом (колоночном) варианте, но и в реакторах с перемешиванием сорбента, что существенно интенсифицирует массообменные процессы, т.е. улучшается технологичность способа;
- повышена универсальность способа, т. к. обеспечивается возможность концентрирования, наряду с мелкими, даже самых крупных вирусов (0,5 мкм и более), в то время как в способе-прототипе матрица биоаффинного носителя способна обеспечить диффузию внутрь его гранул лишь довольно мелких (до 0,08 мкм) вирусов; кроме того, универсальность заявляемого способа также обусловлена возможностью одновременного концентрирования и ферментативной модификацией вируса, когда биоаффинный сорбент наряду с иммобилизованными антителами содержит иммобилизованный модифицирующий фермент (ферменты);
- биоаффинные сорбенты на основе криогеля ПВС инертны и высокоспецифичны, их можно повторно применять без существенной специфической активности, полимер, используемый для приготовления гелевой основы дешев и доступен.
- повышена эффективность способа, т.к. в противоположность способам-аналогам в заявляемом способе применяется биоаффинный сорбент на основе вязкоупругого нехрупкого и гидролитически стабильного криогеля ПВС, поэтому появляется возможность проводить концентрирование вируса не только в хроматографическом (колоночном) варианте, но и в реакторах с перемешиванием сорбента, что существенно интенсифицирует массообменные процессы, т.е. улучшается технологичность способа;
- повышена универсальность способа, т. к. обеспечивается возможность концентрирования, наряду с мелкими, даже самых крупных вирусов (0,5 мкм и более), в то время как в способе-прототипе матрица биоаффинного носителя способна обеспечить диффузию внутрь его гранул лишь довольно мелких (до 0,08 мкм) вирусов; кроме того, универсальность заявляемого способа также обусловлена возможностью одновременного концентрирования и ферментативной модификацией вируса, когда биоаффинный сорбент наряду с иммобилизованными антителами содержит иммобилизованный модифицирующий фермент (ферменты);
- биоаффинные сорбенты на основе криогеля ПВС инертны и высокоспецифичны, их можно повторно применять без существенной специфической активности, полимер, используемый для приготовления гелевой основы дешев и доступен.
Литература
1. Х.Френкель-Конрат. Химия и биология вирусов.// М.,1972, стр. 33-37.
1. Х.Френкель-Конрат. Химия и биология вирусов.// М.,1972, стр. 33-37.
2. Я.Туркова, Аффинная хроматография,//М.,1980, стр. 5-14.
3. Purification of measles virus by affinity chromatography and by ultracentrifufation: a comparative study//Njayou M., Quash G.// J. Yirol. Meth. - 1991, v. 32, N 1, p/67-77.
4. Separation and purification of biopolimers by affinity chromatography on controlled-pore silica gel./Colpan M.//Ger. offen. DE 3627063, cl. B 01 D 15/08, 1988.
5. Separation and purification of antigen for diagnosis of infectious bursa disease in chickens. Nagai Sh., Otaki Y., Ueda S., JP 63210775, cl. G 01 N 33/569, 1989.
6. Применение криогелей поливинилового спирта в биотехнологии. Обзор литературных данных. //Лозинский В.И., Вакула А.В., Зубов А.Л.// Биотехнология, N 4, 1992, с. 5-14.
Claims (2)
1. Способ концентрирования вируса, включающий его связывание биоаффинным сорбентом, содержащим антитела к вирусу, иммобилизованные на полимерной основе, промывку и последующую десорбцию, отличающийся тем, что в качестве полимерной основы биоаффинного сорбента используют криогель поливинилового спирта с размером пор 0,04 - 2,0 мкм.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что связывание вируса осуществляют с помощью биоаффинного сорбента, содержащего, наряду с антителами, иммобилизованные ферменты, модифицирующие вирус.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU97103958A RU2130069C1 (ru) | 1997-03-14 | 1997-03-14 | Способ концентрирования вируса |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU97103958A RU2130069C1 (ru) | 1997-03-14 | 1997-03-14 | Способ концентрирования вируса |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU97103958A RU97103958A (ru) | 1999-03-20 |
| RU2130069C1 true RU2130069C1 (ru) | 1999-05-10 |
Family
ID=20190830
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU97103958A RU2130069C1 (ru) | 1997-03-14 | 1997-03-14 | Способ концентрирования вируса |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2130069C1 (ru) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2190644C1 (ru) * | 2001-04-26 | 2002-10-10 | Институт элементоорганических соединений им. А.Н.Несмеянова РАН | Композиция для получения криогеля поливинилового спирта и способ получения криогеля |
| WO2003031014A1 (en) | 2001-10-12 | 2003-04-17 | Protista International Ab | Separation medium, its preparation and its use |
| WO2003041830A3 (en) * | 2001-10-12 | 2003-11-20 | Protista Internat Ab | Macroporous gel, its preparation and its use |
| WO2004110484A1 (en) * | 2003-06-18 | 2004-12-23 | Gosudarstvenny Nauchny Tsentr Virusologii I Biotekhnologii 'vektor' | Method for producing a live tissue-cultural vaccine against influenza virus |
| RU2252945C1 (ru) * | 2003-10-30 | 2005-05-27 | Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН (ИНЭОС РАН) | Полимерная композиция для получения криогеля поливинилового спирта |
| RU2368660C1 (ru) * | 2007-12-29 | 2009-09-27 | Виктор Николаевич Ляпустин | Устройство для очистки вирионных структур флавивирусов |
| US7854717B1 (en) | 1998-05-22 | 2010-12-21 | Biopheresis Technologies, Inc. | Method and compositions for treatment of cancers |
| US8133490B2 (en) | 1998-05-22 | 2012-03-13 | Biopheresis Technologies, Inc. | Method and system to remove cytokine inhibitors in patients |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1989008701A1 (fr) * | 1988-03-11 | 1989-09-21 | Institut Für Angewandte Biotechnologie Der Tropen | Procede et dispositif de production de virus et d'antigenes viraux |
| RU2016897C1 (ru) * | 1991-09-12 | 1994-07-30 | Омский научно-исследовательский институт природно-очаговых инфекций Государственного комитета санитарно-эпидемиологического надзора РФ | Способ очистки и концентрации комплементсвязывающего антигена вируса клещевого энцефалита |
| RU2051173C1 (ru) * | 1992-01-09 | 1995-12-27 | Виталий Николаевич Гирин | Способ концентрации и очистки вирусов |
| RU2057804C1 (ru) * | 1993-12-22 | 1996-04-10 | Санкт-Петербургский государственный университет технологии и дизайна | Способ получения очищенной биомассы вируса гриппа |
-
1997
- 1997-03-14 RU RU97103958A patent/RU2130069C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1989008701A1 (fr) * | 1988-03-11 | 1989-09-21 | Institut Für Angewandte Biotechnologie Der Tropen | Procede et dispositif de production de virus et d'antigenes viraux |
| RU2016897C1 (ru) * | 1991-09-12 | 1994-07-30 | Омский научно-исследовательский институт природно-очаговых инфекций Государственного комитета санитарно-эпидемиологического надзора РФ | Способ очистки и концентрации комплементсвязывающего антигена вируса клещевого энцефалита |
| RU2051173C1 (ru) * | 1992-01-09 | 1995-12-27 | Виталий Николаевич Гирин | Способ концентрации и очистки вирусов |
| RU2057804C1 (ru) * | 1993-12-22 | 1996-04-10 | Санкт-Петербургский государственный университет технологии и дизайна | Способ получения очищенной биомассы вируса гриппа |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Асташкина О.В. Получение модифицированных химических волокон-аффинных сорбентов для вирусологии - Л., 1991, с.150. Применение криогелей поливинилового спирта в биотехнологии. Обзор литературных данных, Биотехнология, N 4, 1992, с.5 - 14. * |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7854717B1 (en) | 1998-05-22 | 2010-12-21 | Biopheresis Technologies, Inc. | Method and compositions for treatment of cancers |
| US8133490B2 (en) | 1998-05-22 | 2012-03-13 | Biopheresis Technologies, Inc. | Method and system to remove cytokine inhibitors in patients |
| US8197430B1 (en) | 1998-05-22 | 2012-06-12 | Biopheresis Technologies, Inc. | Method and system to remove cytokine inhibitor in patients |
| RU2190644C1 (ru) * | 2001-04-26 | 2002-10-10 | Институт элементоорганических соединений им. А.Н.Несмеянова РАН | Композиция для получения криогеля поливинилового спирта и способ получения криогеля |
| WO2003031014A1 (en) | 2001-10-12 | 2003-04-17 | Protista International Ab | Separation medium, its preparation and its use |
| WO2003041830A3 (en) * | 2001-10-12 | 2003-11-20 | Protista Internat Ab | Macroporous gel, its preparation and its use |
| EP1436056A2 (en) * | 2001-10-12 | 2004-07-14 | Protista International AB | Macroporous gel, its preparation and its use |
| US7547395B2 (en) | 2001-10-12 | 2009-06-16 | Protista Biotechnology Ab | Macroporous gel, its preparation and its use |
| WO2004110484A1 (en) * | 2003-06-18 | 2004-12-23 | Gosudarstvenny Nauchny Tsentr Virusologii I Biotekhnologii 'vektor' | Method for producing a live tissue-cultural vaccine against influenza virus |
| RU2252945C1 (ru) * | 2003-10-30 | 2005-05-27 | Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН (ИНЭОС РАН) | Полимерная композиция для получения криогеля поливинилового спирта |
| RU2368660C1 (ru) * | 2007-12-29 | 2009-09-27 | Виктор Николаевич Ляпустин | Устройство для очистки вирионных структур флавивирусов |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6610630B2 (en) | Chromatography adsorbents utilizing mercapto heterocyclic ligands | |
| Safarik et al. | Magnetic techniques for the isolation and purification of proteins and peptides | |
| JP5530633B2 (ja) | アフィニティークロマトグラフィーマトリックスおよびその作成および使用法。 | |
| US4138287A (en) | Purifying and isolating method for hepatitis virus to use in preparing vaccine | |
| AU2011350672B2 (en) | Method for immobilising nucleic ligands | |
| KR20100015562A (ko) | 바이러스 유사 입자 정제 | |
| CN101279242A (zh) | 用于抗体清除的血液净化吸附剂 | |
| RU2130069C1 (ru) | Способ концентрирования вируса | |
| CN113166792A (zh) | 一种用于从含内毒素源或潜在含内毒素源中去掉或去除内毒素的方法 | |
| JP4739233B2 (ja) | 免疫グロブリンの精製 | |
| US8053565B2 (en) | Multi-media affinity column to prevent leaching of ligands | |
| JPWO2007123242A1 (ja) | ＩｇＧ精製用分離剤、及びそれを用いたＩｇＧ単量体の精製方法 | |
| JPH0489500A (ja) | アフィニティクロマトグラフィーによる物質の精製法および精製装置 | |
| JPH03169893A (ja) | 精製方法 | |
| Heldt et al. | Identification of trimeric peptides that bind porcine parvovirus from mixtures containing human blood plasma | |
| JPS6155415B2 (ru) | ||
| Turkova | Affinity chromatography | |
| JP2007238479A (ja) | ハイドロキシアパタイトに吸着された有機物の溶出方法及び該溶出方法を用いた有機物の精製方法 | |
| Porter et al. | A review of virus and protein sorption by ion exchange resins | |
| JP4067684B2 (ja) | 固相担体を用いた分離方法 | |
| US5576175A (en) | Complex suitable for carrying out a method of purifying pre-S hepatitis B surface antigen | |
| FI101625B (fi) | Pre-S-hepatitis-B-virus-pinta-antigeenin puhdistusmenetelmän toteuttam iseen soveltuva kompleksi | |
| Ayhan et al. | Protein A immobilized poly (methylmethacrylate-co-hydroxyethylmethacrylate) microbeads for IgG adsorption | |
| JP6064402B2 (ja) | 抗体単量体の分離用分離剤及び分離方法 | |
| US5340575A (en) | Complex suitable for carrying out a method of purifying pre-S hepatitis B surface antigen |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20070315 |