RU2117045C1 - Method of assay of mycobacterial beta-lactamase activity - Google Patents
Method of assay of mycobacterial beta-lactamase activity Download PDFInfo
- Publication number
- RU2117045C1 RU2117045C1 SU5036158A RU2117045C1 RU 2117045 C1 RU2117045 C1 RU 2117045C1 SU 5036158 A SU5036158 A SU 5036158A RU 2117045 C1 RU2117045 C1 RU 2117045C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- beta
- lactamase
- antibiotic
- mycobacterial
- test
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к биохимическим исследованиям в микробиологии, и может быть использовано в научных исследованиях и практической медицине для изучения микобактериальных ферментов. The invention relates to medicine, namely to biochemical studies in microbiology, and can be used in scientific research and practical medicine to study mycobacterial enzymes.
С целью повышения эффективности химиотерапии туберкулеза и микобактериоза все шире используют нестандартные антибактериальные препараты. Однако микобактерии проявляют высокую устойчивость к антибиотикам пенициллинового и цефалоспоринового ряда. В основе устойчивости микобактерий к данным антибиотикам лежит продукция специфических ферментов - бета-лактамаз, гидролизующих бета-лактамное кольцо пенициллинов и цефалоспоринов, с образованием лишенных антибактериальной активности продуктов. Открытие ряда препаратов - ингибиторов бета-лактамазы - представляет возможность применения пенициллинов и цефалоспоринов при лечении туберкулеза и микобактериоза. Вместе с тем существуют и другие факторы устойчивости к бета-лактамным антибиотикам, не связанные с продукцией микобактериальных бета-лактамаз. Поэтому применение ингибиторов бета-лактамазы в клинике требует индивидуального подхода к возбудителю. Микобактерии, выделенные у больного туберкулезом или микобактериозом, необходимо проверить на наличие фермента бета-лактамазы и возможность его ингибирования с помощью ингибитора бета-лактамазы. In order to increase the effectiveness of chemotherapy for tuberculosis and mycobacteriosis, non-standard antibacterial drugs are increasingly being used. However, mycobacteria show high resistance to antibiotics of the penicillin and cephalosporin series. The basis of the resistance of mycobacteria to these antibiotics is the production of specific enzymes - beta-lactamases, hydrolyzing the beta-lactam ring of penicillins and cephalosporins, with the formation of products devoid of antibacterial activity. The discovery of a number of drugs - beta-lactamase inhibitors - presents the possibility of using penicillins and cephalosporins in the treatment of tuberculosis and mycobacteriosis. At the same time, there are other factors of resistance to beta-lactam antibiotics that are not associated with the production of mycobacterial beta-lactamases. Therefore, the use of beta-lactamase inhibitors in the clinic requires an individual approach to the pathogen. Mycobacteria isolated from a patient with tuberculosis or mycobacteriosis should be checked for the presence of the beta-lactamase enzyme and the possibility of its inhibition using a beta-lactamase inhibitor.
Существуют различные способы определения бета-лактамазы: микробиологический, потенциометрический, иодометрический, гидроксиламинный - в зависимости от характера исследуемого материала, типа и чистоты фермента. Известные способы определения бета-лактамазы либо не учитывают бактериологические и биохимические особенности рода микобактерий, либо требуют применения сложной аппаратуры и высококачественных реактивов. Микробиологический способ определения бета-лактамазы следует признать наиболее простым в техническом отношении при получении достоверных и воспроизводимых результатов исследования. There are various methods for determining beta-lactamase: microbiological, potentiometric, iodometric, hydroxylamine - depending on the nature of the test material, the type and purity of the enzyme. Known methods for determining beta-lactamase either do not take into account the bacteriological and biochemical characteristics of the genus Mycobacteria, or require the use of sophisticated equipment and high-quality reagents. The microbiological method for determining beta-lactamase should be recognized as the most technically simple when obtaining reliable and reproducible research results.
В основе микробиологического способа Lee, Komarmy [1] определения бета-лактамазы грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов лежит возможность микробной популяции инактивировать антибиотик, заключенный в диске. Стандартные диски с пенициллином помещают в 1 мл бульонной суспензии испытуемых бактерий. Пробирки с суспензией инкубируют 1 ч при 37oC. После этого диски вынимают и помещают на мембранные фильтры, которые накладывают на поверхность агара, засеянного тест-культурой. Антибиотик диффундирует в агар в течение получаса при 37oC, далее диски и фильтры удаляют, а чашки с агаром инкубируют до появления отчетливого роста тест-штамма. Достоинством метода является техническая простота исполнения, быстрота и наглядность полученных результатов. В то же время для определения микобактериальной бета-лактамазы способ Lee, Komarmy никем не применялся, так как род микобактерий характеризуется значительными отличиями культуральных и биохимических свойств от представителей грамположительной и грамотрицательной флоры. Одной из особенностей рода микобактерий является медленный и очень медленный рост, при котором видимые колонии образуются после 2 дней - 8 нед инкубации, в то время как максимальное образование колоний грамположительных и грамотрицательных микробов происходит за 2 ч. Отсюда исходят и отличия в ферментообразующей функции микробных клеток.The microbiological method of Lee, Komarmy [1] for determining beta-lactamase of gram-positive and gram-negative microorganisms is the ability of the microbial population to inactivate the antibiotic contained in the disk. Standard penicillin discs are placed in 1 ml of a broth suspension of test bacteria. Tubes with suspension are incubated for 1 h at 37 o C. After that, the discs are removed and placed on membrane filters, which are applied to the surface of agar seeded with a test culture. The antibiotic diffuses into the agar for half an hour at 37 ° C, then the discs and filters are removed, and the plates with agar are incubated until a distinct growth of the test strain appears. The advantage of the method is the technical simplicity of execution, speed and visibility of the results. At the same time, nobody used the Lee, Komarmy method to determine mycobacterial beta-lactamase, since the genus of mycobacteria is characterized by significant differences in cultural and biochemical properties from representatives of gram-positive and gram-negative flora. One of the features of the mycobacteria genus is its slow and very slow growth, in which visible colonies form after 2 days - 8 weeks of incubation, while the maximum colony formation of gram-positive and gram-negative microbes occurs in 2 hours. The differences in the enzyme-forming function of microbial cells come from .
Наиболее близким к предлагаемому способу является определение бета-лактамазы микобактерий Dufour с соавторами [2], где определение остаточного пенициллина после реакции с микробной суспензией проводится методом вертикальной диффузии. К 5 мл суспензии испытуемых микобактерий прибавляют равный объем пенициллина (50 ед/мл в среде 7H9 твин-альбумин) и помещают в водяную баню при 37oC. После 18 ч инкубации клетки осаждают центрифугированием. По 1 мл супернатанта вносят в 3 пробирки со скошенным питательным агаром. Диффундирование остаточного пенициллина проводят при комнатной температуре в течение 24 ч. На следующий день в каждую пробирку с питательным агаром и остаточным пенициллином вводят суспензию тест-культуры. Инкубация при 37oC - 24 ч. После инкубации определяют зону подавления роста, вызванную остаточным пенициллином от основания скошенного агара до точки роста тест-культуры. Контролем служит пробирка, содержащая пенициллин без микробной суспензии.Closest to the proposed method is the determination of beta-lactamase mycobacteria Dufour et al [2], where the determination of residual penicillin after reaction with a microbial suspension is carried out by the method of vertical diffusion. An equal volume of penicillin (50 u / ml in 7H9 tween-albumin medium) is added to 5 ml of a suspension of test mycobacteria and placed in a water bath at 37 ° C. After 18 hours of incubation, the cells are pelleted by centrifugation. 1 ml of supernatant is added to 3 tubes with beveled nutrient agar. The diffusion of residual penicillin is carried out at room temperature for 24 hours. The next day, a test culture suspension is added to each tube with nutrient agar and residual penicillin. Incubation at 37 o C - 24 hours. After incubation, determine the zone of inhibition of growth caused by residual penicillin from the base of the mowed agar to the growth point of the test culture. The control is a test tube containing penicillin without a microbial suspension.
Недостатком данного способа является сложная, кропотливая и длительная процедура приготовления скошенного питательного агара и диффундирование на его поверхности раствора пенициллина (24 ч). Дополнительные затраты времени требуются также на обязательное центрифугирование реагирующей смеси для осаждения микробных клеток. Кроме того, для каждого испытуемого штамма или нового антибиотика используются 3 пробирки со скошенным агаром, так как зона роста тест-штамма на поверхности скошенного агара не имеет четкой границы, и учет результатов затруднителен. The disadvantage of this method is the complex, painstaking and lengthy procedure for preparing mowed nutrient agar and diffusion of a solution of penicillin on its surface (24 hours). Additional time is also required for the mandatory centrifugation of the reacting mixture to precipitate microbial cells. In addition, for each test strain or new antibiotic, 3 tubes with beveled agar are used, since the growth zone of the test strain on the surface of beveled agar does not have a clear boundary, and it is difficult to account for the results.
Целью изобретения является упрощение и ускорение способа определения микобактериальной бета-лактамазы. Целью является также определение инактивации микобактериальной бета-лактамазы. The aim of the invention is to simplify and accelerate the method for determination of mycobacterial beta-lactamase. The goal is also to determine the inactivation of mycobacterial beta-lactamase.
Поставленная цель достигается путем контакта микобактериальной суспензии с антибиотиком, заключенным в стандартном диске, а при определении инактивации фермента и с ингибитором бета-лактамазы. Активность микобактериальной бета-лактамазы или ее ингибирование определяют по остаточному антибиотику в диске, выражающемуся в изменении зоны подавления роста тест-штамма на чашках Петри. This goal is achieved by contacting the mycobacterial suspension with an antibiotic enclosed in a standard disk, and when determining the inactivation of the enzyme with a beta-lactamase inhibitor. Mycobacterial beta-lactamase activity or its inhibition is determined by the residual antibiotic in the disk, expressed in the change in the zone of inhibition of growth of the test strain on Petri dishes.
Отличием представленного способа определения микобактериальной бета-лактамазы является замена способа вертикальной диффузии способом диффузии с диска. Поэтому отпадает необходимость приготовления раствора антибиотика, титрования его в пробирки с последующим диффундированием на поверхность скошенного агара, что сокращает время определения фермента на 24 ч. Диски с антибиотиком после контакта с микобактериальной суспензией раскладывают на питательный агар в чашки Петри по 5 - 6 в каждую, что значительно сокращает использование лабораторной посуды и упрощает процесс работы. Зона задержки роста тест-штамма вокруг диска с антибиотиком имеет хорошо очерченную границу, что способствует получению достоверных результатов. The difference of the presented method for the determination of mycobacterial beta-lactamase is the replacement of the vertical diffusion method by the diffusion method from the disk. Therefore, there is no need to prepare an antibiotic solution, titrate it into test tubes, followed by diffusion onto the surface of the beveled agar, which reduces the enzyme determination time by 24 hours. Disks with the antibiotic, after contact with mycobacterial suspension, are placed on nutrient agar in Petri dishes 5-6 each, which significantly reduces the use of laboratory glassware and simplifies the process. The zone of growth retardation of the test strain around the antibiotic disk has a well-defined border, which helps to obtain reliable results.
Таким образом, представленный способ дает возможность проводить определение бета-лактамазы одновременно у большого числа испытуемых культур микобактерий с использованием 8 - 10 дисков с различными антибиотиками. Существенным отличием представленного способа является то, что при расширении технических возможностей способа его можно использовать одновременно для определения микобактериальной бета-лактамазы и для определения ингибирования фермента. Для чего в параллельные пробирки наряду с микобактериальной суспензией и диском вносят раствор ингибитора в необходимой концентрации. Thus, the presented method makes it possible to determine beta-lactamase simultaneously in a large number of test cultures of mycobacteria using 8 to 10 disks with various antibiotics. A significant difference of the presented method is that when expanding the technical capabilities of the method, it can be used simultaneously to determine mycobacterial beta-lactamase and to determine the inhibition of the enzyme. Why, in parallel tubes, along with the mycobacterial suspension and disk, a solution of the inhibitor is added in the required concentration.
Предлагаемое время инкубации 22 - 24 ч является оптимальным для определения микобактериальной бета-лактамазы. Установлено, что длительность периода инкубации прямо пропорциональна скорости роста микобактерий. Быстрорастущие микобактерии осуществляли полный или почти полный гидролиз антибиотика за 6 ч инкубации. Активность медленнорастущих микобактерий за этот же период у различных видов составляет от 0 до 73% и достигает максимума к 22 - 24 ч (табл.1). Максимум выявления бета-лактамазы приходится на период 22-24 ч, когда 100% быстрорастущих и 69,3 - 72,7% медленнорастущих микобактерий гидролизуют антибиотик. Поэтому время инкубации 22 - 24 ч позволяет полностью выявить активность бета-лактамазы любой исследуемой культуры независимо от ее видовой принадлежности. The suggested incubation time of 22-24 hours is optimal for determining mycobacterial beta-lactamase. It was found that the duration of the incubation period is directly proportional to the growth rate of mycobacteria. Fast-growing mycobacteria carried out complete or almost complete hydrolysis of the antibiotic after 6 hours of incubation. The activity of slowly growing mycobacteria for the same period in different species ranges from 0 to 73% and reaches a maximum by 22-24 hours (Table 1). The maximum detection of beta-lactamase occurs in the period 22-24 hours, when 100% of fast-growing and 69.3 - 72.7% of slow-growing mycobacteria hydrolyze the antibiotic. Therefore, an incubation time of 22-24 hours allows one to fully reveal the activity of beta-lactamase of any studied culture, regardless of its species.
Для определения микобактериальной бета-лактамазы объем реагирующей смеси должен составить 0,2 - 0,3 мл, так как уменьшение диаметра зоны роста тест-штамма вокруг диска происходит не только из-за гидролиза бета-лактамных антибиотиков микобактериальными ферментами, но и за счет элиминации части антибиотика в реагирующую смесь. Известно, что диски с антибиотиками рассчитаны, как правило, на применение на плотной питательной среде, и в основе их использования лежит диффузия (элиминация) активного начала с поверхности диска. При использовании дисков в жидкой среде изменяется скорость диффузии антибиотика с диска. Кроме того, если для работы с грамотрицательными и грамположительными микробами требуется экспозиция в микробной суспензии в течение 1 ч, то для микобактериальных клеток срок инкубации составляет 22 - 24 ч. Определение изменения содержания антибиотика в диске в зависимости от объема реагирующей смеси и времени инкубации показало, что величина элиминации антибиотика с диска находится в прямой зависимости от объема реагирующей смеси и практически не зависит от времени инкубации. При объеме реагирующей смеси 1,0 и 5,0 мл с диска элиминирует от 40 до 60% антибиотика. Среда в объеме 0,1 мл практически высыхает за 24 ч инкубации. При объеме реагирующей смеси 0,2 и 0,3 мл наблюдается минимальное элиминирование антибиотика за 24 ч инкубации, что проявляется незначительным уменьшением зоны задержки тест-штамма (91,6 - 91,2%). Таким образом, для определения микобактериальной бета-лактамазы объем реагирующей смеси составляет 0,2 - 0,3 мл (табл.2). Контролем опыта является диск, заключенный в таком же объеме среды Сотона, как и объем бактериальной суспензии в опытной пробирке. To determine mycobacterial beta-lactamase, the volume of the reaction mixture should be 0.2 - 0.3 ml, since the decrease in the diameter of the growth zone of the test strain around the disk occurs not only due to the hydrolysis of beta-lactam antibiotics by mycobacterial enzymes, but also due to elimination parts of the antibiotic into the reactive mixture. It is known that antibiotic discs are generally designed for use on a solid nutrient medium, and their use is based on the diffusion (elimination) of the active principle from the surface of the disc. When using disks in a liquid medium, the diffusion rate of the antibiotic from the disk changes. In addition, if exposure to gram-negative and gram-positive microbes requires exposure in a microbial suspension for 1 h, then for mycobacterial cells the incubation period is 22-24 hours. Determination of the change in the antibiotic content in the disk depending on the volume of the reaction mixture and the incubation time showed that the amount of antibiotic elimination from the disk is directly dependent on the volume of the reacting mixture and practically does not depend on the incubation time. When the volume of the reaction mixture is 1.0 and 5.0 ml from the disk, 40 to 60% of the antibiotic is eliminated. The medium in a volume of 0.1 ml almost dries out after 24 hours of incubation. When the volume of the reacting mixture is 0.2 and 0.3 ml, the antibiotic is minimized during 24 hours of incubation, which is manifested by a slight decrease in the delay zone of the test strain (91.6 - 91.2%). Thus, to determine mycobacterial beta-lactamase, the volume of the reacting mixture is 0.2 - 0.3 ml (Table 2). The control of the experiment is a disk enclosed in the same volume of Soton’s medium as the volume of the bacterial suspension in the test tube.
Исследования по определению микобактериальной бета-лактамазы проводятся при постоянном экспериментально отработанном числовом значении плотности суспензии - 10 мг влажного веса в 1 мл среды Сотона. Studies to determine mycobacterial beta-lactamase are carried out with a constant experimentally tested numerical value of the density of the suspension - 10 mg wet weight in 1 ml of Soton’s medium.
Для определения микобактериальной бета-лактамазы применяются диски как производства НТО им. Л. Я. Карпова, так и собственного изготовления. Концентрация антибиотика, нанесенная на диск, колеблется от 10 до 30 мкг. Несмотря на различия в дозе антибиотика, величина зоны задержки роста чувствительного тест-штамма вокруг контрольного диска колеблется незначительно и дает четкое представление о наличии фермента в испытанной культуре. Следовательно, можно сделать вывод, что различия в концентрации препаратов, нанесенных на диски, связаны с их индивидуальными антибактериальными свойствами. Для получения идентичных результатов необходимо иметь одинаковую эффективность воздействия на тест-культуру. To determine mycobacterial beta-lactamases, discs are used as manufactured by NTO named after L. Ya. Karpov, and his own manufacture. The concentration of antibiotic applied to the disk ranges from 10 to 30 μg. Despite the differences in the dose of the antibiotic, the size of the zone of growth inhibition of the sensitive test strain around the control disk fluctuates slightly and gives a clear idea of the presence of the enzyme in the tested culture. Therefore, we can conclude that the differences in the concentration of drugs applied to the disks are associated with their individual antibacterial properties. To obtain identical results, it is necessary to have the same effect on the test culture.
Способ определения микобактериальной бета-лактамазы применен на 469 культурах различных видов микобактерий. Установлено, что после 24 ч. контакта с пенициллином полный или частичный гидролиз антибиотика наблюдается у 90 - 100% испытанных культур всех видов микобактерий, за исключением M. avium. Необходимость последних инактивировать пенициллин при высокой резистентности к данному антибиотику позволяет предположить другой механизм устойчивости M. avium к бета-лактамным антибиотикам. Подобные результаты по определению бета-лактамазы различных видов микобактерий получены в работах Dufour с соавторами, способ которого послужил аналогом в нашей работе. С помощью предложенного способа проведено определение бета-лактамазы с последующим ингибированием фермента на культурах микобактерий туберкулеза. Установлено, что отечественный сульбактам способен подавлять микобактериальную бета-лактамазу по всей широте спектра действия (табл. 3). Незначительная активность фермента, оставшаяся в фильтрате культуры против пенициллина, была устранена увеличением дозы препарата. The method for determining mycobacterial beta-lactamase has been applied to 469 cultures of various types of mycobacteria. It was found that after 24 hours of contact with penicillin, complete or partial hydrolysis of the antibiotic is observed in 90 - 100% of the tested cultures of all types of mycobacteria, with the exception of M. avium. The need for the latter to inactivate penicillin with high resistance to this antibiotic suggests another mechanism of M. avium resistance to beta-lactam antibiotics. Similar results for the determination of beta-lactamases of various types of mycobacteria were obtained in the works of Dufour et al., The method of which served as an analogue in our work. Using the proposed method, the determination of beta-lactamase followed by inhibition of the enzyme in cultures of mycobacterium tuberculosis. It was established that domestic sulbactam is able to suppress mycobacterial beta-lactamase over the entire breadth of the spectrum of action (Table 3). The slight activity of the enzyme remaining in the filtrate of the culture against penicillin was eliminated by increasing the dose of the drug.
В результате использования предложенного способа проведено углубленное исследование микобактериальной бета-лактамазы и установлено совпадение полученных результатов с работами зарубежных авторов:
микобактериальная бета-лактамаза характеризуется широким спектром действия и видовой специфичностью;
отечественный сульбактам ингибирует фермент в бактериальной суспензии микобактерий туберкулеза по всей широте спектра активности.As a result of using the proposed method, an in-depth study of mycobacterial beta-lactamase was carried out and the results were found to coincide with the works of foreign authors:
mycobacterial beta-lactamase is characterized by a wide spectrum of action and species specificity;
domestic sulbactam inhibits the enzyme in the bacterial suspension of mycobacterium tuberculosis across the entire spectrum of activity.
Способ определения микобактериальной бета-лакткамазы осуществляется следующим образом. The method for determining mycobacterial beta-lactamase is as follows.
Материал:
1. Испытуемую культуру микобактерий выращивают на среде Левенштейна-Иенсена. Возраст культуры: быстрорастущие МБ 5 - 7 дней, медленнорастущие МБ 2 - 4 нед. Бактериальную суспензию МБ плотностью 10 мг влажного веса в 1 мл готовят на среде Сотона.Material:
1. The test culture of mycobacteria is grown on Levenshtein-Jensen medium. Culture age: fast-growing MB 5-7 days, slow-growing MB 2-4 weeks. A bacterial suspension of MB with a density of 10 mg wet weight in 1 ml is prepared on Soton medium.
2. Стандартные диски с ампициллином, содержащие 10 мкг антибиотика, изготовленные в объединении НПО им. Л.Я. Карпова. 2. Standard disks with ampicillin containing 10 μg of antibiotic manufactured in the association of NPO them. L.Ya. Karpova.
3. Индикаторный штамм St. aureus 209, высокочувствительный к антибиотикам пенициллинового ряда. Бактериальную суспензию индикаторного штамма готовили из суточной культуры в физиологическом растворе по стандарту мутности N 5 ГИСК им. Л.А. Тарасевича, с последующим разведением в 10 раз. 3. Indicator strain St. aureus 209, highly sensitive to penicillin antibiotics. A bacterial suspension of the indicator strain was prepared from daily culture in physiological saline according to the turbidity standard N 5 GISK them. L.A. Tarasevich, followed by dilution 10 times.
Среда Сотона. Wednesday Soton.
Последовательность определения фермента:
1-й день. Диски с ампициллином раскладывают в стерильные пробирки (120 х 16 мм). В пробирку вносят 0,2 мл суспензии испытуемой культуры МБ. Контролем опыта служит диск с ампициллином, помещенный в 0,2 мл среды Сотона без микобактериальной суспензии. Инкубация при 37oC в течение 24 ч.The sequence of determination of the enzyme:
1st day. Disks with ampicillin are laid out in sterile tubes (120 x 16 mm). 0.2 ml of a suspension of the test MB culture is added to the test tube. The control of the experiment is a disk with ampicillin, placed in 0.2 ml of Soton medium without mycobacterial suspension. Incubation at 37 o C for 24 hours
2-й день. Готовят суспензию индикаторного штамма. Для образования газона бактериальную суспензию индикаторного штамма в количестве 0,1 мл наносят на поверхность кровяного агара, растирают шпателем. Диски с ампициллином удаляют из микобактериальной суспензии испытуемой культуры с помощью петли, обсушивают на стерильной фильтровальной бумаге и раскладывают на засеянный индикаторным штаммом кровяной агар в каждую чашку Петри по 5 - 6 дисков. Инкубация при 37oC в течение 24 ч.2nd day. A suspension of the indicator strain is prepared. To form a lawn, a bacterial suspension of the indicator strain in the amount of 0.1 ml is applied to the surface of blood agar and rubbed with a spatula. Disks with ampicillin are removed from the mycobacterial suspension of the test culture using a loop, dried on sterile filter paper and laid on 5-6 discs in each Petri dish seeded with indicator strain. Incubation at 37 o C for 24 hours
3-й день. Оценка результатов опыта. Активность микобактериальной бета-лактамазы определяют по изменению диаметра зоны подавления роста индикаторного штамма вокруг диска с ампициллином. Действие микобактериального фермента оценивается по следующим критериям (фиг. 1):
1 - диаметр зоны подавления роста индикаторного штамма вокруг диска с ампициллином значительный - контроль;
2 - зона подавления роста индикаторного штамма вокруг диска с ампициллином отсутствует - высокая активность фермента;
3 - диаметр зоны подавления роста индикаторного штамма вокруг диска с ампициллином уменьшен на 50% и более по сравнению с ростом вокруг контрольного диска - умеренная активность фермента;
4 - диаметр зоны подавления роста индикаторного штамма вокруг диска с ампициллином равен контролю или уменьшен менее чем на 50% по сравнению с контролем - фермент, инактивирующий антибиотик, отсутствует.3rd day. Evaluation of the results of the experiment. The activity of mycobacterial beta-lactamase is determined by changing the diameter of the zone of inhibition of growth of the indicator strain around the disk with ampicillin. The effect of mycobacterial enzyme is evaluated according to the following criteria (Fig. 1):
1 - diameter of the zone of inhibition of growth of the indicator strain around the disk with ampicillin significant - control;
2 - zone of inhibition of growth of the indicator strain around the ampicillin disk is absent - high enzyme activity;
3 - the diameter of the zone of inhibition of growth of the indicator strain around the disk with ampicillin is reduced by 50% or more compared with growth around the control disk — moderate enzyme activity;
4 - the diameter of the zone of inhibition of growth of the indicator strain around the disk with ampicillin is equal to the control or reduced by less than 50% compared with the control - the enzyme inactivating the antibiotic is absent.
Способ ингибирования микобактериальной бета-лактамазы осуществляется следующим образом. A method of inhibiting mycobacterial beta-lactamase is as follows.
Материал:
1. Культура микобактерий.Material:
1. Culture of mycobacteria.
2. Стандартные диски с ампициллином. 2. Standard disks with ampicillin.
3. Индикаторный штамм St. aureus 209. 3. Indicator strain St. aureus 209.
4. Среда Сотона. 4. Wednesday Sotona.
Первые четыре компонента используют для способа ингибирования как в предыдущем исследовании. The first four components are used for the inhibition method as in the previous study.
5. Сульбактам - препарат, ингибирующий фермент бета-лактамазу, синтезирован ВНИИ антибиотиков АМН (г. Москва). Навеску сульбатама 25 мг растворяют в 100 мл стерильной дистиллированной воды, получают разведение 250 мкг в 1 мл. 5. Sulbactam - a drug inhibiting the beta-lactamase enzyme, synthesized by the All-Russian Research Institute of Antibiotics AMS (Moscow). A portion of sulbatam 25 mg is dissolved in 100 ml of sterile distilled water, a dilution of 250 μg in 1 ml is obtained.
Последовательность ингибирования фермента:
1-й день. Диски с ампициллином раскладывают в стерильные пробирки (120 х 16 мм). На каждую испытуемую культуру необходимо две пробирки: 1. определение активности фермента; 2. ингибирование фермента. Суспензию каждой испытуемой культуры МБ вносят по 0,2 мл в две пробирки с дисками. Во второй ряд пробирок вносят по 0,2 мл приготовленного раствора сульбактама. Контролем опыта служит диск с ампициллином, помещенный в среду Сотона без бактериальной суспензии. Инкубация при 37oC в течение 24 ч.Enzyme Inhibition Sequence:
1st day. Disks with ampicillin are laid out in sterile tubes (120 x 16 mm). Two test tubes are needed for each test culture: 1. determination of enzyme activity; 2. inhibition of the enzyme. A suspension of each test culture MB contribute 0.2 ml in two tubes with disks. 0.2 ml of the prepared sulbactam solution are added to the second row of tubes. The experiment was controlled by an ampicillin disk placed in Soton's medium without bacterial suspension. Incubation at 37 o C for 24 hours
2-й день. Как описано в предыдущем исследовании. 2nd day. As described in a previous study.
3-й день. Оценка результатов опыта. Ингибирующее действие сульбактама на микобактериальную бета-лактамазу определяют по изменению диаметра зоны роста индикаторного штамма вокруг диска с ампициллином. Действие ингибитора бета-лактамазы оценивают по следующим критериям (фиг. 2):
1 - диаметр зоны подавления роста индикаторного штамма вокруг диска с ампициллином значительный - контроль;
2 - зона подавления роста индикаторного штамма вокруг диска с ампициллином отсутствует - высокая активность фермента;
3 - диаметр зоны подавления роста индикаторного штамма равен контролю - фермент инактивирован сульбактамом.3rd day. Evaluation of the results of the experiment. The inhibitory effect of sulbactam on mycobacterial beta-lactamase is determined by the change in the diameter of the growth zone of the indicator strain around the ampicillin disk. The action of the beta-lactamase inhibitor is evaluated according to the following criteria (Fig. 2):
1 - diameter of the zone of inhibition of growth of the indicator strain around the disk with ampicillin significant - control;
2 - zone of inhibition of growth of the indicator strain around the ampicillin disk is absent - high enzyme activity;
3 - the diameter of the zone of inhibition of growth of the indicator strain is equal to the control - the enzyme is inactivated by sulbactam.
Простота исполнения и доступность для бактериологических лабораторий противотуберкулезных учреждений описанного способа позволяет использовать его с целью рационального вывода химиотерапии больных туберкулезом и микобактериозом. The simplicity of execution and the availability of the described method for bacteriological laboratories of anti-tuberculosis institutions allows it to be used for the rational conclusion of chemotherapy for patients with tuberculosis and mycobacteriosis.
Источники информации
1. Lee W.S., Komarmy L. New method for detecting in vitro inactivation of penicillins by Haemophilus and Stafilococcus aureus // Abstrs. 79-th Ann. Meet. Amer.Soc.Microbiol. Los Angeles. Calif., 1979 Washington. 1979, p.12.Sources of information
1. Lee WS, Komarmy L. New method for detecting in vitro inactivation of penicillins by Haemophilus and Stafilococcus aureus // Abstrs. 79th th Ann. Meet. Amer.Soc.Microbiol. Los Angeles Calif., 1979 Washington. 1979, p. 12.
2. Dufour A.P., Knight R.A., Harris H.W. Mycobacterial penicillinase activity // Amer.Rev. Res.Dis. - 1966. - V.94, p.965-968. 2. Dufour A.P., Knight R.A., Harris H.W. Mycobacterial penicillinase activity // Amer.Rev. Res.Dis. - 1966. - V.94, p. 965-968.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU5036158 RU2117045C1 (en) | 1992-03-20 | 1992-03-20 | Method of assay of mycobacterial beta-lactamase activity |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU5036158 RU2117045C1 (en) | 1992-03-20 | 1992-03-20 | Method of assay of mycobacterial beta-lactamase activity |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2117045C1 true RU2117045C1 (en) | 1998-08-10 |
Family
ID=21601267
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU5036158 RU2117045C1 (en) | 1992-03-20 | 1992-03-20 | Method of assay of mycobacterial beta-lactamase activity |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2117045C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2481401C2 (en) * | 2011-07-15 | 2013-05-10 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Уральская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации" (ГОУ ВПО УГМА Минздравсоцразвития России) | METHOD TO DETECT β-LACTAMASE-PRODUCING OXIDASE-POSITIVE GRAM-NEGATIVE DIPLOCOCCI, SUSPICIOUS FOR APPURTENANCE TO MORAXELLA (BRANCHAMELLA) CATARRHALIS |
| RU2520661C2 (en) * | 2008-08-06 | 2014-06-27 | Дзе Тексас Эй Энд Эм Юниверсити Систем | Using bacterial beta-lactamase for diagnosing in vitro and visualising, diagnosing and treating in vivo |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3937655A (en) * | 1974-04-16 | 1976-02-10 | Eli Lilly And Company | Method for preparing stable β-lactam-type-antibiotic susceptibility test discs |
-
1992
- 1992-03-20 RU SU5036158 patent/RU2117045C1/en active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3937655A (en) * | 1974-04-16 | 1976-02-10 | Eli Lilly And Company | Method for preparing stable β-lactam-type-antibiotic susceptibility test discs |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Dufour A.P. et al., Amer. Rev.Res.Dis., v.94, p.965 - 968, 1966. Am.J.Chem.Path., v.45, p.493, 1966. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2520661C2 (en) * | 2008-08-06 | 2014-06-27 | Дзе Тексас Эй Энд Эм Юниверсити Систем | Using bacterial beta-lactamase for diagnosing in vitro and visualising, diagnosing and treating in vivo |
| RU2481401C2 (en) * | 2011-07-15 | 2013-05-10 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Уральская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации" (ГОУ ВПО УГМА Минздравсоцразвития России) | METHOD TO DETECT β-LACTAMASE-PRODUCING OXIDASE-POSITIVE GRAM-NEGATIVE DIPLOCOCCI, SUSPICIOUS FOR APPURTENANCE TO MORAXELLA (BRANCHAMELLA) CATARRHALIS |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Rolinson | Forty years of beta-lactam research. | |
| Barry et al. | An improved single-disk method for testing the antibiotic susceptibility of rapidly-growing pathogens | |
| Haight et al. | The antibacterial action of erythromycin. | |
| Olsson et al. | Factors contributing to resistance to beta-lactam antibiotics in Bacteroides fragilis | |
| Yajko et al. | Broth microdilution testing of susceptibilities to 30 antimicrobial agents of Mycobacterium avium strains from patients with acquired immune deficiency syndrome | |
| Zeighampour et al. | Antibacterial activity of propolis ethanol extract against antibiotic resistance bacteria isolated from burn wound infections | |
| Basker et al. | Comparative antibacterial activity of azlocillin, mezlocillin, carbenicillin and ticarcillin and relative stability to beta-lactamases of Pseudomonas aeruginosa and Klebsiella aerogenes | |
| RU2117045C1 (en) | Method of assay of mycobacterial beta-lactamase activity | |
| Farrar Jr et al. | Relationship between β-lactamase activity and resistance of Enterobacter to cephalothin | |
| Soriano et al. | Struvite crystal formation by Corynebacterium group D2 in human urine and its prevention by acetohydroxamic acid | |
| Reeves et al. | A laboratory evaluation of a novel (β-lactam antibiotic mecillinam | |
| Hedström et al. | Sphingomyelinase activity of Staphylococcus aureus strains from recurrent furunculosis and other infections | |
| Domingue et al. | The possible role of microbial L-forms in pyelonephritis | |
| RU2132879C1 (en) | Method of determining anticarnosine activity of microorganisms | |
| Bell et al. | Mutation of Pseudomonas aeruginosa to piperadillin resistance mediated by β-lactamase production | |
| RU2213780C2 (en) | Method for assay of bacteriostatic and bactericidal effect of antibiotic | |
| US8911962B2 (en) | Method for neutralization of antibiotics in a culture medium | |
| RU2169767C1 (en) | Strain of bacterium bacillus subtilis showing broad spectrum of antagonistic activity and resistance to antibiotics | |
| Klochko et al. | Antimicrobial and cytotoxic characteristicsof antibiotic streptofungin | |
| King et al. | Sensitivity to carbenicillin and ticarcillin, and the beta-lactamases of Pseudomonas aeruginosa in the UK in 1978-79. | |
| RU2120999C1 (en) | Method of determination of antiplatelet catione-protein activity of microorganisms | |
| Elford | The Influence of Antibacterial substances on the Interaction of Bacteria and Bacteriophaǵes: 1. The Influence of Penicillin | |
| Rahman | Studies on medically important extended spectrum beta-lactamage producing bacteria in Bangladesh | |
| McGowan Jr et al. | Susceptibility of gram-negative aerobic bacilli resistant to carbenicillin in a general hospital to piperacillin and ticarcillin | |
| Wang | A Literature Review of Bacterial Drug Resistance |