RU2124726C1

RU2124726C1 - Method for carrying out antigen immunoassay in biological fluids

Info

Publication number: RU2124726C1
Application number: RU95100426A
Authority: RU
Inventors: Андрей Николаевич Глушков; Татьяна Петровна Аносова; Михаил Петрович Аносов; Надежда Григорьевна Небесная
Original assignee: Андрей Николаевич Глушков; Татьяна Петровна Аносова; Михаил Петрович Аносов; Надежда Григорьевна Небесная
Priority date: 1995-01-11
Filing date: 1995-01-11
Publication date: 1999-01-10
Also published as: RU95100426A

Abstract

FIELD: medicine. SUBSTANCE: method involves treating the biological fluid with polyethylene glycole-6000 before introducing it into analysis test system containing antibodies specific with respect to the antigen to be detected. Immune complexes containing antigen sought for and autologic antibodies are separated from the system in this way. Circulating redundant autologic antibodies are removed. Resuspension of sedimented immune complexes being done in initial volume, the complexes are subjected to dissociation and the antigen becomes easily accessible for antibodies included in the analysis test system. EFFECT: simplified and accurate diagnosis method.

Description

Аналогами заявляемого изобретения являются твердофазные иммуноферментные методы гетерогенного анализа антигенов, включающие в себя:
1) адсорбцию первый антител, специфичных к искомому антигену, на твердой фазе (стенки лунок пластиковых планшетов, шариков, бусинок и т.п.);
2) инкубацию исследуемой биологической жидкости (например, сыворотки крови) с адсорбированными антителами;
3) выявление антигена, связавшегося с адсорбированным антителами, с помощью вторых антител, специфичных к искомому антигену и меченых ферментов (Иммуноферментный анализ. Под ред. Т.Т. Нго, Г. Ленхоффа, М. Мир, 1988, 644 с.).Analogs of the claimed invention are enzyme-linked immunosorbent assays of heterogeneous analysis of antigens, including:
1) the adsorption of the first antibodies specific to the desired antigen on the solid phase (the walls of the holes of plastic tablets, balls, beads, etc.);
2) incubation of the studied biological fluid (for example, blood serum) with adsorbed antibodies;
3) detection of antigen bound to adsorbed antibodies using second antibodies specific for the desired antigen and labeled enzymes (Enzyme-linked immunosorbent assay. Edited by T. T. Ngo, G. Lenhoff, M. Mir, 1988, 644 pp.).

Прототип заявляемого изобретения
является общепринятый метод иммуноферментного анализа опухолевых антигенов (маркеров). В качестве первых антител (адсорбированных на твердой фазе) и вторых антител (меченых ферментов) используются моноклональные антитела, специфичные к тому или иному антигену, ассоциированному с опухолью. Разные фирмы-изтоговители используют различные моноклональные антитела, специфичные к тем или иным антигенам, ассоциированными с опухолями. Мы использовали метод иммуноанализа антигена, ассоциированного с раком молочной железы (ВСА), разработанный фирмой "Диагнотех" (г. Москва).The prototype of the claimed invention
is a common method for enzyme immunoassay of tumor antigens (markers). Monoclonal antibodies specific for a particular antigen associated with a tumor are used as the first antibodies (adsorbed on the solid phase) and the second antibodies (labeled enzymes). Different manufacturer companies use different monoclonal antibodies specific for particular antigens associated with tumors. We used the method of immunoassay of antigen associated with breast cancer (ICA), developed by the company "Diagnostech" (Moscow).

Признаками прототипа, совпадающими с существенными признаками заявляемого изобретения,
являются: 1) использование антител, специфичных к ВСА, адсорбированных на твердой фазе; 2) инкубация материала, содержащего ВСА, с адсорбированными антителами, с помощью вторых антител, специфичных к ВСА и меченных пероксидазой хрена.The signs of the prototype, coinciding with the essential features of the claimed invention,
are: 1) the use of antibodies specific for the ICA adsorbed on the solid phase; 2) incubation of the BCA-containing material with adsorbed antibodies using second antibodies specific for the ICA and labeled with horseradish peroxidase.

Недостатком прототипа
является возможность получения ложноотрицательного или заниженного результата. Количество опухолевого маркера, определенное с помощью прототипа, не всегда совпадает с истинным содержанием маркера в биологической жидкости. Главным ограничивающим фактором является наличие в крови (или другой биологической жидкости) пациента антител, специфичных к исследуемым антигенам (в том числе к опухолевым маркерам). Не касаясь причин наличия антител в биологической жидкости, отметим, что собственные антитела способны связываться с отдельными эпитопами исследуемого антигена. Т.е., собственные антитела способны конкурировать за связывание с искомым антигеном с первым (адсорбированными на твердой фазе) и вторыми (меченными ферментом) антителами, входящими в состав аналитических антител.The prototype disadvantage
is the possibility of obtaining a false negative or understated result. The amount of the tumor marker, determined using the prototype, does not always coincide with the true content of the marker in the biological fluid. The main limiting factor is the presence in the patient’s blood (or other biological fluid) of antibodies specific for the antigens studied (including tumor markers). Not touching on the reasons for the presence of antibodies in biological fluid, we note that native antibodies are able to bind to individual epitopes of the studied antigen. That is, their own antibodies are able to compete for binding to the desired antigen with the first (adsorbed on the solid phase) and second (labeled with the enzyme) antibodies that make up the analytical antibodies.

Если собственных антител пациента имеется значительное количество и все эпитопы на молекулах антигена "замаскированы" ими, то антигены становятся недоступными для антитела, используемых в аналитической тест-системе. В этом случае результат, полученный с помощью прототипа и других антигенов, будет ложно отрицательным. Если "замаскирована" только часть эпитопов, то результат будет заниженным. И в первом, и во втором случаях полученные результаты неверно отражают истинное содержание антигена в исследуемой жидкости, что приводит к диагностическим ошибкам. If there is a significant amount of the patient’s own antibodies and all epitopes on the antigen molecules are “masked” by them, then the antigens become inaccessible to the antibodies used in the analytical test system. In this case, the result obtained using the prototype and other antigens will be false negative. If only part of the epitopes is “masked”, then the result will be underestimated. In both the first and second cases, the results obtained incorrectly reflect the true antigen content in the test fluid, which leads to diagnostic errors.

Заявляемое изобретение направлено на решение следующей задачи - уменьшение количества ложноотрицательных и заниженных результатов иммуноанализа антигенов в биологических жидкостях. The invention is aimed at solving the following problem - reducing the number of false negative and underestimated results of immunoassay of antigens in biological fluids.

Предлагается следующее техническое решение поставленной задачи. Перед инкубацией биологической жидкости с антителами, адсорбированными на твердой фазе, специфичными с искомому антигену, образец исследуемой жидкости обрабатывается раствором полиэтиленглоколя - 6000 (ПЭГ) по методу, описанному L. Hudson, F. Hay (Practical Immunology, Blackwell Scientific Publications, 1980, Second Edition, p. 227 - 228). Обработка ПЭГ приводит с осаждению иммунных комплексов, содержащих циркулирующий антиген, связанный с антителами. Избыток циркулирующих антител удаляется с надосадочной жидкостью. Ресуспендирование осадка в исходном объеме приводит к диссоциации комплексов антиген-антитело по законам термодинамики (Иммунология. Под ред. У. Пола. М.: Мир, 1989, т. 3, с. 5 - 89). В этом случае антиген становится более доступным антителам, входящим в состав аналитических тест-систем. Это подтвердили полученные нами данные. The following technical solution to the problem is proposed. Before incubation of a biological fluid with antibodies adsorbed on a solid phase specific for the desired antigen, a sample of the test fluid is treated with a solution of polyethylene glycol 6000 (PEG) according to the method described by L. Hudson, F. Hay (Practical Immunology, Blackwell Scientific Publications, 1980, Second Edition, p. 227 - 228). PEG treatment results in precipitation of immune complexes containing a circulating antigen associated with antibodies. Excess circulating antibodies are removed with the supernatant. Resuspension of the precipitate in the initial volume leads to the dissociation of antigen-antibody complexes according to the laws of thermodynamics (Immunology. Ed. By W. Paul. M .: Mir, 1989, v. 3, p. 5 - 89). In this case, the antigen becomes more accessible to antibodies that are part of the analytical test systems. This was confirmed by our data.

Образцы сыворотки больных раком молочной железы обрабатывали раствором ПЭГ по следующей схеме. К 0,9 мл сыворотки добавляли 0,1 мл 20% ПЭГ-6000 в вероналовом буферном растворе с добавлением ЭДТА и перемешивали полученную смесь. После инкубации при 4^oC в течение ночи центрифугировали смесь при 3000 g и 4^oC в течение 20 мин. Недосадочную жидкость удаляли, осадок ресуспендировали 2%-ным раствором ПЭГ в том же буферном растворе, центрифугировали в тех же условиях и вновь удаляли надосадочную жидкость. Осадок ресуспендировали в фосфатном буферном растворе в исходном объеме (0,9 мл).Serum samples of patients with breast cancer were treated with a PEG solution according to the following scheme. To 0.9 ml of serum, 0.1 ml of 20% PEG-6000 was added in a veronal buffer solution with the addition of EDTA and the resulting mixture was stirred. After incubation at 4 ^° C. overnight, the mixture was centrifuged at 3,000 g and 4 ^° C. for 20 minutes. The non-supernatant was removed, the pellet was resuspended in a 2% PEG solution in the same buffer solution, centrifuged under the same conditions and the supernatant was again removed. The pellet was resuspended in phosphate buffered saline in the initial volume (0.9 ml).

Образцы сыворотки крови, необработанные ПЭГ, одновременно исследовали на содержание антигена, ассоциированного с раком молочной железы (Breast Cancer Antigen - BCA) с помощью аналитических иммуноферментных тест-систем фирмы "Диагнотех" (г. Москва) в полном соответствии с рекомендациями фирмы. Serum samples, untreated PEG, were simultaneously tested for the content of antigen associated with breast cancer (Breast Cancer Antigen - BCA) using the enzyme-linked immunosorbent assay systems of the company "Diagnostekh" (Moscow) in full accordance with the recommendations of the company.

У 12% больных анализ ВСА по прототипу не выявил искомого антигена в сыворотке. Использование заявляемого метода позволило выявить искомый антиген в 97% случае. Таким образом, использование заявляемого метода позволило выявить 10% ложноотрицательных результатов, т.е. уменьшить количество ложноотрицательных случаев в 4 раза. Кроме того, в 80% случаев результаты, полученные по прототипу, оказались ниже, чем при использовании заявляемого метода. In 12% of patients, the ICA prototype analysis did not reveal the desired serum antigen. Using the proposed method allowed to identify the desired antigen in 97% of cases. Thus, the use of the proposed method allowed us to identify 10% of false negative results, i.e. reduce the number of false-negative cases by 4 times. In addition, in 80% of cases, the results obtained by the prototype were lower than when using the inventive method.

Claims

A method for immunoassay of antigens in biological fluid, comprising incubating the test sample with antibodies specific for the desired antigen, and determining after removing excess antibody, characterized in that the serum of patients with cancer and precancerous diseases is taken as the test sample, with PEG-6000 being sedimented at 3000g in the ratio with the sample 1: 9 and resuspend the precipitate in the initial volume of the sample.