RU2124731C1 - Method of immunoenzymatic analysis of antibodies raised to chemical carcinogens of polycyclic aromatic hydrocarbon group - Google Patents
Method of immunoenzymatic analysis of antibodies raised to chemical carcinogens of polycyclic aromatic hydrocarbon group Download PDFInfo
- Publication number
- RU2124731C1 RU2124731C1 RU94020467A RU94020467A RU2124731C1 RU 2124731 C1 RU2124731 C1 RU 2124731C1 RU 94020467 A RU94020467 A RU 94020467A RU 94020467 A RU94020467 A RU 94020467A RU 2124731 C1 RU2124731 C1 RU 2124731C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antigen
- antibodies
- wells
- enzyme
- polycyclic aromatic
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 239000003183 carcinogenic agent Substances 0.000 title claims description 10
- 125000005575 polycyclic aromatic hydrocarbon group Chemical group 0.000 title claims description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 33
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 33
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 33
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims abstract description 13
- 239000004033 plastic Substances 0.000 claims abstract description 12
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Natural products CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 abstract description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 abstract 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 15
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 15
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 15
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 231100000357 carcinogen Toxicity 0.000 description 7
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 5
- FMMWHPNWAFZXNH-UHFFFAOYSA-N Benz[a]pyrene Chemical compound C1=C2C3=CC=CC=C3C=C(C=C3)C2=C2C3=CC=CC2=C1 FMMWHPNWAFZXNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 4
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 4
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 4
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 4
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 4
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 4
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 4
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 3
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- YNPNZTXNASCQKK-UHFFFAOYSA-N phenanthrene Chemical group C1=CC=C2C3=CC=CC=C3C=CC2=C1 YNPNZTXNASCQKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001792 phenanthrenyl group Chemical group C1(=CC=CC=2C3=CC=CC=C3C=CC12)* 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YOETUEMZNOLGDB-UHFFFAOYSA-N 2-methylpropyl carbonochloridate Chemical compound CC(C)COC(Cl)=O YOETUEMZNOLGDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TXVHTIQJNYSSKO-UHFFFAOYSA-N BeP Natural products C1=CC=C2C3=CC=CC=C3C3=CC=CC4=CC=C1C2=C34 TXVHTIQJNYSSKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 231100000206 health hazard Toxicity 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретение - иммунология, онкология, экология. The technical field to which the invention relates is immunology, oncology, ecology.
Уровень техники. Аналогами заявляемого изобретения являются твердофазные иммуноферментные методы гетерогенного анализа антител типа ELISA, включающие в себя: 1) адсорбцию антигена на стенках лунок пластиковых планшетов; 2) инкубацию исследуемой биологической жидкости с адсорбированными антигенами; 3) выявление антител, связавшихся с антигеном, с помощью анти-антител, меченых ферментом (Иммуноферментный анализ. Под ред. Т.Т. Нго, Г. Ленхоффа. М. Мир, 1988, 644 с.). The prior art. Analogs of the claimed invention are solid-phase enzyme-linked immunosorbent assays for heterogeneous analysis of antibodies of the ELISA type, including: 1) adsorption of antigen on the walls of the wells of plastic tablets; 2) incubation of the studied biological fluid with adsorbed antigens; 3) detection of antibodies bound to the antigen using anti-enzyme-labeled antibodies (Enzyme-linked immunosorbent assay. Edited by T. T. Ngo, G. Lenhoff. M. Mir, 1988, 644 pp.).
Прототипом заявляемого изобретения является метод, описанный J. L. Chagnaud, S. Faiderbe, M. Geffard (dentification and immunochemical characterization of Ig A in sera of patients with mammary tumors. - Int. J. Cancer, 1992, v. 50, p. 395-401). Согласно методу J.L. Chagnaud с соавт. в качестве антигена на стенках лунок пластикового планшета адсорбируют конъюгат бенз(а)пирена с тиреоглобулином в концентрации 64 мкг/мл. Анализ антител к бенз(а)пирену выполняют аналогично схеме, описанной выше. Т.е. вносят в лунки планшета с адсорбированным на стенках антигеном исследуемую сыворотку в разведении 1:1000, удаляют несвязавшиеся иммуноглобулины исследуемой сыворотки многократным отмыванием лунок планшета; вносят в лунки антитела к иммуноглобулинам человека, меченые пероксидазой хрена; удаляют несвязавшиеся меченые ферментом анти-иммуноглобулины многократным отмыванием лунок планшета; определяют количество связавшихся со стенками меченых ферментом анти-иммуноглобулинов (а стало быть и связавшихся с антигеном антител человека в исследуемой сыворотке) по интенсивности цветной реакции после добавления субстрата и хромогена. Для контроля неспецифического связывания антител исследуемой сыворотки с белком-носителем в отдельных лунках планшета адсорбируют белок-носитель без гаптена, в данном случае - без бенз(а)пирена. The prototype of the claimed invention is the method described by JL Chagnaud, S. Faiderbe, M. Geffard (dentification and immunochemical characterization of Ig A in sera of patients with mammary tumors. - Int. J. Cancer, 1992, v. 50, p. 395- 401). According to the method of J.L. Chagnaud et al. as an antigen, the conjugate of benz (a) pyrene with thyroglobulin at a concentration of 64 μg / ml is adsorbed on the walls of the holes of a plastic tablet. Analysis of antibodies to benz (a) pyrene is performed similarly to the scheme described above. Those. injected into the wells of the plate with the antigen adsorbed on the walls of the test serum at a dilution of 1: 1000, remove unbound immunoglobulins of the test serum by repeatedly washing the wells of the tablet; add antibodies to human immunoglobulins labeled with horseradish peroxidase to the wells; remove unbound enzyme-labeled anti-immunoglobulins by repeatedly washing the plate wells; the amount of anti-immunoglobulins labeled with the enzyme bound to the walls (and, therefore, human antibodies bound to the antigen in the test serum) is determined by the intensity of the color reaction after adding the substrate and chromogen. To control the non-specific binding of the antibodies of the test serum to the carrier protein, the carrier protein is adsorbed without hapten in individual wells of the tablet, in this case without benzo (a) pyrene.
Признаками прототипа, совпадающими с существенными признаками заявляемого изобретения являются: 1) использование в качестве антигена, адсорбированного на стенках лунок пластикового планшета, конъюгата гаптена с белком-носителем; 2) использование белка-носителя без гаптена в качестве контроля неспецифического связывания исследуемых антител; 3) общая схема выполнения метода - инкубация разведенной исследуемой сыворотки в лунках планшета, на стенках которых адсорбированы антигены; выявление связавшихся с антигенами антител исследуемой сыворотки с помощью анти-иммуноглобулиновых антител, меченых ферментом; определение связавшихся меченых анти-иммуноглобулиновых антител по интенсивности цветной ферментативной реакции. Signs of the prototype, coinciding with the essential features of the claimed invention are: 1) use as an antigen adsorbed on the walls of the holes of a plastic tablet, a hapten conjugate with a carrier protein; 2) the use of a carrier protein without hapten as a control of nonspecific binding of the studied antibodies; 3) the general scheme of the method - incubation of the diluted test serum in the wells of the tablet, on the walls of which antigens are adsorbed; detection of serum antibodies bound to antigens of the test serum using anti-immunoglobulin antibodies labeled with the enzyme; determination of bound labeled anti-immunoglobulin antibodies by the intensity of the color enzymatic reaction.
Недостатками прототипа являются: 1) использование в качестве гаптена нативных молекул канцерогена, что сопряжено с риском для здоровья изготовителя и исследователя, выполняющего данный метод, за счет высокой канцерогенной опасности; 2) использование тиреоглобулина в качестве белка-носителя в ряде случаев может сопровождаться высоким неспецифическим связыванием антител исследуемой сыворотки не с гаптеном, а с белком-носителем (известны, например, целые группы заболеваний человека, характеризующиеся образованием ауто-антител к тиреоглобулину), что существенно ограничивает возможность метода; 3) большой расход антигена при подготовке тест-системы к выполнению метода - для адсорбции антиген вносили в лунки планшета в концентрации 64 мкг/мл. The disadvantages of the prototype are: 1) the use of native carcinogen molecules as a hapten, which is associated with a health risk for the manufacturer and researcher performing this method due to the high carcinogenic hazard; 2) the use of thyroglobulin as a carrier protein in some cases may be accompanied by a high nonspecific binding of the antibodies of the test serum not with haptens, but with a carrier protein (for example, whole groups of human diseases characterized by the formation of auto antibodies to thyroglobulin are known), which is essential limits the ability of the method; 3) a large consumption of antigen in preparing the test system for the method - for adsorption, the antigen was introduced into the wells of the tablet at a concentration of 64 μg / ml.
Сущность изобретения. SUMMARY OF THE INVENTION
Заявляемое изобретение направлено на решение следующих задач: 1) снижение канцерогенной опасности для здоровья исследователя и изготовителя тест-систем; 2) снижение неспецифического связывания антител исследуемой сыворотки с белком-носителем; 3) повышение экономичности метода. The invention is aimed at solving the following problems: 1) reduction of a carcinogenic hazard to the health of the researcher and manufacturer of test systems; 2) reduction of non-specific binding of the antibodies of the test serum to the carrier protein; 3) increasing the efficiency of the method.
Предлагаются следующие технические решения перечисленных задач:
1) Использовать в качестве гаптена не нативные канцерогены, а, в отличие от прототипа, их химические аналоги, не обладающие канцерогенной активностью, либо со значительно сниженной канцерогенной активностью. Для канцерогенов группы полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) такими соединениями являются их аналоги, имеющие заместители в бэй-области (в положении "5" фенантренового фрагмента). Заместитель, введенный в положение "5" фенантренового фрагмента, препятствует окислению ПАУ в бэй-области и образованию диолэпоксидов, являющихся активными формами канцерогенов ПАУ (Турусов В.С., Кобляков В.А. Стадийность канцерогенеза и механизмы действия химических канцерогенов. Итоги науки и техники. ВИНИТИ. Онкология, 1986, т. 15, с. 6-75). Введение заместителей в бэй-область не изменяет антигенных свойств молекулы исходного канцерогена, т. к. при иммунизации замещенной формой ПАУ в качестве гаптена образуются антитела, перекрестно реагирующие со многими представителями группы ПАУ (F.L.Moolten, N.J.Capparell, E.Boger, P. Mahathalang. Induction of antibodies against Carcinogenic polycyclic aromatic hydrocarbons. - Nature, 1978, v. 272, N 13, p. 614-616). Поэтому замещенные в бэй-области аналоги ПАУ, не обладая канцерогенной опасностью для здоровья и сохраняя антигенные свойства исходного канцерогена, вполне могут служить в качестве гаптена в составе антигена в методах и тест-системах для анализа антител к химическим канцерогенам группы ПАУ.The following technical solutions to the above tasks are proposed:
1) Use as a hapten not native carcinogens, but, unlike the prototype, their chemical analogues that do not have carcinogenic activity, or with significantly reduced carcinogenic activity. For carcinogens of the group of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), such compounds are their analogues having substituents in the bay region (at
2) Для снижения неспецифического связывания антител исследуемой сыворотки использовать в качестве белка-носителя альбумин, который в отличие от тиреоглобулина обладает меньшей антигенной и иммуногенной активностью и повсеместно используется в иммуно-анализах для блокирования неспецифического связывания антител с пластиком планшетов или других твердых носителей антигенов (Иммуноферментный анализ. Под ред. Т.Т.Нго, Ленхоффа. М. Мир; 1988, 466 с.). Растворами альбумина разводят сыворотку перед иммуноанализом антител (в т.ч. в прототипе буферный раствор, содержащий 1 г/л бычьего сывороточного альбумина, применяли для разведения исследуемой сыворотки). 2) To reduce the non-specific binding of antibodies of the test serum, use albumin as a carrier protein, which, unlike thyroglobulin, has less antigenic and immunogenic activity and is widely used in immunoassays to block non-specific binding of antibodies to plastic of tablets or other solid carriers of antigens (Enzyme-linked immunosorbent Analysis, Edited by T.T.Ngo, Lenhoff, M. Mir; 1988, 466 pp.). Serum solutions are diluted with serum before antibody immunoassay (including in the prototype a buffer solution containing 1 g / l of bovine serum albumin was used to dilute the test serum).
3) Повышение экономичности метода достигается за счет снижения концентрации антигена при адсорбции его на поверхность лунок планшета. За счет высокой адсорбционной активности альбумина, который используется в настоящем предложении в качестве белка-носителя, оптимальная концентрация антигенов при адсорбции по заявляемому способу составляет 2 мкг/мл, что в 32 раза меньше, чем в прототипе (64 мкг/мл). 3) Improving the efficiency of the method is achieved by reducing the concentration of antigen during its adsorption on the surface of the wells of the tablet. Due to the high adsorption activity of albumin, which is used as a carrier protein in the present proposal, the optimal concentration of antigens during adsorption by the present method is 2 μg / ml, which is 32 times less than in the prototype (64 μg / ml).
Таким образом существенными признаками заявляемого изобретения, отличительными от наиболее близкого аналога (прототипа) и обеспечивающими получение технического результата, являются:
1) Использование в качестве гаптена химических аналогов ПАУ, имеющих заместители в положении "5" фенантренового фрагмента молекулы ПАУ (в бэй-области);
2) Использование в качестве белка-носителя альбумина;
3) Снижение концентрации конъюгатов ПАУ - белок-носитель при адсорбции на стенки лунок планшетов до 2 мкг/мл;
Перечень фигур чертежей и иных материалов:
Фиг. 1. Схема иммуноанализа антител к ПАУ.Thus, the essential features of the claimed invention, distinguishing from the closest analogue (prototype) and providing a technical result, are:
1) Use as a hapten of chemical analogues of PAHs having substituents in position “5” of the phenanthrene fragment of the PAH molecule (in the bay region);
2) Use as an albumin carrier protein;
3) Reducing the concentration of PAH conjugates - carrier protein upon adsorption on the wall of the wells of the tablets to 2 μg / ml;
The list of figures of drawings and other materials:
FIG. 1. Scheme of immunoassay of antibodies to PAHs.
Фиг. 2. Кинетика адсорбции антигена на пластике. FIG. 2. Kinetics of antigen adsorption on plastic.
Фиг. 3. Схема внесения антигенов и исследуемой жидкости в лунки планшета. FIG. 3. Scheme for the introduction of antigens and test fluid into the wells of the tablet.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения Синтез конъюгата "ПАУ-Белок"
Синтез конъюгата "ПАУ-Белок" выполняли в полном соответствии с методом, описанным Moolten F.L. et al (Nature, 1978, v. 272, N 13, p. 614-616). 50 мг фторметилбензантрил уксусной кислоты (ФМБА) конъюгировали с 270 мг человеческого сывороточного альбумина (ЧСА) опосредованно через образование смешанного ангидрида с изобутилхлоркарбонатом.Information confirming the possibility of carrying out the invention Synthesis of conjugate "PAH-Protein"
The synthesis of the PAH-Protein conjugate was carried out in full accordance with the method described by Moolten FL et al (Nature, 1978, v. 272, No. 13, p. 614-616). 50 mg of fluoromethylbenzantryl acetic acid (FMBA) was conjugated to 270 mg of human serum albumin (HSA) indirectly through the formation of a mixed anhydride with isobutyl chlorocarbonate.
Ход анализа
1. Адсорбция антигенов. ЧСА (1) и ФМБА-ЧСА (2) растворяли в HO (концентрация 2 мкг/мл) и вносили по 100 мкл в лунки полистиролового 96-луночного планшета (на фиг. 1 и 3 соответственно ряды А, В и Б, Г). Инкубировали при 37oC в течение 60 мин. Для выбора оптимальных условий адсорбции антигена на пластике инкубировали ФМБА-ЧСА по 100 мкл на лунку в концентрациях 0,5; 1; 2,5; 5; 10; 25; 50 мкг/мл в течение 30, 60, 90, 120, 150, 180 минут. Блокировали незанятые участки пластика внесением раствора овальбумина в лунки планшета в концентрации 0,1% по 100 мкл на лунку в течение 30 минут по стандартным правилам ELISA. Для определения адсорбированного материала вносили в лунки по 100 мкл кроличьих антител к ЧСА, конъюгированных с пероксидазой хрена. После отмывки несвязавшихся меченых антител к ЧСА и добавления субстрата и хромогена в соответствии со стандартным методом ELISA определяли оптическую плотность. Графики, характеризующие кинетику связывания ФМБА-ЧСА с пластиком, представлены на фиг. 2. На рисунке видно, что оптимальной концентрацией для адсорбции антигенов на пластик является 2 мкг/мл, что в 32 раза меньше, чем в прототипе, а наиболее оптимальным временем адсорбции является 1-2 часа при температуре 37oC.Analysis progress
1. Adsorption of antigens. HSA (1) and FMBA-HSA (2) were dissolved in HO (
Последующие этапы выполняли в полном соответствии с прототипом. The subsequent steps were performed in full accordance with the prototype.
2. Несвязавшийся материал удаляли из лунок простым вытряхиванием. 2. Unbound material was removed from the wells by simple shaking.
3. Блокировали незанятые участки пластика внесением 0,1% раствора овальбумина в лунки планшета по 100 мкл/лунку на 30 минут. 3. Unoccupied areas of plastic were blocked by introducing a 0.1% solution of ovalbumin into the wells of the plate at 100 μl / well for 30 minutes.
4. После удаления блокирующего раствора вносили в лунки исследуемую сыворотку человека, разведенную 1:1000 0,1% раствором овальбумина (фиг. 3) и инкубировали планшет в течение 2 часов при 18oC. Каждый образец исследуемой сыворотки вносили в 3 лунки А и в 3 лунки Б. В лунки В и Г для определения фонового связывания с антигенами меченых пероксидазой анти-антител (5) вносили 0,1% раствор овальбумина.4. After removing the blocking solution, the test human serum was diluted 1: 1000 with 0.1% ovalbumin solution (Fig. 3) and the plate was incubated for 2 hours at 18 o C. Each sample of the test serum was added to 3 wells A and in 3 wells B. To test the background binding of peroxidase-labeled anti-antibodies (5) to wells B and D, 0.1% ovalbumin solution was added.
5. Удаляли несвязавшиеся антитела путем 10-кратного отмывания лунок забуференной дистиллированной водой с 0,02% Твин-20. 5. Unbound antibodies were removed by washing the
6. Для определения связавшихся с антигенами антител (3, 4) вносили в лунки антитела к иммуноглобулинам человека, конъюгированных с пероксидазой хрена (5), по 100 мкл на лунку и инкубировали при 18oC в течение 1 часа.6. To determine antibodies bound to antigens (3, 4), 100 μl per well of antibodies to human immunoglobulins conjugated to horseradish peroxidase (5) were added to the wells and incubated at 18 ° C for 1 hour.
7. Отмывали лунки так же, как в п.5. 7. Washed the wells as in
8. Вносили в лунки по 100 мкл субстратного буферного раствора с хромогеном (3,25 мл 0,2 М фосфатного буферного раствора, 3,05 мл 0,1 М лимонной кислоты и 4 мг ортофенилендиамина, 18 мкл 30% перекиси водорода и доводим до 12,5 дистиллированной воды) на 1-5 минут при 18oC.8. 100 μl of a substrate buffer solution with chromogen (3.25 ml of 0.2 M phosphate buffer solution, 3.05 ml of 0.1 M citric acid and 4 mg of orthophenylenediamine, 18 μl of 30% hydrogen peroxide) were added to the wells. 12.5 distilled water) for 1-5 minutes at 18 o C.
9. Добавляли в лунки по 75 мкл 1 Н раствора HCl. 9. 75 μl of 1 N HCl solution was added to the wells.
10. Оптическую плотность регистрировали на фотометре "Унискан" при 492 нм. 10. The optical density was recorded on a Uniscan photometer at 492 nm.
Подсчет результатов
Таким образом, для каждого планшета имеется по два значения неспецифического фонового связывания меченых ферментом анти-антител: с белком-носителем (лунка В) и с полным антигеном (лунка Г). Кроме того, для каждого из образцов исследуемой жидкости имеется тоже по два значения связывания искомых антител с антигенами: с белком-носителем (лунка А) и с полным антигеном (лунка Б). Для установления истинного связывания искомых антител с гаптеном (ПАУ) для каждого образца (Xn) выполняется следующий расчет:
где
А, Б, В и Г - соответствующие усредненные оптические плотности.Counting results
Thus, for each tablet, there are two values of non-specific background binding of enzyme labeled anti-antibodies: with a carrier protein (well B) and with a complete antigen (well G). In addition, for each of the samples of the studied liquid, there are also two values of the binding of the desired antibodies to antigens: with the carrier protein (well A) and with the full antigen (well B). To establish the true binding of the desired antibodies to hapten (PAH) for each sample (X n ) the following calculation is performed:
Where
A, B, C and D are the corresponding averaged optical densities.
Xn показывает на сколько процентов превышает истинное связывание искомых антител с гаптеном по сравнению с фоновым связыванием их с белком-носителем. При этом учитывается и фоновое связывание меченых пероксидазой хрена анти-антител с гаптеном и с белком-носителем.X n shows how many percent exceeds the true binding of the desired antibodies to hapten compared to their background binding to the carrier protein. In this case, background binding of horseradish peroxidase-labeled anti-antibodies with haptens and with a carrier protein is also taken into account.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU94020467A RU2124731C1 (en) | 1994-06-01 | 1994-06-01 | Method of immunoenzymatic analysis of antibodies raised to chemical carcinogens of polycyclic aromatic hydrocarbon group |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU94020467A RU2124731C1 (en) | 1994-06-01 | 1994-06-01 | Method of immunoenzymatic analysis of antibodies raised to chemical carcinogens of polycyclic aromatic hydrocarbon group |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU94020467A RU94020467A (en) | 1996-11-27 |
| RU2124731C1 true RU2124731C1 (en) | 1999-01-10 |
Family
ID=20156693
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU94020467A RU2124731C1 (en) | 1994-06-01 | 1994-06-01 | Method of immunoenzymatic analysis of antibodies raised to chemical carcinogens of polycyclic aromatic hydrocarbon group |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2124731C1 (en) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2218352C1 (en) * | 2002-06-19 | 2003-12-10 | Федеральное государственное учреждение Всероссийский государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов - центр качества ветеринарных препаратов и кормов | Conjugate of 4-[1-ethyl-2-(4-hydroxyphenyl)-butene-1-yl]-phenylacetic acid with bovine serum albumin for immunochemical method of determination of diethylstilboestrol |
| RU2218351C1 (en) * | 2002-06-19 | 2003-12-10 | Федеральное государственное учреждение Всероссийский государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов - центр качества ветеринарных препаратов и кормов | CONJUGATE OF [19-NOR-17α--ETHYNYL-17β--HYDROXY-PREGNA-1,35"10"TRIENE-3-YL]-OXYACETIC ACID WITH BOVINE SERUM ALBUMIN FOR IMMUNOCHEMICAL METHOD FOR DETERMINATION OF ETHYNYLESTRADIOL |
| RU2423519C1 (en) * | 2010-02-24 | 2011-07-10 | Учреждение Российской академии наук Институт экологии человека Сибирского отделения РАН (ИЭЧ СО РАН) | Mus Musculus ANIMAL HYBRID CULTURED CELL STRAIN PRODUCING benzo[a]pyrene AND benz[a]anthraccene SPECIFIC MONOCLONAL ANTIBODIES |
| RU2702900C1 (en) * | 2018-12-03 | 2019-10-14 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный исследовательский центр угля и углехимии Сибирского отделения Российской академии наук" | Method for quantitative determination of antibodies to benzo[a]pyrene in human biological fluids |
-
1994
- 1994-06-01 RU RU94020467A patent/RU2124731C1/en active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| J.L.Chagnaud et al., Identification and immunochemical characterization of Ig A in sera of patient with mammary tumors., Int.J.Cancer, 1992, v. 50, p. 395 - 410. * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2218352C1 (en) * | 2002-06-19 | 2003-12-10 | Федеральное государственное учреждение Всероссийский государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов - центр качества ветеринарных препаратов и кормов | Conjugate of 4-[1-ethyl-2-(4-hydroxyphenyl)-butene-1-yl]-phenylacetic acid with bovine serum albumin for immunochemical method of determination of diethylstilboestrol |
| RU2218351C1 (en) * | 2002-06-19 | 2003-12-10 | Федеральное государственное учреждение Всероссийский государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов - центр качества ветеринарных препаратов и кормов | CONJUGATE OF [19-NOR-17α--ETHYNYL-17β--HYDROXY-PREGNA-1,35"10"TRIENE-3-YL]-OXYACETIC ACID WITH BOVINE SERUM ALBUMIN FOR IMMUNOCHEMICAL METHOD FOR DETERMINATION OF ETHYNYLESTRADIOL |
| RU2423519C1 (en) * | 2010-02-24 | 2011-07-10 | Учреждение Российской академии наук Институт экологии человека Сибирского отделения РАН (ИЭЧ СО РАН) | Mus Musculus ANIMAL HYBRID CULTURED CELL STRAIN PRODUCING benzo[a]pyrene AND benz[a]anthraccene SPECIFIC MONOCLONAL ANTIBODIES |
| RU2702900C1 (en) * | 2018-12-03 | 2019-10-14 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный исследовательский центр угля и углехимии Сибирского отделения Российской академии наук" | Method for quantitative determination of antibodies to benzo[a]pyrene in human biological fluids |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU94020467A (en) | 1996-11-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3364537B2 (en) | Non-competitive binding assay | |
| Wisdom | Enzyme-immunoassay. | |
| US4925788A (en) | Immunoassay system and procedure based on precipitin-like interaction between immune complex and Clq or other non-immunospecific factor | |
| JP3749263B2 (en) | Immunoassay for detecting antiphospholipid antibodies | |
| US4943525A (en) | Simultaneous immunoassay for the determination of antigens and antibodies | |
| US4292403A (en) | Detection and/or determination of IgM, IgA, IgD and IgE immunoglobulins | |
| US7125517B2 (en) | Systems and methods for detection of analytes in biological fluids | |
| US4828985A (en) | Antibodies against the complex of a small molecule and its binding protein, their preparation and their use in diagnostic methods | |
| EP0303110A2 (en) | Immunodiagnostic device and method | |
| US4894347A (en) | Erythrocyte agglutination assay | |
| JPH0239747B2 (en) | ||
| JP2642342B2 (en) | Solid phase diffusion test method | |
| CA2172247A1 (en) | Method of assaying oxidized lipoprotein and application thereof | |
| WO1986004683A1 (en) | Determination of clinical parameters by enzyme immunoprocess | |
| US4837145A (en) | Layered immunoassay using antibodies bound to transport particles to determine the presence of an antigen | |
| HK1000970B (en) | Solid phase diffusion assay | |
| CA1148858A (en) | Determination of immunoglobulins | |
| US6225043B1 (en) | Separation and analysis | |
| RU2124731C1 (en) | Method of immunoenzymatic analysis of antibodies raised to chemical carcinogens of polycyclic aromatic hydrocarbon group | |
| EP0166583A2 (en) | Compositions for enzyme immunoassay of prostaglandins | |
| CN110780066A (en) | Test strip for immunochromatography for detecting object in sample containing red blood cells, and immunochromatography using same | |
| EP0303980A2 (en) | Carrier coated with antigen or antibody | |
| JP2000214165A (en) | Homogeneous system enzyme immunity analyzing method | |
| Van der Sluis et al. | The relevance of various tests for the study of specificity in immunocytochemical staining: a review | |
| JP2657672B2 (en) | Ultrasensitive specific antibody assay |