[go: up one dir, main page]

RU2111010C1 - Иммуноген для предотвращения и лечения ретровирусных заболеваний, преимущественно спида - Google Patents

Иммуноген для предотвращения и лечения ретровирусных заболеваний, преимущественно спида Download PDF

Info

Publication number
RU2111010C1
RU2111010C1 SU5052305A SU5052305A RU2111010C1 RU 2111010 C1 RU2111010 C1 RU 2111010C1 SU 5052305 A SU5052305 A SU 5052305A SU 5052305 A SU5052305 A SU 5052305A RU 2111010 C1 RU2111010 C1 RU 2111010C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
hiv
immunogen
virus
cells
retrovirus
Prior art date
Application number
SU5052305A
Other languages
English (en)
Inventor
Салк Джонас
Дж. Карло Деннис
Original Assignee
Дзе Имьюн Респонс Корпорейшн, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Дзе Имьюн Респонс Корпорейшн, Инк. filed Critical Дзе Имьюн Респонс Корпорейшн, Инк.
Application granted granted Critical
Publication of RU2111010C1 publication Critical patent/RU2111010C1/ru

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61MDEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M1/00Suction or pumping devices for medical purposes; Devices for carrying-off, for treatment of, or for carrying-over, body-liquids; Drainage systems
    • A61M1/36Other treatment of blood in a by-pass of the natural circulatory system, e.g. temperature adaptation, irradiation ; Extra-corporeal blood circuits
    • A61M1/3687Chemical treatment
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12Antivirals
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011Details
    • C12N2740/10011Retroviridae
    • C12N2740/16011Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Anesthesiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Ultra Sonic Daignosis Equipment (AREA)
  • Information Retrieval, Db Structures And Fs Structures Therefor (AREA)

Abstract

Средство может быть использовано для борьбы с ретровирусами, в частности для предотвращения и лечения спида. Оно представляет собой иммуноген, содержащий неинфекционные частицы ретровируса HIV, свободные от его наружной оболочки, или по крайней мере один антиген, выделенный из данного ретровируса. 1 табл, 4 ил.

Description

Изобретение относится к борьбе с ретровирусами, более конкретно к иммуногену для предотвращения и лечения ретровирусных заболеваний, преимущественно спида.
На дату приоритета данного изобретения специальная литература не содержит сведений о создании высокоэффективного средства для борьбы с ретровирусами, преимущественно ретровирусом HIV.
Задачей изобретения является создание высокоэффективного средства для борьбы с ретровирусами, преимущественно ретровирусом HIV.
Поставленная задача решается предлагаемым иммуногеном для предотвращения или лечения ретровирусных заболеваний, преимущественно спида, содержащим неинфекционные частицы ретровируса, свободные от белков наружной оболочки, или выбранные антигены, выделенные из ретровируса.
Изобретение далее поясняется на примере ретровируса HIV.
Когда индивидуум становится зараженным HIV, вирус предпочтительно приспособляется к определенному классу клеток, называемых лимфоцитами T4, которые отличаются присутствием поверхностного маркера клеток, называемого CD 4. Эти белые кровяные клетки (лейкоциты) играют существенную роль в иммунной системе, функционируя как решающие компоненты как гуморальной, так и клеточной иммунной реакции. Основное содержание губительного воздействия HIV может быть приписано функциональному подавлению или разрушению T4-лимфоцитов
Вирион интактного HIV является приблизительно сферическим и имеет диаметр приблизительно 110 мм. Вирион имеет наружную мембрану, покрытую шишками или шипами, выполненными из глюкопротеина gp. 160/120. Кроме того, существует трансмембранный белок, обозначенный gp41. Внутри вириона находятся два структурных белка: наружная оболочка составлена фосфопротеином p17 и внутренний нуклеоид, или центральное ядро, выполнен из фосфопротеина p24. Вирусная РНК присутствует внутри ядра вместе с двумя копиями обратной транскриптазы p66/51, которая необходима для синтеза вирусной ДНК из матрицы РНК. Схематическая модель HIV представлена на фиг. 1.
Как показано на фиг. 2, геном РНК HIV кодирует три основных структурных гена: gag, pol и env, которые фланкированы на обоих концах длинными концевыми дупликациями (LTR). Ген gag кодирует специфические белки ядра, p55, p39, p24, p17 и p15. Гены pol кодируют обратную транскриптазу p65/p51 и протеазу p31. Гены env кодируют гликопротеин наружной мембраны gp120 и его предшественник gp160, а также трансмембранный гликопротеин gp41. Некоторые из генов являются чрезвычайно вариабельными, в частности, гены env. Кроме того, существуют пять других генов, не присутствующих в других ретровирусах, которые либо вовлечены в транскрипционную или трансляционную регуляцию, либо кодируют другие структурные белки. Структура гена HIV известна. Она описана Ратнером и др. Nature, 313, стр. 277 (1985).
HIV присоединяется к клеткам хозяина путем взаимодействия мембранных гликопротеинов с поверхностным рецептором клетки. Оказывается, что при контакте HIV с клеткой T4 протеин gp120 взаимодействует с рецептором CD4. Вирусная оболочка затем слияется с клеточной мембраной, и внутреннее ядро вируса входит в зараженную клетку, где транскрипция РНК в вирус ДНК катализируется обратной транскриптазой. Провирус может оставаться в клатке в латентной форме в течение нескольких месяцев или лет, и все это время зараженный индивидуум является бессимптомным. Однако, если вирус позднее активируется, вызывая вирусную репликацию и иммуносупрессию, индивидуум будет затем восприимчивым к условно-патогенным заражениям, включая рак, ассоциируемым со спидом.
На фиг. 3 представлено схематическое воспроизведение уровня некоторых антител и антигенов, присутствующих в развитии из бессимптомного состояния до состояния ARC (связанный со спидом комплекс) и до спида у HIV - сероположительных пациентов, зараженных HIV.
На фиг. 4 представлены результаты анализа по Вестерну иммуногена по примеру 1, которые показывают, что он свободен от белков наружной оболочки при скрининге гомологичными и гетерологичными сыворотками, которые содержат высокие титры антитела против белков наружной оболочки.
А. Коммерческие полоски по Вестерну с пятнами HIV в результате скрининга гетерологичными сыворотками шимпанзе;
Б. Полоски по Вестерну с пятнами иммуногена в результате скрининга гетерологичными сыворотками шимпанзе;
В. Коммерческие полоски с HIV-пятнами по Вестерну в результате скрининга гомологичными сыворотками человека;
Г. Полоски по Вестерну с пятнами иммуногена в результате скрининга гомологичными сыворотками человека.
Как показано схематически на фиг. 3, высокие уровни антитела против gp160/120 (наружная оболочка), которые присутствуют в бессимптомной фазе заражения HIV, также продолжают существовать в симптомной фазе. Уровень антитела p24 в бессимптомной фазе является высоким, но, по-видимому, снижается в симптомной фазе. Аналогично HIV-сероположительные сыворотки содержат антитело, которое ингибирует функцию обратной транскриптазы. У пациентов, в которых антитело против обратной транскриптазы присутствует на высоких уровнях, попытки относительно выделения вируса менее часто положительны, нежели у тех, в которых оно отсутствует. Поэтому следует, что уменьшение клеточных и гуморальных иммунозащитных факторов, таких как T4-клетки и антитела против GAG, включая анти-p24, и антитела против pol, включая антитело против обратной транскриптазы, связано с развитием HIL до спида.
Используемый в данном описании термин "HIV" включает типы 1 и 2 и является сининимом HTLV-III, LAV-1 и LAV-2. HIV относится к вирусу в общем смысле и включает все формы, подтипы и вариации.
Используемый в данном описании термин "белок наружной оболочки" относится к той части мембранного гликопротеина ретровируса, которая выступает за пределы мембраны, в противоположность трансмембранному белку, gp41. Белок наружной оболочки HIV является синонимом gp120 и его предшественника gp160.
Используемый в данном описании термин "gp120" или "gp160/120" относится к гликопротеинам, имеющим либо антигенную специфичность, либо биологическую функцию белка наружной оболочки; gp160, как полагают, является предшественником gp120.
Используемый в данном описании термин "генный продукт" относится к полипептиду или белку, который кодируется геном. Термин, как предполагают, включает в себя белковые производные, такие как гликопротеины. Понятно, что в аминокислотную последовательность генного продукта могут быть внесены ограниченные модификации без нарушения биологической функции или иммуногенности генного продукта, и только часть первичной последовательности может потребоваться для иммуногенности.
Идентификация HIV-специфических генов и генных продуктов основана на терминологии HIV типа 1, представленной на фиг.1. Предполагается, однако, что ссылка на специфический ген или генный продукт HIV типа 1, на основе его молекулярной массы будет также включать соответствующий ген или генный продукт HIV типа 2 и, когда присутствует гомологичный ген, другие ретровирусы. Генные продукты других типов и родов могут иметь незначительно отличающиеся молекулярные массы. Например, gp41 HIV типа 1 эквивалентен gp36 типа 2, тогда как gp120 типа 1 соответствует gp130 типа 2.
HIV можно культивировать из пробы периферической крови зараженных индивидуумов. Например, одноядерные клетки из периферической крови, такие как лифоциты, могут быть получены путем наслоения пробы гепаринизированной венозной крови по градиенту плотности Ficoll-Hypaque и центрифугирования пробы. Одноядерные клетки затем собирают, активируют, например, фитогемагглютинином в течение двух-трех дней и культивируют в подходящей среде, предпочтительно пополненной интерлейкином 2. Вирус может быть обнаружен либо анализом на обратную транскриптазу, анализом с захватом антигена для p24, иммунофлюоресценцией, либо электронной микроскопией для обнаружения присутствия вирусных частиц в клетках. Все эти методы хорошо известны специалистам в данной области. После выделения вирус может быть включен в другие клетки.
Важно использовать неинфекционную вакцину с тем, чтобы избежать проникновения инфекции в хозяина. Различные методы хорошо известны для придания болезнетворному организму неинфекционности. Вирус можно инактивировать или сделать репликационно-недостаточным. Предпочтительно, однако, обрабатывать его комбинацией бета- пропиолактона и гамма-излучения. При этом бета-пропиолактон должен находиться в контакте с вирусом как минимум 2,5 ч. Чтобы полностью удалить какой-либо остаточный бета-пропиолактон, бета-пропиолактон должен оставаться в растворе в течение как минимум пяти часов при температуре 37oC.
Выделенный вирус затем обрабатывают так, чтобы удалить белки наружной оболочки. Такое удаление предпочтительно осуществляют неоднократными замораживанием и оттаиванием вируса в сочетании с физическими методами, которые вызывают набухание и сокращение вирусных частиц, хотя также можно использовать другие физические и нефизические методы, такие как разрушение ультразвуком, в отдельности или в сочетании друг с другом.
Как уже указывалось выше, предлагаемый иммуноген может также представлять собой в основном очищенные генные продукты ретровируса, такого как HIV, за исключением белков наружной оболочки. Такие генные продукты включают те продукты, которые кодируются генами gag (p55, p39, p24, p17 и p15), генами pol (p66/p51 и p31-34), и трансмембранный гликопротеин gp41. Эти генные продукты могут быть использованы отдельно или в комбинации. Альтернативно генные продукты остальных пяти генов генома HIV могут быть также использованы в качестве иммуногена. Генные продукты могут быть выделены и очищены от вируса или могут быть получены клонированием и экспрессией подходящего гена в организме хозяина, такого как бактериальные, грибковые или млекопитающие клетки, хорошо известными в данной области методами. Альтернативно антигены могут быть синтезированы с использованием хорошо известных методов, таких как автоматизированный пептидный синтез. Аминокислотная последовательность генных продуктов выведена из никлеотидной последовательности.
Для иммунизации человека или животного предлагаемый иммуноген может применяться вместе со вспомогательными веществами. Но он может также применяться в своей водной форме без вспомогательного вещества. При этом дозу выбирают так, чтобы она была иммунологически эффективной, и она, как правило, составляет от 1 до 100 мкг белка, предпочтительно около 30 мкг белка.
Активную иммунизацию осуществляют и предпочтительно повторяют раз с минимальным интервалом по меньшей мере 90 дней, хотя дополнительные ревакцинации могут подходить в соответствии с изменениями в уровне иммунной активности на основе, например, уменьшения количества антител против HIV-генным продуктам, другим, нежели белки наружной оболочки. Такую иммунизацию предпочтительно осуществляют первоначально путем внутримышечной инъекции с последующей внутрикожной инжекцией, хотя может быть использована любая комбинация внутрикожной и внутримышечной инъекции.
Предпочтительно иммунокомпетентность или иммунную активность сероположительного индивидуума определяют перед иммунизацией с тем, чтобы определить подходящий путь лечения. В качестве метода такого определения сыворотки пациентов подвергают скринингу на присутствие антител против p24 (например, при помощи иммуноферментного твердофазного анализа), антитела против обратной транскриптазы и/или уровня клеток T4 при помощи хорошо известных методов. Пациенты, проявляющие индикаторы низкой иммунокомпентентности, например низкие титры p24 или антитела против обратной транскриптазы или низкие количества клеток T4, являются подходящими кандидатами для пассивной иммунотерапии, предпочтительно в сочетании (проводимой перед или совместно) с активной иммунизацией.
Серонегативные индивидуумы могут быть вакцинированы с тем, чтобы вызвать иммунозащитные факторы для предотвращения инфекции. Предпочтительно вакцину вводят первоначально путем внутримышечной инъекции с последующим введением бустера, осуществляемым либо внутримышечно, либо внутрикожно. Физиологически эффективная доза содержит предпочтительно от 1 до 100 мкг и более предпочтительно около З0 мкг иммуногена. Вакцину предпочтительно вводят в сочетание с адъювантом, т.е. вспомогательным веществом, наиболее предпочтительно адъювантом для обеспечения получения препарата типа "вода в масле". Различные подходящие адъюванты хорошо известны в данной области.
Кроме того, поскольку антитела против gp160/120 могут содействовать вирусной абсорбции клетками, эти специфические антитела могут быть удалены из пациента, зараженного HIV, перед иммунотерапией. Иммуносорбентные колонки, выполненные из полых целлюлозных волокон, модифицируют с тем, чтобы ковалентно связать лиганды, реакционноспособные с антителами против gp160/120. Такие лиганды включают антигены gp160/120, полученные из очищенных гликопротеинов, которые в свою очередь получены из только что собранных вирусных частиц или из культурального супернатанта HIV-продуцирующих T4-лимфоцитов. Альтернативно такие лиганды могут быть получены методами рекомбинантной ДНК с использованием трансфецированных клеток. Альтернативно идиотипы, реакционноспособные с антителами против gp160/120, могут быть использованы для этих целей.
Такие анти-идиотипные антитела могут быть получены методами, хорошо известными в данной области.
Пример 1. Получение вирусных частиц, свободных от белков наружной оболочки.
Клетки, зараженные штаммом HIV No. HZ 321 (выделившимся из плазмы 26-летней африканской женщины из Саира) выращивают в среде А, состоящей из RPMI 1640 с 10%-ной эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, 25 мМ буфера HEPES, 50 мкг/мл гентамицина и 100 мгк/мл стрептомицина.
Культуры увеличивают в объеме путем подачи исходных клеток в центрифужные пробирки и доведения объема приблизительно до 8 л добавкой предварительно нагретой среды А. При этом степень разведения составляет приблизительно 1:5. Затем осуществляют второе разведение в соотношении 1:3.
Супернатант от 5-7-дневной суспензии HIV-зараженных клеток фильтруют через фильтр размером 0,45 мкм. Свежеприготовленный раствор 1:40 бета-пропиолактона прибавляют к супернатанту до конечной концентрации 1:4000. Раствор инкубируют в течение пяти часов при температуре 37oC и pH поддерживают на уровне 7,2-7,4.
Через 5 ч 20 мл раствора супернатанта удаляют, чтобы определить уровень инфективности и количество оставшегося бета- пропиолактона. Затем супернатант замораживают при температуре -70oC. Замороженный супернатант затем подвергают гамма-облучению кобальтом60 мощностью 4,5 mR.
Раствор супернатанта затем оттаивают и концентрируют путем 40- кратной фильтрации через выполненные с мол.м. 100000 фильтры. Концентрат подают в снабженные мешалкой колбы Т-21, предварительно обработанные 70%-ным изопропанолом, и центрифугируют при 28000 об/мин в течение одного часа. Супернатант удаляют и осадок повторно суспендируют в содержащем ЭТУК натриевом буфере до общего конечного объема приблизительно 24 мл. 4 мл этой суспензии расслаивают над 8 мл 30%-ной сахарозы в полиалломерных пробирках, предварительно обработанных 70%-ным изопропанолом, и центрифугируют в течение одного часа при 28000 об/мин. Супернатант сливают из З0%-ной сахарозы и осадок ресуспендируют в указанном натриевом буфере.
Градиент в ультрасветлых центрифужных пробирках, предварительно обработанных 70%-ным изопропанолом, устанавливают путем прибавления 3 мл 45%-й сахарозы в пробирку и наложения сверху 6 мл 30%-й сахарозы. 3 мл вышеописанной суспензии наслаивают на раствор. Пробирки центрифугируют в течение 60 мин при 28000 об/мин.
Раствор над слоями при 35%-м переходе отсасывают пипеткой и сливают. Слои из всех пробирок соединяют в одной конической пробирке и разбавляют в соотношении 1: 10 фосфатсодержащим буферным солевым раствором. Раствор центрифугируют в полиалломерных пробирках, предварительно обработанных 70%-ным изопропанолом, в течение одного часа при 28000 об/мин. Супернатант удаляют и осадки в пробирках ресуспендируют в указанном фосфатсодержащим буферном растворе при концентрации 1 мл на 10 л исходного вещества.
Альтернативно особенно, когда иммуноген получают в больших количествах, стадию облучения можно осуществлять после объединения слоев. Затем вирус расслаивают на градиенте 15-50%-ной сахарозы. Вирусные слои объединяют и ресуспендируют в вышеуказанном фосфатсодержащем буферном растворе. Вирус центрифугируют при 28000 об/мин в течение одного часа и ресуспендируют в упомянутом буферном растворе до конечной концентрации равной 1,0 мг/мл.
Количество имеющегося белка определяют в соответствии с методом Бредфорда (см. Anal. Biochem, 72, стр.248, 1976 г). Белок разбавляют вышеуказанным фосфатсодержащим буферным раствором до концентрации равной 1,0 мг/мл.
Уровень остаточного бета-пропиолактона в иммуногене определяют с использованием капиллярного газо-жидкостного хроматографа. При этом приготовляют стандартные растворы бета-пропиолактона и масляной кислоты, имеющие концентрации между 1 и 500 частями на миллион. Пробы объемом 2 мкм вводят в капиллярный хроматограф в соответствии с рекомендацией изготовителя. Предел обнаружения составляет 0,1 ч/мил. Иммуноген содержит менее чем 0,05 ч/мил. бета-пропиолактона.
Восемь проб иммуногена анализируют на содержание бета-пропиолактона капиллярной газовой хроматографией, используя масляную кислоту в качестве внутреннего стандарта. Используют следующие хроматографические условия: колонка: 30 м • 0,25 мм, кварцевое стекло, открытая, трубчатая; стационарная фаза: 100%-ный цианопропил-кремний; температура ввода пробы 140oC; рабочая температура: 70oC/1 мин, 20oC/мин до 130oC; методика ввода пробы: нерасщепляющая. При вышеприведенных условиях время удерживания бета-пропиолактона и масляной кислоты соответствует 7,52 мин и 6,70 мин соответственно. Ввод 2 мкл 1 ч/мил. раствора бета-пропиолактона приводит к получению пика, который может быть измерен количественно. Концентрация 1 ч/мил. раствора до 1/10 его объема упариванием растворителя при температуре 40oC при пониженном давлении не приводит к ощутимой потери бета-пропиолактона. Предел обнаружения после концентрации составляет 0,1 ч/мил./0,1 мкг/мл.
Чтобы подтвердить то, что иммуноген свободен от белков наружной оболочки, иммун2оген вначале разделяют на 11,0%-ных полиакриламидных гелях с применением додецилсульфата натрия в соответствии со способом Лэммли, см. Nature 227, стр. 680, 1970 г). Очищенный материал затем переносят на нитроцеллюлозную бумагу в соответствии с методом, предложенным Таубином и др. (см. Proc. Nature. Acad. Sci., 76, стр. 4350, 1979 г) и иммуноокрашивают в соответствии с методом, предложенным Цанг и др. (см. Meth. Enzymalogy, 92, стр.377, 1983 г). Как можно видеть на фиг.4, пятна полученного таким образом иммуногена не имеют полосу, соответствующую gp120/160, как указано в контрольных испытаниях, при взаимодействии с сыворотками, содержащими высокие титры анти-gp160/120.
Как показано на фиг.4, коммерческие полоски с имеющимися на них белками HIV, подвергнутые скринингу с гетерологичной сывороткой (шимпанзе А86-С и А-3) и содержащие высокие титры антител против белков наружной оболочки, gp160/120, являются негативными (нереакционноспособными) на полосках, полученных при анализе полученного вышеописанным образом иммуногена, свободного от наружной оболочки. Гомологические человеческие сыворотки (003 и 010), содержащие высоко-титры антител против белков наружной оболочки, gp160/120, являются реакционноспособными с коммерческими полосками, но негативными с полосками, полученными из иммуногена, свободного от наружной оболочки. Как гомологические, так и гетерологические сыворотки вступают во взаимодействие с другими генными продуктами HIV.
Отсутствие белков наружной оболочки на предлагаемом иммуногене подтверждают электронной микроскопией. К иммуногенному препарату последовательно добавляют 2,5%-ный глутаральдегид и осмиевый ангидрид, дегидратируют с помощью растворов этанола разных концентраций и заливают в EPON-812. Тонкие шлифы получают с помощью прибора LKB Microtom (фирма LKB, Уписала, Швеция) с использованием алмазного скальпеля. Толщина шлифов составляет 60 нм. Шлифы окрашивают уранилацетатом и лимоннокислым свинцом, наблюдают и фотографируют с использованием электронного микроскопа марки Цейс 109. Служащие в качестве контроля клетки, зараженные HIV, подготовляют с использованием той же методики. При этом обнаруживают, что иммуноген на имеет темно-окрашенную наружную оболочку, которая присуща контрольным пробам и которая отражает gp160/120 на вирусной поверхности.
Пример 2. Иммунотерапия сероположительных индивидуумов.
Девять пациентов, сероположительных к HIV, лечат иммунотерапией при даче иммуногена по примеру 1. При этом иммуноген эмульгируют в соотношении 1:1 в неполном адъюванте Фройнда в эмульсификаторе марки Spex 8000 Mixer Mill инофирмы Спекс Индастриз Инк. , США; 1,0 мл раствора, содержащего 100 мкг белка, вводят внутримышечно. Бустер 100 мкг белка без адъюванта вводят через 90 дней путем внутрикожной инъекции.
Присутствие вируса HIV в лимфоцитах периферической крови пациентов определяют как до, так и после иммунизации путем сокультивирования вместе со свежеприготовленными лимфоцитами периферической крови, стимулированными фитогемагглютинином и интерлейкином-2 в соответствии с методом Галло и др. (см. J. Clin. Microb., 25, стр. 1291, 1987 г). Оборудование для обнаружения присутствия антигенов HIV, таких как p24, коммерчески доступно (например, от инофирмы Е.И.Дю-Пон энд Де-Немурс Ко., Инк, США). Каждого пациента обследуют три раза перед иммунизацией и через 2, 4, 6, 8, 12 и 14 недель после иммунизации.
В таблице представлены результаты исследований. Пациенты 010 и 003, из которых HIV выделен перед иммунизацией, не проявляют выделяемый вирус вплоть до 12 недели после иммунизации. Пациенты 008 и 009 не являются переносчиками вируса вплоть до 8 недели после иммунизации. Все четыре пациента проявляют высокие титры анти-p24 (> 1:5000) и антитела против обратной транскриптазы (> 1: 1000) перед иммунизацией. Остальные пять пациентов, которые проявляют низкие титры анти-p24 и антитела против обратной транскриптазы перед иммунизацией, продолжают проявлять выделяемый вирус после иммунизации.

Claims (1)

  1. Иммуноген для предотвращения или лечения СПИДа, содержащий частицы ретровируса, отличающийся тем, что он содержит неинфекционные частицы ретровируса HIV, свободные от его наружной оболочки, или по крайней мере один антиген, выделенный из данного ретровируса.
SU5052305A 1987-06-10 1988-06-09 Иммуноген для предотвращения и лечения ретровирусных заболеваний, преимущественно спида RU2111010C1 (ru)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US6028087A 1987-06-10 1987-06-10
US060280 1987-06-10
US20075288A 1988-05-31 1988-05-31
US200752 1988-05-31

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2111010C1 true RU2111010C1 (ru) 1998-05-20

Family

ID=26739775

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SU5052305A RU2111010C1 (ru) 1987-06-10 1988-06-09 Иммуноген для предотвращения и лечения ретровирусных заболеваний, преимущественно спида

Country Status (14)

Country Link
EP (3) EP0602761A1 (ru)
JP (1) JPH0720880B2 (ru)
AT (1) ATE132374T1 (ru)
AU (1) AU612383B2 (ru)
CA (1) CA1336407C (ru)
DE (1) DE3854857T2 (ru)
DK (1) DK56389A (ru)
FI (1) FI95871C (ru)
IL (1) IL86675A (ru)
NO (1) NO175846C (ru)
OA (1) OA09037A (ru)
RU (1) RU2111010C1 (ru)
UA (1) UA27716C2 (ru)
WO (1) WO1988009670A1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2337922C2 (ru) * 2001-08-07 2008-11-10 Медести Интернационале С.Р.Л. ИЗОЛИРОВАННЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ НА ОСНОВЕ НЕЙТРАЛИЗУЮЩЕГО ЭПИТОПА БЕЛКА p17 ВИРУСА ВИЧ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В КАЧЕСТВЕ ВАКЦИН, А ТАКЖЕ НЕЙТРАЛИЗУЮЩИЕ АНТИ-p17-АНТИТЕЛА, СПЕЦИФИЧЕСКИ РАСПОЗНАЮЩИЕ УКАЗАННЫЙ НЕЙТРАЛИЗУЮЩИЙ ЭПИТОП

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ223980A (en) * 1987-03-23 1991-02-26 Hiver Ltd An aids-type virus vaccine comprising an antibody equivalent which recognises an epitope on a cd4 cell-marker
US5256767A (en) * 1987-06-10 1993-10-26 The Immune Response Corporation Retroviral antigens
US5227159A (en) * 1989-01-31 1993-07-13 Miller Richard A Anti-idiotype antibodies reactive with shared idiotopes expressed by B cell lymphomas and autoantibodies
EP0474868B1 (en) * 1989-05-30 1996-11-13 Nippon Zeon Co., Ltd. Method of producing core structure of retro virus and particle produced thereby
FR2661834B1 (fr) * 1990-05-09 1995-01-27 Merieux Inst Procede de fabrication d'immunogenes de retrovirus et de vaccins contre les infections retrovirales, notamment hiv, et immunogenes et vaccins obtenus.
WO1994002171A1 (en) * 1992-07-20 1994-02-03 The Immune Response Corporation Prophylactic and therapeutic control of retroviral infections
WO1995025789A1 (en) * 1994-03-22 1995-09-28 The Immune Response Corporation Highly efficient production and isolation of viral particles
IT1271593B (it) * 1994-11-30 1997-06-04 Sanitaria Scaligera Spa Procedimento ed apparecchiatura per l'immunoadsorbimento specifico di virus hiv, di antigene gp120 e complesso cd4-gp120.

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4716102A (en) * 1984-08-15 1987-12-29 Regents Of The University Of California Purified AIDS-associated virus ARV-2
DK507185A (da) * 1984-11-05 1986-05-06 Du Pont Fremgangsmaade til inaktivering af human tumor leukaemi virus iii
US4725669A (en) * 1984-11-09 1988-02-16 President And Fellows Of Harvard College Assay for detecting infection by human T-cell lymphotropic virus-III
EP0187041B1 (en) * 1984-12-24 1996-05-15 Genentech, Inc. Fusions of AIDS-related polypeptides
AU594333B2 (en) * 1985-04-08 1990-03-08 Genetic Systems Corporation Expression and diagnostic use of gag encoded peptides which are immunologically reactive with antibodies to lav
NZ215867A (en) * 1985-04-19 1989-10-27 Hoffmann La Roche Aids envelope protein, dna vectors and method of production
WO1987002892A1 (en) * 1985-11-14 1987-05-21 President And Fellows Of Harvard College T-lymphotrophic virus
EP0250128A3 (en) * 1986-06-18 1988-06-08 American Registry of Pathology Novel virus isolated from patients with aids
CA1341277C (en) * 1987-03-16 2001-07-31 Roland Keith Mcgready Anti-paratopic antibody and a method of its manufacture

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EP 0213894 (Advanced Genetics Research Institute), 11.03.87, A 61 K 39/21. EP 0214709 (United Biomedical, Inc), 18.03.87, A 61 K 39/21. EP 0213921 (Hemresearch, Inc), 28.05.86, A 61 K 45/02. *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2337922C2 (ru) * 2001-08-07 2008-11-10 Медести Интернационале С.Р.Л. ИЗОЛИРОВАННЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ НА ОСНОВЕ НЕЙТРАЛИЗУЮЩЕГО ЭПИТОПА БЕЛКА p17 ВИРУСА ВИЧ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В КАЧЕСТВЕ ВАКЦИН, А ТАКЖЕ НЕЙТРАЛИЗУЮЩИЕ АНТИ-p17-АНТИТЕЛА, СПЕЦИФИЧЕСКИ РАСПОЗНАЮЩИЕ УКАЗАННЫЙ НЕЙТРАЛИЗУЮЩИЙ ЭПИТОП
RU2337922C9 (ru) * 2001-08-07 2009-02-10 Медести Интернационале С.Р.Л. ИЗОЛИРОВАННЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ НА ОСНОВЕ НЕЙТРАЛИЗУЮЩЕГО ЭПИТОПА БЕЛКА p17 ВИРУСА ВИЧ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В КАЧЕСТВЕ ВАКЦИН, А ТАКЖЕ НЕЙТРАЛИЗУЮЩИЕ АНТИ-p17-АНТИТЕЛА, СПЕЦИФИЧЕСКИ РАСПОЗНАЮЩИЕ УКАЗАННЫЙ НЕЙТРАЛИЗУЮЩИЙ ЭПИТОП

Also Published As

Publication number Publication date
EP0685236A1 (en) 1995-12-06
FI890603A0 (fi) 1989-02-08
NO890565D0 (no) 1989-02-09
JPH0720880B2 (ja) 1995-03-08
NO175846B (ru) 1994-09-12
AU1962688A (en) 1989-01-04
CA1336407C (en) 1995-07-25
DE3854857D1 (de) 1996-02-15
EP0602761A1 (en) 1994-06-22
DE3854857T2 (de) 1996-08-22
DK56389D0 (da) 1989-02-08
OA09037A (en) 1991-03-31
JPH02500440A (ja) 1990-02-15
EP0317622B1 (en) 1996-01-03
EP0317622A4 (en) 1990-05-14
NO890565L (no) 1989-02-09
ATE132374T1 (de) 1996-01-15
DK56389A (da) 1989-02-08
EP0317622A1 (en) 1989-05-31
NO175846C (no) 1994-12-21
FI890603L (fi) 1989-02-08
FI95871C (fi) 1996-04-10
FI95871B (fi) 1995-12-29
AU612383B2 (en) 1991-07-11
IL86675A (en) 1993-04-04
UA27716C2 (ru) 2000-10-16
WO1988009670A1 (en) 1988-12-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5916806A (en) Prevention and treatment of retroviral disease
Franchini et al. Cytoplasmic localization of the HTLV-III 3′ orf protein in cultured T cells
US5795743A (en) HIV-3 retrovirus antigen compositions
JP2691184B2 (ja) 感染性ウイルス粒子を生産することなく、エイズウイルス抗原を製造する細胞系
Wang et al. Conditional infectivity of a human immunodeficiency virus matrix domain deletion mutant
DI MARZO VERONESE et al. Immunological and chemical analysis of P6, the carboxyl-terminal fragment of HIV P15
JP2537570B2 (ja) エイズ及びその他のレトロウイルス病用ワクチンの遺伝子工学による製造
US7229625B2 (en) Retrovirus-like particles made non-infectious by a plurality of mutations
Luo et al. Expression of gag precursor protein and secretion of virus-like gag particles of HIV-2 from recombinant baculovirus-infected insect cells
RU2111010C1 (ru) Иммуноген для предотвращения и лечения ретровирусных заболеваний, преимущественно спида
US6627395B1 (en) Methods for the propagation, isolation, identification, and preparation of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)
Pyle et al. Purification of 120,000 dalton envelope glycoprotein from culture fluids of human immunodeficiency virus (HIV)-infected H9 cells
Hosie The development of a vaccine against feline immunodeficiency virus
RU1837890C (ru) Способ получени иммуногена, стимулирующего иммунную систему человека, зараженного HIY
WO1988008449A1 (en) Hiv related human retrovirus strain with cloned nucleotide sequence and applications thereof
US20100178302A1 (en) Chronic pathogen-expressing cell lines
IL104340A (en) Antidotes against idiotyps that react with anti-PG 021 \ 061 antibodies
Bukrinsky et al. False‐positive sera do not react with human immunodeficiency virus (HIV) Gag‐encoded recombinant antigen
Manca et al. HTLV-1 seroprevalence in AIDS patients and in HIV-1 seropositive and seronegative subjects at risk for AIDS in northern Italy
Neurath et al. Radioimmunoassay and enzyme-linked immunoassay of antibodies directed against lymphadenopathy-associated virus (LAV) proteins larger than the core protein (P24)
Krohn et al. Proliferative T‐Cell Response to HIV Envelope Glycoprotein in Immunized and Infected Primates and Human Beings
WO1989009618A1 (en) Method for controlling hiv infectivity and vaccines for use therein

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20060610