RU2126690C1 - Способ очистки инсулина-сырца, получаемого из поджелудочной железы свиней - Google Patents
Способ очистки инсулина-сырца, получаемого из поджелудочной железы свиней Download PDFInfo
- Publication number
- RU2126690C1 RU2126690C1 RU96121464A RU96121464A RU2126690C1 RU 2126690 C1 RU2126690 C1 RU 2126690C1 RU 96121464 A RU96121464 A RU 96121464A RU 96121464 A RU96121464 A RU 96121464A RU 2126690 C1 RU2126690 C1 RU 2126690C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- insulin
- preferred
- sorbent
- solution
- column
- Prior art date
Links
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 172
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 title claims abstract description 91
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 title claims abstract description 91
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 title claims abstract description 85
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 47
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 title claims description 4
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims abstract description 23
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims abstract description 16
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 15
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 claims abstract description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims abstract description 11
- 230000002608 insulinlike Effects 0.000 claims abstract description 11
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 claims description 69
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 46
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 239000003607 modifier Substances 0.000 claims description 20
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 15
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 claims description 12
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 claims description 12
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims description 12
- 238000003795 desorption Methods 0.000 claims description 11
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 11
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 10
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 claims description 9
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 9
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 8
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 8
- DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N Tert-Butanol Chemical compound CC(C)(C)O DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- BTANRVKWQNVYAZ-UHFFFAOYSA-N butan-2-ol Chemical compound CCC(C)O BTANRVKWQNVYAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 claims description 8
- 108700022849 desamido- insulin Proteins 0.000 claims description 8
- ZXEKIIBDNHEJCQ-UHFFFAOYSA-N isobutanol Chemical compound CC(C)CO ZXEKIIBDNHEJCQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 7
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000011591 potassium Substances 0.000 claims description 6
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical group [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 5
- 230000001788 irregular Effects 0.000 claims description 5
- 239000000049 pigment Substances 0.000 claims description 5
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims description 4
- FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylacetamide Chemical compound CN(C)C(C)=O FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 claims description 4
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 claims description 4
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 4
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 claims description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 4
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 4
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 claims description 4
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 4
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims description 4
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 4
- 238000002086 displacement chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 3
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 claims description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 claims description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 claims description 2
- 125000005233 alkylalcohol group Chemical group 0.000 claims description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 claims description 2
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 claims description 2
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 claims description 2
- -1 siloxanes Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims 1
- 239000000047 product Substances 0.000 abstract description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 abstract description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 abstract 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 6
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 6
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 description 6
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 4
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 238000011549 displacement method Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000004237 preparative chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010005991 Pork Regular Insulin Proteins 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Сущность изобретения: последовательная комбинации обращенно-фазового и анионнообменного методов на хроматографической установке низкого давления. Способ предусматривает проведение загрузки и элюирования разделяемых компонентов во фронтально-вытеснительном режиме. Технический результат: получение высокоочищенного инсулина, содержащего не менее 7% основного вещества, не более 0,001% проинсулина, не более 1% высокомолекулярных белков и не более 1% инсулиноподобных примесей с выходом не менее 70%. 12 з.п. ф-лы.
Description
Изобретение относится к области медицины, конкретно, к способам очистки инсулина - препарата для лечения сахарного диабета.
Современные препараты инсулина производят из субстанции высокой степени очистки. Это связано с тем, что белковые примеси, обычно присутствующие в инсулинах, получаемых из поджелудочных желез животных, особенно проинсулины, эфиры инсулина и полимерные инсулины обладают высокой антигенной активностью и могут вызывать иммуногенные поражения сосудов и внутренних органов больных сахарным диабетом, которые применяют препараты недостаточно очищенных инсулинов. В Фармакопеях развитых стран, в частности Британской, Европейской и США содержание проинсулина в субстанции животных инсулинов ограничено 0,001%, высокомолекулярных белков (димерных и полимерных инсулинов) - 1% , дезамидоинсулинов - 3% [1].
Для производства высокоочищенной субстанции инсулинов различной природы в настоящее время широко применяют разнообразные хроматографические методы [2]. Основным критерием эффективности промышленной хроматографической технологии является производительность хроматографической колонны, выражаемой в количестве очищенного продукта, получаемого в единицу времени с единицы объема сорбента. При этом производительность колонны пропорциональна емкости, селективности и эффективности сорбента [3]. По этой причине в современных промышленных хроматографических процессах стремятся использовать высокоэффективные сорбенты, имеющие, как правило, сферическую или сфероидную форму и небольшой размер частиц (5-10 мкм), что обеспечивает при прочих равных условиях большую эффективность, а, следовательно, и более высокую производительность указанных сорбентов по сравнению с менее эффективными сорбентами с более крупными частицами неправильной формы.
С другой стороны, применение высокоэффективных сорбентов требует использования высокого давления (до 200 атм) на входе в колонну для реализации оптимальных скоростей потока мобильной фазы. Промышленные хроматографические системы высокого давления достаточно дороги, что в определенной степени препятствует их широкому использованию в производстве фармацевтических препаратов.
Большинство примесей, снижающих качество субстанции инсулина, представляют собой его близкие аналоги с минимальными структурными отличиями [4]. Поэтому для их отделения от основного продукта в препаративном масштабе приходится использовать либо высокоэффективные сорбенты и, соответственно, дорогостоящие хроматографические системы высокого давления, либо сорбенты и мобильные фазы, обеспечивающие высокую селективность разделения основного вещества и примесей. Только в этих случаях можно использовать высокие удельные нагрузки на сорбент, что делает процесс хроматографической очистки экономически рентабельным. При этом высокоселективные процессы экономически выгоднее высокоэффективных, так как в этом случае можно использовать относительно низкоэффективные сорбенты и, соответственно, более дешевые хроматографические системы низкого давления [5] .
В общем случае процесс препаративного хроматографического разделения может быть реализован, по крайней мере, двумя различными способами: элютивным или вытеснительным. В элютивном способе разделение компонентов смеси осуществляют за счет разницы в их коэффициентах распределения между мобильной и стационарной фазами. При этом, очевидно, что при больших удельных нагрузках на сорбент происходит значительное уширение и перекрывание пиков компонентов, что приводит к снижению выхода целевых продуктов [6].
В случае вытеснительного способа используют способность компонентов мобильной фазы или компонентов разделяемой смеси конкурировать за места на стационарной фазе таким образом, что в процессе нанесения смеси на сорбент и последующего элюирования формируется так называемый фронт вытеснения, то есть последовательность зон разделяемых компонентов, в которой каждый последующий компонент вытесняет предыдущий из стационарной фазы [7].
Теория процесса вытеснительной хроматографии только начинает разрабатываться, и в большинстве случаев параметры процесса подбираются эмпирическим путем. При удачно подобранных условиях степень перекрывания зон компонентов во фронте вытеснения незначительна, что позволяет использовать гораздо большие удельные нагрузки на сорбент, чем в случае элютивного способа [8].
Как правило, эффективность фронтально-вытеснительного препаративного хроматографического процесса зависит от следующих параметров
- состава исходной разделяемой смеси и требуемого качества целевых продуктов, что определяет удельную нагрузку на сорбент, а также требования к сорбенту и начальному составу мобильной фазы;
- характеристик используемого сорбента, которые определяют его емкость, селективность, динамику массообмена, совместимость с компонентами разделяемой смеси;
- начального состава и скорости мобильной фазы, которые определяют состав динамической стационарной фазы, а также условия формирования первичного фронта вытеснения адсорбированных компонентов разделяемой смеси за счет реализации эффекта самовытеснения;
- условий элюирования хроматографической колонны (градиент, скорость потока и др.), которые определяют порядок элюирования и степень перекрывания хроматографических зон разделяемых компонентов, то есть выход и качество получаемых продуктов.
- состава исходной разделяемой смеси и требуемого качества целевых продуктов, что определяет удельную нагрузку на сорбент, а также требования к сорбенту и начальному составу мобильной фазы;
- характеристик используемого сорбента, которые определяют его емкость, селективность, динамику массообмена, совместимость с компонентами разделяемой смеси;
- начального состава и скорости мобильной фазы, которые определяют состав динамической стационарной фазы, а также условия формирования первичного фронта вытеснения адсорбированных компонентов разделяемой смеси за счет реализации эффекта самовытеснения;
- условий элюирования хроматографической колонны (градиент, скорость потока и др.), которые определяют порядок элюирования и степень перекрывания хроматографических зон разделяемых компонентов, то есть выход и качество получаемых продуктов.
В случае хроматографической очистки инсулинов проблема подбора параметров процесса усложняется высокой лабильностью молекул инсулина, а именно их способностью быстро и необратимо денатурировать под действием самых различных факторов, в том числе при контакте с гидрофобными и некоторыми металлическими поверхностями, в присутствии целого ряда неорганических и органических соединений, при повышении или значительном понижении температуры и др. [9] .
По этой причине в технологических процессах очистки инсулинов необходимо использовать только полностью совместимые с ними материалы и реагенты. Требования стабильности инсулинов накладывают определенные ограничения на температурные условия процесса, на материалы колонок, фильтров и трубопроводов, а также на сорбенты и состав мобильных фаз [10].
В научно-технической и патентной литературе приведены примеры использования различных препаративных хроматографических методов в очистке инсулинов различной природы.
Гель-проникающую хроматографию предложено использовать для очистки инсулинов от примесей димерных и полимерных инсулинов [11]. Однако, данный вид хроматографии можно применять только в элютивном варианте, то есть при небольших удельных нагрузках и низких скоростях элютрования, что делает указанные процессы экономически неэффективными.
Ионообменную препаративную хроматографию, в частности на карбоксиметил-, диэтиламиноэтил- и других ионообменных сорбентах предложено использовать для очистки инсулинов от инсулиноподобных примесей, в частности от дезамидоинсулинов [12]. Однако, и в этом случае подобранные условия позволяют использовать лишь невысокие удельные нагрузки на сорбент, что снижает эффективность процесса.
Обращенно-фазовую препаративную хроматографию предложено использовать для очистки инсулинов от проинсулинов и других инсулиноподобных примесей.
Приведенные в литературе данные свидетельствуют об успешном применении в этом случае фронтально-вытеснительного способа хроматографирования. Однако, в указанных работах достаточно высокая удельная нагрузка на сорбент (около 10% от полной сорбционной емкости сорбента) и требуемые выходы очищенных целевых продуктов достигались лишь при использовании высокоэффективных колонн и хроматографических систем высокого давления [13].
Мы обнаружили, что достаточно эффективной очистки инсулина от инсулиноподобных примесей и проинсулина с реализацией фронтально-вытеснительного способа хроматографирования можно достичь на низкоэффективных сорбентах с использованием хроматографических систем низкого давления за счет комбинирования методов обращенно-фазовой и анионообменной препаративной хроматографии. При этом удельная нагрузка на сорбенты составляет не менее 30% от их полной сорбционной емкости, что значительно превышает приведенные в литературе показатели.
Наиболее близким аналогом по технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому является способ очистки инсулина путем использования хроматографических методов [14].
Недостатками [14] являются невозможность получения инсулина требуемой чистоты.
Техническим результатом изобретения является высокая степень очистки инсулина с содержанием не менее 97% основного вещества, не более 0,001 проинсулина, не более 1% высокомолекулярных белков и не более 1% инсулиноподобных примесей с выходом не менее 70%.
Технический результат достигается тем, что в способе очистки природного инсулина-сырца, получаемого из поджелудочной железы свиней, включающем различные типы хроматографии, согласно изобретению, хроматографическую очистку осуществляют последовательно в две стадии обращенно-фазовым и анионообменным методами во фронтально-вытеснительном режиме с использованием селективной десорбции целевого продукта с хроматографических колонн.
Оптимальными условиями достижения указанного результата являются следующие:
- в качестве исходного сырья используют инсулин-сырец с содержанием основного вещества не менее 80%, наиболее предпочтительно содержание не менее 90%;
содержание проинсулина, дезамидоинсулинов, полимерных инсулинов и других инсулиноподобных примесей составляет не более 5% каждой, наиболее предпочтительно содержание не более 3% каждой примеси;
- хроматографическую очистку осуществляют после предварительной очистки раствора исходного инсулина-сырца от нерастворимых и липидо-пигментных примесей последовательной фильтрацией через мембранный фильтр и фор-колонку с сорбентом в условиях, обеспечивающих эффективное отделение липидо-пигментных примесей, с получением раствора технического инсулина;
- стадию обращенно-фазовой хроматографии осуществляют на препаративном хроматографе низкого или среднего давления, который позволяет реализовать режим последовательной и параллельной работы не менее двух хроматографических колонн с использованием прямого и обратного потока элюирующих растворов, а также ступенчатого или градиентного элюирования;
- стадию обращенно-фазовой хроматографии осуществляют путем нанесения исходного раствора технического инсулина на последовательно соединенные колонны в режиме фронтально-вытеснительной хроматографии в условиях, обеспечивающих селективное прочное связывание загрязняющих примесей-проинсулина и полимерных инсулинов на предколонне, с последующим разъединением колонн и градиентным элюированием рабочей колонны с постепенным увеличением содержания органического модификатора в элюирующем растворе в специально подобранных условиях, обеспечивающих селективную десорбцию инсулина с сорбента и одновременно эффективное вытеснение целевым продуктом инсулиноподобных примесей;
- стадию обращенно-фазовой хроматографии проводят на гидрофобных сорбентах на основе силикагеля, поверхность которого модифицирована мономерными или полимерными силоксанами, содержащими углеводородные радикалы C4-C20, наиболее предпочтительны радикалы C12-C18; диаметр пор указанных сорбентов составляет 10-30 нм, наиболее предпочтителен интервал 15-20 нм; удельная поверхность сорбентов составляет 80-300 м/г, наиболее предпочтителен интервал 100-200 м/г; размер частиц составляет 30-70 мкм, наиболее предпочтителен размер 30-50 мкм; форма частиц сорбента - сферическая, сфероидная или нерегулярная, наиболее предпочтительна сферическая или сфероидная форма; полная сорбционная емкость сорбентов по инсулину составляет не менее 80 г/л сорбента; сорбент полностью совместим с растворами инсулина, а именно в условиях проведения процесса не вызывает денатурацию, агрегацию и полимеризацию молекул инсулина;
- для нанесения на сорбент исходного инсулина-сырца используют его растворы с концентрацией белка 50-200 мг/мл, наиболее предпочтительна концентрация 80-150 мг/мл, в смеси водных растворов ионных и органических модификаторов, причем в качестве анионов используют сульфат, ацетат, хлорид или фосфат, наиболее предпочтителен сульфат, в качестве катионов используют аммоний, натрий или калий, наиболее предпочтителен аммоний; в качестве органического модификатора используют низшие алкиловые спирты: метанол, этанол, н-пропанол, изопропанол, н-бутанол, втор-бутанол, трет-бутанол, изобутанол, а также ацетонитрил, диметилформамид или диметилацетамид, наиболее предпочтителен этанол; концентрация ионного модификатора составляет 0,01-0,1 моль/л, наиболее предпочтительна 0,03-0,07 моль/л; концентрация органического модификатора составляет 10-20 об.%, наиболее предпочтительна 12-15 об.% ; значение pH раствора исходного инсулина-сырца составляет 2,0-3,5, наиболее предпочтительно значение 2,5-3,0; линейная скорость жидкой фазы внутри хроматографической колонны составляет 0,1-0,5 см/мин, наиболее предпочтительна скорость 0,2-0,4 см/мин;
- количество вводимого в колонны частично очищенного инсулина-сырца составляет 10-40 вес. % от полной емкости используемого обращенно-фазового сорбента, наиболее предпочтительно количество 20-30 вес.%;
- стадию анионообменной хроматографии осуществляют путем введения раствора частично очищенного с помощью обращенно-фазовой хроматографии инсулина-сырца в колонку с анионообменным сорбентом в режиме фронтальной хроматографии в условиях, обеспечивающих селективное прочное связывание с сорбентом дезамидоинсулина и других подобных загрязняющих примесей, с последующим элюированием колонны с увеличением содержания ионного модификатора в элюирующем растворе в условия, обеспечивающих селективную десорбцию инсулина с анионообменного сорбента;
-стадию анионообменной хроматографии проводят на сорбентах на основе силикагеля или гидрофильного пористого полимера, поверхность которого модифицирована химическими ионогенными группами, обладающими свойствами слабых анионообменников, наиболее предпочтительны диэтиламиноэтильные (ДЭАЭ)- группы; диаметр пор указанных сорбентов составляет 15 - 50 нм, наиболее предпочтителен диаметр 20-30 нм; размер частиц составляет 20-150 мкм, наиболее предпочтителен размер 20-50 мкм; форма частиц сорбента сферическая, сфероидная или нерегулярная, наиболее предпочтительна сферическая или сфероидная форма; обменная емкость анионообменника составляет не менее 0,1 мэкв/мл сорбента; полная сорбционная емкость по инсулину составляет не менее 30 мг/мл сорбента; сорбент полностью совместим с растворами инсулина, а именно в условиях проведения процесса не должен вызывать денатурацию, агрегацию и полимеризацию молекул инсулина;
- для нанесения на анионообменник используют раствор инсулина с концентрацией белка 20-50 мг/мл, наиболее предпочтительна 25-30 мг/мл; в водных растворах ионных и органических модификаторов, причем в качестве анионов используют сульфат, ацетат, хлорид и фосфат, наиболее предпочтительны сульфат и хлорид; в качестве катионов используют натрий, калий и аммоний, наиболее предпочтительны калий и аммоний; в качестве органического модификатора используют низшие алкиловые спирты: метанол, этанол, н-пропанол, изопропанол, н-бутанол, втор-бутанол, изо-бутанол, трет-бутанол, а также ацетонитрил, деметилформамид и диметилацетамид, наиболее предпочтителен изопропанол; концентрация ионного модификатора составляет 0,01-0,05 моль/л, наиболее предпочтительна концентрация 0,013-0,017 моль/л; объемная концентрация органического модификатора в растворе составляет 25-35 , наиболее предпочтительна концентрация 28-30 об; значение pH исходного раствора инсулина составляет 7,5-8,5, наиболее предпочтительно значение 7,8-8,0; линейная скорость жидкой фазы внутри анионообменной колонки составляет 0,1-0,5 см/мин, наиболее предпочтительна скорость 0,2-0,3 см/мин;
- количество вводимого в анионообменную колонну исходного инсулина составляет 30-70 вес.% от полной сорбционной емкости используемого анионообменника по инсулину, наиболее предпочтительно количество 40-60.%;
- все технологические операции по хроматографической очистке инсулина-сырца осуществляют при температуре 5 -20oC, наиболее предпочтительна температура 8-15oC.
- в качестве исходного сырья используют инсулин-сырец с содержанием основного вещества не менее 80%, наиболее предпочтительно содержание не менее 90%;
содержание проинсулина, дезамидоинсулинов, полимерных инсулинов и других инсулиноподобных примесей составляет не более 5% каждой, наиболее предпочтительно содержание не более 3% каждой примеси;
- хроматографическую очистку осуществляют после предварительной очистки раствора исходного инсулина-сырца от нерастворимых и липидо-пигментных примесей последовательной фильтрацией через мембранный фильтр и фор-колонку с сорбентом в условиях, обеспечивающих эффективное отделение липидо-пигментных примесей, с получением раствора технического инсулина;
- стадию обращенно-фазовой хроматографии осуществляют на препаративном хроматографе низкого или среднего давления, который позволяет реализовать режим последовательной и параллельной работы не менее двух хроматографических колонн с использованием прямого и обратного потока элюирующих растворов, а также ступенчатого или градиентного элюирования;
- стадию обращенно-фазовой хроматографии осуществляют путем нанесения исходного раствора технического инсулина на последовательно соединенные колонны в режиме фронтально-вытеснительной хроматографии в условиях, обеспечивающих селективное прочное связывание загрязняющих примесей-проинсулина и полимерных инсулинов на предколонне, с последующим разъединением колонн и градиентным элюированием рабочей колонны с постепенным увеличением содержания органического модификатора в элюирующем растворе в специально подобранных условиях, обеспечивающих селективную десорбцию инсулина с сорбента и одновременно эффективное вытеснение целевым продуктом инсулиноподобных примесей;
- стадию обращенно-фазовой хроматографии проводят на гидрофобных сорбентах на основе силикагеля, поверхность которого модифицирована мономерными или полимерными силоксанами, содержащими углеводородные радикалы C4-C20, наиболее предпочтительны радикалы C12-C18; диаметр пор указанных сорбентов составляет 10-30 нм, наиболее предпочтителен интервал 15-20 нм; удельная поверхность сорбентов составляет 80-300 м/г, наиболее предпочтителен интервал 100-200 м/г; размер частиц составляет 30-70 мкм, наиболее предпочтителен размер 30-50 мкм; форма частиц сорбента - сферическая, сфероидная или нерегулярная, наиболее предпочтительна сферическая или сфероидная форма; полная сорбционная емкость сорбентов по инсулину составляет не менее 80 г/л сорбента; сорбент полностью совместим с растворами инсулина, а именно в условиях проведения процесса не вызывает денатурацию, агрегацию и полимеризацию молекул инсулина;
- для нанесения на сорбент исходного инсулина-сырца используют его растворы с концентрацией белка 50-200 мг/мл, наиболее предпочтительна концентрация 80-150 мг/мл, в смеси водных растворов ионных и органических модификаторов, причем в качестве анионов используют сульфат, ацетат, хлорид или фосфат, наиболее предпочтителен сульфат, в качестве катионов используют аммоний, натрий или калий, наиболее предпочтителен аммоний; в качестве органического модификатора используют низшие алкиловые спирты: метанол, этанол, н-пропанол, изопропанол, н-бутанол, втор-бутанол, трет-бутанол, изобутанол, а также ацетонитрил, диметилформамид или диметилацетамид, наиболее предпочтителен этанол; концентрация ионного модификатора составляет 0,01-0,1 моль/л, наиболее предпочтительна 0,03-0,07 моль/л; концентрация органического модификатора составляет 10-20 об.%, наиболее предпочтительна 12-15 об.% ; значение pH раствора исходного инсулина-сырца составляет 2,0-3,5, наиболее предпочтительно значение 2,5-3,0; линейная скорость жидкой фазы внутри хроматографической колонны составляет 0,1-0,5 см/мин, наиболее предпочтительна скорость 0,2-0,4 см/мин;
- количество вводимого в колонны частично очищенного инсулина-сырца составляет 10-40 вес. % от полной емкости используемого обращенно-фазового сорбента, наиболее предпочтительно количество 20-30 вес.%;
- стадию анионообменной хроматографии осуществляют путем введения раствора частично очищенного с помощью обращенно-фазовой хроматографии инсулина-сырца в колонку с анионообменным сорбентом в режиме фронтальной хроматографии в условиях, обеспечивающих селективное прочное связывание с сорбентом дезамидоинсулина и других подобных загрязняющих примесей, с последующим элюированием колонны с увеличением содержания ионного модификатора в элюирующем растворе в условия, обеспечивающих селективную десорбцию инсулина с анионообменного сорбента;
-стадию анионообменной хроматографии проводят на сорбентах на основе силикагеля или гидрофильного пористого полимера, поверхность которого модифицирована химическими ионогенными группами, обладающими свойствами слабых анионообменников, наиболее предпочтительны диэтиламиноэтильные (ДЭАЭ)- группы; диаметр пор указанных сорбентов составляет 15 - 50 нм, наиболее предпочтителен диаметр 20-30 нм; размер частиц составляет 20-150 мкм, наиболее предпочтителен размер 20-50 мкм; форма частиц сорбента сферическая, сфероидная или нерегулярная, наиболее предпочтительна сферическая или сфероидная форма; обменная емкость анионообменника составляет не менее 0,1 мэкв/мл сорбента; полная сорбционная емкость по инсулину составляет не менее 30 мг/мл сорбента; сорбент полностью совместим с растворами инсулина, а именно в условиях проведения процесса не должен вызывать денатурацию, агрегацию и полимеризацию молекул инсулина;
- для нанесения на анионообменник используют раствор инсулина с концентрацией белка 20-50 мг/мл, наиболее предпочтительна 25-30 мг/мл; в водных растворах ионных и органических модификаторов, причем в качестве анионов используют сульфат, ацетат, хлорид и фосфат, наиболее предпочтительны сульфат и хлорид; в качестве катионов используют натрий, калий и аммоний, наиболее предпочтительны калий и аммоний; в качестве органического модификатора используют низшие алкиловые спирты: метанол, этанол, н-пропанол, изопропанол, н-бутанол, втор-бутанол, изо-бутанол, трет-бутанол, а также ацетонитрил, деметилформамид и диметилацетамид, наиболее предпочтителен изопропанол; концентрация ионного модификатора составляет 0,01-0,05 моль/л, наиболее предпочтительна концентрация 0,013-0,017 моль/л; объемная концентрация органического модификатора в растворе составляет 25-35 , наиболее предпочтительна концентрация 28-30 об; значение pH исходного раствора инсулина составляет 7,5-8,5, наиболее предпочтительно значение 7,8-8,0; линейная скорость жидкой фазы внутри анионообменной колонки составляет 0,1-0,5 см/мин, наиболее предпочтительна скорость 0,2-0,3 см/мин;
- количество вводимого в анионообменную колонну исходного инсулина составляет 30-70 вес.% от полной сорбционной емкости используемого анионообменника по инсулину, наиболее предпочтительно количество 40-60.%;
- все технологические операции по хроматографической очистке инсулина-сырца осуществляют при температуре 5 -20oC, наиболее предпочтительна температура 8-15oC.
Сущность изобретения иллюстрируется следующим примером.
Пример
1,28 кг инсулина-сырца, содержащего 90% основного вещества, 3% проинсулина, 3% дезамидоинсулина, 3% полимерных инсулинов и 1% других инсулиноподобных примесей, растворяют в 10 литрах 0,05 М водно-спиртового раствора сульфата аммония, содержащего 10 об.% этанола и необходимое для растворения инсулина количество серной кислоты. Полученный раствор с концентрацией белка 120 г/л pH 2,5 фильтруют через 0,2 мкм мембранный фильтр и затем для очистки от липидо-пигментных примесей пропускают через форколонну (10х30 см), содержащую 1,5 кг гидрофобного сорбента (Octadecyl-Silica, 15 нм, 35-75 мкм) со скоростью 60 мл/мин. Для селективной десорбции инсулина форколонну промывают 5 литрами 0,05 М раствора сульфата аммония в 10%-ном водном растворе этанола с pH 2,5.
1,28 кг инсулина-сырца, содержащего 90% основного вещества, 3% проинсулина, 3% дезамидоинсулина, 3% полимерных инсулинов и 1% других инсулиноподобных примесей, растворяют в 10 литрах 0,05 М водно-спиртового раствора сульфата аммония, содержащего 10 об.% этанола и необходимое для растворения инсулина количество серной кислоты. Полученный раствор с концентрацией белка 120 г/л pH 2,5 фильтруют через 0,2 мкм мембранный фильтр и затем для очистки от липидо-пигментных примесей пропускают через форколонну (10х30 см), содержащую 1,5 кг гидрофобного сорбента (Octadecyl-Silica, 15 нм, 35-75 мкм) со скоростью 60 мл/мин. Для селективной десорбции инсулина форколонну промывают 5 литрами 0,05 М раствора сульфата аммония в 10%-ном водном растворе этанола с pH 2,5.
Полученный раствор частично очищенного инсулина наносят на последовательно соединенные предколонну (20х30 см, 1,5 л сорбента Octadecyl-Silica, 15 нм, 20- 30 мкм) и рабочую колонну (20х50 см, 7 л сорбента Octadecyl-Silica, 15 нм, 35-75 мкм) со скоростью 50 мл/мин. После нанесения инсулина на сорбент колонны промывают 6,5 литрами 0,05 М раствора сульфата аммония в 10%-ном водном растворе этанола с pH 2,5 со скоростью 150 мл/мин.
После промывки предколонну отсоединяют от рабочей колонны и проводят селективную десорбцию инсулина с предколонны 10 литрами 0,04 М раствора сульфата аммония в 25%-ном водном растворе этанола с pH 2,5 со скоростью 150 мл/мин. Селективную десорбцию инсулина с рабочей колонны осуществляют в градиентном режиме со скоростью 200 мл/мин в течение 300 мин, постепенно по заданной программе повышая содержание этанола в элюирующем растворе с 10% до 25%.
В процессе десорбции инсулина с предколонны и рабочей колонны собирают фракции по 3-5 л, состав которых определяют с помощью аналитической количественной ВЭЖХ в описанных в литературе условиях. Объединяют фракции очищенного инсулина, содержащего менее 0,001% проинсулина, менее 1% полимерных инсулинов и менее 1% инсулиноподобных примесей. Получают 30 л раствора, к которому для осаждения инсулина добавляют 30 л воды и с помощью 7%-ного водного раствора аммиака доводят pH полученного раствора до 5,7. Для завершения коагуляции инсулина раствор перемешивают в течение 10 часов при температуре 10-15oC.
После отстаивания надосадочную жидкость декантируют, а осадок центрифугируют при 3000 х g в течение 30 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость декантируют, а осадок дважды промывают водой с pH 5,8 с последующими центрифугированием в тех же условиях.
На стадии обращенно-фазовой хроматографии получают 3,8 кг влажной пасты частично очищенного инсулина, содержащей 28% белка. Выход составляет 92% от загруженного инсулина-сырца.
Указанную выше влажную пасту растворяют в рассчитанном объеме 0,015 М водно-спиртового раствора сульфата аммония, содержащего 30% изопропанола, с pH 9,5 таким образом, чтобы получить раствор с массовой концентрацией белка 30 г/л. Приготовленный раствор фильтруют через мембранный фильтр и затем наносят на анионообменную колонну (30х50 см, сорбент Amicon DEAE- Silica, 20-50 мкм, 8 л) со скоростью 200 мл/мин. После нанесения исходного раствора инсулина колонну промывают 10 литрами 0,015 М водно-спиртового раствора хлорида калия, содержащего 30% изопропанола, с pH 7,8 со скоростью 200 мл/мин.
Селективную десорбцию инсулина с анионообменного сорбента проводят промывкой 20 литрами 0,015 М водно-спиртового раствора сульфата аммония, содержащего 30% изопропанола, с pH 7,8 со скоростью 200 мл/мин с последующей промывкой колонны 40 литрами того же элюирующего раствора, содержащего дополнительно 0,015 моль/л хлористого аммония.
В процесс десорбции собирают фракции объемом 3-5 л, состав которых определяют с помощью количественной аналитической ВЭЖХ в описанных в литературе условиях. По результатам анализа объединяют фракции таким образом, чтобы получить инсулин, содержащий менее 1% дезамидоинсулинов.
Из полученного раствора очищенный инсулин кристаллизуют в виде цинкового комплекса в описанных в литературе условиях. После фильтрации и сушки в вакууме получают кристаллическую субстанцию очищенного свиного инсулина, отвечающего международным и отечественным фармакопейным требованиям.
Выход целевого продукта на стадии анионообменной хроматографии составляет 80% от загруженного инсулина.
Настоящее изобретение позволяет использовать высокие удельные нагрузки на сорбенты, составляющие не менее 30% от их полной сорбционной емкости, так как способ предусматривает проведение загрузки и элюирования разделяемых компонентов во фронтально-вытеснительном режиме. В результате получают высокоочищенный инсулин, содержащий не менее 97% основного вещества, не более 0,001% проинсулина, не более 1% высокомолекулярных белков и не более 1% инсулиноподобных примесей с выходом не менее 70%.
Литература
1. British Pharmacopeia, 1993.
1. British Pharmacopeia, 1993.
2. Патент США N 4129560 (12.12.78).
3. Helenius et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1977, 74, N 2.
4. Патент Великобритании , N 881885.
5. McLeod A et al. J. Chromatogr., 1984, 285, 319-331.
6. Сох G.B. J.Chromatogr., 1992, 599, 195-203.
7. Kopaciewicz W. et al. - J.Chromatogr., 1987, 409, 111-124.
8. Lee A.L. et al. - J.Chromatogr., 1988, 443, 31-43.
9. Felinger A. et al. - J. Chromatogr., 1992, 609, 35-47.
10. Snyder R. et al. - J.Chromatogr., 1991, 536, 57-73.
11. Европейский патент N 0547544 A 2 (14.12.92)
12. Kroeff E.P. et al. - J.Chromatogr., 1989, 461, 45-61/
13. Европейский патент N 0474213 A 1.
12. Kroeff E.P. et al. - J.Chromatogr., 1989, 461, 45-61/
13. Европейский патент N 0474213 A 1.
14. Международная заявка, WO 81/00674.0
Claims (13)
1. Способ очистки природного инсулина-сырца, получаемого из поджелудочной железы свиней, включающий различные типы хроматографии, отличающийся тем, что хроматографическую очистку осуществляют последовательно в две стадии обращенно-фазовым и анионообменным методами во фронтально-вытеснительном режиме с использованием селективной десорбции целевого продукта с хроматографических колонн.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве исходного сырья используют инсулин-сырец с содержанием основного вещества не менее 80%, наиболее предпочтительно содержание не менее 90%; содержание проинсулина, дезамидоинсулинов, полимерных инсулинов и других инсулиноподобных примесей составляет не более 5% каждой, наиболее предпочтительно содержание не более 3% каждой примеси.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что хроматографическую очистку осуществляют после предварительной очистки раствора исходного инсулина-сырца от нерастворимых и липидо-пигментных примесей последовательной фильтрацией через мембранный фильтр и фор-колонку с сорбентом в условиях, обеспечивающих эффективное отделение липидно-пигментных примесей, с получением раствора технического инсулина.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что стадию обращенно-фазовой хроматографии осуществляют на препаративном хроматографе низкого или среднего давления, который позволяет реализовать режим последовательной и параллельной работы не менее двух хроматографических колонн с использованием прямого и обратного потока элюирующих растворов, а также ступенчатого или градиентного элюирования.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что стадию обращенно-фазовой хроматографии осуществляют путем нанесения исходного раствора технического инсулина на последовательно соединенные колонны в режиме фронтально-вытеснительной хроматографии в условиях, обеспечивающих селективное прочное связывание загрязняющих примесей-проинсулина и полимерных инсулинов на предколонне, с последующим разъединением колонн и градиентным элюированием рабочей колонны с постепенным увеличением содержания органического модификатора в элюирующем растворе в специально подобранных условиях, обеспечивающих селективную десорбцию инсулина с сорбента и одновременно эффективное вытеснение целевым продуктом инсулиноподобных примесей.
6. Способ по п.3, отличающийся тем, что стадию обращенно-фазовой хроматографии проводят на гидрофобных сорбентах на основе силикагеля, поверхность которого модифицирована мономерными или полимерными силоксанами, содержащими углеводородные радикалы С4-С20, наиболее предпочтительны радикалы С12-С18; диаметр пор указанных сорбентов составляет 10 - 30 нм, наиболее предпочтителен интервал 15 - 20 нм; удельная поверхность сорбентов составляет 80 - 300 м/г, наиболее предпочтителен интервал 100 - 200 м/г; размер частиц составляет 30 - 70 мкм, наиболее предпочтителен размер 30 - 50 мкм; форма частиц сорбента - сферическая, сфероидная или нерегулярная, наиболее предпочтительна сферическая или сфероидная форма; полная сорбционная емкость сорбентов по инсулину составляет не менее 80 г/л сорбента; сорбент полностью совместим с растворами инсулина, а именно в условиях проведения процесса не вызывает денатурацию, агрегацию и полимеризацию молекул инсулина.
7. Способ по п. 4, отличающийся тем, что для нанесения на сорбент исходного инсулина-сырца используют его растворы с концентрацией белка 50 - 200 мг/мл, наиболее предпочтительна концентрация 80 - 150 мг/мл; в смеси водных растворов ионных и органических модификаторов, причем в качестве анионов используют сульфат, ацетат, хлорид или фосфат, наиболее предпочтителен сульфат; в качестве катионов используют аммоний, натрий или калий, наиболее предпочтителен аммоний; в качестве органического модификатора используют низшие алкиловые спирты: метанол, этанол, н-пропанол, изопропанол, н-бутанол, вторбутанол, трет-бутанол, изобутанол, а также ацетонитрил, диметилформамид или диметилацетамид, наиболее предпочтителен этанол; концентрация ионного модификатора составляет 0,01 - 0,1 моль/л, наиболее предпочтительна 0,03, - 0,07 моль/л; концентрация органического модификатора 10 - 20 об.%, наиболее предпочтительна 12 - 15 об.%; значение рН раствора исходного инсулина-сырца 2,0 - 3,5, наиболее предпочтительно значение 2,5 - 3,0; линейная скорость жидкой фазы внутри хроматографической колонны 0,1 - 0,5 см/мин, наиболее предпочтительна скорость 0,2 - 0,4 см/мин.
8. Способ по п.7, отличающийся тем, что количество вводимого в колонны частично очищенного инсулина-сырца составляет 10 - 40 вес.% от полной емкости используемого обращенно-фазового сорбента, наиболее предпочтительно количество 20 - 30 вес.%.
9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что стадию анионообменной хроматографии осуществляют путем введения раствора частично очищенного с помощью обращенно-фазовой хроматографии инсулина-сырца в колонку с анионообменным сорбентом в режиме фронтальной хроматографии в условиях, обеспечивающих селективное прочное связывание с сорбентом дезамидоинсулина и других подобных загрязняющих примесей, с последующим элюированием колонны с увеличением содержания ионного модификатора в элюирующем растворе в условиях, обеспечивающих селективную десорбцию инсулина с анионообменного сорбента.
10. Способ по п.9, отличающийся тем, что стадию анионообменной хроматографии проводят на сорбентах на основе силикагеля или гидрофильного пористого полимера, поверхность которого модифицирована химическими ионогенными группами, обладающими свойствами слабых анионообменников, наиболее предпочтительны диэтиламиноэтильные (ДЭАЭ)-группы; диаметр пор указанных сорбентов 15 - 50 нм, наиболее предпочтителен диаметр 20 - 30 нм; размер частиц 20 - 150 мкм, наиболее предпочтителен размер 20 - 50 мкм; форма частиц сорбента сферическая, сфероидная или нерегулярная, наиболее предпочтительная сферическая или сфероидная форма; обменная емкость анионообменника не менее 0,1 мэкв/мл сорбента; полная сорбционная емкость по инсулину составляет не менее 30 мг/мл сорбента; сорбент полностью совместим с растворами инсулина, а именно в условиях проведения процесса не должен вызывать денатурацию, агрегацию и полимеризацию молекул инсулина.
11. Способ по п.9, отличающийся тем, что для нанесения на анионообменник используют раствор инсулина с концентрацией белка 20 - 50 мг/мл, наиболее предпочтительна 25 - 30 мг/мл; в водных растворах ионных и органических модификаторов, причем в качестве анионов используют сульфат, ацетат, хлорид и фосфат, наиболее предпочтительны сульфат и хлорид; в качестве катионов используют натрий, калий и аммоний, наиболее предпочтительны калий и аммоний; в качестве органического модификатора используют низшие алкиловые спирты: метанол, этанол, н-пропанол, изопропанол, н-бутанол, втор-бутанол, изо-бутанол, трет-бутанол, а также ацетонитрил, деметилформамид и диметилацетамид, наиболее предпочтителен изопропанол; концентрация ионного модификатора 0,01 - 0,05 моль/л, наиболее предпочтительна концентрация 0,013 - 0,017 моль/л; объемная концентрация органического модификатора в растворе 25 - 35%, наиболее предпочтительна концентрация 28 - 30 об.%; значение рН исходного раствора инсулина 7,5 - 8,5, наиболее предпочтительно значение 7,8 - 8,0; линейная скорость жидкой фазы внутри анионообменной колонки 0,1 - 0,5 см/мин, наиболее предпочтительна скорость 0,2 - 0,3 см/мин.
12. Способ по п.9, отличающийся тем, что количество вводимого в анионообменную колонну исходного инсулина составляет 30 - 70 вес.% от полной сорбционной емкости используемого анионообменника по инсулину, наиболее предпочтительно количество 40 - 60%.
13. Способ по п.1, отличающийся тем, что все технологические операции по хроматографической очистке инсулина-сырца осуществляют при 5 - 20oC, наиболее предпочтительна температура 8 - 15oC.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU96121464A RU2126690C1 (ru) | 1996-11-06 | 1996-11-06 | Способ очистки инсулина-сырца, получаемого из поджелудочной железы свиней |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU96121464A RU2126690C1 (ru) | 1996-11-06 | 1996-11-06 | Способ очистки инсулина-сырца, получаемого из поджелудочной железы свиней |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU96121464A RU96121464A (ru) | 1999-02-10 |
| RU2126690C1 true RU2126690C1 (ru) | 1999-02-27 |
Family
ID=20187041
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU96121464A RU2126690C1 (ru) | 1996-11-06 | 1996-11-06 | Способ очистки инсулина-сырца, получаемого из поджелудочной железы свиней |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2126690C1 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005026315A3 (fr) * | 2003-09-18 | 2005-06-30 | Vladimir Vladimirovi Tsygankov | Procede de fabrication d'insuline a partir d'une source naturelle et insuline fabriquee par ce procede |
| RU2453331C1 (ru) * | 2011-06-29 | 2012-06-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Завод Медсинтез" | Способ получения высокоочищенного кристаллического инсулина любого происхождения |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1131507A1 (ru) * | 1982-05-28 | 1984-12-30 | Черновицкий Ордена Трудового Красного Знамени Государственный Университет | Способ получени инсулина |
| US4601852A (en) * | 1981-01-17 | 1986-07-22 | Hoechst Aktiengesellschaft | Process for the preparation of human or the derivatives thereof from pig insulin or the derivatives thereof |
| FR2581647A1 (fr) * | 1985-04-12 | 1986-11-14 | Berlin Chemie Veb | Procede de purification de l'insuline |
-
1996
- 1996-11-06 RU RU96121464A patent/RU2126690C1/ru active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4601852A (en) * | 1981-01-17 | 1986-07-22 | Hoechst Aktiengesellschaft | Process for the preparation of human or the derivatives thereof from pig insulin or the derivatives thereof |
| SU1131507A1 (ru) * | 1982-05-28 | 1984-12-30 | Черновицкий Ордена Трудового Красного Знамени Государственный Университет | Способ получени инсулина |
| FR2581647A1 (fr) * | 1985-04-12 | 1986-11-14 | Berlin Chemie Veb | Procede de purification de l'insuline |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005026315A3 (fr) * | 2003-09-18 | 2005-06-30 | Vladimir Vladimirovi Tsygankov | Procede de fabrication d'insuline a partir d'une source naturelle et insuline fabriquee par ce procede |
| RU2453331C1 (ru) * | 2011-06-29 | 2012-06-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Завод Медсинтез" | Способ получения высокоочищенного кристаллического инсулина любого происхождения |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4519646B2 (ja) | プレプロインスリンの精製方法 | |
| KR101868858B1 (ko) | 형질전환 쌀 알곡으로부터 인간 혈청 알부민을 정제하는 방법 | |
| US9364772B2 (en) | Regeneration of chromatographic stationary phases | |
| EP1729867B1 (en) | A method for chromatographic purification | |
| WO2009135656A1 (en) | A method for the purification of antibodies using displacement chromatography | |
| CN110540587A (zh) | 一种有效提高合成肽纯化收率的色谱方法 | |
| FR2467602A1 (fr) | Procede pour la purification d'interferon et interferon ainsi obtenu | |
| JP2002523732A (ja) | インスリンのクロマトグラフィーによる精製法 | |
| Gan et al. | New affinity nylon membrane used for adsorption of γ-globulin | |
| CN111499537B (zh) | 一种植物源神经酰胺提取物的精制纯化方法 | |
| RU2126690C1 (ru) | Способ очистки инсулина-сырца, получаемого из поджелудочной железы свиней | |
| EP1613409B1 (en) | Regeneration of chromatographic stationary phases | |
| CN114405065B (zh) | 一种利用动态热力学平衡纯化制备手性多肽型药物的方法 | |
| CN100343390C (zh) | 反义寡核苷酸的分离 | |
| Reifsnyder et al. | Purification of insulin-like growth factor-I and related proteins using underivatized silica | |
| CA3045214A1 (en) | Process for the purification of lipopolypeptide antibiotics | |
| CN112645993B (zh) | 一种高纯度盐酸林可霉素的纯化方法 | |
| CN114316088B (zh) | 亲和树脂、制备方法及其在分离纯化藻蓝蛋白中的应用 | |
| CN106573948A (zh) | 高纯度低内毒素碳水化合物(hple)组合物及其分离方法 | |
| KR20250011797A (ko) | 알부민이 융합된 단백질의 정제방법 | |
| CN116514927A (zh) | 一种替考拉宁的纯化方法 | |
| CN118240798A (zh) | 一种牛痘病毒加帽酶纯化的方法 | |
| CN113372433A (zh) | 纯化fsh方法 | |
| CN116284285A (zh) | 一种离子交换层析纯化腐生子囊菌抗菌肽Plectasin的方法 | |
| KR20240155248A (ko) | 바닐린을 회수 및 정제하는 방법 |