RU2120303C1

RU2120303C1 - Method of preparing immunoglobulins used for treatment of carnivorous animals with plague, or parvoviral enteritis, or adenoviral hepatitis

Info

Publication number: RU2120303C1
Application number: RU94014835A
Authority: RU
Inventors: Александр Михайлович Шестопалов; Анатолий Петрович Константинов; Александр Гаврилович Дурыманов
Original assignee: Александр Михайлович Шестопалов; Анатолий Петрович Константинов; Александр Гаврилович Дурыманов
Priority date: 1994-04-21
Filing date: 1994-04-21
Publication date: 1998-10-20
Also published as: RU94014835A

Abstract

FIELD: veterinary virology. SUBSTANCE: method involves immunization of donor-animals (sheep, goats) firstly with cultural viral antigen by subcutaneous route with noncomplete and complete Freund's adjuvant and then with antigen no containing Freund's adjuvant at a single dose at all immunization stages (10: 25) ml and at antigen titer 5 lg LD₅₀,, not less. Blood samples are taken from donors at regular intervals at blood antibody titer 2.5 lg, not less, in reaction of biological neutralization for plague viruses or carnivorous adenoviral hepatitis and at 1:512, not less, in suppression hemagglutination reaction for parvoviral enteritis. Then animals are subjected for the periodical repeated vaccination at the same titer and dose of antigen but without Freund's antigen. Immunoglobulins are isolated by precipitation with salts followed by purification using the preparative chromatography method. EFFECT: increased yield of the highly purified immunoglobulins, enhanced specificity and activity of immunoglobulins. 1 tbl, 5 ex

Description

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и иммунологии и может быть использовано при получении лечебно-профилактических иммуноглобулинов против чумы, или парвовирусного энтерита, или аденовирусного гепатита плотоядных. The invention relates to the field of veterinary virology and immunology and can be used to obtain therapeutic and prophylactic immunoglobulins against plague, or parvovirus enteritis, or carnivorous adenovirus hepatitis.

Известен способ получения лечебно-профилактических иммуноглобулинов против столбняка, энцефаломиелита и ринопневмонии (пат. США 4911910, МКИ A 61 K 39/395, 39/40, C 07 K 15/06, опубл. 27.03.90) [1]б включающий иммунизацию животных-доноров вирусными антигенами. В качестве животных-доноров используют лошадей. Забор крови у доноров осуществляют периодически с последующим выделением иммуноглобулинов и их очисткой. Препарат вводят жеребятам в лечебно-профилактических целях против гриппа, столбняка, энцефаломиелита и ринопневмонии лошадей. A known method of obtaining therapeutic and prophylactic immunoglobulins against tetanus, encephalomyelitis and rhinopneumonia (US Pat. US 4911910, MKI A 61 K 39/395, 39/40, C 07 K 15/06, publ. 27.03.90) [1] b including immunization animal donors with viral antigens. Horses are used as animal donors. Blood sampling from donors is carried out periodically with subsequent isolation of immunoglobulins and their purification. The drug is administered to foals for therapeutic and preventive purposes against influenza, tetanus, encephalomyelitis and equine rhinopneumonia.

Однако полученные иммуноглобулины не имеют специфических антител к вирусам чумы, парвовирусного энтерита и вирусного гепатита плотоядных. Кроме того, лошади, используемые в качестве доноров, требуют больших затрат при их содержании, неудобны при вакцинации и заборе крови. However, the resulting immunoglobulins do not have specific antibodies to plague viruses, parvovirus enteritis and carnivorous hepatitis viruses. In addition, horses used as donors are expensive to maintain and inconvenient in vaccination and blood sampling.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) является способ получения лечебных иммуноглобулинов против парвовирусного энтерита собак (авт. свид. СССР 1369287, C 12 N 7/00, заявл. 29.05.86) [2] Способ включает иммунизацию животных-доноров путем введения в их организм внутривенно штамма "Дан" культуральный парвовирусный энтерит собак. В качестве животных-доноров используют кроликов. После истечения двух недель после последнего введения вируса проводят обескровливание кроликов и из этой крови готовят гипериммунную сыворотку, содержащую специфические иммуноглобулины против парвовируса собак. Однако полученный препарат обладает недостаточной активностью и высокой реактогенностью, т. е. не имеет достаточной степени очистки от белков. Кроме того, использование кроликов в качестве доноров для получения большого количества иммуноглобулинов экономически не целесообразно вследствие одноразового использования, т.е. полного обескровливания после первой же иммунизации, приводящей к умерщвлению этих животных. The closest technical solution (prototype) is a method for producing therapeutic immunoglobulins against parvovirus enteritis in dogs (ed. Certificate of the USSR 1369287, C 12 N 7/00, application. 29.05.86) [2] The method includes immunization of animal donors by introducing them into organism intravenous strain "Dan" is a cultural parvovirus enteritis of dogs. As animal donors, rabbits are used. After two weeks have passed since the last virus injection, rabbits are bled and a hyperimmune serum containing specific immunoglobulins against dog parvovirus is prepared from this blood. However, the resulting preparation has insufficient activity and high reactogenicity, i.e., it does not have a sufficient degree of protein purification. In addition, the use of rabbits as donors to obtain a large number of immunoglobulins is not economically feasible due to a single use, i.e. complete bleeding after the first immunization, leading to the killing of these animals.

Задачей предлагаемого технического решения является получение в больших объемах высокоочищенных иммуноглобулинов для лечения чумы, или парвовирусного энтерита, или аденовирусного гепатита плотоядных, обладающих высокой специфичностью и активностью. The objective of the proposed technical solution is to obtain in large volumes of highly purified immunoglobulins for the treatment of plague, or parvovirus enteritis, or carnivorous adenovirus hepatitis with high specificity and activity.

Поставленная задача решается тем, что способ включает иммунизацию животных-доноров путем введения в их организм культурального вирусного антигена. В качестве животных-доноров используют овец или коз. Иммунизацию вирусным антигеном проводят вначале подкожно с неполным и полным адъювантом Фрейнда, а затем без адъюванта Фрейнда. Разовая доза на всех этапах иммунизации составляет (10 - 20) мл с титром антигена не ниже 5 lg LD₅₀. Забор крови у животных осуществляют периодически после достижения титра антител в крови не менее 2,5 lg в реакции биологической нейтрализации для вирусов чумы или аденовирусного гепатита плотоядных и не менее 1 : 512 в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) для парвовирусного энтерита плотоядных. Животных периодически ревакцинируют с тем же титром и дозой антигена без адъюванта Фрейнда. Иммуноглобулины выделяют осаждением их солями с последующей очисткой препаративной хроматографией.The problem is solved in that the method includes the immunization of animal donors by introducing into their body a cultural viral antigen. Sheep or goats are used as animal donors. Immunization with a viral antigen is carried out initially subcutaneously with incomplete and complete Freund's adjuvant, and then without Freund's adjuvant. A single dose at all stages of immunization is (10 - 20) ml with an antigen titer of at least 5 lg LD ₅₀ . Blood sampling in animals is carried out periodically after reaching a blood antibody titer of at least 2.5 lg in the biological neutralization reaction for plague viruses or carnivorous adenovirus hepatitis and at least 1: 512 in the hemagglutination inhibition test (RTHA) for carvivorous parvovirus enteritis. Animals are periodically revaccinated with the same titer and dose of antigen without Freund's adjuvant. Immunoglobulins are isolated by precipitation with salts, followed by purification by preparative chromatography.

Использование в качестве животных-доноров овец или коз позволяет получать сыворотки с высоким содержанием лечебных иммуноглобулинов, т.к. указанные животные обладают повышенной реактивностью к антигенам чумы, парвовирусного энтерита и аденовирусного гепатита плотоядных. Кроме того овцы и козы более удобны в содержании и при заборе крови по сравнению с волами или лошадьми [1] и позволяют по сравнению с кроликами-донорами [2] многократный забор крови в больших количествах. Предлагаемая схема иммунизации с подкожным введением доз антигена с неполным и полным адъювантами Фрейнда позволяет повысить разовую дозу вводимого антигена с одновременным снижением его токсичности и реактогенности. При снижении разовой дозы менее 10 мл и титра антигена ниже 5 lg LD₅₀ значительно снижается эффективность иммунизации и выход иммуноглобулинов. Увеличение дозы вводимого антигена более 25 мл приводит к ухудшению состояния организма донора при незначительном увеличении титра антител. Доза антигена 20 мл является оптимальной. Забор крови у животных экономически не целесообразен, если титр антител в этой крови менее 2,5 lg в реакции биологической нейтрализации для вирусов чумы и аденовирусного гепатита плотоядных и титр антител менее 1 : 512 в РТГА для парвовирусного энтерита плотоядных.The use of sheep or goats as animal donors allows obtaining serums with a high content of therapeutic immunoglobulins, as these animals have increased reactivity to plague antigens, parvovirus enteritis and carnivorous adenovirus hepatitis. In addition, sheep and goats are more convenient in keeping and taking blood compared to oxen or horses [1] and allow multiple blood sampling in large quantities compared to donor rabbits [2]. The proposed immunization schedule with subcutaneous administration of doses of antigen with incomplete and complete Freund's adjuvants allows to increase a single dose of the administered antigen while reducing its toxicity and reactogenicity. With a decrease in a single dose of less than 10 ml and an antigen titer below 5 lg LD _50, immunization efficiency and immunoglobulin yield are significantly reduced. An increase in the dose of introduced antigen of more than 25 ml leads to a deterioration in the condition of the donor organism with a slight increase in antibody titer. A dose of 20 ml of antigen is optimal. Blood sampling in animals is not economically feasible if the antibody titer in this blood is less than 2.5 lg in the biological neutralization reaction for plague viruses and carnivorous adenovirus hepatitis and the antibody titer is less than 1: 512 in RTGA for carvivorous parvovirus enteritis.

Способ получения лечебных иммуноглобулинов осуществляют следующим образом. The method of obtaining therapeutic immunoglobulins is as follows.

Пример 1. Животных-доноров, которыми являются здоровые овцы или козы, иммунизируют вирусным антигеном чумы плотоядных, приготовленным из крови или слизистых выделений больных животных. Схема иммунизации следующая. Первую вакцинацию проводят подкожно дозой антигена объемом 20 мл и титром антигена 5 lg LD₅₀ с неполным адъювантом Фрейнда (1 : 1). Вторую вакцинацию проводят через 2 недели при подкожном введении антигена с полным адъювантом Фрейнда (1 : 1). Объем дозы и титр антигена те же. Третью вакцинацию проводят через 2 недели с внутримышечным введением антигена без адъюванта Фрейнда. Через две недели после третьей прививки у животных-доноров формируется грундиммунитет, который характеризуется наличием специфических антител. Для вируса чумы плотоядных титр антител в крови проверяется на чувствительных животных-хорьках. Если титр антител в крови животных-доноров равен или более 2,5 lg в реакции биологической нейтрализации, то приступают к забору крови у животных объемом от 0,5 до 1 литра. Забор крови осуществляют периодически, как правило, через 1 месяц. Через 2 недели после забора крови проводят ревакцинацию животных-доноров с дозой антигена 20 мл и титром антигена 5 lg LD₅₀ без адъюванта Фрейнда. Ревакцинацию осуществляют также периодически через 1 месяц. Далее кровь центрифугируют и получают гипериммунную сыворотку. Иммуноглобулины осаждают 20%-ным сульфатом аммония с последующей их очисткой препаративной хроматографией на сефадексе G-100. За счет разбавления при хроматографической очистке объем препарата увеличивается в 1,5 раза. Чистота выхода продукта 97%, что позволяет его использовать не только для внутримышечного, но и для внутривенного введения, что ускоряет процесс лечения заболевших животных.Example 1. Animal donors, which are healthy sheep or goats, are immunized with the carnivore plague virus antigen prepared from the blood or mucous secretions of sick animals. The immunization schedule is as follows. The first vaccination is carried out subcutaneously with a dose of 20 ml antigen and an antigen titer of 5 lg LD ₅₀ with incomplete Freund's adjuvant (1: 1). The second vaccination is carried out after 2 weeks with subcutaneous administration of antigen with complete Freund's adjuvant (1: 1). The dose volume and antigen titer are the same. The third vaccination is carried out after 2 weeks with intramuscular injection of antigen without Freund's adjuvant. Two weeks after the third vaccination, animal donors form a grossimmunity, which is characterized by the presence of specific antibodies. For the plague virus of carnivores, the antibody titer in the blood is tested on sensitive ferret animals. If the titer of antibodies in the blood of animal donors is equal to or more than 2.5 lg in the biological neutralization reaction, then they begin to collect blood from animals with a volume of 0.5 to 1 liter. Blood sampling is carried out periodically, usually after 1 month. 2 weeks after blood sampling, donor animals are revaccinated with a 20 ml antigen dose and 5 lg LD ₅₀ antigen titer without Freund's adjuvant. Revaccination is also carried out periodically after 1 month. Then the blood is centrifuged and hyperimmune serum is obtained. Immunoglobulins are precipitated with 20% ammonium sulfate, followed by purification by preparative chromatography on Sephadex G-100. Due to dilution during chromatographic purification, the volume of the drug increases by 1.5 times. The purity of the product yield is 97%, which allows it to be used not only for intramuscular, but also for intravenous administration, which accelerates the treatment of diseased animals.

Пример 2. Для получения лечебных иммуноглобулинов против аденовирусного гепатита плотоядных животных-доноров иммунизируют также, как в примере 1. Титр антител в крови доноров (овец или коз) проверяют на чувствительных животных-щенках собак (до 5 мес.) или песцов. Периодический забор крови проводят после достижения титра антител в крови животных-доноров не менее 2,5 lg в реакции биологической нейтрализации, очистку иммуноглобулинов осуществляют так же, как в примере 1. Example 2. To obtain therapeutic immunoglobulins against adenoviral hepatitis, carnivorous donor animals are immunized as in Example 1. The antibody titer in the blood of donors (sheep or goats) is tested on sensitive dog puppies (up to 5 months) or Arctic foxes. Periodic blood sampling is carried out after reaching a titer of antibodies in the blood of animal donors of at least 2.5 lg in the biological neutralization reaction, purification of immunoglobulins is carried out in the same way as in example 1.

Пример 3. Для получения лечебных иммуноглобулинов против парвовирусного энтерита плотоядных схему иммунизации проводят так же, как в примере 1. Титр антител в крови животных-доноров (овец или коз) проверяют по РТГА с эритроцитами свиньи. Периодический забор крови после достижения титра антител в крови животных-доноров не менее 1 : 512 в реакции торможения гемагглютинации. Очистку иммуноглобулинов осуществляют так же, как в примере 1. Example 3. To obtain therapeutic immunoglobulins against parvovirus enteritis carnivores, the immunization schedule is carried out in the same way as in example 1. The antibody titer in the blood of animal donors (sheep or goats) is checked for RTGA with pig red blood cells. Periodic blood sampling after reaching an antibody titer in the blood of animal donors of at least 1: 512 in the hemagglutination inhibition reaction. Purification of immunoglobulins is carried out as in example 1.

Пример 4. Свойства полученных иммуноглобулинов против чумы, парвовирусного энтерита и аденовирусного гепатита излучались на мышах. Препараты вводились мышам объемом 1 - 3 мл. Результаты исследований приведены в таблице. Из таблицы видно, что препараты нетоксичны, обладают высокой активностью и низкой реактогенностью, что соответствует ТУ-10.07.04.92 и ТУ-10.07.03.92. В процессе препаративной хроматографии объем препарата увеличивается в 1,5 раза с сохранением его активности. По сравнению с прототипом предлагаемые лечебные препараты обладают пониженной реактогенностью. В прототипе одновременно с гипериммунной сывороткой вводят антигистаминные препараты, чтобы уменьшить реакцию организма на неочищенный препарат. Example 4. The properties of the obtained immunoglobulins against plague, parvovirus enteritis and adenovirus hepatitis were radiated in mice. Drugs were administered to mice with a volume of 1-3 ml. The research results are shown in the table. The table shows that the drugs are non-toxic, have high activity and low reactogenicity, which corresponds to TU-10.07.04.92 and TU-10.07.03.92. In the process of preparative chromatography, the volume of the drug increases by 1.5 times while maintaining its activity. Compared with the prototype, the proposed medicinal products have reduced reactogenicity. In the prototype, antihistamines are administered simultaneously with hyperimmune serum to reduce the body's response to the crude drug.

Пример 5. Предлагаемые препараты против чумы ("Иммуночум"), или парвовирусного энтерита ("Иммунопарв"), или аденовирусного гепатита ("Иммуногепс") являются моноспецифическими очищенными иммуноглобулинами, которые наиболее выгодно применять при точно диагностированном заболевании. Example 5. The proposed drugs against plague ("Immunochum"), or parvovirus enteritis ("Immunoparv"), or adenovirus hepatitis ("Immunogeps") are monospecific purified immunoglobulins, which are most advantageous for use in accurately diagnosed disease.

Препарат "Иммуночум" успешно применяется при ликвидации чумы плотоядных на песцовой звероферме МП "Прогресс" г. Армавира Краснодарского края в сентябре - октябре 1993 г. Серологически (методами РГА и РТГА) был исключен парвовирусный энтерит плотоядных. На основании клинических и патоморфологических признаков был поставлен диагноз - чума плотоядных. С таким диагнозом пало 5 песцов. Для предотвращения дальнейшего развития эпизоотии на ферме было проведено однократное внутримышечное введение всему поголовью песцов лечебной дозы препарата "Иммуночум" с титром в реакции нейтрализации 3 lg. После однократного введения "Иммуночума" наблюдалось прекращение падежа животных, хотя непродолжительное время отмечались пониженный аппетит и вялость у некоторых песцов. Это позволяет рекомендовать использование данного препарата в качестве лечебного для борьбы с чумой плотоядных при промышленном и индивидуальном содержании ценных пушных зверей. The preparation "Immunochum" is successfully used in the elimination of carnivore plague at the Arctic fox farm "Progress" in Armavir, Krasnodar Territory in September - October 1993. Parvovirus enteritis of carnivores was excluded serologically (by the methods of RGA and RTGA). On the basis of clinical and pathomorphological signs, the diagnosis was made - carnivore plague. With this diagnosis, 5 Arctic foxes fell. To prevent the further development of epizootics on the farm, a single intramuscular injection of a therapeutic dose of the Immunochum drug with a titer in the neutralization reaction of 3 lg was administered to the entire Arctic fox population. After a single administration of Immunochum, the death of animals was observed, although a short appetite and lethargy were noted in some Arctic foxes. This allows us to recommend the use of this drug as a treatment for the fight against plague of carnivores in the industrial and individual keeping of valuable fur animals.

В течение трех месяцев 1993 г. в Новосибирском опытном охотничьем хозяйстве, занимающемся разведением Западно-Сибирской лайки (пос. Кубовая, Новосибирская обл. ), наблюдалась эпизоотия парвовирусного энтерита, диагноз которого был поставлен на основании клинической картины и патологоанатомически при вскрытии. Позднее диагноз был подтвержден серологическими методами. Щенкам всех лаек в питомнике внутримышечно, двукратно с интервалом 12 часов были введены лечебные иммуноглобулины "Иммунопарв" с титром в РТГА 1 : 512. Параллельно проводилась ревакцинация всего взрослого поголовья лаек в питомнике против парвовирусного энтерита. Такое использование препарата "Иммунопарв" дало положительный результат: в течение месяца смертность щенков-отъемышей снизилась с 95% до 5 - 7%. Последующее наблюдение в течение 8 месяцев показало, что в некоторых пометах встречались спорадические случаи парвовирусного энтерита, но своевременным использованием предлагаемого препарата их удавалось быстро локализовать и лечить. Данные результаты позволяют рекомендовать аналогичную схему лечения в питомниках собак, на лисьих, песцовых и норочьих фермах. For three months of 1993, an epizootic parvovirus enteritis was diagnosed in the Novosibirsk experimental hunting farm engaged in breeding West Siberian huskies (the village of Kubovaya, Novosibirsk Region), the diagnosis of which was made on the basis of the clinical picture and pathological anatomy. The diagnosis was later confirmed by serological methods. Puppies of all huskies in the kennel were injected intramuscularly, twice with an interval of 12 hours, with the Immunoparv therapeutic immunoglobulins with a titer in RTGA of 1: 512. In parallel, revaccination of the entire adult population of huskies in the kennel against parvovirus enteritis was carried out. Such use of the Immunoparv preparation gave a positive result: within a month, the mortality of weaned puppies decreased from 95% to 5-7%. Subsequent observation over 8 months showed that in some litters there were sporadic cases of parvovirus enteritis, but the timely use of the proposed drug was able to quickly localize and treat. These results allow us to recommend a similar treatment regimen in dog kennels, on foxes, arctic foxes and burrowing farms.

Промышленная применимость. Изобретение может быть использовано в ветеринарии и иммунологии. Industrial applicability. The invention can be used in veterinary medicine and immunology.

Claims

A method of producing immunoglobulins for the treatment of plague, or parvovirus enteritis, or carnivorous adenovirus hepatitis, comprising immunizing animal donors by introducing into their body a cultural viral antigen with a frequency and number of doses sufficient to produce specific antibodies in the blood of animals, after which blood is sampled with subsequent isolation of specific immunoglobulins from it, characterized in that sheep or goats are used as animal donors, immunization with a viral antigen, etc. first bred subcutaneously with incomplete and complete Freund's adjuvant, and then without Freund's adjuvant with a single dose at all stages of immunization (10 - 25) ml and an antigen titer of at least 5 lg LD ₅₀ , blood sampling in animals is carried out periodically after reaching the antibody titer in the blood not less than 2.5 lg in the biological neutralization reaction for plague viruses or carnivorous adenovirus hepatitis and not less than 1: 512 in the hemagglutination inhibition reaction for parvovirus enteritis followed by periodic revaccination of animals with the same titer and dose of antigen Freund's adjuvant, wherein the immunoglobulin is recovered by precipitation of the salts, followed by purification by preparative chromatography.