RU2125464C1

RU2125464C1 - Method of immunostimulating agent preparing

Info

Publication number: RU2125464C1
Application number: RU98101487A
Authority: RU
Inventors: В.А. Внуков; А.В. Гончарук
Original assignee: Внуков Владислав Анатольевич; Гончарук Анатолий Васильевич
Priority date: 1998-01-27
Filing date: 1998-01-27
Publication date: 1999-01-27

Abstract

FIELD: medicine, immunology. SUBSTANCE: method involves extraction of defatted and depigmented biomass of Spirulina platensis as a raw source with distilled water at 50-70 C at ratio dried biomass : distilled water = 1: (30-50). Obtained suspension is treated with 80-90% phenol solution at ratio suspension : phenol solution = 10:1 at 50-70 C. Then an aqueous phase is separated, dialyzed and dried. EFFECT: increased immunostimulating activity of the end product. 1 ex, 2 dwg

Description

Изобретение относится к области медицины, а именно к способам получения иммуностимуляторов. The invention relates to medicine, in particular to methods for producing immunostimulants.

Известен способ получения иммуностимулятора путем экстракции сырья растительного происхождения, в качестве которого используют сборы растений (см. напр. авт.св. СССР 1797894, кл. А 61 К 35/78, 1990). A known method of obtaining an immunostimulant by extraction of raw materials of plant origin, which is used as the fees of plants (see, for example, auth. St. USSR 1797894, class A 61 K 35/78, 1990).

Полученный известным способом иммуностимулятор не обладает достаточной активностью. Received in a known manner immunostimulant does not have sufficient activity.

Известен также способ получения иммуностимулятора, когда в качестве сырья используется тимус теленка (см. напр. Goldstein A.L., Guha A., Zatz M.M., Hardy A., White A. Purification and biological activity of the thymus gland. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.7, p.1800-1807, 1972). There is also a known method for producing an immunostimulant when calf thymus is used as a raw material (see, for example, Goldstein AL, Guha A., Zatz MM, Hardy A., White A. Purification and biological activity of the thymus gland. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 7, p. 1800-1807, 1972).

Полученный известным способом иммуностимулятор при его высокой стоимости не обладает достаточной активностью. Received in a known manner immunostimulant at its high cost does not have sufficient activity.

Заявленное изобретение направлено на получение иммуностимулятора с более высокой активностью. The claimed invention is aimed at obtaining an immunostimulant with higher activity.

Указанный результат достигается за счет того, что в качестве сырья используют обезжиренную и депигментированную биомассу Spirulina platensis, которую экстрагируют дистиллированной водой при 50 - 70^oС и отношении высушенной биомассы к дистиллированной воде 1: (30 - 50), полученную суспензию обрабатывают 80-90%-ным раствором фенола при отношении суспензии к раствору фенола 10:1, при температуре 50-70^oС, после чего водную фазу отделяют, диализуют и высушивают.The specified result is achieved due to the fact that the raw materials use defatted and depigmented biomass Spirulina platensis, which is extracted with distilled water at 50 - 70 ^o With a ratio of dried biomass to distilled water 1: (30 - 50), the resulting suspension is treated 80-90 % phenol solution at a ratio of suspension to phenol solution of 10: 1, at a temperature of 50-70 ^o C, after which the aqueous phase is separated, dialyzed and dried.

Сущность изобретения характеризуется совокупностью существенных признаков, представленных в формуле изобретения, и иллюстрируется чертежами, где на фиг. 1 представлены графики влияния полученного предлагаемым способом иммуностимулятора и иммуностимулятора, полученного из тимуса телят на Т-спонтанное розеткообразование эритроцитов барана против Т-лимфоцитов человека (% Е-РОК), на фиг. 2 - восстановление иммунного ответа у мышей, подавленного гидрокортизоном, на пятый день после введения указанных иммуностимуляторов. The invention is characterized by a combination of essential features presented in the claims, and is illustrated by drawings, where in FIG. 1 shows graphs of the effect of the proposed method immunostimulant and immunostimulant obtained from the thymus of calves on the T-spontaneous rosette formation of sheep erythrocytes against human T-lymphocytes (% E-ROCK), in FIG. 2 - restoration of the immune response in mice suppressed by hydrocortisone on the fifth day after the introduction of these immunostimulants.

Как следует из результатов тестовых испытаний, по характеру иммуностимулирующего действия получаемый по предлагаемому способу препарат сходен с известным препаратом, получаемым из тимуса телят, но одинаковый эффект достигается при меньших дозах. As follows from the results of test tests, by the nature of the immunostimulating action, the preparation obtained by the proposed method is similar to the known preparation obtained from the thymus of calves, but the same effect is achieved at lower doses.

При использовании иммуностимулятора, полученного по предлагаемому способу, в дозах от 10^-2 мкг до 10^-3 мкг на мл инкубационной среды наблюдается увеличение числа Е-РОК почти на 50% от контроля, в то время как тимозин в той же концентрации увеличивает число Е-РОК всего на 15-20%.When using the immunostimulant obtained by the proposed method, in doses from 10 ^-2 μg to 10 ^-3 μg per ml of incubation medium, an increase in the number of E-ROCK is observed by almost 50% of the control, while thymosin in the same concentration increases the number E -ROCK only 15-20%.

При парентеральном введении иммуностимулятора, полученного по предлагаемому способу, мышам с эндогенным гиперкортицизмом наблюдается полное восстановление иммунного ответа на пятый день при дозировке 10^-2 мкг/мышь.When parenteral administration of an immunostimulant obtained by the proposed method, mice with endogenous hypercorticism is observed complete restoration of the immune response on the fifth day at a dosage of 10 ^-2 μg / mouse.

Пример. К 400 мл густой биомассы Spirulina platensis в целях обезжиривания и депигментации добавляют 1000 мл смеси хлороформа и метанола (2:1 объем на объем). Полученную суспензию подвергают перемешиванию в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем клеточную массу отделяют на воронке Бюхнера и вновь ресуспендируют в таком же объеме смеси хлороформа и метанола. Процедуру освобождения клеток от пигментов, липидов и фосфолипидов повторяют еще раз. Example. To 400 ml of the thick biomass of Spirulina platensis, for the purpose of degreasing and depigmentation, add 1000 ml of a mixture of chloroform and methanol (2: 1 volume per volume). The resulting suspension was stirred for 1 h at room temperature. Then the cell mass is separated on a Buchner funnel and again resuspended in the same volume of a mixture of chloroform and methanol. The procedure for releasing cells from pigments, lipids and phospholipids is repeated again.

Затем клеточную массу выкладывают на фильтровальную бумагу и подсушивают на воздухе в течение 4-5 ч. Из 400 мл исходной суспензии получают 10-12 г обезжиренных воздушно-сухих клеток водоросли. Then the cell mass is spread on filter paper and dried in air for 4-5 hours. From 400 ml of the initial suspension, 10-12 g of defatted air-dried algae cells are obtained.

Полученный объем сухих клеток суспендируют в 300 мл дистиллированной воды при 70^oС и, поддерживая постоянной температуру, перемешивают в течение 12 ч, затем приливают 30 мл 90% фенола, нагретого до 70^oС. Суспензию выдерживают при перемешивании 30 мин и после охлаждения до комнатной температуры центрифугируют при 3000 об/мин в течение 30 мин до расслоения фенольной и водной фазы. Водную фазу диализуют против дистиллированной воды в течение 3-х дней и лиофилизируют.The obtained volume of dry cells is suspended in 300 ml of distilled water at 70 ^° C and, while maintaining a constant temperature, stirred for 12 hours, then 30 ml of 90% phenol heated to 70 ^° C are added ^. The suspension is kept under stirring for 30 minutes and after cooling to at room temperature, they are centrifuged at 3000 rpm for 30 minutes until the phenolic and aqueous phases are separated. The aqueous phase is dialyzed against distilled water for 3 days and lyophilized.

Получаемый препарат - белый хлопьевидный порошок, хорошо растворимый в воде, представляет собой углевод-белковый комплекс, содержащий 32-34% полисахаридов, 23-25% белков, 11-13% аминосахаров и 28-30% аминокислот и минеральных веществ (состав комплекса определен по известным методикам). Углеводная часть состоит из остатков рамнозы (в преобладающем количестве), маннозы, галактозы, глюкозы, ксилозы и арабинозы. The resulting preparation is a white flocculent powder, well soluble in water, is a carbohydrate-protein complex containing 32-34% polysaccharides, 23-25% proteins, 11-13% amino sugars and 28-30% amino acids and minerals (the composition of the complex is determined by known techniques). The carbohydrate part consists of rhamnose residues (in a predominant amount), mannose, galactose, glucose, xylose and arabinose.

Для получения оптимальных количественных характеристик по извлечению препарата из биомассы, при сохранении его активности, процесс экстракции проводят при массовом отношении биомассы к воде 1 : (30 - 50), используют 80 - 90%-ный раствор фенола, а обработку суспензии фенолом при объемном соотношении 10:1, при сохранении температурного режима в пределах 50 - 70^oС.To obtain optimal quantitative characteristics for the extraction of the drug from biomass, while maintaining its activity, the extraction process is carried out at a mass ratio of biomass to water of 1: (30 - 50), an 80 - 90% phenol solution is used, and the suspension is treated with phenol at a volume ratio 10: 1, while maintaining the temperature in the range of 50 - 70 ^o C.

В случае понижения температуры ниже 50^oС при проведении экстракции и обработке суспензии раствором фенола процесс получения препарата значительно затягивается по времени, а при повышении температуры выше 70^oС происходит разрушение активных веществ и, соответственно, снижение активности получаемого препарата.In the case of lowering the temperature below 50 ^o With the extraction and processing of the suspension with a solution of phenol, the process of obtaining the drug is significantly delayed in time, and when the temperature rises above 70 ^o With the destruction of the active substances and, accordingly, a decrease in the activity of the resulting drug.

Уменьшение отношения биомассы к дистиллированной воде меньше 30 приводит к снижению объема получаемого препарата, тогда как увеличение этого отношения более 50 уже не приводит к заметным изменениям указанной характеристики. A decrease in the ratio of biomass to distilled water of less than 30 leads to a decrease in the volume of the resulting preparation, while an increase in this ratio of more than 50 no longer leads to noticeable changes in this characteristic.

Выбор параметров раствора фенола, как и приведенный выше выбор температурного режима, определяется, с одной стороны, сохранением активных веществ и, соответственно, активности получаемого препарата. The choice of parameters for phenol solution, as well as the above choice of temperature, is determined, on the one hand, by the preservation of active substances and, accordingly, the activity of the resulting preparation.

При соблюдении приведенных параметров обеспечивается выход конечного продукта 300 - 500 мг на 10 г сухих клеток, что составляет 3 - 5% от массы сухого сырья. Subject to the given parameters, the yield of the final product is 300–500 mg per 10 g of dry cells, which is 3–5% of the mass of dry raw materials.

Claims

A method of producing an immunostimulant by extraction of natural raw materials, characterized in that the fat-free and depigmented biomass Spirulina platensis is used as a raw material source, which is extracted with distilled water at 50 - 70 ^o C and the ratio of dried biomass to distilled water 1: (30 - 50), obtained the suspension is treated with 80 - 90% phenol solution at a ratio of suspension to phenol solution of 10: 1 and a temperature of 50 - 70 ^o C, after which the aqueous phase is separated, dialyzed and dried.