RU2126832C1 - Method of cell culture preparing - Google Patents
Method of cell culture preparing Download PDFInfo
- Publication number
- RU2126832C1 RU2126832C1 RU97120401A RU97120401A RU2126832C1 RU 2126832 C1 RU2126832 C1 RU 2126832C1 RU 97120401 A RU97120401 A RU 97120401A RU 97120401 A RU97120401 A RU 97120401A RU 2126832 C1 RU2126832 C1 RU 2126832C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- complex
- solution
- organs
- collagenolytic
- tissues
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения культур клеток из органов и тканей человека и животных. The invention relates to biotechnology, and in particular to methods for producing cell cultures from organs and tissues of humans and animals.
В биотехнологии широко используется способ получения культур клеток, в котором для дезагрегации и отделения клеток монослоя от субстрата используют препараты трипсина или химотрипсина, выделенные из поджелудочной железы свиньи или крупного рогатого скота [1]. Однако известно, что препараты трипсина и химотрипсина не обладают коллагенолитической активностью и практически не способны гидролизовать интерстициальный коллаген, что делает их применение неэффективным. In biotechnology, a method of obtaining cell cultures is widely used, in which trypsin or chymotrypsin preparations isolated from pig pancreas or cattle are used to disaggregate and separate monolayer cells from the substrate [1]. However, it is known that trypsin and chymotrypsin preparations do not have collagenolytic activity and are practically not able to hydrolyze interstitial collagen, which makes their use ineffective.
Известен способ получения культур клеток путем обработки органов ферментным препаратом коллагеназы, полученным из патогенного микроорганизма Clostridium histolyticum [2]. Основным недостатком данного способа является то, что препарат клостридиальной коллагеназы, полученный из вышеуказанного микроорганизма, содержит значительное количество патогенных и пирогенных примесей, которые практически невозможно исключить при очистке любым известным способом, что отрицательно сказывается на проценте выхода живых клеток. Кроме того, клостридиальная коллагеназа не способна гидролизовать неколлагеновые белки, что необходимо для более полной дезагрегации тканей и органов и как следствие увеличения выхода живых клеток. Данная коллагеназа проявляет максимальную активность при температуре 37oC. При более низких температурах, оптимальных для получения культур клеток, ее активность недостаточна для эффективного применения.A known method of producing cell cultures by treating organs with an enzyme preparation of collagenase obtained from the pathogenic microorganism Clostridium histolyticum [2]. The main disadvantage of this method is that the preparation of clostridial collagenase obtained from the above microorganism contains a significant amount of pathogenic and pyrogenic impurities, which are almost impossible to exclude during purification by any known method, which negatively affects the percentage of yield of living cells. In addition, clostridial collagenase is not able to hydrolyze non-collagen proteins, which is necessary for a more complete disaggregation of tissues and organs and, as a result, an increase in the yield of living cells. This collagenase exhibits maximum activity at a temperature of 37 o C. At lower temperatures, optimal for obtaining cell cultures, its activity is insufficient for effective use.
Таким образом существует противоречие: трипсиноподобные ферменты не способны интенсивно гидролизовать интерстициальный коллаген, а коллагеназа - остальные неколлагеновые белки, гидролиз которых также необходим для полной дезагрегации тканей. Thus, there is a contradiction: trypsin-like enzymes are not able to intensively hydrolyze interstitial collagen, and collagenase is the rest of non-collagen proteins, the hydrolysis of which is also necessary for complete disaggregation of tissues.
Указанное противоречие частично устраняется способом [3], в котором для культивирования клеток эукариотов используется ферментативный гидролизат мышечной ткани гидробионтов - ластоногих. Данный гидролизат содержит как коллагеназы (тканевые), так и общие протеиназы, присутствие которых обеспечивает более глубокую дезагрегацию тканей. Однако известно, что тканевые коллагеназы являются белками с высоким молекулярным весом и нестабильны в смеси с другими протеолитическими ферментами. Это свойство снижает эффективность применения тканевого гидролизата мышечной ткани при получении культур клеток. This contradiction is partially eliminated by the method [3], in which an enzymatic hydrolyzate of muscle tissue of hydrobionts, pinnipeds, is used to cultivate eukaryotic cells. This hydrolyzate contains both collagenases (tissue) and general proteinases, the presence of which provides a deeper disaggregation of tissues. However, tissue collagenases are known to be high molecular weight proteins and unstable when mixed with other proteolytic enzymes. This property reduces the effectiveness of the use of tissue hydrolyzate of muscle tissue in obtaining cell cultures.
Более эффективным для получения культур клеток является применение природных ферментных комплексов, обладающих как общей протеолитической, так и коллагенолитической активностями. More effective for obtaining cell cultures is the use of natural enzyme complexes with both common proteolytic and collagenolytic activities.
В качестве прототипа выбран способ получения культур клеток [4], в котором обработку тканей и органов осуществляют ферментным препаратом коллазы в растворе версена. Препарат коллазы представляет собой комплекс протеолитических ферментов с коллагенолитической активностью и выделен из гепатопанкреаса Камчатского краба. Прототип позволяет увеличить выход живых клеток по сравнению со способом [1] в 2-2,5 раза и обладает незначительным повреждающим действием на клетки в процессе дезинтеграции тканей. As a prototype, a method for producing cell cultures [4] was selected, in which the processing of tissues and organs is carried out with the enzyme preparation of collase in a versene solution. The collase preparation is a complex of proteolytic enzymes with collagenolytic activity and is isolated from the hepatopancreas of the Kamchatka crab. The prototype allows to increase the yield of living cells in comparison with the method [1] by 2-2.5 times and has a slight damaging effect on the cells in the process of tissue disintegration.
Авторами установлено, что способ [4] позволяет получать культуры фибробластов и кератиноцитов с высокой степенью дезинтеграции и высоким выходом живых клеток. Но следует отметить, что гепатоциты из печени взрослого человека наиболее чувствительны к токсическому воздействию на клетки и это свойство делает их незаменимыми при проверке различных веществ на токсичность. Исследования показали, что при использовании раствора с оптимальной концентрацией комплекса ферментов из краба, позволяющей эффективно дезагрегировать ткань печени, проявляется повреждающее действие компонентов ферментного препарата из краба на клетки, что снижает выход жизнеспособных гепатоцитов. С другой стороны, снижение концентрации комплекса в растворе снижает эффективность способа из-за уменьшения степени дезагрегации тканей печени. Аналогично влияние температуры: ее повышение приводит к повышению выхода клеток, но снижает их жизнеспособность, а снижение делает способ неэффективным. Кроме того, известно, что процесс получения культур клеток из печени человека предъявляет особые требования к степени чистоты используемых препаратов, а препарат комплекса протеиназ из краба содержит не менее 0,5% примесей, необходимых для стабилизации комплекса протеиназ, но токсичных для гепатоцитов. The authors found that the method [4] allows to obtain cultures of fibroblasts and keratinocytes with a high degree of disintegration and a high yield of living cells. But it should be noted that hepatocytes from the liver of an adult are most sensitive to toxic effects on cells and this property makes them indispensable when checking various substances for toxicity. Studies have shown that when using a solution with an optimal concentration of the complex of enzymes from the crab, which allows you to effectively disaggregate the liver tissue, the damaging effect of the components of the enzyme preparation from the crab on the cells appears, which reduces the yield of viable hepatocytes. On the other hand, a decrease in the concentration of the complex in solution reduces the effectiveness of the method due to a decrease in the degree of disaggregation of liver tissue. Similarly, the influence of temperature: its increase leads to an increase in the yield of cells, but reduces their viability, and a decrease makes the method ineffective. In addition, it is known that the process of obtaining cell cultures from the human liver makes special demands on the degree of purity of the preparations used, and the preparation of the complex of proteinases from the crab contains at least 0.5% of impurities necessary to stabilize the complex of proteinases, but toxic to hepatocytes.
Вышеуказанные недостатки делают прототип недостаточно эффективным и ограничивают область его применения. The above disadvantages make the prototype not effective enough and limit the scope of its application.
В основу изобретения поставлена задача расширения области применения способа получения культур клеток при увеличении выхода жизнеспособных клеток за счет повышения степени дезагрегации тканей и сокращения повреждающего действия на клетки. The basis of the invention is the task of expanding the scope of the method for producing cell cultures by increasing the yield of viable cells by increasing the degree of tissue disaggregation and reducing the damaging effect on cells.
Поставленная задача решается тем, что в способе получения культур клеток, включающем обработку тканей и органов раствором комплекса коллагенолитических ферментов, полученного из пищеварительных органов гидробионтов, согласно изобретению в качестве указанного комплекса используют комплекс, полученный из пищеварительных органов головоногих моллюсков при концентрации комплекса по белку 0,01-0,4 мг/мл при температуре 0-18oC.The problem is solved in that in a method for producing cell cultures, including treating tissues and organs with a solution of a complex of collagenolytic enzymes obtained from the digestive organs of aquatic organisms, according to the invention, the complex obtained from the digestive organs of cephalopods at a concentration of the complex of protein 0 is used as the specified complex. 01-0.4 mg / ml at a temperature of 0-18 o C.
Наилучший результат достигается при применении в качестве растворителя физиологического раствора или раствора глюкозы. The best result is achieved when physiological saline or glucose solution is used as a solvent.
Авторами установлено, что комплекс коллагенолитических протеиназ из пищеварительных органов головоногих проявляет высокую активность в широком диапазоне температур и высокую стабильность. Это позволяет при выделении ферментного комплекса из кальмаров достичь высокой степени очистки (до 99,9%), недостижимой для препарата из крабов, в случае которого примеси играют стабилизирующую роль. Последнее обстоятельство препятствует применению препарата из крабов для эффективного получения культур клеток, наиболее чувствительных к токсичным примесям (например, гепатоцитов). The authors found that the complex of collagenolytic proteinases from the digestive organs of cephalopods exhibits high activity in a wide temperature range and high stability. This makes it possible to achieve a high degree of purification (up to 99.9%), which is unattainable for a preparation from crabs, in the case of which impurities play a stabilizing role when isolating the enzyme complex from squid. The latter circumstance prevents the use of the drug from crabs to effectively obtain cell cultures that are most sensitive to toxic impurities (for example, hepatocytes).
Ниже приведены примеры реализации заявляемого способа при использовании ферментного комплекса из кальмаров. Аналогичные нижеприведенным результаты были получены авторами при использовании ферментных комплексов из каракатиц и осьминогов. The following are examples of the implementation of the proposed method when using the enzyme complex of squid. Similar results below were obtained by the authors using enzyme complexes of cuttlefish and octopus.
Результаты, полученные в приведенных ниже примерах, сведены в таблице. The results obtained in the examples below are summarized in the table.
Пример 1. Получение культуры гепатоцитов из печени. Example 1. Obtaining a culture of hepatocytes from the liver.
Печень взрослого человека промыли физиологическим раствором путем сосудистой перфузии под давлением до светло-желтого цвета. Затем через воротную вену ввели 1,3 л физиологического раствора, содержащего 0,01% препарата комплекса коллагенолитических протеиназ из пищеварительных органов кальмара (до вздутия печени). После этого печень на 35 мин целиком погрузили в 5 л обогащенного кислородом физиологического раствора, содержащего 0,3 мг/мл препарата коллагенолитического комплекса. Все процедуры проводили при температуре 2oC. Печень освободили от капсулы, ткань механически измельчили, полученную массу проинкубировали в термостате при температуре 10oC в течение 30 мин, а затем профильтровали через фильтр с диаметром пор 40 мкм. К полученному фильтрату добавили физиологический раствор в соотношении 1:1 и полученную взвесь осаждали на центрифуге К-70 при 1000 об/мин в течение 5 мин.An adult's liver was washed with saline by vascular perfusion under pressure until light yellow. Then, 1.3 l of physiological saline containing 0.01% of the complex of collagenolytic proteinases from the digestive organs of squid (before bloating of the liver) was injected through the portal vein. After that, the liver was completely immersed for 35 min in 5 l of oxygen-enriched physiological solution containing 0.3 mg / ml of the collagenolytic complex preparation. All procedures were performed at a temperature of 2 o C. The liver was freed from the capsule, the tissue was mechanically crushed, the resulting mass was incubated in a thermostat at a temperature of 10 o C for 30 minutes, and then filtered through a filter with a pore diameter of 40 μm. Saline was added to the resulting filtrate in a ratio of 1: 1, and the resulting suspension was besieged on a K-70 centrifuge at 1000 rpm for 5 minutes.
Полученный осадок собрали и ресуспендировали в 1%-ном альбуминовом гидролизате. Для подсчета живых клеток отобрали 1 мл клеточной взвеси, содержание интактных клеток определяли по окрашиванию 0,2%-ным раствором трипанового синего с последующим микроскопированием. При окрашивании живые клетки оставались светлыми, а погибшие окрашивались в темно-синий цвет. Процент живых клеток составлял 72%. The resulting precipitate was collected and resuspended in a 1% albumin hydrolyzate. To count living cells, 1 ml of cell suspension was taken, the content of intact cells was determined by staining with 0.2% trypan blue solution, followed by microscopy. When stained, living cells remained light, and the dead were stained in dark blue. The percentage of living cells was 72%.
Культуру клеток из взвеси получали по стандартной методике. Клеточную взвесь с концентрацией клеток 1 млн/мл засеяли в матрацы из расчета 100 тыс. клеток/см2 рабочей поверхности и 200 тыс. клеток/мл среды - альбуминового гидролизата и сыворотки крови крупного рогатого скота. Культивирование производили в течение 3 сут при постоянном наблюдении путем микроскопирования (при 80 - кратном увеличении) на протяжении всего срока культивирования.The cell culture from the suspension was obtained according to standard methods. A cell suspension with a cell concentration of 1 million / ml was seeded into mattresses at the rate of 100 thousand cells / cm 2 of the working surface and 200 thousand cells / ml of medium — albumin hydrolyzate and cattle blood serum. Cultivation was carried out for 3 days under constant observation by microscopy (at 80-fold increase) throughout the entire cultivation period.
Пример 2. Получение культуры первичных фибробластов куриных эмбрионов. Example 2. Obtaining a culture of primary fibroblasts of chicken embryos.
Десятидневные куриные эмбрионы с удаленными глазами и кишечником механически измельчили (размер фрагментов 2х2х2 мм), промыли от крови раствором Хенкса и залили физиологическим раствором, содержащим коллагенолитический комплекс из пищеварительных органов кальмара при концентрации 0,02 мг/мл. Дезагрегацию ткани проводили в 4 цикла: в течение 15 мин суспензию перемешивали, надосадочную жидкость фильтровали (диаметр пор фильтра 60 мкм), для оставшихся фрагментов ткани процедуру повторяли. Все операции осуществляли при 18oC.Ten-day-old chicken embryos with removed eyes and intestines were mechanically crushed (fragment size 2x2x2 mm), washed from the blood with Hanks solution, and filled with saline containing a collagenolytic complex from squid digestive organs at a concentration of 0.02 mg / ml. Tissue disaggregation was carried out in 4 cycles: the suspension was stirred for 15 min, the supernatant was filtered (filter pore diameter 60 μm), the procedure was repeated for the remaining tissue fragments. All operations were carried out at 18 o C.
Собранный фильтрат осаждали на центрифуге К-27 при 1000 об/мин в течение 10 мин. Полученный осадок ресуспендировали, клетки подсчитывали и культивировали как описано в примере 1. The collected filtrate was besieged on a K-27 centrifuge at 1000 rpm for 10 minutes. The resulting pellet was resuspended, the cells were counted and cultured as described in example 1.
Аналогичным образом получали культуры гепатоцитов, кератоцитов, фибробластов из различных источников. При этом в качестве растворителя использовали физиологический раствор, 5% раствор глюкозы и различные буферные растворы (Tris, HEPES, PIPES, фосфатный буферный раствор и др.). Были получены следующие результаты: выход интактных клеток составил 65-78%, при этом степень дезагрегации ткани была высокой. При сравнительных испытаниях заявляемого способа и способа-прототипа было установлено, что применение комплекса коллагенолитических протеиназ из кальмара для получения культуры первичных фибробластов из куриных эмбрионов выход интактных клеток увеличивается в 1,4 раза. Испытания также показали, что степень дезагрегации тканей мало зависит от применяемого растворителя, однако выход живых клеток максимален при использовании физиологического раствора и 5%-ного раствора глюкозы и составляет 72-78% (для сравнения: при использовании других указанных растворов выход живых клеток составляет 65-73%). Similarly received culture of hepatocytes, keratocytes, fibroblasts from various sources. In this case, physiological saline, 5% glucose solution and various buffer solutions (Tris, HEPES, PIPES, phosphate buffer solution, etc.) were used as a solvent. The following results were obtained: the yield of intact cells was 65-78%, while the degree of tissue disaggregation was high. In comparative tests of the proposed method and the prototype method, it was found that the use of a complex of collagenolytic proteinases from squid to obtain a culture of primary fibroblasts from chicken embryos increases the yield of intact cells by 1.4 times. Tests also showed that the degree of tissue disaggregation depends little on the solvent used, however, the yield of living cells is maximum when using physiological saline and 5% glucose solution and is 72-78% (for comparison: when using other specified solutions, the yield of living cells is 65 -73%).
Для сравнения ниже приведен пример (аналогичный примеру 1) получения культуры гепатоцитов из печени взрослого человека с использованием протеолитического комплекса из краба. For comparison, below is an example (similar to example 1) of obtaining a culture of hepatocytes from the liver of an adult using a proteolytic complex from crab.
Пример 3. Получение культуры гепатоцитов из печени. Example 3. Obtaining a culture of hepatocytes from the liver.
Печень взрослого человека промыли 0,02% раствором версена. Затем ввели раствор версена, содержащий 0,01% препарата комплекса коллагенолитических протеиназ из пищеварительных органов краба. После этого печень погрузили в указанный буферный раствор, содержащий 0,3 мг/мл препарата коллагенолитического комплекса. Все процедуры проводили при температуре 4oC. Печень освободили от капсулы, ткань механически измельчили, полученную массу проинкубировали в термостате, а затем профильтровали. К полученному фильтрату добавили буферный раствор в соотношении 1:1 и полученную взвесь осадили на центрифуге.An adult's liver was washed with a 0.02% versene solution. Then, a versene solution was introduced containing 0.01% of the preparation of a complex of collagenolytic proteinases from the digestive organs of the crab. After that, the liver was immersed in the indicated buffer solution containing 0.3 mg / ml of the collagenolytic complex preparation. All procedures were carried out at a temperature of 4 o C. The liver was freed from the capsule, the tissue was mechanically crushed, the resulting mass was incubated in a thermostat, and then filtered. To the obtained filtrate was added a buffer solution in the ratio 1: 1 and the resulting suspension was precipitated in a centrifuge.
Полученный осадок ресуспендировали. Содержание интактных клеток определяли по окрашиванию раствором трипанового синего. Процент живых клеток составлял 72%, однако выход клеток на единицу массы ткани уменьшился в 2,1 раза, поэтому количество живых клеток на единицу массы ткани было существенно ниже, чем при использовании препарата комплекса коллагенолитических протеиназ из кальмара. The resulting precipitate was resuspended. The content of intact cells was determined by staining with trypan blue solution. The percentage of living cells was 72%, however, the yield of cells per unit mass of tissue decreased 2.1 times, so the number of living cells per unit mass of tissue was significantly lower than when using the complex of collagenolytic proteinases from squid.
Пример 4. Получение культуры гепатоцитов из печени. Example 4. Obtaining a culture of hepatocytes from the liver.
Аналогично предыдущему примеру 3 получали культуру гепатоцитов с применением комплекса протеаз из краба при температуре 18oC, оптимальной для способа, описанного в [4], при этом выход клеток на единицу массы ткани увеличился в 1,5 раза и составил 66% от выхода по заявляемому способу, однако несколько уменьшилось содержание живых клеток.Similarly to the previous example 3, a hepatocyte culture was obtained using a complex of crab proteases at a temperature of 18 o C, optimal for the method described in [4], while the cell yield per unit mass of tissue increased by 1.5 times and amounted to 66% of the yield the claimed method, however, the content of living cells decreased slightly.
Из вышеизложенного следует, что применение коллагенолитического комплекса из головоногих при получении культур клеток эффективно для различных органов и тканей человека и животных и позволяет увеличить как степень дезагрегации тканей, так и выход интактных клеток, применимых в том числе и для размножения вирусов. Снижение нижней границы рабочей температуры и концентрации коллагенолитического комплекса также способствует увеличению количества живых клеток, сохраняющих пролиферативную активность при пересевах. It follows from the foregoing that the use of a collagenolytic complex from cephalopods in obtaining cell cultures is effective for various organs and tissues of humans and animals and can increase both the degree of tissue disaggregation and the yield of intact cells, which are also applicable for the propagation of viruses. A decrease in the lower limit of the working temperature and concentration of the collagenolytic complex also contributes to an increase in the number of living cells that preserve proliferative activity during reseeding.
Источники информации. Sources of information.
1. Р.Адамс. Методы получения культуры клеток для биохимиков. - М.: Мир, 1983 г. стр.52-59. 1. R. Adams. Methods of obtaining cell culture for biochemists. - M.: Mir, 1983 p. 52-59.
2. Заявка ФРГ N 3413960, МКИ C 12 N 5/00. 2. Application of Germany N 3413960, MKI C 12 N 5/00.
3. Патент РФ N 2074249, МКИ C 12 N 1/00. 3. RF patent N 2074249, MKI C 12
4. Патент РФ N 2067995, МКИ C 12 N 5/00 (прототип). 4. RF patent N 2067995, MKI C 12 N 5/00 (prototype).
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU97120401A RU2126832C1 (en) | 1997-11-28 | 1997-11-28 | Method of cell culture preparing |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU97120401A RU2126832C1 (en) | 1997-11-28 | 1997-11-28 | Method of cell culture preparing |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2126832C1 true RU2126832C1 (en) | 1999-02-27 |
| RU97120401A RU97120401A (en) | 1999-05-27 |
Family
ID=20199822
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU97120401A RU2126832C1 (en) | 1997-11-28 | 1997-11-28 | Method of cell culture preparing |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2126832C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2412994C1 (en) * | 2010-01-20 | 2011-02-27 | ФГУП "Всероссийский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии" (ВНИРО) | Method of obtaining culture of pacific salmon cells |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3413960A1 (en) * | 1984-04-13 | 1985-10-17 | Behringwerke Ag | METHOD FOR OBTAINING CELL CULTURES |
| RU2067995C1 (en) * | 1992-12-02 | 1996-10-20 | Всесоюзный научно-исследовательский институт молекулярной биологии Научно-производственного объединения "Вектор" | Method of cell culture preparing |
-
1997
- 1997-11-28 RU RU97120401A patent/RU2126832C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3413960A1 (en) * | 1984-04-13 | 1985-10-17 | Behringwerke Ag | METHOD FOR OBTAINING CELL CULTURES |
| RU2067995C1 (en) * | 1992-12-02 | 1996-10-20 | Всесоюзный научно-исследовательский институт молекулярной биологии Научно-производственного объединения "Вектор" | Method of cell culture preparing |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Р.Адамс. Методы получения культуры клеток для биохимиков. - М.: Мир, 1983. С.52-59. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2412994C1 (en) * | 2010-01-20 | 2011-02-27 | ФГУП "Всероссийский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии" (ВНИРО) | Method of obtaining culture of pacific salmon cells |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lasfargues et al. | A method for the continuous cultivation of mammary epithelium | |
| US5422261A (en) | Composition containing collagenase and chymopapain for hydrolyzing connective tissue to isolate cells | |
| Cohen et al. | Purification and properties of a nerve growth-promoting factor isolated from mouse sarcoma 180 | |
| Fullmer et al. | Collagenolytic activity in gingivae of man | |
| EP3171152B1 (en) | Process and device for isolating cells from biological tissue | |
| JPH10508205A (en) | Composition containing collagenase and chymopapain for isolating hepatocytes and pancreatic islet of Langerhans cells | |
| JP3253108B2 (en) | Compositions containing proteases produced by Vibrio and methods for use in debridement and wound healing | |
| Sylvén et al. | Studies on the histochemical “leucine aminopeptidase” reaction: IV. Chemical and histochemical characterization of the intracellular and stromal LNA reactions in solid tumor transplants | |
| US5145681A (en) | Compositions containing protease produced by vibrio and method of use in debridement and wound healing | |
| RU2126832C1 (en) | Method of cell culture preparing | |
| CN104399122A (en) | Acellular matrix and preparation method thereof | |
| RU2148636C1 (en) | Method of preparing yeast low-molecular extract and substance prepared by this method | |
| JP2002512525A (en) | Hydrophilic composition containing protease produced by Vibrio | |
| US12325868B2 (en) | Purified fish proteases with high specific activities and its process of production | |
| RU2103360C1 (en) | Nutrient medium for culturing eucaryotic cells and method for preparing base of proteolytic hydrolyzate medium | |
| RU2214827C1 (en) | Method for preparing collagen for treatment of pathology of body tissues | |
| Bullock et al. | Observations on the digestion of the shells of the eggs of Taenia taeniaeformis | |
| RU2182596C2 (en) | Strain arthrobotrys longa mecht as producer of longolytin and complex of fibrinolytic and thrombolytic enzymes with specific capacity to activate plasminogen and external agent for thrombosis treatment | |
| Kolokol'chikova et al. | Morphological changes in burn wounds after transplantation of allogenic fibroblasts | |
| RU2236460C1 (en) | Method for preparing collagenase | |
| EP0857202B1 (en) | Method for inhibiting chymopapain and papain enzyme activity with polysaccharides of animal origin | |
| RU2067995C1 (en) | Method of cell culture preparing | |
| Thomas | Proteolytic enzymes produced in liquid media by Fusiformis nodosus | |
| RU2796462C1 (en) | Method for non-enzymatic production of islet tissue from the pancreas | |
| Kuznetsov et al. | A novel endogenous inhibitor from the hepatopancreas of the Kamchatka crab Paralithodes camtschaticus |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20161129 |