RU2108579C1 - Method for investigating blood platelets activation and aggregation - Google Patents
Method for investigating blood platelets activation and aggregation Download PDFInfo
- Publication number
- RU2108579C1 RU2108579C1 RU96116232A RU96116232A RU2108579C1 RU 2108579 C1 RU2108579 C1 RU 2108579C1 RU 96116232 A RU96116232 A RU 96116232A RU 96116232 A RU96116232 A RU 96116232A RU 2108579 C1 RU2108579 C1 RU 2108579C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- aggregation
- medium
- platelet
- activation
- angles
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 title claims abstract description 25
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 230000004913 activation Effects 0.000 title claims description 20
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 title description 37
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 claims description 16
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 11
- 210000004623 platelet-rich plasma Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000000556 agonist Substances 0.000 claims description 6
- 230000010118 platelet activation Effects 0.000 claims description 6
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 3
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 claims 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 claims 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 9
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 abstract description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 abstract 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 21
- UCTWMZQNUQWSLP-UHFFFAOYSA-N adrenaline Chemical compound CNCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 UCTWMZQNUQWSLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- AQHHHDLHHXJYJD-UHFFFAOYSA-N propranolol Chemical compound C1=CC=C2C(OCC(O)CNC(C)C)=CC=CC2=C1 AQHHHDLHHXJYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 5'-adenylphosphoric acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 6
- XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N Adenosine diphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- BLGXFZZNTVWLAY-CCZXDCJGSA-N Yohimbine Natural products C1=CC=C2C(CCN3C[C@@H]4CC[C@@H](O)[C@H]([C@H]4C[C@H]33)C(=O)OC)=C3NC2=C1 BLGXFZZNTVWLAY-CCZXDCJGSA-N 0.000 description 5
- BLGXFZZNTVWLAY-UHFFFAOYSA-N beta-Yohimbin Natural products C1=CC=C2C(CCN3CC4CCC(O)C(C4CC33)C(=O)OC)=C3NC2=C1 BLGXFZZNTVWLAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 210000001243 pseudopodia Anatomy 0.000 description 5
- BLGXFZZNTVWLAY-SCYLSFHTSA-N yohimbine Chemical compound C1=CC=C2C(CCN3C[C@@H]4CC[C@H](O)[C@@H]([C@H]4C[C@H]33)C(=O)OC)=C3NC2=C1 BLGXFZZNTVWLAY-SCYLSFHTSA-N 0.000 description 5
- 229960000317 yohimbine Drugs 0.000 description 5
- AADVZSXPNRLYLV-UHFFFAOYSA-N yohimbine carboxylic acid Natural products C1=CC=C2C(CCN3CC4CCC(C(C4CC33)C(O)=O)O)=C3NC2=C1 AADVZSXPNRLYLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 229960003712 propranolol Drugs 0.000 description 4
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 3
- 230000001732 thrombotic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002834 transmittance Methods 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 239000000670 adrenergic alpha-2 receptor antagonist Substances 0.000 description 2
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 2
- 239000002876 beta blocker Substances 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000003771 laboratory diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 206010008132 Cerebral thrombosis Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000289659 Erinaceidae Species 0.000 description 1
- 244000060234 Gmelina philippensis Species 0.000 description 1
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 description 1
- 201000001429 Intracranial Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000030621 adenylate cyclase Human genes 0.000 description 1
- 108060000200 adenylate cyclase Proteins 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 239000003710 calcium ionophore Substances 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000001085 differential centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- PGHMRUGBZOYCAA-ADZNBVRBSA-N ionomycin Chemical compound O1[C@H](C[C@H](O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)/C=C/C[C@@H](C)C[C@@H](C)C(/O)=C/C(=O)[C@@H](C)C[C@@H](C)C[C@@H](CCC(O)=O)C)CC[C@@]1(C)[C@@H]1O[C@](C)([C@@H](C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-ADZNBVRBSA-N 0.000 description 1
- PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N ionomycin Natural products O1C(CC(O)C(C)C(O)C(C)C=CCC(C)CC(C)C(O)=CC(=O)C(C)CC(C)CC(CCC(O)=O)C)CCC1(C)C1OC(C)(C(C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002555 ionophore Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- HYIMSNHJOBLJNT-UHFFFAOYSA-N nifedipine Chemical compound COC(=O)C1=C(C)NC(C)=C(C(=O)OC)C1C1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O HYIMSNHJOBLJNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001597 nifedipine Drugs 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002287 radioligand Substances 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 238000013391 scatchard analysis Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к способам исследования функциональной активности тромбоцитов, конкретно к регистрации активации тромбоцитов: сферизации клеток и образование псевдоподий, а также и к регистрации агрегации клеток, и может быть использовано клинико-диагностическими лабораториями медицинских учреждений для выполнении диагностики предтромбоза и тромботических состояний, фармацевтическими предприятиями для тестирования действия фарм-препаратов и научными лабораториями для исследования молекулярных механизмов функционирования тромбоцитов и принципов организации сигнальных систем. The invention relates to methods for studying the functional activity of platelets, specifically to registering platelet activation: cell spherization and the formation of pseudopodia, as well as to register cell aggregation, and can be used by clinical diagnostic laboratories of medical institutions to diagnose pre-thrombosis and thrombotic conditions, pharmaceutical enterprises for testing the effects of pharmaceuticals and scientific laboratories to study the molecular mechanisms of functioning I have platelets and the principles of organization of signaling systems.
Анализ активации и агрегации тромбоцитов относится к важнейшим задачам гематологии, поскольку диагностика тромбозов широко распространена в клинической практике и играет важную роль в оценке патогенеза многих заболеваний. Летальность от ишемической болезни сердца и тромбозов сосудов головного мозга составляет в развитых странах 40-50% от общей летальности взрослого населения. Analysis of platelet activation and aggregation is one of the most important hematology problems, since the diagnosis of thrombosis is widespread in clinical practice and plays an important role in assessing the pathogenesis of many diseases. Mortality from coronary heart disease and cerebral thrombosis in developed countries is 40-50% of the total mortality of the adult population.
Наиболее распространенным способом оценки функциональной активности тромбоцитов является регистрация агрегации тромбоцитов по изменению пропускания - метод Борна (G.V.Born, V.J.Cross The aggregation of platelet. // J. Physiol. 1963, V. 16,P178-195). В этом методе при регистрации используется обогащенная плазма тромбоцитов с низким содержанием ионов кальция в среде. The most common way to evaluate platelet functional activity is to record platelet aggregation by transmittance change - the Born method (G.V. Born, V.J. Cross The aggregation of platelet. // J. Physiol. 1963, V. 16, P178-195). In this method, enriched platelet plasma with a low content of calcium ions in the medium is used during registration.
Существенным недостатком этого метода является трудность регистрации активации тромбоцитов по пропусканию в плазме, поскольку доля активационного сигнала составляет несколько процентов от общего сигнала (Born G.V.R. Odservations on the change in shape of blood platelets brought abort by adenosine diphosphate. //J.Physiol. -1970-V.209.P487-511) и невозможностью проводить оценку при физиологической концентрации ионов кальция в среде (около 1 mM). Микроскопический метод оценки форм тромбоцитов, обладая простотой и доступностью в клинической практике (Шитикова А.С. Изменение формы тромбоцитов как показатель их внутрисосудистой активации. В сб. "Клинико-лабораторная диагностика предтромбоза и тромботических состояний", С-Петербург: 1991, с. 38-52), является трудоемкими в исполнении, не реализуется в аппаратурном исполнении и не позволяет проводить кинетических исследований. A significant drawback of this method is the difficulty in registering platelet transmittance activation in plasma, since the proportion of the activation signal is several percent of the total signal (Born GVR Odservations on the change in shape of blood platelets brought abort by adenosine diphosphate. // J. Physiol. -1970 -V.209.P487-511) and the inability to evaluate at a physiological concentration of calcium ions in the medium (about 1 mM). A microscopic method for assessing platelet forms, having simplicity and accessibility in clinical practice (Shitikova A.S. Changing the shape of platelets as an indicator of their intravascular activation. In the collection "Clinical and laboratory diagnosis of prethrombosis and thrombotic conditions", St. Petersburg: 1991, p. 38-52), it is time-consuming to perform, is not implemented in hardware and does not allow kinetic studies.
Более широкими возможностями в регистрации активации и агрегации обладают рео-оптические методы, связанные или с изменением величины светопропускания при изменении скорости перемешивания (Latimer P.,Born G.V.R.,Michal F. Application of light-scatteting theory to the optical effects associated wint the morphology of blood platelets. //Arch.Biochem.Biophys. -1977-V.180. P151-159. ; Holme S.,Murphy S. Quantative measurement of platelet shape by light transmission studies application to storage of platelets for transfusion. //J.Lab.Clin.Med.-1978-V.92(1).P53-64.) или анализом флюктуаций интенсивности прошедшего света (Габбасов.В.А, Попов.Е.Г, Гаврилов.И.Ю, Позин.Е.Я, Маркосян.Р.А. Новый методический подход к исследованию агрегации тромбоцитов in vitro. // Бюл. экспер., биол., 1989, N10, с. 437-440). Последний метод позволил авторам разработать новый способ определения индивидуальной чувствительности к нифедипину у больных сердечно-сосудистых заболеваний [2]. Возможности этих методов ограничены тем, что полученные результаты сильно зависят от гидродинамических характеристик измерительного прибора. Позволяя получить хорошее разрешение активационного и агрегационного процессов (в отличие от метода Борна), эти методы не позволяют различать активационные стадии (сферизация и образование псевдоподий). Другим недостатком этих методов является то, что все они реализованы в условиях плазмы с низким нефизиологическим значением концентрации ионов кальция в среде. Rheo-optical methods associated with or with a change in the transmittance with a change in the mixing speed possess broader possibilities in recording activation and aggregation (Latimer P., Born GVR, Michal F. Application of light-scatteting theory to the optical effects associated wint the morphology of blood platelets. //Arch.Biochem.Biophys. -1977-V.180. P151-159.; Holme S., Murphy S. Quantitative measurement of platelet shape by light transmission studies application to storage of platelets for transfusion. // J .Lab.Clin.Med.-1978-V.92 (1) .P53-64.) Or by analyzing fluctuations in the intensity of transmitted light (Gabbasov.V.A, Popov.E.G, Gavrilov.I.Yu., Pozin.E .Ya, Markosyan, R.A. A new methodological approach to the use of study by in vitro platelet aggregation. // Bull. Exper., biol., 1989, N10, p. 437-440). The latter method allowed the authors to develop a new method for determining individual sensitivity to nifedipine in patients with cardiovascular diseases [2]. The capabilities of these methods are limited in that the results obtained strongly depend on the hydrodynamic characteristics of the measuring device. Allowing to obtain a good resolution of the activation and aggregation processes (in contrast to the Born method), these methods do not allow distinguishing activation stages (spherization and pseudopodia formation). Another disadvantage of these methods is that they are all implemented in plasma conditions with a low non-physiological value of the concentration of calcium ions in the medium.
Широкое распространение получили проточные цитометрические анализаторы. Применение анализаторов в исследовании активации и агрегации (Barradas MA; O'Donoghue S; Milkhailidis DP Measurement of platelet volime using a channelyzer: assessment of the effect of agonists and antagonists. // In Vivo. -1992- V. 6(6). P. 629-34), (Pradalier A; Abuaf N; Launay JM; Vincent D Platelet size and volume distribution measured by automated platelet analyzer. // Cephalalgia. -1992-V.12(5). P 321-2.) дало удовлетворительные результаты, однако анализаторы не позволяют производить непрерывную регистрацию. Flow cytometric analyzers are widely used. The use of analyzers in the study of activation and aggregation (Barradas MA; O'Donoghue S; Milkhailidis DP Measurement of platelet volime using a channelyzer: assessment of the effect of agonists and antagonists. // In Vivo. -1992- V. 6 (6). P. 629-34), (Pradalier A; Abuaf N; Launay JM; Vincent D Platelet size and volume distribution measured by automated platelet analyzer. // Cephalalgia. -1992-V.12 (5). P 321-2.) gave satisfactory results, but the analyzers do not allow continuous recording.
Использование светорассеивающих характеристик тромбоцитов дает лучшую возможность в кинетической идентификации активных форм и агрегатов по сравнению с вышеперечисленными методами. Амплитудо-частотный анализ флюктуаций интенсивности рассеянного света в угле 90±23o позволил получить распределение по размерам образующихся агрегатов, но не дает возможности регистрировать активацию тромбоцитов (Ozaki Y; Satoh K; Yatomi Y; Yamamoto T; Shirasawa Y; Kume S. Detection of platelet aggregates with a particle counting method using light scattering. //Anal Biochem. -1994-V.218(2). P284-94). Прототипом к изобретению является способ, включающий получение обогащенной тромбоцитами плазмы (PRP) из крови, разбавление обогащенной тромбоцитами плазмы обедненной тромбоцитами плазмой, помещение разбавленной тромбоцитной плазмы в кюветное отделение фотометра, снабженного перемешивающим устройством, и измерение амплитудно-частотной характеристики интенсивности светорассеяния в 40o угле, который позволяет независимо регистрировать активацию (не разделяя ее по стадиям) и агрегацию тромбоцитов [1].The use of the light-scattering characteristics of platelets provides a better opportunity in the kinetic identification of active forms and aggregates in comparison with the above methods. The amplitude-frequency analysis of fluctuations in the intensity of scattered light at an angle of 90 ± 23 o allowed us to obtain a size distribution of the formed aggregates, but it does not make it possible to detect platelet activation (Ozaki Y; Satoh K; Yatomi Y; Yamamoto T; Shirasawa Y; Kume S. Detection of platelet aggregates with a particle counting method using light scattering. // Anal Biochem. -1994-V.218 (2). P284-94). A prototype of the invention is a method comprising receiving platelet rich plasma (PRP) from blood, diluting platelet rich plasma with platelet poor plasma, placing the diluted platelet plasma in a cuvette compartment of a photometer equipped with a stirrer, and measuring the amplitude-frequency characteristic of light scattering at 40 ° angle , which allows you to independently register activation (without dividing it by stages) and platelet aggregation [1].
Недостатками данного способа, принятого за прототип, являются невозможность проводить измерения при значениях ионов кальция в среде близким к физиологическим (около 1 mM) и невозможность использовать интенсивность светорассеяния для идентификации активационных стадий. Указанные недостатки обусловлены тем, что для разбавления обогащенной тромбоцитами плазмы использована обедненная тромбоцитами плазма. The disadvantages of this method, adopted as a prototype, are the inability to measure when the values of calcium ions in the medium are close to physiological (about 1 mM) and the inability to use the light scattering intensity to identify activation stages. These drawbacks are due to the fact that platelet-poor plasma was used to dilute platelet-rich plasma.
Целью изобретения является разработка способа измерения активированных форм тромбоцитов для исследования ранее недоступных кинетических параметров 2-х стадий активации и исследования агрегации клеток при физиологической концентрации ионов кальция в среде, что позволяет расширить информационную ценность клинических, фармакологических и научных методов. The aim of the invention is to develop a method for measuring activated forms of platelets for the study of previously inaccessible kinetic parameters of 2 stages of activation and study of cell aggregation at a physiological concentration of calcium ions in the medium, which allows to expand the informational value of clinical, pharmacological and scientific methods.
Поставленная цель достигается тем, что плазма разбавляется в 20-100 раз солевой средой с малым коэффициентом преломления и последующая регистрация интенсивности светорассеяния осуществляется в малых углах в условиях однократного рассеяния. Условия разбавления позволяют варьировать среду и проводить исследования при значениях концентрации ионов кальция в среде, близких к физиологическим (около 1 mM). This goal is achieved by the fact that the plasma is diluted 20-100 times with a salt medium with a low refractive index and the subsequent registration of light scattering intensity is carried out at small angles under conditions of a single scattering. The dilution conditions allow you to vary the medium and conduct studies at values of the concentration of calcium ions in the medium close to physiological (about 1 mM).
Предлагаемый способ поясняется фиг. 1-9. The proposed method is illustrated in FIG. 1-9.
Критерием оценки появления эффектов многократного рассеяния является отклонение от линейной зависимости рассеянного света и концентрации тромбоцитов. Зависимости интенсивности светорассеяния от концентрации неактивированных клеток в углах регистрации 1-15o в кювете длиной 2 см в солевой среде (140 mM NaCl, pH 7,8 Трисбуфер, [Ca2+]o-0,6 mM) в диапазоне концентрации клеток до 107 кл/мл является линейной (при большей клеточности сказываются эффекты многократного рассеяния и зависимости теряет линейный характер) (см. фиг.1). Диапазон по концентрации клеток 105 oC107 кл/мл является существенным условием реализации предлагаемого способа. Величина сигнала интенсивности светорассеяния после добавления PRP пропорциональная концентрация клеток.The criterion for assessing the occurrence of multiple scattering effects is the deviation from the linear dependence of the scattered light and platelet concentration. Dependences of the light scattering intensity on the concentration of unactivated cells at registration angles 1-15 ° in a 2 cm long cuvette in saline medium (140 mM NaCl, pH 7.8 Trisbuffer, [Ca 2+ ] o -0.6 mM) in the cell concentration range up to 10 7 cells / ml is linear (with greater cellularity, the effects of multiple scattering affect and the dependence loses its linear character) (see figure 1). The range of
В наших условиях разбавления плазмы (PRP) агрегация тромбоцитов возможна только при условии добавления ионов кальция в среду (0,2-1 mM CaCl2) и протекает, преимущественно, с образованием диаметров, т.к. является реакцией второго порядка по отношению к концентрации клеток. Это положение показано на фиг. 2.Under our conditions of plasma dilution (PRP), platelet aggregation is possible only if calcium ions are added to the medium (0.2-1 mM CaCl 2 ) and proceeds mainly with the formation of diameters, because is a second-order reaction with respect to cell concentration. This position is shown in FIG. 2.
Идентификации активационных стадий, агрегации и выбор углов регистрации светорассеяния сделан на основании исследования индикатрисс светорассеяния суспензии тромбоцитов в разных состояниях. На фиг. 3 представлен полулогарифмический вид индикатрисс рассеяния мономеров (дисков), полученных при внесении PRP в солевую среду: 140 mM NaCl, pH 7,8 трис-буфер, CaCl2=0,6 mM и димеров (полученных при агрегации, вызванной 0,6 μ М АДФ). Полнота димеризации контролировалась следующими условиями: 1) агрегация (регистрируемая в 4%-ном угле) имеет быстрый (около 5 мин) экспоненциальный характер и при выходе на плато не имеет обратимого характера (т.е. дезагрегации и образования агрегатов с большим числом клеток не наблюдается; оба эти процесса вызывают уменьшение сигнала); 2) при выходе на плато добавка 3 μ М адреналина не вызывает изменения сигнала (все клетки активированы). Видно, что в диапазоне углов 5 - 6o наблюдается инверсия сигнала. Удобным для регистрации агрегационного процесса является угол около 4o, что дает величину отношения интенсивностей светорассеяния от димеров и от мономеров γ около 3 oC 4. Эта величина удобна для оценки полноты агрегационного процесса.The identification of activation stages, aggregation, and the choice of light scattering detection angles are based on the study of light scattering indicatrixes of a platelet suspension in different states. In FIG. Figure 3 shows the semi-logarithmic form of the scattering indicatrix of monomers (disks) obtained by adding PRP to the salt medium: 140 mM NaCl, pH 7.8 Tris buffer, CaCl 2 = 0.6 mM and dimers (obtained by aggregation caused by 0.6 μ M ADP). The completeness of dimerization was controlled by the following conditions: 1) aggregation (recorded at 4% angle) has a fast (about 5 min) exponential character and when reaching a plateau it does not have a reversible character (i.e., disaggregation and aggregation with a large number of cells are not observed; both of these processes cause a decrease in the signal); 2) when reaching a plateau, the addition of 3 μM adrenaline does not cause a signal change (all cells are activated). It is seen that in the range of angles 5 - 6 o there is a signal inversion. An angle of about 4 ° is convenient for recording the aggregation process, which gives a ratio of light scattering intensities from dimers to monomers γ of about 3 ° C. This value is convenient for assessing the completeness of the aggregation process.
Первичная активация клеток (сферизация) связана с повышением внутриклеточной концентрации ионов кальция (Siess W.Molekular mechanisms of platelet activation. //Physiological Reviews -1989-V.69,N.1,58-178), что достигается действием агонистов (АДФ), действием кальциевых ионофоров или при изменении ионного состава среды. Нами было показано, что действие этих факторов проявляется только в динамике изменения интенсивности светорассеяния в диапазоне углов 9-16o, тогда как изменения интенсивности светорассеяния в диапазоне углов 1-8o не наблюдается. Действительно, в низких дозах АДФ (nM), иономицин (Ca-ионофор) (при 0,2 μ M) вызывает увеличение I12 (интенсивности в 12-ти градусном угле) (фиг. 4), что позволяет связывать это увеличение со сферической клетки.Primary cell activation (spherization) is associated with an increase in the intracellular concentration of calcium ions (Siess W. Molecular mechanisms of platelet activation. // Physiological Reviews -1989-V.69, N.1.58-178), which is achieved by the action of agonists (ADP) , the action of calcium ionophores or when changing the ionic composition of the medium. We have shown that the effect of these factors is manifested only in the dynamics of changes in light scattering intensity in the range of angles 9-16 o , while changes in light scattering intensity in the range of angles 1-8 o are not observed. Indeed, at low doses of ADP (nM), ionomycin (Ca-ionophore) (at 0.2 μ M) causes an increase in I 12 (intensity at a 12-degree angle) (Fig. 4), which allows us to associate this increase with a spherical cells.
Устойчивая сферизация (что важно в регистрации индикатриссы) достигается при полной замене ионов натрия калиевыми в нашей среде (фиг. 5). Она характеризуется направленностью сигнала "Активации", сходной с той, которая проявляется под действием сильных агонистов в Na-среде, сигнал достигается того же уровня, однако скорости увеличения этого сигнала на порядок медленнее скорости, вызываемой агонистами (t1/2≈ мин, по сравнению t1/2≈ с в присутствии агонистов). Как видно фиг.5 в N+-среде спонтанной активации не наблюдается, а в K+-среде наблюдается спонтанная первая стадия активации (сферизация). В присутствии ЭДТА (1 mM) в KCl среде перехода не наблюдается (или он очень медленный) (фиг. 5).Stable spherization (which is important in registering an indicatrix) is achieved with a complete replacement of sodium ions with potassium in our environment (Fig. 5). It is characterized by the direction of the “Activation” signal, similar to that manifested by strong agonists in the Na medium, the signal reaches the same level, however, the rate of increase of this signal is an order of magnitude slower than the speed caused by the agonists (t 1/2 ≈ min, compared t 1/2 ≈ s in the presence of agonists). As can be seen in FIG. 5, in the N + environment, spontaneous activation is not observed, and in the K + environment, a spontaneous first stage of activation (spherization) is observed. In the presence of EDTA (1 mM), no transition is observed in the KCl medium (or it is very slow) (Fig. 5).
Получив устойчивое сферическое состояние в KCl-среде, мы провели сравнение индикатрисс неактивированных клеток (дисков) (в NaCl-среде) и сферизованных (в KCl-среде). На фиг. 6 видно, что их индикатриссы совпадают в малых углах (3-8o) и расходятся в более дальних углах (9-15o). Иидикатриссы расходятся также около 1o, но соотношение в сигналах при этом значительно меньше.Having obtained a stable spherical state in a KCl medium, we compared the indicatrices of unactivated cells (disks) (in a NaCl medium) and spherized (in a KCl medium). In FIG. 6 it can be seen that their indicatrices coincide in small angles (3-8 o ) and diverge in more distant angles (9-15 o ). Idicatrixes also diverge about 1 o , but the ratio in the signals is much less.
То, что в наших условиях разбавления плазмы агрегация невозможна в солевой среде без внесения свободного кальция в среду, можно удачно использовать для независимого исследования кривые светорассеяния тромбоцитов (концентрация клеток 2•106 кл/мл) в солевой среде (140 mM NaCl, 12 mM Трисбуфер pH 7,8) при двух углах: 4 и 12o, при внесении 0,6 μ M АДФ, с последующей добавкой CaCl2 (0,6 mM), вызывающей агрегацию. Видно, что в отсутствии агрегации динамика сигнала в угле 12o имеет двухфазный характер, что дает право связать ее с двумя реакциями: сферизацией клетки и образованием псевдоподий, а агрегация (как образование димеров) регистрируется в обоих углах, причем наблюдается инвертирование сигнала в 12-ти градусном угле при сохранении временных показателей в обоих углах регистрации.The fact that, under our conditions of plasma dilution, aggregation is impossible in a salt medium without adding free calcium to the medium, we can successfully use platelet light scattering curves (
Тромбоциты с псевдоподиями ("ежики"), т.е. способные к агрегации после внесения кальция в среду, и неактивированные (диски) дают совпадающие индикатриссы и отличаются только флюктуацией сигнала. Platelets with pseudopodia ("hedgehogs"), i.e. capable of aggregation after calcium is added to the medium, and inactive (discs) give matching indicatrices and differ only in signal fluctuation.
Таким образом одновременная регистрация интенсивности светорассеяния в двух углах (около 4 и 12o) суспензии тромбоцитов в солевой среде (с малым коэффициентом преломления) позволяет провести идентификацию активационных стадий и агрегации. На фиг. 8 показана поэтапная схема получения тромбоцитов в разных состояниях. Помещение клеток в KCl-среду (без добавления кальция) переводит тромбоцит в сферизованное состояние, добавка насыщающей концентрации АДФ (около 1 μ M) позволяет тромбоцитам образовать псевдоподий и, наконец, внесение кальция в среду (около 1 mM) вызывает агрегацию клеток. Обратный порядок эксперимента позволяет определить процентную долю клеток в разных состояниях. Диагностическая ценность такого определения подтверждена многими работами (напр. Шитикова А.С. Изменение формы тромбоцитов как показатель их внутрисосудистой активации. В сб. "Клинико-лабораторная диагностика предтромбоза и тромботических состояний", С-Петербург: 1991, с.38-52).Thus, the simultaneous recording of light scattering intensity at two angles (about 4 and 12 o ) of a platelet suspension in a salt medium (with a low refractive index) allows the identification of activation stages and aggregation. In FIG. 8 shows a phased scheme for the production of platelets in different states. Placing cells in a KCl medium (without adding calcium) transfers the platelet to a spherical state, adding a saturating concentration of ADP (about 1 μM) allows platelets to form pseudopodia and, finally, introducing calcium into the medium (about 1 mM) causes cell aggregation. The reverse order of the experiment allows us to determine the percentage of cells in different states. The diagnostic value of this definition has been confirmed by many works (for example, A. Shitikova. Changing the shape of platelets as an indicator of their intravascular activation. In the collection "Clinical and laboratory diagnosis of prethrombosis and thrombotic conditions", St. Petersburg: 1991, p. 38-52) .
Пример. Получение обогащенной плазмы тромбоцитов из венозной донорской крови кроликов методом дифференциального центрифугирования с использованием в качестве антикоагулянта 3,2%-ного цитрата натрия (pH 6,0). Example. Obtaining enriched platelet plasma from venous donor blood of rabbits by differential centrifugation using anticoagulant 3.2% sodium citrate (pH 6.0).
Разбавление обогащенной тромбоцитами плазмы в 50 раз KCl-средой (140 mM KCl, 10 mM Трис-Cl буфер (pH 7,8)) при этом наблюдается сферизация тромбоцитов. После чего тромбоциты кроликов приобретают способность агрегировать под влиянием адреналина (в NaCl - среде тромбоциты не чувствительны к действию адреналина). Получив фиксированное (достаточно устойчивое) состояние начальной активации тромбоцитов в K+ среде (устойчивый "шарик"), проводят кинетическое исследование второй стадии активации (формирование "ежика"). Далее проводится графическая обработка результатов этих экспериментов методом Вульфа (зависимость ΔI от ΔI/S , что позволяет получить, оценить параметры связывания адреналина и блокирования связывания антагонистами : иохимбином ( α2 -адреноблокатор) и пропранололом ( β -адреноблокатор) сходные с данными полученными радиолигандным методом (анализ по Скэтчарду) (Bylund D.B.(1994). На фиг. 9 (зависимость ΔI12 от ΔI12/ [адреналин]) представлен графический анализ параметров связывания адреналина, и его блокирования пропранололом и иохимбином. Для обоих блокаторов видно, что тип ингибирования - конкурентный, а вычисленные значения для адреналина - Kм (EC50) ≈ 1,5 μ M (концентрация медиатора, необходимая для достижения половины максимального эффекта), для иохимбина - Ki ≈ 50 nM (концентрация блокатора, необходимая половинного подавления связывания медиатора), для пропранолола - Ki ≈ 3 μ M, т. е. селективность иохимбина ( α2 -адреноблокатора) на два порядка выше пропранолола ( β -адреноблокатора). Значения Ki для иохимбина близким к величине KD (Авдонин П.В. (1994)) и принятому мнению о наличии в тромбоцитах преимущественно α2 - адренорецептора, характерной особенностью которого является сопряженность с Gi-белком, который вызывает угнетение аденилатциклазы.Dilution of platelet-
Из приведенного примера осуществления изобретения видно, как предлагаемый способ может быть использован для тестирования фарм-препаратов. From the above example embodiment of the invention shows how the proposed method can be used for testing pharmaceutical preparations.
Представленные данные свидетельствуют о том, что использование (изобретения обеспечивает возможность: измерения активированных форм тромбоцитов; исследовать кинетические параметры активации для оценки токсинов и лекарственных препаратов; научных задач по организации сигнальных систем клеток, особенность функционирования тромбоцитов при различных заболеваниях. The data presented indicate that the use (of the invention provides the possibility of: measuring activated forms of platelets; to study the kinetic parameters of activation for the assessment of toxins and drugs; scientific tasks on the organization of signaling systems of cells, a feature of the functioning of platelets in various diseases.
Claims (3)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU96116232A RU2108579C1 (en) | 1996-07-30 | 1996-07-30 | Method for investigating blood platelets activation and aggregation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU96116232A RU2108579C1 (en) | 1996-07-30 | 1996-07-30 | Method for investigating blood platelets activation and aggregation |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2108579C1 true RU2108579C1 (en) | 1998-04-10 |
| RU96116232A RU96116232A (en) | 1998-09-20 |
Family
ID=20184306
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU96116232A RU2108579C1 (en) | 1996-07-30 | 1996-07-30 | Method for investigating blood platelets activation and aggregation |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2108579C1 (en) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2213976C2 (en) * | 2001-02-20 | 2003-10-10 | Нижегородский государственный научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии | Method for evaluating aggregation properties of blood platelets |
| RU2297834C2 (en) * | 2005-04-21 | 2007-04-27 | Московский научно-исследовательский институт глазных болезней им. Гельмгольца | Method for carrying out yag-laser vitreolysis in traumatic hemophthalm cases |
| RU2319965C1 (en) * | 2006-11-27 | 2008-03-20 | Государственное учреждение Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского (МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского) | Method for determining blood state of aggregation in infantine inflammatory process cases |
| RU2336525C2 (en) * | 2006-09-08 | 2008-10-20 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Российский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method of evaluation of thrombocyte aggregation in blood plasma and time of its coagulation |
| RU2391665C1 (en) * | 2008-12-29 | 2010-06-10 | Общество с ограниченной ответственностью "ВИНТЕЛ" | Method of determining agregative activity of platelets and device for its realisation |
| RU2416796C1 (en) * | 2009-11-24 | 2011-04-20 | Федеральное государственное учреждение "Нижегородский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи" | Method for thrombocyte intravascular activation analysis |
| RU2426990C1 (en) * | 2009-11-19 | 2011-08-20 | Российская Федерация, от имени которой выступает Федеральное Агентство по науке и инновациям | Method of optical analysis of thrombocyte aggregation |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2179318C2 (en) * | 2000-04-05 | 2002-02-10 | Учебно-научный центр Медицинского центра Управления делами Президента РФ | Method of estimating effect of platelet concentration on factors of hemostasis systems |
-
1996
- 1996-07-30 RU RU96116232A patent/RU2108579C1/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 1. Affolter H., Platsches A., "Rheo-optical shape analysis of human blood platelets". Thromb. Haemostas, 1982, v.48(2), p.204-207. 2. SU, 1642385 (В.А.Габбасов и др.), 1989, G 01 N 33/49. * |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2213976C2 (en) * | 2001-02-20 | 2003-10-10 | Нижегородский государственный научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии | Method for evaluating aggregation properties of blood platelets |
| RU2297834C2 (en) * | 2005-04-21 | 2007-04-27 | Московский научно-исследовательский институт глазных болезней им. Гельмгольца | Method for carrying out yag-laser vitreolysis in traumatic hemophthalm cases |
| RU2336525C2 (en) * | 2006-09-08 | 2008-10-20 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Российский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method of evaluation of thrombocyte aggregation in blood plasma and time of its coagulation |
| RU2319965C1 (en) * | 2006-11-27 | 2008-03-20 | Государственное учреждение Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского (МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского) | Method for determining blood state of aggregation in infantine inflammatory process cases |
| RU2391665C1 (en) * | 2008-12-29 | 2010-06-10 | Общество с ограниченной ответственностью "ВИНТЕЛ" | Method of determining agregative activity of platelets and device for its realisation |
| RU2426990C1 (en) * | 2009-11-19 | 2011-08-20 | Российская Федерация, от имени которой выступает Федеральное Агентство по науке и инновациям | Method of optical analysis of thrombocyte aggregation |
| RU2416796C1 (en) * | 2009-11-24 | 2011-04-20 | Федеральное государственное учреждение "Нижегородский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи" | Method for thrombocyte intravascular activation analysis |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bliden et al. | Determination of non-Vitamin K oral anticoagulant (NOAC) effects using a new-generation thrombelastography TEG 6s system | |
| Gurbel et al. | First report of the point-of-care TEG: a technical validation study of the TEG-6S system | |
| Konstantinidi et al. | Clinical application of thromboelastography/thromboelastometry (TEG/TEM) in the neonatal population: a narrative review | |
| RU2391665C1 (en) | Method of determining agregative activity of platelets and device for its realisation | |
| Rand et al. | Platelet function assays | |
| Harrison et al. | Guidelines for the laboratory investigation of heritable disorders of platelet function | |
| McMichael et al. | Viscoelastic coagulation testing: technology, applications, and limitations | |
| Enriquez et al. | Point-of-care coagulation testing and transfusion algorithms | |
| Artang et al. | Fully automated thromboelastograph TEG 6s to measure anticoagulant effects of direct oral anticoagulants in healthy male volunteers | |
| Balle et al. | Platelet function during extracorporeal membrane oxygenation in adult patients | |
| Hebert et al. | Individual red blood cell fetal hemoglobin quantification allows to determine protective thresholds in sickle cell disease | |
| JP6526717B2 (en) | Methods and reagents for detecting fibrinolysis and hyperfibrinolysis | |
| KR20150038327A (en) | Method and system for absolute platelet percent aggregation determination | |
| RU2108579C1 (en) | Method for investigating blood platelets activation and aggregation | |
| Mason et al. | The current role of platelet function testing in clinical practice | |
| Manivannan et al. | Diagnosis of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria: recent advances | |
| Haines et al. | In vitro and in vivo assessment of platelet function in healthy dogs during administration of a low-dose aspirin regimen | |
| JP2018189658A (en) | Blood analysis | |
| Botto et al. | Thromboelastometric assessment of hemostasis following hydroxyethyl starch (130/0.4) administration as a constant rate infusion in hypoalbuminemic dogs | |
| Alayoud et al. | Utility of a blood volume monitor in the management of anemia in dialysis by computing the total hemoglobin mass | |
| Fries et al. | Point-of-care testing in critically ill patients | |
| Kataria et al. | Redefining haemostasis: Role of rotational thromboelastometry in critical care settings | |
| JP2022550653A (en) | Methods for Determining Blood Gases or Metabolic Parameters | |
| Ofek et al. | International normalized ratio as a screening test for assessment of anticoagulant activity for patients treated with rivaroxaban or apixaban: a pilot study | |
| WO2023242387A1 (en) | Automated fluorescence-based quantification of pocked red cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20150731 |