RU2197988C2 - Antiplague vaccine - Google Patents
Antiplague vaccine Download PDFInfo
- Publication number
- RU2197988C2 RU2197988C2 RU97116840/13A RU97116840A RU2197988C2 RU 2197988 C2 RU2197988 C2 RU 2197988C2 RU 97116840/13 A RU97116840/13 A RU 97116840/13A RU 97116840 A RU97116840 A RU 97116840A RU 2197988 C2 RU2197988 C2 RU 2197988C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- vaccine
- dna
- antigen
- vaccine according
- specified
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 82
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 63
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 claims abstract description 53
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 33
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 28
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 20
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 12
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 58
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 54
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 54
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 53
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 29
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 claims description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 11
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 8
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 claims description 7
- 239000002775 capsule Substances 0.000 claims description 7
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 6
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 5
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 claims description 5
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Chemical compound OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 4
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 claims description 3
- 239000004621 biodegradable polymer Substances 0.000 claims description 3
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 claims description 3
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 claims description 3
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 2
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 claims description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108700028353 OmpC Proteins 0.000 claims 1
- 108700016242 Yersinia pestis caf1 Proteins 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 101150018266 degP gene Proteins 0.000 claims 1
- 101150007310 htrA gene Proteins 0.000 claims 1
- 239000002569 water oil cream Substances 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 241000607734 Yersinia <bacteria> Species 0.000 abstract 1
- 241000894007 species Species 0.000 abstract 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 45
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 41
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 35
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 34
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 27
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 22
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 22
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 20
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 19
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 19
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 19
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 18
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 17
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 15
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 15
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 15
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 14
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 14
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 14
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 14
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 11
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 10
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 10
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 10
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 10
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 9
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 9
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 8
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 7
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 7
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 7
- RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N Poloxamer Chemical compound C1CO1.CC1CO1 RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 5
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 5
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 5
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 4
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 4
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 4
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101100257994 Arabidopsis thaliana FAB2 gene Proteins 0.000 description 3
- 241001167018 Aroa Species 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000506654 Haemulon album Species 0.000 description 3
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 3
- 241000293871 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi Species 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 3
- 101150037081 aroA gene Proteins 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 3
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 3
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 description 3
- 229940126578 oral vaccine Drugs 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- -1 polyoxypropylene Polymers 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 3
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 3
- 101100491986 Emericella nidulans (strain FGSC A4 / ATCC 38163 / CBS 112.46 / NRRL 194 / M139) aromA gene Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 2
- 201000006824 bubonic plague Diseases 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- BTIJJDXEELBZFS-QDUVMHSLSA-K hemin Chemical compound CC1=C(CCC(O)=O)C(C=C2C(CCC(O)=O)=C(C)\C(N2[Fe](Cl)N23)=C\4)=N\C1=C/C2=C(C)C(C=C)=C3\C=C/1C(C)=C(C=C)C/4=N\1 BTIJJDXEELBZFS-QDUVMHSLSA-K 0.000 description 2
- 229940025294 hemin Drugs 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000000935 solvent evaporation Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UWTATZPHSA-N D-lactic acid Chemical compound C[C@@H](O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 108010088842 Fibrinolysin Proteins 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 108010054278 Lac Repressors Proteins 0.000 description 1
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 101100257820 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) ssp-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000046974 Tscherskia triton Species 0.000 description 1
- 241001467018 Typhis Species 0.000 description 1
- 206010048249 Yersinia infections Diseases 0.000 description 1
- 208000025079 Yersinia infectious disease Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N acridine orange free base Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3C=C21 DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002730 additional effect Effects 0.000 description 1
- 229960003311 ampicillin trihydrate Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 150000001491 aromatic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N benzoquinolinylidene Natural products C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 229940030156 cell vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- IQFVPQOLBLOTPF-HKXUKFGYSA-L congo red Chemical compound [Na+].[Na+].C1=CC=CC2=C(N)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3)C3=CC=C(C=C3)/N=N/C3=C(C4=CC=CC=C4C(=C3)S([O-])(=O)=O)N)=CC(S([O-])(=O)=O)=C21 IQFVPQOLBLOTPF-HKXUKFGYSA-L 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 229940022769 d- lactic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000011152 fibreglass Substances 0.000 description 1
- 229940001501 fibrinolysin Drugs 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000005661 hydrophobic surface Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 229940102213 injectable suspension Drugs 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229940039412 ketalar Drugs 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 229940124590 live attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940023012 live-attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012768 mass vaccination Methods 0.000 description 1
- VPNGEIHDPSLNMU-UHFFFAOYSA-N medetomidine hydrochloride Chemical compound Cl.C=1C=CC(C)=C(C)C=1C(C)C1=CNC=N1 VPNGEIHDPSLNMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 231100000957 no side effect Toxicity 0.000 description 1
- QHGUCRYDKWKLMG-UHFFFAOYSA-N octopamine Chemical compound NCC(O)C1=CC=C(O)C=C1 QHGUCRYDKWKLMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001576 octopamine Drugs 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 229960004545 plague vaccines Drugs 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000033458 reproduction Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000012130 whole-cell lysate Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к новым вакцинам, применяемым в качестве меры предосторожности по защите от инфицирования микроорганизмом Yersinia pestis, и к способам их введения. В частности, обеспечиваются парентерально или перорально вводимые вакцины, способные обеспечить защиту от бубонной и легочной чумы, особенно путем индукции слизистого иммунитета как у людей, так и у других животных. The invention relates to new vaccines used as a precautionary measure against infection by the microorganism Yersinia pestis, and to methods for their administration. In particular, parenteral or oral vaccines are provided that can provide protection against bubonic and pulmonary plague, especially by inducing mucosal immunity in both humans and other animals.
Yersinia pestis представляет собой высоко вирулентный патогенный микроорганизм, вызывающий чуму у большого числа животных, включая человека. Инфицирование такими микроорганизмами ведет к высокому коэффициенту смертности. Исследования показали, что высокая вирулентность является следствием сложного ряда факторов, кодируемых как хромосомой, так и тремя плазмидами, включающего в себя гены Lcr, фибринолизин и капсулу. Yersinia pestis is a highly virulent pathogen that causes plague in a large number of animals, including humans. Infection with such microorganisms leads to a high mortality rate. Studies have shown that high virulence is the result of a complex series of factors encoded by both the chromosome and three plasmids, including the Lcr genes, fibrinolysin and capsule.
Человек является случайным хозяином в естественном цикле заболевания, и бубонная чума, характеризующаяся припухлостью местных лимфатических узлов, может развиться вследствие укуса инфицированной блохи. Одним из осложнений бубонной чумы является вторичная пневмония, и в данных случаях заболевание легко передается от человека к человеку воздушнокапельным путем. Чума эндемична для регионов Северной и Южной Америки, Африки, Китая и Азии (смотри Butler (1983) Plaque and Other Yersinia Infections; Plenum Press, New York). Считается, что современные вспышки заболевания являются частью четвертой всемирной пандемии заболевания с очевидной необходимостью защиты лиц, проживающих или передвигающихся по территориям распространения заболевания, и персонала лабораторий, контактирующего с бактерией. A person is a random host in the natural cycle of the disease, and bubonic plague, characterized by swelling of the local lymph nodes, can develop due to the bite of an infected flea. One of the complications of bubonic plague is secondary pneumonia, and in these cases, the disease is easily transmitted from person to person by airborne droplets. Plague is endemic in the Americas, Africa, China, and Asia (see Butler (1983) Plaque and Other Yersinia Infections; Plenum Press, New York). It is believed that modern outbreaks of the disease are part of the fourth global pandemic of the disease with the obvious need to protect people living or moving around the disease, and laboratory personnel in contact with the bacterium.
Современные цельноклеточные вакцины, пригодные для предотвращения развития чумы, высоко гетерогенны, что приводит к возникновению побочных эффектов, которые делают их неподходящими для широкомасштабного применения (например, Meyer et аl. (1974) J. Infect.Dis. 129 прил. 13-18 и 85-120; Marshall et al. (1974) там же прил. 19-25). Modern whole-cell vaccines suitable for preventing the development of plague are highly heterogeneous, leading to side effects that make them unsuitable for widespread use (e.g., Meyer et al. (1974) J. Infect.Dis. 129 appendix 13-18 and 85-120; Marshall et al. (1974) ibid. 19-25).
Одной современной противочумной вакциной является вакцина Cutter, которая содержит зафиксированные формальдегидом бациллы чумы и которую вводят в организм с помощью внутримышечной инъекции. Однако, несмотря на то что парентеральная иммунизация эффективна для индукции системного иммунитета, она не способна эффективно индуцировать слизистый иммунитет (McGhee et al) (1992) Vaccine 10, 75-88), и сообщалось о случаях развития легочной чумы у вакцинированных лиц (Meyer (1970) Bull. WHO 42 стр.653-666). Итак, о вакцине, способной индуцировать защитный иммунный ответ на поверхности слизистых оболочек, не сообщалось. One modern plague vaccine is the Cutter vaccine, which contains formaldehyde-fixed plague bacilli and is injected into the body via intramuscular injection. However, although parenteral immunization is effective in inducing systemic immunity, it is not able to effectively induce mucosal immunity (McGhee et al) (1992) Vaccine 10, 75-88), and cases of the development of pulmonary plague in vaccinated individuals have been reported (Meyer ( 1970) Bull. WHO 42 pp. 653-666). So, a vaccine capable of inducing a protective immune response on the surface of mucous membranes has not been reported.
В бывшем Советском Союзе с 1939 года интенсивно испытывали и применяли живую ослабленную вакцину EV76, хотя ее эффективность в индукции иммунного ответа у человека спорна (Meyer et al. (1974) J.Infect.Dis. 129 прил.: 13-18). Было показано, что вирулентность EV76 различается у нескольких видов животных, и приматы, кроме человека, особенно подвержены хроническому инфицированию данным штаммом. На Западе данную вакцину считают неприменимой для массовых вакцинаций по причине крайней тяжести побочных эффектов и способности штамма возвращаться к полной вирулентности. In the former Soviet Union, the live attenuated EV76 vaccine was intensively tested and used since 1939, although its effectiveness in inducing an immune response in humans is controversial (Meyer et al. (1974) J.Infect.Dis. 129 appendix: 13-18). It has been shown that the virulence of EV76 varies in several animal species, and primates, except humans, are especially susceptible to chronic infection with this strain. In the West, this vaccine is considered inapplicable for mass vaccinations due to the extreme severity of side effects and the ability of the strain to return to full virulence.
Двумя известными антигенами Y.pestis являются LcrV (V-антиген) и F1-антиген Y.pestis, для каждого из которых сейчас обнаружена способность индуцировать защитный иммунный ответ у животных. Авторы настоящего изобретения ранее получили микроорганизмы для живой перорально вводимой вакцины, способные экспрессировать V-антиген и F1-антиген соответственно, каждый из которых обеспечивает хорошую защиту при контрольном заражении Y.pestis до 103 КОЕ. Данные вакцины являются предметом соответствующих заявок на патент PCT/GB 94/02818 и GB 9404577.O.Two known Y.pestis antigens are LcrV (V antigen) and Y.pestis F1 antigen, each of which has now been found to induce a protective immune response in animals. The inventors of the present invention have previously obtained microorganisms for a live, orally administered vaccine capable of expressing a V antigen and an F1 antigen, respectively, each of which provides good protection against a control infection of Y. pestis with up to 10 3 CFU. These vaccines are the subject of the relevant patent applications PCT /
Авторы настоящего изобретения обнаружили удивительный факт, что тогда как было показано, что только живая вакцина EV, создающая неприемлемо вредные для здоровья факторы, способна обеспечить хорошую защиту при контрольном заражении 109 и более КОЕ штамма GB Y.pestis, a V- и F1-антигены по отдельности обеспечивают полную защиту при контрольном заражении лишь около 105 КОЕ, при введении объединенной вакцины, содержащей V- и F1-антигены, они могут, по меньшей мере, обеспечить такую же защиту, что и EV76, без какого-либо риска, из-за которого воздерживаются от всеобщего применения вакцины EV.The inventors of the present invention discovered the surprising fact that while it was shown that only a live EV vaccine that creates unacceptably unhealthy factors can provide good protection against infection with 10 9 or more CFU of GB strain Y. pestis, a V- and F1- individually antigens provide complete protection during infection control of only about 10 5 CFU, when a combined vaccine containing V and F1 antigens is administered, they can at least provide the same protection as EV76, without any risk, because of which they refrain from seobschego use EV vaccine.
Они обнаружили, что носителем для введения может быть простая смесь двух белковых компонентов, что еще более преимущественно по сравнению с более сложным ослабленным цельным микроорганизмом. Для долгосрочной защиты и в целях индукции слизистого иммунитета они обеспечили предпочтительные формы вакцины, содержащие два компонента в форме живой ослабленной вакцины, такой как F1- и V-экспрессирующая АrоА или С Salmonella typhi, на которую ссылаются в указанных выше совместно поданных заявках, или в более предпочтительных формах одинарного или двойного мутанта, экспрессирующего данные антигены по отдельности, или гибридного белка, содержащего оба антигена. They found that the carrier for administration could be a simple mixture of two protein components, which is even more advantageous compared to a more complex, weakened whole microorganism. For long-term protection and for the purpose of inducing mucosal immunity, they provided preferred vaccine forms containing two components in the form of a live attenuated vaccine, such as the F1- and V-expressing AroA or C Salmonella typhi, referred to in the above jointly filed applications, or more preferred forms of a single or double mutant expressing these antigens individually, or a hybrid protein containing both antigens.
Далее, обеспечиваются микроорганизмы, содержащие как F1-, так и V-типы construct или плазмид из совместно поданных заявок настоящих заявителей, на которые ссылаются выше. Они включают в себя constructs, которые способны трансформировать микроорганизмы, заселяющие кишечник человека или животного так, чтобы они становились способны экспрессировать белки, которые эквивалентны по последовательности F1- и V-антигенам соответственно; причем это индуцирует защитный иммунный ответ на Yersinia pestis в организме человека или животного, когда микроорганизм вводят перорально или парентерально, и предпочтительно позволяет микроорганизму поддерживать его способность населять кишечник человека или животного. Further, microorganisms are provided that contain both F1- and V-types construct or plasmids from the jointly filed applications of the present applicants referred to above. They include constructs that are capable of transforming microorganisms that inhabit the intestines of a human or animal so that they become able to express proteins that are equivalent in sequence to the F1 and V antigens, respectively; moreover, it induces a protective immune response to Yersinia pestis in the human or animal body when the microorganism is administered orally or parenterally, and preferably allows the microorganism to maintain its ability to inhabit the intestines of the human or animal.
Особенно предпочтительные рекомбинантная ДНК, плазмида или микроорганизм, заселяющий кишечник человека или животного, кодирует или экспрессирует весь или защитную эпитопную часть зрелого V-белка Yersinia pestis и весь или защитную эпитопную часть зрелого F1-белка Yersinia pestis. ДНК, кодирующая весь или защитную эпитопную часть V-белка, и ДНК, кодирующая весь или защитную эпитопную часть F1-белка, могут применяться непосредственно в качестве генетической вакцины. Particularly preferred recombinant DNA, a plasmid, or a microorganism that colonizes the intestines of a human or animal, encodes or expresses the entire or protective epitope part of the mature Yersinia pestis V protein and the entire or protective epitope part of the mature Yersinia pestis F1 protein. DNA encoding the entire or protective epitope part of the V protein and DNA encoding the whole or protective epitope part of the F1 protein can be used directly as a genetic vaccine.
Особенно предпочтительная рекомбинантная ДНК, кодирующая V, содержит последовательность ДНК, как описана в ПОСЛ. ИД. 3, более предпочтительно, расположенная в рамке с промотором, таким как lacz и nirβ, и предпочтительно в векторе способном экспрессировать и реплицироваться в Salmonella. Особенно предпочтительная рекомбинантная ДНК, кодирующая F1, содержит последовательность ДНК, как описана в ПОСЛ. ИД. 10. ПОСЛ. ИД. 2 и ПОСЛ. ИД. 4 показывают аминокислотные последовательности двух предпочтительных V-антигенных белков; ПОСЛ. ИД. 2 представляет собой последовательность самого V-антигена, а ПОСЛ. ИД. 4 представляет собой последовательность V-антигена с четырьмя дополнительными определяемыми вектором N-концевыми аминокислотами. ПОСЛ. ИД. 11 представляет собой последовательность F1-белка, которая кодируется ПОСЛ. ИД. 10. A particularly preferred recombinant DNA encoding V contains a DNA sequence as described in SEQ. ID 3, more preferably located in a frame with a promoter such as lacz and nirβ, and preferably in a vector capable of expressing and replicating in Salmonella. A particularly preferred recombinant DNA encoding F1 contains a DNA sequence as described in SEQ.
Предпочтительные constructs ДНК, применяемые в микроорганизмах по изобретению, позволяют получать микроорганизмы, которые будучи введены перорально, индуцируют местную стимуляцию ассоциированной с кишечником лимфоидной ткани (АКЛТ, GALT) и посредством миграции лимфоцитов через общую иммунную систему слизистой оболочки обеспечивают вторичную стимуляцию ассоциированной с бронхами лимфоидной ткани (АБЛТ, BALТ). Таким образом, на поверхности слизистой оболочки дыхательных путей достигается развитие иммунного ответа, опосредованного секреторным IgA. Preferred DNA constructs used in the microorganisms of the invention allow the production of microorganisms which, when administered orally, induce local stimulation of intestinal lymphoid tissue (GALT) and, through the migration of lymphocytes through the general immune system of the mucous membrane, provide secondary stimulation of bronchial lymphoid tissue (ABLT, BALT). Thus, the development of an immune response mediated by secretory IgA is achieved on the surface of the mucous membrane of the respiratory tract.
Микроорганизмы, полученные путем трансформации с применением данной ДНК в виде вектора или вставленной непосредственно, предпочтительно являются ослабленными, более предпочтительно представляют собой ослабленные сальмонеллы. Microorganisms obtained by transformation using this DNA as a vector or directly inserted are preferably weakened, more preferably weakened salmonella.
Ослабленные микроорганизмы, такие как S.typhimurium, били положительно охарактеризованы в качестве носителей для различных гетерологичных антигенов (Curtiss (1990); Cardenas and Clements (1992)). Ослабление может быть осуществлено различными способами, как, например, путем применения подхода, заключающегося в использовании мутаций аrо А и/или аrо С (смотри Hosieth et al. (1980) Nature 291, 238-239; Douqan et al. (1986) Parasite Immunol. 9, 151-160; Chatfield et al. (1989) Vaccine 7, 495-498); также могут быть применены множественные мутации, такие как мутанты аrо А и аrо С, которые описаны Hone et al. (1991) Vaccine 9, стр.810-816. Однако может быть применен любой микрооорганизм с подходящим дефектом, который безопасен для применения в данных целях. Attenuated microorganisms, such as S. typhimurium, were positively characterized as carriers for various heterologous antigens (Curtiss (1990); Cardenas and Clements (1992)). Attenuation can be accomplished in various ways, such as, for example, by applying the ao A and / or aro C mutations (see Hosieth et al. (1980) Nature 291, 238-239; Douqan et al. (1986) Parasite Immunol. 9, 151-160; Chatfield et al. (1989) Vaccine 7, 495-498); multiple mutations, such as mutants aro A and aro C, as described by Hone et al. (1991) Vaccine 9, pp. 810-816. However, any microorganism with a suitable defect that is safe for this purpose can be used.
Для данных и других микроорганизмов известные многие другие такие ослабленные делеции и мутации, которые делают их подходящими для трансформации с помощью constructs по настоящему изобретению в целях экспрессии белков вакцины в кишечнике и/или заселения кишечника животных, подлежащих лечению от Y. pestis. Для иммунизации людей векторы, содержащие constructs по настоящему изобретению, помещают в ослабленную S. typhi и данный трансформированный организм применяют в качестве активного ингредиента живой пероральной вакцины. For these and other microorganisms, many other such attenuated deletions and mutations are known that make them suitable for transformation using the constructs of the present invention to express vaccine proteins in the intestines and / or colonize the intestines of animals to be treated for Y. pestis. To immunize humans, vectors containing the constructs of the present invention are placed in attenuated S. typhi and this transformed organism is used as an active ingredient in a live oral vaccine.
Когда ДНК применяют для трансформации ослабленного микроорганизма путем непосредственного включения ДНК в микроорганизм, это может быть осуществлено путем непосредственной интеграции в ген. Альтернативно, при включении в форме плазмиды, которая экспрессирует (кодирует?) V- или F1-белок или их эпитопные фрагменты, данная операция может быть осуществлена таким образом, что экспрессируется лишь V- или F1-белок или фрагмент или что экспрессия происходит в виде гибридного пептида с еще одним белковым или пептидным фрагментом, предпочтительно включающим другой из антигенных F1/V-компонентов. Такой еще один белковый или пептидный фрагмент может быть таковым, что это ускорило бы транспорт зрелых белков или пептида через клеточную мембрану наружу, или может представлять собой еще один антиген Y.pestis. When DNA is used to transform a weakened microorganism by directly incorporating DNA into the microorganism, this can be accomplished by direct integration into the gene. Alternatively, when incorporated in the form of a plasmid that expresses (encodes?) A V or F1 protein or its epitope fragments, this operation can be carried out in such a way that only a V or F1 protein or fragment is expressed, or that expression occurs as a hybrid peptide with another protein or peptide fragment, preferably comprising another of the antigenic F1 / V components. Such another protein or peptide fragment may be such that it would accelerate the transport of mature proteins or peptide across the cell membrane to the outside, or it may be another Y. pestis antigen.
Из штамма KIM Y.pestis Price et al. клонировали ген Icr и опубликовали его нуклеотидную последовательность в J.Bacteriol. (1989) 171, стр.5646-5653. В примерах, приведенных ниже, данную информацию применяли для конструирования олигонуклеотидных праймеров, которые могли бы амплифицировать ген из Y.pestis (штамм GB), применяя полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Праймеры ПЦР конструировали так, чтобы они были комплементарны соответствующим последовательностям, располагающимся за 5'- и 3'-концами гена IcrV, при этом имея 5'-концевые хвосты, содержащие сайт узнавания рестриктазы, для того чтобы сделать возможным направленное клонирование амплифицированного гена IcrV в плазмидный вектор (5'-праймер ПЦР, содержащий сайт EcorRI, и 3'-праймер, содержащий сайт Sad). Данные рестриктазные сайты представляют собой лишь примеры и не должны рассматриваться как исключающие другие рестриктазы. From KIM strain Y. pestis Price et al. cloned the Icr gene and published its nucleotide sequence in J. Bacteriol. (1989) 171, pp. 5646-5653. In the examples below, this information was used to design oligonucleotide primers that could amplify a gene from Y. pestis (strain GB) using a polymerase chain reaction (PCR). PCR primers were designed so that they were complementary to the corresponding sequences located at the 5'- and 3'-ends of the IcrV gene, while having 5'-tail tails containing the restriction enzyme recognition site in order to enable directional cloning of the amplified IcrV gene in plasmid vector (5'-PCR primer containing the EcorRI site, and 3'-primer containing the Sad site). These restriction enzyme sites are merely examples and should not be construed as excluding other restriction enzymes.
В примерах, приведенных ниже, constructs по изобретению включают в себя lac-промотор, но могут быть применены и другие промоторы, такие как промотор макрофагов (nirβ). In the examples below, constructs of the invention include the lac promoter, but other promoters, such as the macrophage promoter (nirβ), can be used.
Продуцирование F1 было в полной мере описано в Oyston et al. (1995) Infect.Immun. Том 63 2 стр.563 - смотри страницу 564 после результатов: Cloning and Expression of cafl. The production of F1 has been fully described in Oyston et al. (1995) Infect.Immun. Volume 63 2 p. 563 - see page 564 after the results: Cloning and Expression of cafl.
Дозировка антигенных компонентов в вакцине может варьировать в зависимости от индивидуальных характеристик иммунной системы животных, но для проведения иммунизации на мыши в качестве животной модели в примерах, приведенных ниже, было обнаружено, что по 10 мкг каждого из V и F1 на дозу является эффективной дозировкой для обеспечения полной защиты при использовании стандартного графика первичной и повторной иммунизации. The dosage of the antigenic components in the vaccine may vary depending on the individual characteristics of the animal’s immune system, but for immunization with mice as an animal model in the examples below, it was found that 10 μg of each of V and F1 per dose is an effective dosage for provide complete protection when using a standard schedule of primary and re-immunization.
Антигены могут быть включены в традиционный фармацевтически приемлемый носитель, каких-либо особенных ограничений здесь не налагается. Антигены могут быть с легкостью включены в масло в водной эмульсии. В состав вакцины могут быть включены адъюванты, и было обнаружено, что при лечении мышей в качестве модели эффективным является неполный адъювант Фройнда (НАФ). Antigens may be included in a traditional pharmaceutically acceptable carrier, without any particular limitation. Antigens can be easily incorporated into the oil in an aqueous emulsion. Adjuvants may be included in the vaccine, and it has been found that in the treatment of mice, Freund's incomplete adjuvant (NAF) is effective as a model.
Носитель может быть приспособленным для парентерального введения, в частности для внутрибрюшинного введения, но необязательно и для перорального введения, в случае вакцин, основанных на микроорганизмах, или в случае введения в форме капель или капсул, таких как липосомы или микрокапсулы, если это будет эффективно в доставке композиции в дыхательные пути индивидуума в целях индукции иммунного ответа в слизистых оболочках. Носитель может также включать в себя систему замедленного высвобождения, например Alhydrogel. The carrier may be adapted for parenteral administration, in particular for intraperitoneal administration, but not necessarily for oral administration, in the case of microorganism-based vaccines, or in the case of administration in the form of drops or capsules, such as liposomes or microcapsules, if this is effective in delivering the composition to the respiratory tract of an individual in order to induce an immune response in the mucous membranes. The carrier may also include a sustained release system, such as Alhydrogel.
Другой способ инкапсулирования включает в себя применение полимерных структур, в частности линейных блоксополимеров. Могут быть применены полимеры, подверженные биологическому разложению, например полимолочная кислота с или без гликолевой кислоты или блоксополимер; причем они могут содержать следующее повторяющееся звено: (ПОП-ПОЭ)n, где ПОП представляет собой полиоксипропилен, а ПОЭ представляет собой полиоксиэтилен. Блоксополимеры, которые содержат (ПОП-ПОЭ), особенно применимы.Another method of encapsulation involves the use of polymer structures, in particular linear block copolymers. Biodegradable polymers may be used, for example polylactic acid with or without glycolic acid or block copolymer; moreover, they may contain the following repeating unit: (POP-POE) n , where POP is polyoxypropylene and POE is polyoxyethylene. The block copolymers that contain (POP-POE) are especially applicable.
Теперь с помощью лишь иллюстрации будут приведены примеры способа, constructs, микроорганизмов и вакцин по изобретению путем ссылки на следующие список последовательностей, чертежи и примеры. Остальные осуществления будут очевидны специалистам в данной области в свете данных осуществлений. Now, by way of illustration only, examples of the method, constructs, microorganisms, and vaccines of the invention will be provided by reference to the following list of sequences, drawings, and examples. Other implementations will be apparent to those skilled in the art in light of these implementations.
Фиг. 1 в форме линейчатой диаграммы иллюстрирует коэффициенты выживаемости в ряде групп после контрольного заражения Y.pestis. FIG. 1 in the form of a bar chart illustrates survival rates in a number of groups after control infection with Y. pestis.
Фиг. 2 в графической форме иллюстрирует первичные ответы, опосредованные IgG, на внутримышечную иммунизацию мышей Balb/c БСА. FIG. 2 graphically illustrates primary IgG-mediated responses to intramuscular immunization of Balb / c BSA mice.
Список последовательностей
ПОСЛ. ИД. 1: показывает нуклеотидную и производную аминокислотную последовательности ДНК, кодирующей V, с 6 основаниями вектора pMAL-p2 или pMAL-c2, в котором ее клонируют, используя сайт EcoRI в последовательности GAATTC на 5'-конце (из 5'-концевого праймера ПЦР) и сайт Sall в последовательности GTCGAC на 3'-конце (из 3'-концевого праймера ПЦР). Основание в положении 1006 было заменено путем ПЦР-мутагенеза на Т с получением второго стоп-кодона в рамке. Началом аминокислотной последовательности является С-конец сайта отщепления фактора Ха.Sequence List
LAST ID 1: shows the nucleotide and derivative amino acid sequence of a DNA encoding V with 6 bases of the pMAL-p2 or pMAL-c2 vector in which it is cloned using the EcoRI site in the GAATTC sequence at the 5'-end (from the 5'-end PCR primer) and the Sall site in the GTCGAC sequence at the 3'-end (from the 3'-end PCR primer). The base at position 1006 was replaced by PCR mutagenesis with T to give a second stop codon in the frame. The beginning of the amino acid sequence is the C-terminus of the factor Xa cleavage site.
ПОСЛ.ИД. 2: показывает аминокислотную последовательность пептида, экспрессируемого вставочной ДНК по изобретению, с дополнительными четырьмя аминокислотами, кодируемыми вектором (IE+FS) на N-конце. LAST ID 2: shows the amino acid sequence of the peptide expressed by the inserted DNA of the invention, with an additional four amino acids encoded by the vector (IE + FS) at the N-terminus.
ПОСЛ. ИД. 3: показывает нуклеотидную и производную аминокислотную последовательности ДНК, кодирующей V, с 10 основаниями вектора pGEX-5X-2, в котором ее клонируют, показанный на 5'-конце, используя сайт EcoRI в последовательности GAATTC (GA - из 5'-концевого праймера ПЦР) и сайт Sall в последовательности GTCGAC (GTCGAC - из 3'-концевого праймера ПЦР). Основание в положении 1006 было заменено путем ПЦР-мутагенеза с получением второго стоп-кодона в рамке; основание в положении 16 было заменено с А на С с получением сайта EcoRI. Началом аминокислотной последовательности является С-конец сайта отщепления фактора Ха. LAST ID 3: shows the nucleotide and derivative amino acid sequence of a DNA encoding V with 10 bases of the pGEX-5X-2 vector in which it is cloned, shown at the 5'-end using the EcoRI site in the GAATTC sequence (GA from the 5'-end primer PCR) and the Sall site in the GTCGAC sequence (GTCGAC from the 3'-end PCR primer). The base at position 1006 was replaced by PCR mutagenesis to give a second stop codon in the frame; the base at position 16 was replaced from A to C to give the EcoRI site. The beginning of the amino acid sequence is the C-terminus of the factor Xa cleavage site.
ПОСЛ. ИД. 4: показывает аминокислотную последовательность пептида, экспрессируемого ДНК с ПОСЛ. ИД. 3, с четырьмя аминокислотами, кодируемыми вектором (G, I, P и G) на N-конце. LAST ID 4: shows the amino acid sequence of the peptide expressed by DNA with SEQ. ID 3, with four amino acids encoded by a vector (G, I, P, and G) at the N-terminus.
ПОСЛ. ИД. 5: показывает нуклеотидную последовательность 5'-концевого затравочного олигонуклеотида, применяемого для создания V-кодирующей ДНК, применяемой в ПОСЛ. ИД. 1. LAST ID 5: shows the nucleotide sequence of the 5'-terminal seed oligonucleotide used to create the V-coding DNA used in SEQ.
ПОСЛ. ИД. 6: показывает нуклеотидную последовательность 3'-концевого затравочного олигонуклеотида, применяемого для создания V-кодирующей ДНК, применяемой в примерах. LAST ID 6: shows the nucleotide sequence of the 3'-terminal seed oligonucleotide used to create the V-coding DNA used in the examples.
ПОСЛ. ИД. 7: показывает нуклеотидную последовательность ПЦР-затравочного олигонуклеотида, соответствующего первым 21 основаниям, кодирующим зрелый cafl с дополнительной 5'-областью, кодирующей сайт Saсl. LAST ID 7: shows the nucleotide sequence of a PCR primer oligonucleotide corresponding to the first 21 bases encoding mature cafl with an additional 5'-region encoding the CaCl site.
ПОСЛ. ИД. 8: показывает нуклеотидную последовательность ПЦР-затравочного олигонуклеотида, соответствующего последовательности cafl, которая кодирует "шпильку" правее терминирующего кодона, с дополнительной 5'-областью, кодирующей сайты Sacl и Accl. LAST ID 8: shows the nucleotide sequence of a PCR seed oligonucleotide corresponding to a cafl sequence that encodes a hairpin to the right of the termination codon, with an additional 5 ′ region encoding the Sacl and Accl sites.
ПОСЛ. ИД. 9: показывает нуклеотидную последовательность ПЦР-затравочного олигонуклеотида, соответствующего области внутреннего конца гена cafl, начинающегося на 107 оснований правее конца первого олигонуклеотида. LAST ID 9: shows the nucleotide sequence of a PCR seed oligonucleotide corresponding to the region of the inner end of the cafl gene starting 107 bases to the right of the end of the first oligonucleotide.
ПОСЛ. ИД. 10: показывает нуклеотидную последовательность construct pFGAL2a, показывающего слияние нескольких первых оснований последовательности, кодирующей β-галактозидазу, в векторе с cafl за исключением его сигнальной последовательности, и имеющего 5'-конец, включающий в себя сайт рестрикции Sac I: последовательность показана до 3'-конца cafl AACC с несколькими основаниями вектора. LAST ID 10: shows the construct pFGAL2a nucleotide sequence showing the fusion of the first few bases of a β-galactosidase coding sequence in a cafl vector except for its signal sequence and having a 5 ′ end including a Sac I restriction site: the sequence is shown up to 3 ′ -close cafl AACC with several vector bases.
ПОСЛ. ИД. 11: показывает аминокислотную последовательность белка, кодируемого pFGAL2a. Данная последовательность может быть продолжена Met, Thr, Met, He, Thr, Asn. LAST ID 11: shows the amino acid sequence of the protein encoded by pFGAL2a. This sequence can be continued Met, Thr, Met, He, Thr, Asn.
ПОСЛ. ИД. 12: представляет собой последовательность праймера F1OU2, применяемого для амплификации оперона F1. LAST ID 12: represents the sequence of primer F1OU2 used to amplify the operon F1.
ПОСЛ. ИД. 13: представляет собой последовательность праймера M4D, применяемого для амплификации оперона F1. LAST ID 13: represents the sequence of the primer M4D used for amplification of the operon F1.
ПОСЛ. ИД. 14: представляет собой последовательность праймера M3U, применяемого для амплификации оперона F1. LAST ID 14: represents the sequence of the primer M3U used for amplification of the operon F1.
ПОСЛ. ИД. 15: представляет собой последовательность праймера FlOD2, применяемого для амплификации оперона F1. LAST ID 15: represents the sequence of the primer FlOD2 used for amplification of the operon F1.
ПОСЛ. ИД. 16: представляет собой нуклеотидную и производную аминокислотную последовательности фрагмента ДНК, кодирующего гибридный белок F1-V. Имеются клонирующий сайт Sacl на 5'-конце и клонирующий сайт Hind III на 3'-конце. Основания 452-472 представляют собой последовательность, содержащуюся в клонируемой вставке, но происходящую из ПЦР-праймеров (не обнаружена в ДНК Y.pestis). LAST ID 16: represents the nucleotide and derivative amino acid sequences of a DNA fragment encoding an F1-V fusion protein. There is a Sacl cloning site at the 5'-end and a Hind III cloning site at the 3'-end. Bases 452-472 represent the sequence contained in the cloned insert, but derived from PCR primers (not found in Y. pestis DNA).
ПОСЛ. ИД. 17: представляет собой аминокислотную последовательность ПОСЛ. ИД. 16. LAST ID 17: represents the amino acid sequence of SEQ. ID 16.
ПОСЛ. ИД. 18: представляет собой последовательность праймера 5'FAB2, применяемого для амплификации оперона F1, включая сигнальную последовательность. LAST ID 18: represents the sequence of primer 5'FAB2 used to amplify the operon F1, including the signal sequence.
ПОСЛ. ИД. 19: представляет собой последовательность праймера 3' FBAM, применяемого для амплификации оперона F1, включая сигнальную последовательность. LAST ID 19: represents the sequence of the 3 ′ FBAM primer used to amplify the F1 operon, including the signal sequence.
ПОСЛ. ИД. 20: представляет собой нуклеотидную и аминокислотную последовательности F1-антигена, как определены с помощью ПЦР-праймеров, подробно описанных в приведенной ПОСЛ. ИД. 18 и 19, включая сигнальную последовательность. LAST ID 20: represents the nucleotide and amino acid sequences of the F1 antigen as determined by PCR primers described in detail in the above SEQ. ID 18 and 19, including the signal sequence.
ПОСЛ. ИД. 21: представляет собой аминокислотную последовательность ПОСЛ. ИД. 20. LAST ID 21: represents the amino acid sequence of SEQ.
ПОСЛ. ИД. 22: представляет собой нуклеотидную и аминокислотную последовательности гибридного белка F1/V, включая область мостика из 6 аминокислот. G в положении 1522 модифицировали в Т для получения второго стоп-кодона в рамке. LAST ID 22: represents the nucleotide and amino acid sequences of the F1 / V fusion protein, including a 6 amino acid bridge region. G at position 1522 was modified at T to obtain a second frame stop codon.
ПОСЛ. ИД. 23: представляет собой аминокислотную последовательность ПОСЛ. ИД. 22. Область мостика, на которую ссылаются в ПОСЛ. ИД. 22, представлена аминокислотами в положениях 171-176 (основания 523-540) в ПОСЛ. ИД. 22. LAST ID 23: represents the amino acid sequence of SEQ. ID 22. The area of the bridge referred to in POST. ID 22 is represented by amino acids at positions 171-176 (bases 523-540) in SEQ. ID 22.
ПОСЛ. ИД. 24: показывает нуклеотидную последовательность 5'-концевого затравочного олигонуклеотида, применяемого для создания V-кодирующей ДНК, применяемой в ПОСЛ. ИД. 3. LAST ID 24: shows the nucleotide sequence of the 5'-terminal seed oligonucleotide used to create the V-coding DNA used in SEQ. ID 3.
ПРИМЕРЫ
Клонирование ПОСЛ. ИД. 3
Материалы и методы: материалы для приготовления сред для выращивания получали из Oxoid Ltd. или Difco Laboratories. Все ферменты, применявшиеся для манипуляций с ДНК, получали из Boehringer Mannheim UK Ltd. и применяли в соответствии с инструкциями производителя. Все остальные химические и биохимические реактивы получали из Sigma Chemical Co, если только не указывается особо. Моноспецифичные кроличью поликлональную анти-V и мышиную анти-GST сыворотки получали от Dr.R.Brubaker (Department of Microbiology, Michigan State University) Dr. E.D.Willianson. (Chemical and Biological Defence Establishment) соответственно.EXAMPLES
Cloning ID 3
Materials and methods: materials for the preparation of growth media were obtained from Oxoid Ltd. or Difco Laboratories. All enzymes used to manipulate DNA were obtained from Boehringer Mannheim UK Ltd. and used in accordance with the manufacturer's instructions. All other chemical and biochemical reagents were obtained from Sigma Chemical Co, unless otherwise indicated. Monospecific rabbit polyclonal anti-V and mouse anti-GST serum were obtained from Dr. R. Brubaker (Department of Microbiology, Michigan State University) Dr. EDWillianson. (Chemical and Biological Defense Establishment), respectively.
Штаммы бактерий и культивирование: Yersinia pestis GB культивировали в аэробных условиях при 28oС в жидкой среде (рН 6,8), содержащей 15 г протеолитического пептона, 2,5 г гидролизата печени, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г NaCl на литр с добавлением 80 мл 0,25% гемина, растворенного в 0,1М NaOH (Blood Base Broth). Escherichia coli JM109 культивировали и хранили, как описано Sambrook et al. Molecular Cloning. A Laboratory Manual.Bacterial strains and cultivation: Yersinia pestis GB was cultured under aerobic conditions at 28 ° C in a liquid medium (pH 6.8) containing 15 g of proteolytic peptone, 2.5 g of liver hydrolyzate, 5 g of yeast extract, 5 g of NaCl per liter s adding 80 ml of 0.25% hemin dissolved in 0.1 M NaOH (Blood Base Broth). Escherichia coli JM109 was cultured and stored as described by Sambrook et al. Molecular Cloning A Laboratory Manual.
Получение рекомбинантных V- и F1-белков: манипуляции на ДНК. Хромосомную ДНК выделяли из Y.pestis по методу Marmur. Obtaining recombinant V and F1 proteins: DNA manipulation. Chromosomal DNA was isolated from Y. pestis according to the Marmur method.
Получение рекомбинантного V-антигена: ген, кодирующий V-антиген (1crV), амплифицировали из ДНК Y.pestis, применяя полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с использованием 125 пмоль праймеров, гомологичных последовательностям между 5'- и 3'-концами гена (смотри Price et al. (1989) J.Bacteriol. 171 стр. 5646-5653). Preparation of Recombinant V Antigen: A gene encoding a V antigen (1crV) was amplified from Y. pestis DNA using a polymerase chain reaction (PCR) using 125 pmol primers homologous to the sequences between the 5'- and 3'-ends of the gene (see Price et al. (1989) J. Bacteriol. 171 pp. 5646-5653).
Последовательности 5'-праймера (V/5'E: GATCGAATTCGAGCCTACGAACAA) и 3'-праймера (GGATCGTCGACTTACATAATTACCTCGTGTCA) также включают в себя 5'-области, кодирующие сайты рестрикции EcoRI и Sall соответственно. В дополнение к этому, два нуклеотида были изменены по сравнению с опубликованной последовательностью IcrV (Price et al., 1989) так, что сайт EcoRI был завершен, и амплифицированный ген кодировал дополнительный терминирующий кодон (ТАА). ПЦР-праймеры получали с помощью синтезатора ДНК (392 Applied Biosystems) Applied Biosystems. Фрагмент ДНК получали после 30 циклов амплификации (95oС, 20 с, 45oС, 20 с, 72oС, 30 с: Perkin GeneAmp PCR System). Фрагмент очищали, расщепляли с помощью EcoRI и Sall, лигировали с надлежащим образом расщепленной плазмидой pGEX-5Х-2 и трансформировали E. coli JM109 путем электропорации (смотри Sambrook et al. 1989). Колонию, содержащую рекомбинантную плазмиду (pVGlOO), идентифицировали с помощью ПЦР, применяя 30-mer праймеры (5'-нуклеотиды, расположенные в положениях 54 и 794; смотри Price et al., 1989), которые амплифицируют внутренний сегмент гена IcrV).The sequences of the 5'-primer (V / 5'E: GATCGAATTCGAGCCTACGAACAA) and 3'-primer (GGATCGTCGACTTACATAATTACCTCGTGTCA) also include 5'-regions encoding the restriction sites EcoRI and Sall, respectively. In addition, the two nucleotides were changed from the published IcrV sequence (Price et al., 1989) so that the EcoRI site was completed and the amplified gene encoded an additional termination codon (TAA). PCR primers were obtained using a DNA synthesizer (392 Applied Biosystems) Applied Biosystems. A DNA fragment was obtained after 30 amplification cycles (95 ° C, 20 s, 45 ° C, 20 s, 72 ° C, 30 s: Perkin GeneAmp PCR System). The fragment was purified, digested with EcoRI and Sall, ligated with the properly digested plasmid pGEX-5X-2, and transformed with E. coli JM109 by electroporation (see Sambrook et al. 1989). A colony containing a recombinant plasmid (pVGlOO) was identified by PCR using 30-mer primers (5'-nucleotides located at positions 54 and 794; see Price et al., 1989), which amplify the internal segment of the IcrV gene).
Экспрессия rV в E.coli: культуры E.coli. JMlP9/pVGl00 выращивали на LB, содержащем 100 мкгмл-1 ампициллин при 37oС до тех пор, пока поглощение (600 нм) не становилось равным 0,3. Затем к культуре добавляли изопропил-β--D-тиогалактопиранозид (ИТГП) до конечной концентрации 1 мМ и выращивание продолжали в течение последующих 5 часов. Цельные клеточные лизаты бактерий получали, как описано в Sambrook et al., и экспрессию гибридного белка GST/V исследовали путем окрашивания 10% SDS-полиакриламидных гелей (Mini-Protean II, Bio-Rad) кумасси бриллиантовым голубым R250 и путем вестерн-блоттинга (смотри Sambrook et al.). Отпечатки, полученные с помощью вестерн-блоттинга, метили с помощью кроличьей анти-V сыворотки в разведении 1/4000 или мышиной анти-GST сыворотки в разведении 1/1000 и белковые ансамбли визуализировали с помощью вторичных антител, меченных коллоидным золотом (Auroprobe BLplus, Cambio).Expression of rV in E. coli: E. coli cultures. JMlP9 / pVGl00 was grown on LB containing 100 μgml -1 ampicillin at 37 ° C until the absorbance (600 nm) became 0.3. Then, isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (ITHP) was added to the culture to a final concentration of 1 mM, and cultivation was continued for the next 5 hours. Whole bacterial cell lysates were prepared as described in Sambrook et al., And expression of the GST / V fusion protein was examined by staining 10% SDS-polyacrylamide gels (Mini-Protean II, Bio-Rad) with Coomassie brilliant blue R250 and Western blotting ( see Sambrook et al.). Imprints obtained by western blotting were labeled with rabbit anti-V serum in 1/4000 dilution or mouse anti-GST serum in 1/1000 dilution and protein ensembles were visualized with secondary antibodies labeled with colloidal gold (Auroprobe BLplus, Cambio )
Количественный анализ экспрессии GST/V in vitro. Культуры E.coli JM109, содержащие pVGl00 или pGEX-5X-2, выращивали, как описано выше. Из культур в логарифмической и стационарной фазах отбирали аликвоты по одному мл и количество жизнеспособных клеток определяли путем посева на L-arap, содержащий ампициллин. Клетки из второй 1 мл аликвоты собирали методом центрифугирования и ресуспендировали в 1 мл фосфатно-буферного раствора (ФБР). Суспензию клеток замораживали до -20oС в течение 1 часа, оттаивали и затем обрабатывали ультразвуком на льду при температуре на 10oС ниже в течение 3 х 30 с (генератор ультразвука модели XL2015, зонд Microtip 3,2 мм; Heat Systems Inc.). На планшете для микротитрования делали серии разведений в ФБР гомогенатов, полученных с помощью ультразвука, и стандартного раствора rV (5 мкгмл) и оставляли на ночь при 4oС для протекания связывания. Количество гибридного белка GST/V в каждом гомогенате, полученном с помощью ультразвука, определяли по стандартной методике ELISA, применяя кроличью анти-V сыворотку в качестве первичного антитела. Антитела инкубировали в 1%-ном растворе порошка обезжиренного молока в ФБР.Quantitative analysis of GST / V expression in vitro. Cultures of E. coli JM109 containing pVGl00 or pGEX-5X-2 were grown as described above. Aliquots of one ml were taken from the cultures in the logarithmic and stationary phases, and the number of viable cells was determined by plating on L-arap containing ampicillin. Cells from the second 1 ml aliquot were collected by centrifugation and resuspended in 1 ml of phosphate buffered saline (PBS). The cell suspension was frozen to -20 ° C for 1 hour, thawed and then sonicated on ice at a temperature of 10 ° C lower for 3 x 30 s (XL2015 ultrasound generator, 3.2 mm probe; Microtip probe; Heat Systems Inc. ) A series of dilutions in FBI of homogenates obtained by ultrasound and a standard rV solution (5 μgml) were made on a microtiter plate and left overnight at 4 ° C for binding. The amount of GST / V fusion protein in each ultrasound homogenate was determined by standard ELISA using rabbit anti-V serum as the primary antibody. Antibodies were incubated in a 1% solution of skim milk powder in the FBI.
Очистка rV. E. coli JM109/pVG100 выращивали в 5•100 мл объемах LB, как описано выше. Клетки собирали методом центрифугирования и ресуспендировали в 3 мл фосфатно-буферного раствора (ФБР). После добавления 80 мкл лизоцима (10 мгмл-1) клеточную суспензию инкубировали в течение 10 мин при 22oС. Добавляли Тритон Х-100 до конечной концентрации 1% и клетки замораживали (-20oС), оттаивали и обрабатывали ультразвуком на льду на 70% мощности в течение 3•30 с (генератор ультразвука модели XL2015). Лизированные клетки центрифугировали и объем супернатанта доводили до 30 мл с помощью ФБР и смешивали с 5 мл глютатион-сефарозы 4В (Pharmacia Biotech), которую трижды промывали ФБР + 0,1% Тритоном Х-100. Смесь перемешивали в течение 18 часов при 4oС, центрифугировали и дважды промывали 100 мл ФБР и затем набивали в хроматографическую колонку (Poly-Prep; BioRad) в виде 50% взвеси. Гибридный белок GST/V элюировали 10 мл 50 мМ Триса, рН 8,0, содержащего 5 мМ восстановленный глютатион (Pharmacia Biotech). После диализа против ФБР гибридный белок расцепляли фактором Ха (Boehringer Mannheim UK Ltd.) в течение 18 часов при 22oС, в соответствии с инструкциями производителя. Отщепленный GST и избыток нерасщепленного GST/V удаляли из раствора путем афинной адсорбции, как описано выше, оставляя очищенный рекомбинантный V (rV).Cleaning rV. E. coli JM109 / pVG100 was grown in 5 x 100 ml volumes of LB, as described above. Cells were harvested by centrifugation and resuspended in 3 ml of phosphate buffered saline (PBS). After adding 80 μl of lysozyme (10 mg ml −1 ), the cell suspension was incubated for 10 min at 22 ° C. Triton X-100 was added to a final concentration of 1% and the cells were frozen (-20 ° C), thawed and sonicated on ice on
Иммунизация rV. В данном исследовании применяли самок мышей Bald/c в возрасте шести недель, выращенных в особых условиях, свободных от патогенов (Charles River Laboratories, Margate, Kent, UK). Группа из 16 мышей получала 0,2 мл первичную иммунизирующую дозу 10,13 мкг rV-антигена, презентированного в 1: 1 водомасляной эмульсии с неполным адъювантом Фройнда (НАФ), внутрибрюшинно (в/б). На 14 и 34 дни каждое животное получало повторные иммунизирующие дозы, приготовленные, как описано выше. На 64 день 6 животных забивали и их ткани отбирали для проведения иммунологических анализов, как описано ниже. Оставшихся животных подвергали контрольному заражению Y. pestis. Контрольную группу не подвергавшихся иммунизации 16 мышей одного возраста делили сходным образом на группы для отбирания образцов тканей и контрольного заражения. В последующем эксперименте по определению степени защиты от более высоких доз Y. pestis при контрольном заражении применяли группы из 5 или 6 rV-иммунизированных и контрольных мышей. Immunization rV. In this study, six-week-old female Bald / c mice were raised under special pathogen-free conditions (Charles River Laboratories, Margate, Kent, UK). A group of 16 mice received a 0.2 ml primary immunizing dose of 10.13 μg of rV antigen, presented in a 1: 1 oil-in-water emulsion with incomplete Freund's adjuvant (NAF), ip (ip). On days 14 and 34, each animal received repeated immunizing doses, prepared as described above. On
Измерение титра сывороточных антител у мышей, анестезированных в/б 0,1 мл смеси, содержащей 6 мг Domitor (Norden Laboratories) и 27 мкг кеталара (Parke-Davies), отбирали образцы крови путем пункции сердца. Образцы группировали и сыворотку отделяли. Титр сывороточных антител измеряли с помощью модифицированного ELISA (Willimson and Tiball, (1993) Vaccine 11: 1253-1258). Вкратце, rV (5 мкгмл-1 в ФБР) наносили на планшет для микротитрования и на планшете в двойном экземпляре готовили серии разведений тестируемых сывороток. Связавшиеся антитела определяли, применяя конъюгаты антимышиных поливалентных Ig, меченных пероксидазой. Титр специфичных антител определяли как максимальное разведение сыворотки, позволяющее получить показатель поглощения больше чем 0,1 единицы, после вычитания поглощения, имеющего место при неспецифическом связывании, определенного в контрольных сыворотках.Measurement of the titer of serum antibodies in mice, anesthetized in / b 0.1 ml of a mixture containing 6 mg of Domitor (Norden Laboratories) and 27 μg of ketalar (Parke-Davies), blood samples were taken by heart puncture. Samples were grouped and serum was separated. The serum antibody titer was measured using a modified ELISA (Willimson and Tiball, (1993) Vaccine 11: 1253-1258). Briefly, rV (5 μgml −1 in the FBI) was applied to a microtiter plate and a series of dilutions of the test sera were prepared on the tablet in duplicate. Bound antibodies were determined using conjugates of anti-mouse polyvalent Ig labeled with peroxidase. The titer of specific antibodies was determined as the maximum dilution of serum, allowing to obtain an absorption index of more than 0.1 units, after subtracting the absorption that occurs with nonspecific binding determined in control sera.
Выделение очищенных Т-клеток из селезенки. Сырую суспензию смешанных клеток селезенки получали путем аккуратного протирания селезенки сквозь мелкоячеистое сито. Клетки отмывали от капсулы селезенки и соединительной ткани 2 мл тканевой культуральной среды (DMEM с 20 мМ L-глютамином,105 ME1 пенициллина и 100 мгл-1 стрептомицина. Из суспензии клеток селезенки путем центрифугирования в градиенте плотности Ficoll-Hypaque (Lymphocyte Separation Medium, ICN Flow) выделяли популяцию смешанных лимфоцитов. Для определения процента жизнеспособных клеток в препарате применяли смешанный краситель, содержавший акридиновый оранжевый (0,0003% м/о) и бромид этидия (0,001% м/о).Isolation of purified T cells from the spleen. A crude suspension of mixed spleen cells was obtained by gently rubbing the spleen through a fine mesh sieve. Cells were washed from the capsule of the spleen and connective tissue with 2 ml of tissue culture medium (DMEM with 20 mM L-glutamine, 10 5 ME 1 penicillin and 100 mg -1 streptomycin. From a suspension of spleen cells by centrifugation in a density gradient Ficoll-Hypaque (Lymphocyte Separation Medium , ICN Flow), a mixed lymphocyte population was isolated, using mixed dye containing acridine orange (0.0003% m / v) and ethidium bromide (0.001% m / v) to determine the percentage of viable cells in the preparation.
Смешанные лимфоциты инкубировали с Dynabeads (M450, Dynal UK), покрытыми антимышиным IgG барана, в соотношении 1:3 в течение 30 минут при 4oС. В-клетки, связавшиеся с Dynabead, удаляли методом магнитного разделения и оставшиеся Т-клетки ресуспендировали в DMEM с добавлением антибиотика и 10% по объему околоплодной сыворотки теленка (ОСТ) до желаемой клеточной плотности для засевания планшетов для микротитрования.Mixed lymphocytes were incubated with Dynabeads (M450, Dynal UK) coated with ram anti-mouse IgG in a ratio of 1: 3 for 30 minutes at 4 ° C. B cells that bind to Dynabead were removed by magnetic separation and the remaining T cells were resuspended in DMEM supplemented with antibiotic and 10% by volume amniotic calf serum (OST) to the desired cell density for inoculation of microtiter plates.
Пролиферация неочищенных клеток селезенки и очищенных Т-клеток in vitro в ответ на rV. В лунках планшета для микротитрования делали двухкратные убывающие разведения rV и конканавалина А (положительный контроль) в DMEM (в интервале 0-50 мкгмл-1) так, что в каждой лунке было по 0,1 мл. Отрицательные контроли состояли лишь из 0,1 мл DMEM. Каждую лунку засевали равными объемами суспензии неочищенных клеток селезенки или Т-клеток с минимальной плотностью 5•104 клеток и инкубировали в течение 72 часов при 37oС (5% СО2). В каждую лунку вносили аликвоту одного мкКи 3H-тимидина ([метил [3H]тимидин СА 74 ГБкммоль-1; Amersham) в 30 мкл DMEM с добавлением 10% ОСТ и инкубацию продолжали в течение 24 ч. Содержимое лунок собирали на стекловолоконные фильтры, применяя харвестер клеток (Titertek) и диски, представляющие каждую лунку, выбивали из прокладок фильтров в 1,5 мл сцинтилляционной жидкости (Cyoscint, ICN Biomedicals Inc.) для измерения включения 3H-тимидина в клетки. Индекс клеточной стимуляции рассчитывали из 4 воспроизведений как среднее число импульсов в минуту (после стимуляции)/(среднее число импульсов в минуту (в отрицательном контроле).Proliferation of untreated spleen cells and purified T cells in vitro in response to rV. Twice decreasing dilutions of rV and concanavalin A (positive control) in DMEM (in the range of 0-50 μgml -1 ) were made in the wells of the microtiter plate so that 0.1 ml was in each well. Negative controls consisted of only 0.1 ml DMEM. Each well was seeded with equal volumes of a suspension of untreated spleen cells or T cells with a minimum density of 5 • 10 4 cells and incubated for 72 hours at 37 ° C (5% CO 2 ). An aliquot of one µCi 3 H-thymidine ([methyl [ 3 H] thymidine CA 74 GBcmol -1 ; Amersham) was added to each well in 30 μl DMEM supplemented with 10% OCT and incubation was continued for 24 hours. The contents of the wells were collected on fiberglass filters using a cell harvester (Titertek) and discs representing each well were knocked out of the filter pads in 1.5 ml scintillation fluid (Cyoscint, ICN Biomedicals Inc.) to measure the incorporation of 3 H-thymidine into the cells. The cell stimulation index was calculated from 4 reproductions as the average number of pulses per minute (after stimulation) / (average number of pulses per minute (in the negative control).
Получение рекомбинантного F1-антигена: клонирование cafl:ДHK выделяли из Y.pestis по методу Marmur et al. (1961) J.Mol.Biol. 3: стр.208-218. Фрагмент ДНК, кодирующий открытую рамку считывания cafl за исключением его сигнальной последовательности, амплифицировали из ДНК Y.pestis, применяя полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Олигонуклеотиды для использования в ПЦР получали с помощью синтезатора ДНК Beckman 200А. Preparation of recombinant F1 antigen: cafl cloning: DHK was isolated from Y. pestis according to the method of Marmur et al. (1961) J. Mol. Biol. 3: p. 208-218. The DNA fragment encoding the cafl open reading frame with the exception of its signal sequence was amplified from Y. pestis DNA using a polymerase chain reaction (PCR). Oligonucleotides for use in PCR were obtained using a Beckman 200A DNA synthesizer.
Конструкт pFGAL2a. Синтезировали олигонуклеотид GATCGAGCTCGGCAGATTTAACTGCAAGCACC (посл. ИД. 7), соответствующий первым 21 основанию гена cafl, следующих сразу за нуклеотидами, кодирующими сигнальную последовательность, с дополнительной 5'-областью, кодирующей сайт Sacl, и комплементарный олигонуклеотид CAGGTCGAGCTCGTCGACGGTTAGGCTCAAAGTAG (ПОСЛ. ИД. 8), соответствующий последовательности, которая кодирует предполагаемую "шпилькоподобную" структуру правее терминирующего кодона cafl, с добавленной 5'-областью, кодирующей сайты Sacl и Accl. Фрагмент ДНК получали после 35 циклов амплификации (95oС, 15 с; 50oС, 15 с; 72oС, 30 с, применяя Perkin Elmer 9600 GeneAmp PCR System). Фрагмент очищали, расщепляли с помощью Sacl и Accl, лигировали с подобным образом расщепленной плазмидой pUC18 и трансформировали E.coli JM109 путем электропорации. Электропорацию проводили, применяя Bio-Rad Gene Pulser с 0,2 см кюветами при 1,25 кВ, 25 мкФ, 800 Ом со значением временной постоянной, равным 20.Construct pFGAL2a. The oligonucleotide GATCGAGCTCGGCAGATTTAACTGCAAGCACC (last ID 7) was synthesized, corresponding to the first 21 bases of the cafl gene, immediately following the nucleotides encoding the signal sequence, with an additional 5'-region encoding the Sacl site, and the complementary oligonucleotide CAGGTCGTCGCAGCAGTAGCGCAGCAG. corresponding to the sequence that encodes the putative "hairpin-like" structure to the right of the cafl termination codon, with an added 5'-region encoding the Sacl and Accl sites. A DNA fragment was obtained after 35 amplification cycles (95 ° C, 15 s; 50 ° C, 15 s; 72 ° C, 30 s using the Perkin Elmer 9600 GeneAmp PCR System). The fragment was purified, digested with Sacl and Accl, ligated with the similarly cleaved plasmid pUC18, and transformed with E. coli JM109 by electroporation. Electroporation was carried out using a Bio-Rad Gene Pulser with 0.2 cm cuvettes at 1.25 kV, 25 μF, 800 Ohms with a time constant of 20.
Колонию pFGAL2a, содержащую клонируемый ген cafl, идентифицировали с помощью ПЦР, применяя олигонуклеотид TGGTACGCTTACTCTTGGCGGCTAT (ПОСЛ. ИД. 9), соответствующий внутренней области от 128 до 153 нуклеотида гена от сайта, идентифицированного как сайт отщепления сигнальной последовательности (смотри Galyov et al. (1990)) и ПОСЛ. ИД. 2. Культуру E.coli, экспрессирующую F1, содержащую pFGAL2a, выращивали при 37oС с перемешиванием в Luria Broth. с 1 мМ изопропил-β-D-тиогалактопиранозидом (ИТГП) в течение 18 часов. Цельные клеточные лизаты и периплазматические и цитоплазматические фракции из бактерий получали, как описано Sambrook et al. (1989).A colony of pFGAL2a containing the cloned cafl gene was identified by PCR using the TGGTACGCTTACTCTTGGCGGCTAT oligonucleotide (PEFC. ID. 9) corresponding to an internal region of 128 to 153 nucleotides of the gene from the site identified as signaling cleavage site et al (see G et al. )) and POST.
SDS-PAGE и вестерн-блоттинг: электрофорез в полиакриламидном геле (PAGE) с добавлением SDS и вестерн-блоттинг проводили, как описано Hunter et al. (1993) Infec. Immun. 61, 3958-3965. Блоты пробовали поликлональными антисыворотками, полученными от овец (В283) против убитых Y.pestis (штамм EV76, выращенный при 37oС), и связавшиеся антитела определяли с помощью антибараньего IgG осла, меченного пероксидазой хрена (Sigma).SDS-PAGE and Western Blot: Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE) supplemented with SDS and Western Blot were performed as described by Hunter et al. (1993) Infec. Immun. 61, 3958-3965. Blots were tested with polyclonal antisera obtained from sheep (B283) against killed Y. pestis (strain EV76 grown at 37 ° C), and bound antibodies were determined using anti-sheep IgG donkey labeled with horseradish peroxidase (Sigma).
Примеры 1 и 2 комбинации вакцин V/F1: сравнительные примеры: влияние вакцин на смертность мышей при контрольном заражении штаммом (GB) Y.pestis. Examples 1 and 2 of the combination of vaccines V / F1: comparative examples: the effect of vaccines on the mortality of mice in the control infection with strain (GB) Y. pestis.
Животные: Barrier bred самок мышей Ва1b/с в возрасте 6 недель, свободных от мышиных патогенов, получали из Charles-River Laboratories, Margate, Kent, UK и использовали во всех данных примерах. Animals: Barrier bred 6-week-old female Ba1b / c mice free of mouse pathogens were obtained from Charles-River Laboratories, Margate, Kent, UK and used in all of these examples.
Иммунизация: мышей делили на группы по 5 или 6 мышей и иммунизировали следующим образом. Immunization: mice were divided into groups of 5 or 6 mice and were immunized as follows.
Сравнительная вакцина EV76: мыши общим числом 50 получали на 0 день расписания подкожно (п/к) однократную первично иммунизирующую дозу живой вакцины EV76, введенную в общем объеме 100 мкл. Comparative vaccine EV76: mice with a total of 50 received on the 0th day of the schedule subcutaneously (s / c) a single primary immunizing dose of live vaccine EV76, administered in a total volume of 100 μl.
Сравнительная вакцина Cutter USP: следующую группу из 50 мышей первично иммунизировали 100 мкл вакцины Cutter внутримышечно (в/м); причем данная доза представляет собой около 0,2 человеческой дозы и содержит приблизительно 2•108 убитых формальдегидом бацилл чумы. Данную дозу повторно вводили каждому животному на 16 день расписания для проведения повторной иммунизации.Comparative USP Cutter Vaccine: The following group of 50 mice was initially immunized with 100 μl of intramuscular Cutter vaccine (IM); moreover, this dose is about 0.2 human dose and contains approximately 2 • 10 8 plague bacilli killed by formaldehyde. This dose was re-administered to each animal on day 16 of the schedule for re-immunization.
Вакцины F1 и V: группы из 62 мышей внутрибрюшинно (в/б получали первично иммунизирующую дозу либо рекомбинантного V-антигена, либо рекомбинантного F1-антигена, презентированного в 1:1 водомасляной эмульсии с неполным адъювантом Фройнда (НАФ; Sigma). Животных первично иммунизировали дозой соответствующего антигена в 10 мкг в общем объеме 0,1 мл эмульсии. Животных повторно иммунизировали дозой соответствующего антигена на 14 (группы V и F1) и 28 (вся группа F1 и подгруппа из 12 животных из группы V) дни. Vaccines F1 and V: groups of 62 mice intraperitoneally (ip received a primary immunizing dose of either a recombinant V antigen or a recombinant F1 antigen presented in a 1: 1 oil-in-water emulsion with incomplete Freund adjuvant (NAF; Sigma). dose of the corresponding antigen of 10 μg in a total volume of 0.1 ml of the emulsion. Animals were re-immunized with a dose of the corresponding antigen on 14 (groups V and F1) and 28 (the whole group F1 and a subgroup of 12 animals from group V) days.
Следующую группу из 12 мышей первично и повторно иммунизировали на 0, 14 и 28 дни комбинацией 10 мкг F1 и 10 мкг V, совместно включенных в состав водной фазы 1:1 водомасляной эмульсии с НАФ (конечный объем 0,1 мл на мышь). The next group of 12 mice was primary and re-immunized on days 0, 14, and 28 with a combination of 10 μg F1 and 10 μg V, which were jointly included in the 1: 1 aqueous phase of an oil-in-water emulsion with NAF (final volume 0.1 ml per mouse).
На 50 день расписания иммунизации из каждой обрабатываемой группы случайным образом выбирали 6 животных для дальнейшего анализа ответов клеток селезенки. Остальных животных из каждой группы подвергали контрольному заражению Y. pestis. Сходным образом отделяли необрабатываемую контрольную группу равновозрастных мышей. On
Контрольное заражение многократными LD в целях определения порога защиты: мышей из каждой иммунизированной группы и необработанного контроля разбивали на группы по 5 или 6 мышей для подкожного (п/к) контрольного заражения штаммом GB Y. pestis в интервале дозировок от 20 до 2•109 жизнеспособных микроорганизмов. За подвергнувшимися контрольному заражению мышами внимательно наблюдали в течение 14-суточного периода на предмет развития симптоматики, а где оказывалось необходимым, аккуратно регистрировали время до смерти.Control infection with multiple LDs in order to determine the protection threshold: mice from each immunized group and untreated control were divided into groups of 5 or 6 mice for subcutaneous (subcutaneous) control infection with GB Y. pestis strain in a dosage range from 20 to 2 • 10 9 viable microorganisms. The mice subjected to control infection were carefully monitored for a 14-day period for the development of symptoms, and where it turned out to be necessary, the time to death was accurately recorded.
Животных, погибших в результате контрольного заражения, вскрывали и брали мазки крови, печени и селезенки на бактериологические анализы. Animals that died as a result of the control infection were opened and smears of blood, liver and spleen were taken for bacteriological tests.
Результаты данных контрольных заражений контрольных и тестируемых животных приведены в таблице 1 ниже; причем даны два ряда результатов, соответствующих двум сериям экспериментов с соответствующими контролями. Из данных результатов легко заметить, что тогда как V-антиген является более эффективным, чем Cutter, он все же уступает EV76. Однако, будучи объединенным с менее эффективным F1, он образует комбинацию, эффективную в той же мере, что и EV76, без побочных эффектов. The results of these control infections of control and test animals are shown in table 1 below; moreover, two series of results are given corresponding to two series of experiments with corresponding controls. From these results it is easy to see that while the V-antigen is more effective than Cutter, it is still inferior to EV76. However, when combined with a less effective F1, it forms a combination that is as effective as EV76, with no side effects.
ПРИМЕР 3
Получение ослабленной Salmonella для применения в пероральной вакцине
Экспрессия рекомбинантного V-антигена в S.typhimurium и typhi.EXAMPLE 3
Obtaining Attenuated Salmonella for Use in Oral Vaccine
Expression of recombinant V-antigen in S. typhimurium and typhi.
Амплифицированный ген IcrV клонировали в три различных плазмидных вектора:
pMAL-p2: вектор, предназначенный для экспрессии клонируемого гена в виде продукта слияния с белком, связывающим мальтозу (БСМ). С-конец БСМ слит с N-концом V-антигена. Полученный таким образом при экспрессии белок транспортируется в периплазму. Вектор, содержащий последовательность ДНК V-антигена обозначили как pVMP100.The amplified IcrV gene was cloned into three different plasmid vectors:
pMAL-p2: a vector designed to express the cloned gene as a fusion product with maltose binding protein (BSM). The C-terminus of BSM is fused to the N-terminus of the V antigen. The protein thus obtained upon expression is transported to the periplasm. A vector containing the V antigen DNA sequence was designated as pVMP100.
pMAL-c2: вектор, сходный с pMAL-p2 за исключением того, что гибридный белок MBP-V-антиген экспрессируется в цитоплазме. Рекомбинантную плазмиду обозначили как pVMC100. pMAL-c2: a vector similar to pMAL-p2 except that the fusion protein MBP-V antigen is expressed in the cytoplasm. Recombinant plasmid was designated as pVMC100.
pGEX-5X-2: вектор, предназначенный для экспрессии клонируемого гена в виде белка, слитого с глютатион-S-трансферазой (GST). С-конец GST слит с N-концом V-антигена и гибридный белок экспрессируется в цитоплазме. Рекомбинантную плазмиду обозначили как pVG100. pGEX-5X-2: a vector designed to express the cloned gene as a protein fused to glutathione S-transferase (GST). The C-terminus of GST is fused to the N-terminus of the V antigen and the fusion protein is expressed in the cytoplasm. Recombinant plasmid was designated as pVG100.
Все векторы содержат промотор Рtac и ген laclQ; причем последний кодирует репрессор lac, который прекращает транскрипцию Рtac у Escherichia coli до тех пор, пока не будет добавлен ИТГП. Плазмиды содержат область начала репликации с pBR322, и как результат в бактериальной клетке реплицируется низкое количество копий.All vectors contain the P tac promoter and the lacl Q gene; moreover, the latter encodes a lac repressor, which terminates transcription of P tac in Escherichia coli until ITHP is added. Plasmids contain the region of origin of replication with pBR322, and as a result, a low number of copies is replicated in the bacterial cell.
Каждую рекомбинантную плазмиду электропорировали в штамм SL 3261 Salmonella typhimurium, ослабленный штамм, который интенсивно применяется в качестве переносчика в живой вакцине для экспрессии чужеродных антигенов. Он содержит специфическую мутацию - делецию - в гене аrоА, которая делает мутанта зависимым от определенных ароматических соединений, которые требуются ему для роста (смотри Hosieth et al.). Для получения микроорганизма, пригодного для применения в вакцинации человека, электропорацию производят в ослабленную Salmonella typhi. Each recombinant plasmid was electroporated into a strain of
Все рекомбинантные плазмиды экспрессируют V-антиген, как показано с помощью вестерн-блоттинга культур S. typhimurium и мечения моноспецифической анти-V-антигенной поликлональной антисывороткой, поставляемой R.Brubaker, Dept. Microbiology, Michigan State University, East Lancing, MI 48824-1101, USA. Рекомбинантную S. typhimurium вводили внутривенно мышам в количестве 5•107 КОЕ/доза, и для них были показаны высокие уровни заселения печени и селезенки; было выделено от 8•106 до 5•108 КОЕ на орган. Большинство выделенных бактериальных клеток были также устойчивыми к ампициллину, что указывает на сохранение рекомбинантных плазмид.All recombinant plasmids express the V antigen as shown by Western blotting of S. typhimurium cultures and labeling the monospecific anti-V antigenic polyclonal antiserum supplied by R. Brubaker, Dept. Microbiology, Michigan State University, East Lancing, MI 48824-1101, USA. Recombinant S. typhimurium was administered intravenously to mice in an amount of 5 · 10 7 CFU / dose, and high levels of population of the liver and spleen were shown for them; from 8 • 10 6 to 5 • 10 8 CFU per organ was allocated. Most isolated bacterial cells were also resistant to ampicillin, indicating the preservation of recombinant plasmids.
Экспрессия F1 в S.typhimurium: Плазмиду pFGAL2a выделяли, применяя стандартные методики, описанные Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning; a Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbour Laboratory, New York. Очищенную плазмиду электропорировали в S.typhimurium LB5010 (рестрикция-, модификация+) и метилированную pFGAL2a в последующем выделяли из LB5010 для электропорации в S. typhimurium SL3261 (аrоА-). Периплазматическую и цитоплазматическую фракции подготавливали для SDS-ЭПАГ и вестерн-блоттинга, как описано выше.Expression of F1 in S. typhimurium: Plasmid pFGAL2a was isolated using standard techniques described by Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning; a Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, New York. The purified plasmid was electroporated in S. typhimurium LB5010 (restriction - , modification + ) and methylated pFGAL2a was subsequently isolated from LB5010 for electroporation in S. typhimurium SL3261 (aroA - ). Periplasmic and cytoplasmic fractions were prepared for SDS-EPAG and Western blotting, as described above.
Устойчивость конструктов: пяти самкам мышей Balb/c вводили внутривенно либо 5•105 либо 5•107 КОЕ S.typhimurium, содержащих pFGAL2a в 200 мкл фосфатно-буферного раствора. Контрольным мышам подобным образом вводили S.typhimurium, содержащую рuС18 без вставок. Через 7 дней мышей забивали путем сворачивания шеи и брали их печени и селезенки. Органы гомогенизировали в 10 мл фосфатно-буферного раствора, применяя stomacher в максимальном режиме в течение 2 минут и гомогенат серийно разводили в фосфатно-буферном растворе и помещали на L-агар или L-агар, содержащий 55 мкгмл-1 ампициллина.Stability of constructs: five female Balb / c mice were injected intravenously with either 5 • 10 5 or 5 • 10 7 CFU of S. typhimurium containing pFGAL2a in 200 μl of phosphate-buffered saline. S. typhimurium containing puC18 without inserts was similarly administered to control mice. After 7 days, the mice were sacrificed by folding the neck and their liver and spleen were taken. The organs were homogenized in 10 ml of phosphate-buffered saline using stomacher in maximum mode for 2 minutes, and the homogenate was serially diluted in phosphate-buffered saline and placed on L-agar or L-agar containing 55 μg -1 ampicillin.
Конструкт F1-оперона: попытки реплицировать целый F1-оперон с помощью ПЦР в виде единого фрагмента были безуспешны, так что была разработана стратегия, посредством которой его амплифицировали, применяя ПЦР, с получением двух отдельных фрагментов с применением пар праймеров (а) ПОСЛ. ИД. 12 и 13 и (б) ПОСЛ.ИД. 14 и 15 соответственно для получения фрагментов размером в 3,36 кбайт и 1,89 кбайт с матрицы ДНК Y.pestis MP6. Экстракт ДНК по Marmur применяли без очистки СsСl2. Применявшиеся условия проведения ПЦР представляли собой 96oС в течение 30 секунд, 57oС в течение 30 секунд и 72oС в течение 1 минуты; суммарно 30 циклов.Design of the F1 operon: attempts to replicate the whole F1 operon using PCR as a single fragment were unsuccessful, so a strategy was developed by which it was amplified using PCR to obtain two separate fragments using primer pairs (a) AFR. ID 12 and 13 and (b)
Данные два фрагмента расщепляли, применяя Nhel, и объединяли вместе. These two fragments were digested using Nhel and combined together.
Слитый фрагмент, кодирующий оперон по всей длине (5,25 кбайт), расщепляли с помощью EcoRI и Sall и затем клонировали в ряд векторов. Когда данный фрагмент клонировали в pBR322 и экспрессировали в E.coli, S.typhimurium LB5010 или SL3261, была замечена неустойчивость рекомбинантной плазмиды. Чтобы избежать данной проблемы, оперон клонировали в плазмиде pLG339, низкокопийной плазмиде kmR. Единый F1-оперон также вставляли в ген АrоС в хромосоме S. typhimurium, применяя вектор pBRD1084. Список последовательностей см. в конце описания.The fused fragment encoding the operon along the entire length (5.25 kB) was digested with EcoRI and Sall and then cloned into a series of vectors. When this fragment was cloned into pBR322 and expressed in E. coli, S. typhimurium LB5010 or SL3261, instability of the recombinant plasmid was observed. To avoid this problem, the operon was cloned into plasmid pLG339, the low copy plasmid km R. A single F1 operon was also inserted into the AroC gene on the S. typhimurium chromosome using the vector pBRD1084. For a list of sequences, see the end of the description.
Как обсуждалось ранее в данной заявке: V- и F1-антигены могут быть микроинкапсулированы. V- и F1-антигены могут быть микроинкапсулированы по отдельности. Объединенные микроинкапсулированные субъединицы могут быть применены для иммунизации. Авторы настоящего изобретения убеждены, что защита, достигаемая с помощью объединенных микроинкапсулированных субъединиц, превосходит защиту, обеспечиваемую существующими противочумными вакцинами, и что объединением субъединиц достигается дополнительный эффект. Эффективность защиты с помощью объединенных микроинкапсулированных субъединиц может быть еще более усовершенствована путем совместного введения адъюванта, например субъединицы В холерного токсина (ХТВ). Микроинкапсулирование вакцины на основе субъединиц продлевает срок высвобождения вакцины in vivo, делает возможным пероральное, интраназальное или ингаляционное введение и расширяет круг возможных мишеней. As discussed earlier in this application: V and F1 antigens can be microencapsulated. V and F1 antigens can be microencapsulated separately. The combined microencapsulated subunits can be used for immunization. The authors of the present invention are convinced that the protection achieved by the combined microencapsulated subunits is superior to the protection provided by existing anti-plague vaccines, and that by combining the subunits an additional effect is achieved. The effectiveness of the protection using the combined microencapsulated subunits can be further improved by coadministration of an adjuvant, for example, the cholera toxin subunit B (CTB). The microencapsulation of a subunit-based vaccine prolongs the in vivo release time of the vaccine, enables oral, intranasal or inhalation administration and widens the range of possible targets.
Микроинкапсулирование вакцины на основе объединенных V-и F1-субъединиц описано ниже. Также продемонстрировано, что данный состав способен индуцировать как слизистый, так и системный иммунитет против чумы. The microencapsulation of a vaccine based on the combined V and F1 subunits is described below. It has also been demonstrated that this composition is able to induce both mucous and systemic immunity against plague.
Микроинкапсулирование субъединиц проводили в PLA 2000, применяя методику выпаривания растворителя. Microencapsulation of subunits was performed in
Иммунизацию микроинкапсулированными частицами проводили следующим образом. Immunization with microencapsulated particles was carried out as follows.
Группы по 25 мышей получали первично иммунизирующую дозу в 25 мкг либо V-антигена, либо F1-антигена, презентированного в микросферах, ресуспендированных в ФБР для внутрибрюшинных инъекций. Другие группы по 21 мыши получали комбинацию по 25 мкг F1- и V-антигенов, презентированных в микросферах. Дозу в 25 мкг F1 вводили в общей массе 5,42 мг сфер, тогда как 25 мкг V содержались в 2,08 мг сфер. Требуемую массу микросфер ресуспендировали для инъекции в 100 мкл ФБР на животное. Животных повторно иммунизировали соответствующим(и) антигеном(ами) на 14 и 28 дни. Groups of 25 mice received a primary immunizing dose of 25 μg of either the V antigen or the F1 antigen presented in microspheres resuspended in the FBI for intraperitoneal injection. Other groups of 21 mice received a combination of 25 μg of F1 and V antigens presented in microspheres. A dose of 25 μg F1 was administered in a total mass of 5.42 mg of spheres, while 25 μg of V was contained in 2.08 mg of spheres. The required mass of microspheres was resuspended for injection in 100 μl of the FBI per animal. Animals were re-immunized with the appropriate antigen (s) on days 14 and 28.
Еще две группы по 21 мыши первично, а затем вторично иммунизировали в/б на 14 и 28 дни комбинацией 10 мкг F1 и 10 мкг V, совместно включенных в водную фазу 25% (по объему) суспензии alhydrogel (Alhydrogel 1,3%, Superfos, Denmark) в ФБР. Two more groups of 21 mice were primary and then secondly immunized i.v. on days 14 and 28 with a combination of 10 μg F1 and 10 μg V, together included in the
Избранные группы животных получали в дополнение дозу в 10 мкг СТВ (Sigma, Poole), включенного в носитель при каждой дозировке. Selected groups of animals received, in addition, a dose of 10 μg of CTB (Sigma, Poole) included in the vehicle at each dosage.
Контрольные группы, каждая из которых состояла из 21 мыши, получали либо только alhydrogel (100 мкл 25% раствора), либо только СТВ (10 мкг в 100 мкл ФБР), либо не обрабатывались вообще. Control groups, each of which consisted of 21 mice, received either only alhydrogel (100 μl of a 25% solution), or only CTB (10 μg in 100 μl of the FBI), or were not processed at all.
В целях сравнения защитной эффективности иммунизации объединенными субъединицами, свободными или микроинкапсулированными, с эффективностью защиты, обеспечиваемой вакциной по Greer (полученной из Greer Laboratories), животных подвергали п/к контрольному заражению вирулентной Y.pestis. In order to compare the protective efficacy of immunization with pooled or microencapsulated combined subunits with the protective efficacy provided by the Greer vaccine (obtained from Greer Laboratories), the animals were subjected to sc inoculation with virulent Y. pestis.
Среди животных, вакцинированных по Greer, индекс выживаемости составил 60% при контрольном заражении 2•105 КОЕ Y.pestis (фиг.1). В сравнение с этим среди животных, вакцированных объединенными микроинкапсулированными Fl+V (группа 1), при данном уровне контрольного заражения выжило 80% особей, а в группе 2 (μV+μFl+10 мкг СТВ) выживаемость составила 100%. Таким образом, объединенный микроинкапсулированный состав обеспечивал защиту от вирулентной Y.pestis без каких-либо проявлений побочных эффектов.Among animals vaccinated according to Greer, the survival index was 60% with a control infection of 2 • 10 5 CFU Y. pestis (figure 1). In comparison, among animals vaccinated with combined microencapsulated Fl + V (group 1), at this level of control infection, 80% of individuals survived, and in group 2 (μV + μFl + 10 μg PTS), the survival rate was 100%. Thus, the combined microencapsulated composition provided protection against virulent Y. pestis without any manifestation of side effects.
Вкратце, обрабатываемые группы представляли собой:
1. 25 мкг микроинкапсулированного F1 (μF1) + 25 мкг микроинкапсулированного V (μV) в/б;
2. 25 мкг μF1+25 мкг μV+10 мкг СТВ в/б;
3. 25 мкг μF1 в/б;
4. 25 мкг μV;
5. 25 мкг μF1+25 мкг μV в alhydrogel в/б;
6. Вакцина по Greer 0,1 мл в/м.Briefly, the treatment groups were:
1. 25 μg microencapsulated F1 (μF1) + 25 μg microencapsulated V (μV) ip;
2.25 μg μF1 + 25 μg μV + 10 μg PTS b / w;
3.25 μg μF1 ip;
4.25 μg μV;
5.25 μg μF1 + 25 μg μV in alhydrogel ip;
6. Greer vaccine 0.1 ml w / m.
Микроинкапсулирование может быть проведено с помощью блоксополимеров, в следующих экспериментах в качестве модели применяли белковый антиген БСА. Получение и охарактеризование микросфер проводят следующим образом. Загруженные белком микросферы получали в соответствии с процедурами методики выпаривания масляно-водного растворителя, описанной ранее, смотри R.L.Hunter and Bennet B., The J.Immunol., 133 (6), 3167-3175 (1984), с некоторыми модификациями. Раствор полимера (поли-D-молочной кислоты: Resomer 206, Boehringer Ingelheim, Germany; 125 или 250 мг) в ацетоне (22,5 мл), содержащем модельный белок (антиген). БСА (15-25% от теоретического уровня загрузки) и 0,11% м/о Pluronic L101 (или 0,09% м/о L121), полученный от Zeneca probe, озвучивали ультразвуком в течение 10 секунд и затем добавляли в водную фазу (22,5 мл), перемешивая при 100 об/мин в течение 5 минут, и подвергали роторному испарению до тех пор, пока органический растворитель не был удален. Полученный коллоид промывали и сушили вымораживанием. Микросферы среднего диаметра ~ 1 мкм (что было определено с помощью Malvern Mastersizer) и загрузку белка ~ 0,5-1,0% производили в данных условиях получения. Внешнюю морфологию полученных микросфер анализировали с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). Поверхностные характеристики определяли с точки зрения дзета-потенциала и гидрофобности. Microencapsulation can be carried out using block copolymers; in the following experiments, the BSA protein antigen was used as a model. The preparation and characterization of microspheres is as follows. Protein-loaded microspheres were prepared according to the procedures of the oil-water solvent evaporation method described previously, see R. L. Hunter and Bennet B., The J. Immunol., 133 (6), 3167-3175 (1984), with some modifications. A solution of a polymer (poly-D-lactic acid: Resomer 206, Boehringer Ingelheim, Germany; 125 or 250 mg) in acetone (22.5 ml) containing a model protein (antigen). BSA (15-25% of theoretical load) and 0.11% m / v Pluronic L101 (or 0.09% m / o L121) obtained from Zeneca probe were sonicated by ultrasound for 10 seconds and then added to the aqueous phase (22.5 ml), stirring at 100 rpm for 5 minutes, and rotary evaporated until the organic solvent was removed. The resulting colloid was washed and freeze dried. Microspheres of an average diameter of ~ 1 μm (as determined using the Malvern Mastersizer) and protein loading of ~ 0.5-1.0% were produced under these production conditions. The external morphology of the obtained microspheres was analyzed using scanning electron microscopy (SEM). Surface characteristics were determined in terms of zeta potential and hydrophobicity.
Измерения гидрофобности: гидрофобность микросфер количественно анализировали с помощью гидрофобной хроматографии (ГХ), как сообщалось ранее, смотри H. O. Alpar and A.J.Almeida, Eur.J.Pharm.Biopharm, 40, (4), 198-202 (1994). Микросферы снимали с серии агароз, которые были модифицированы гидрофобными остатками. Время удержания микросфер на октилагарозе принимали за показатель гидрофобности. Measurement of hydrophobicity: the hydrophobicity of the microspheres was quantitatively analyzed using hydrophobic chromatography (GC), as previously reported, see H. O. Alpar and A.J. Almeida, Eur.J.Pharm.Biopharm, 40, (4), 198-202 (1994). The microspheres were removed from a series of agaroses that were modified with hydrophobic residues. The retention time of microspheres on octylagarose was taken as an indicator of hydrophobicity.
Иммунизация: исследование было призвано установить влияние различий в типе микросфер и поверхностных характеристик на иммунный ответ. Самкам мышей Balb/c (пяти на группу) в/м вводили разовую дозу либо БСА, инкапсулированного в микросферы, образованные Pluronic, либо только свободного БСА в 100 мкл, либо суспендированного в присутствии поверхностно-активного вещества. Контрольная группа мышей получала то же количество антигена, инкапсулированного в микросферы, содержащие PVA в качестве стабилизатора эмульсии. Периодически в течение 2 месяцев брали образцы крови из кончика хвоста. Сыворотку из каждого образца анализировали на предмет анти-БСА антител, применяя твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA). Результаты представлены в графическом виде на фиг. 2. Immunization: The study was designed to establish the effect of differences in the type of microspheres and surface characteristics on the immune response. Female Balb / c mice (five per group) were injected with a single dose of either BSA encapsulated in microspheres formed by Pluronic, or only free BSA in 100 μl, or suspended in the presence of a surfactant. A control group of mice received the same amount of antigen encapsulated in microspheres containing PVA as an emulsion stabilizer. Periodically, blood samples were taken from the tip of the tail for 2 months. Serum from each sample was analyzed for anti-BSA antibodies using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The results are presented in graphical form in FIG. 2.
Присутствие Pluronic L101 и L121 наделяет поверхность гораздо большим уровнем гидрофобности по сравнению с PVA-содержащими составами (70% удержанных микросфер на октилагарозной колонке в отличие от 95% удержания на 30% латексной колонке). Гидрофобная поверхность будет облегчать взаимодействия макрофагов и последующий фагоцитоз и, таким образом, будет являться гораздо более пригодной для опосредования, усиленного иммунного ответа. Фиг. 2 показывает влияние различных БСА-содержащих составов на индукцию иммунного ответа. Пробы, полученные с применением Pluronic L101, обладали более сильным влиянием на титр анти-БСА антител в плазме, чем пробы, полученные с применением PVA. Пробы, полученные с применением Pluronic L121, слегка уступали пробам с PVA-содержащими микросферами в индуцировании мощного первичного антительного ответа после введения лишь малой дозы антигена (1 мкг). Отмечается более высокий уровень содержания IgG в сыворотке, достигнутый с применением Pluronic L101-coдержащих препаратов по сравнению с другими препаратами, и это может отчасти быть следствием большей гидрофобности поверхности. The presence of Pluronic L101 and L121 gives the surface a much greater level of hydrophobicity compared to PVA-containing formulations (70% retention microspheres on an octylagarose column, as opposed to 95% retention on a 30% latex column). The hydrophobic surface will facilitate the interaction of macrophages and subsequent phagocytosis and, thus, will be much more suitable for mediation, enhanced immune response. FIG. 2 shows the effect of various BSA-containing formulations on the induction of an immune response. Samples obtained using Pluronic L101 had a stronger effect on the titer of anti-BSA antibodies in plasma than samples obtained using PVA. Samples obtained using Pluronic L121 were slightly inferior to samples with PVA-containing microspheres in inducing a potent primary antibody response after administration of only a small dose of antigen (1 μg). There is a higher serum IgG level achieved with Pluronic L101-containing preparations compared to other drugs, and this may partly be due to greater surface hydrophobicity.
Также ранее в настоящей заявке было указано, что ДНК, кодирующая весь или части F1-антигена, или ДНК, кодирующая весь или часть V-антигена, может быть непосредственно применена в качестве генетической вакцины. В порядке примера, это может быть выполнено следующим образом. It was also stated earlier in this application that DNA encoding all or part of an F1 antigen, or DNA encoding all or part of a V antigen, can be directly used as a genetic vaccine. As an example, this can be done as follows.
1) ДНК, кодирующую F1 и V Y.pestis, получают путем амплификации специфических участков генома Y.pestis с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) или путем выделения данных генов из предварительно сконструированных плазмидных клонов, например, для V-приведенной последовательности ИД. 3. 1) DNA encoding F1 and V of Y. pestis is obtained by amplification of specific parts of the Y. pestis genome using polymerase chain reaction (PCR) or by isolating these genes from pre-engineered plasmid clones, for example, for a V-reduced ID sequence. 3.
2) Гены F1 и V клонируют в экспрессирующие векторы-плазмиды млекопитающего так, чтобы данные гены были расположены правее эукариотического промотора. Подходящие плазмиды включают pCMV (полученную от Clontech), в которой применяют непосредственный ранний промотор цитомегаловируса. F1 и V могут клонироваться по отдельности или в комбинации и могут клонироваться в виде продуктов слияния с такими генами, как последовательность, кодирующая глютатион-5-трансферазу, или сигнальная последовательность эукариот, которые могут стабилизировать экспрессируемый белок и облегчить его транспорт из клеток млекопитающих. 2) The F1 and V genes are cloned into mammalian expression vector plasmids so that these genes are located to the right of the eukaryotic promoter. Suitable plasmids include pCMV (obtained from Clontech), which uses the immediate early promoter of cytomegalovirus. F1 and V can be cloned individually or in combination and can be cloned as fusion products with genes such as the
3) Рекомбинантные плазмиды размножают в Escherichia соli и сырой продукт очищают для трансфекции модели млекопитающего и для внутримышечной или внутрикожной или ингаляционной иммунизации экспериментальных животных. 3) Recombinant plasmids are propagated in Escherichia coli and the crude product is purified for transfection of a mammalian model and for intramuscular or intradermal or inhalation immunization of experimental animals.
ПРИМЕР 4
Для создания ДНК-вакцины, экспрессирующей V-антиген, плазмидный вектор pCMV расщепляли с помощью рестриктазы Not 1 для удаления кодирующей последовательности гена lacz. Расщепленную плазмиду обрабатывали ферментом Klenow для получения тупоконечной векторной ДНК. Рестрикт ssp 1, содержащий кодирующую последовательность гибридного белка V-антигена и глютатион-S-трансферазы, выделяли из рекомбинантной плазмиды pVG100 и лигировали с векторной ДНК. Последовательность, кодирующая V, применяемая в данном случае представляет собой последовательность, описанную в приведенной ПОСЛ. ИД. 3. Рекомбинантной плазмидой трансформируют штамм Nova Blue E. coli. Очищенную плазмиду прививали мышам Ва1b/с с помощью внутримышечной инъекции. Иммуноглобулиновые ответные реакции на V-антиген определяли в сыворотке привитых животных.EXAMPLE 4
To create a DNA vaccine expressing the V antigen, the pCMV plasmid vector was digested with
ПРИМЕР 5
Для создания ДНК-вакцины, экспрессирующей F1-антиген, предназначались праймеры ПЦР для полной амплификации открытой рамки считывания cafl. Он кодирует F1 и его сигнальный
пептид, который направляет транспорт белка из бактериальной клетки. Праймеры ПЦР имели на 5'-концах "хвосты",которые содержали сайты узнавания рестриктаз для обеспечения направленного встраивания в плазмидный вектор. Последовательности праймеров ПЦР, 5'FAB2 и 3'FBAM, даны в приведенной ПОСЛ. ИД. 18 и ПОСЛ. ИД. 19 соответственно.EXAMPLE 5
To create a DNA vaccine expressing the F1 antigen, PCR primers were designed to fully amplify the cafl open reading frame. It encodes F1 and its signal
a peptide that directs the transport of protein from a bacterial cell. PCR primers had “tails” at the 5'-ends that contained restriction enzyme recognition sites to allow targeted insertion into the plasmid vector. The sequences of PCR primers, 5'FAB2 and 3'FBAM, are given in the above SEQ. ID 18 and AFTER. ID 19 respectively.
5'FAB2 и 3'FBAM применяли для амплификации ПЦР-фрагмента, последовательность которого приведена в ПОСЛ. ИД. 20. ПЦР-фрагмент расщепляли с помощью рестриктаз Nhe 1 и Bam H1 и клонировали в плазмиде pBKCMV, которую расщепляли теми же ферментами. Полученной плазмидой, pFlAB, трансформировали Е. coli Nova Blue и очищенную плазмиду применяли для привития мышам Ва1b/с с помощью внутримышечной инъекции. У привитых животных обнаруживали иммуноглобулиновые ответные реакции на F1. 5'FAB2 and 3'FBAM were used to amplify the PCR fragment, the sequence of which is shown in SEQ.
ПРИМЕР 6
Для создания ДНК-вакцины, экспрессирующей как F1, так и V, кодирующую последовательность V встраивали в ДНК-вакцину, экспрессирующую F1, подробно описанную в примере 2. Между кодирующими последовательностями F1 и V помещали линкерную область, кодирующую 6 аминокислот, для того чтобы оба белка достигали своей конформационной структуры независимо друг от друга. Линкер-V-кодирующую последовательность получали путем расщепления рекомбинантной плазмиды placFV6 с помощью Bam H1 и Hind III. Линкер-V-ДНК лигировали с плазмидой pF1AB, которую также расщепляли с помощью Ваm H1 и Hind III. Полученной плазмидой, pFVAB, трансформировали клетки E.coli Nova Blue и неочищенные плазмиды очищали для дальнейшего применения. Нуклеотидная и производная аминокислотная последовательности продукта слияния F1/V даны в приведенной ПОСЛ. ИД. 22.EXAMPLE 6
To create a DNA vaccine expressing both F1 and V, the coding sequence V was inserted into the DNA vaccine expressing F1 described in detail in Example 2. A
Пример гибридного белка, содержащего как F1-, так и V-антигены, описан ниже. An example of a fusion protein containing both F1 and V antigens is described below.
Ферменты и реактивы
Материалы для приготовления сред для выращивания получали из Oxoid Ltd. или Difco Laboratories. Все ферменты, применявшиеся для манипуляций с ДНК, получали из Boehringer Mannheim UK Ltd. и применяли в соответствии с инструкциями производителя. Все остальные химические и биохимические реактивы получали из Sigma Chemical Co, если только не указывается особо. Моноспецифичную кроличью поликлональную анти-V сыворотку получали от Dr. R.Brubaker (Department of Microbiology, Michigan State University) и мышиный анти- F1 моноклональные антитела (MAT) IgA F13G8-1 получали из American Type Culture Collection.Enzymes and Reagents
Materials for preparing growth media were obtained from Oxoid Ltd. or Difco Laboratories. All enzymes used to manipulate DNA were obtained from Boehringer Mannheim UK Ltd. and used in accordance with the manufacturer's instructions. All other chemical and biochemical reagents were obtained from Sigma Chemical Co, unless otherwise indicated. Monospecific rabbit polyclonal anti-V serum was obtained from Dr. R. Brubaker (Department of Microbiology, Michigan State University) and mouse anti-F1 monoclonal antibodies (MAT) IgA F13G8-1 were obtained from the American Type Culture Collection.
Штаммы бактерий и культивирование
Yersinia pestis GB культивировали в аэробных условиях при 28oС в жидкой среде (рН 6,8), содержащей 15 г протеолитического пептона, 2,5 г гидролизата печени, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г NaCl на литр с добавлением 80 мл 0,25% гемина, растворенного в 0,1М NaOH (Blood Base Broth). Escherichia coli JM109 культивировали и хранили, как описана Sambrook et al. (Sambrook J. et al. 1989, Molecular Cloning, a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, Laboratory Press, New York).Bacterial strains and cultivation
Yersinia pestis GB was cultivated under aerobic conditions at 28 o C in a liquid medium (pH 6.8) containing 15 g of proteolytic peptone, 2.5 g of liver hydrolyzate, 5 g of yeast extract, 5 g of NaCl per liter with the addition of 80
Манипуляции с ДНК
Хромосомную ДНК выделяли из Y.pestis по методу Marmur (Marmur, J. 1961, J. Kol. Biol. 3: 208-218). Гены, кодирующие F1-антиген (cafl) и V-антиген (IcrV), амплифицировали из ДНК Y.Pestis, применяя полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с использованием 125 пмоль праймеров, гомологичных последовательностям между 5'- и 3'-концами гена (Galyov, E.E. et al. 1990. FEBS Lett. 277: 230-232; Price S.B. et al. 1989. J. Bacteriol. 171: 5646-5653), хотя для cafl амплифицировали только область, кодирующую зрелый F1-антиген. Последовательности 5'-праймера F1 (F/5'B: GATCGAGCTCGGCAGATTTAACTGCAAGC-АСС), 3'-праймера F1 (Flink/3'A: GCATGGATCCTTGGTTAGATACGGTTACGGT), 5' -праймера V (Vlink/5'A: ATGGATCCATCGAAGGTCGTATTAGAGCCTACGAACAA)) и 3'-праймера V (VG/3'A: GCATAAGCTTCTA*GT GTCATTTACCAGACGT) также включают в себя 5'-хвосты, кодирующие сайты рестрикции Sacl, BamHI, BamHI и HindIII соответственно. В дополнение к этому, нуклеотид А* был изменен по сравнению с опубликованной последовательностью IcrV (Price S.B. et al. 1989. J.Bacteriol. 171: 5646-5653) так, что он стал включать дополнительный терминирующий кодон (ТАА) в амплифицированной ДНК. Хвост праймера Vlink/5'A также включал в себя нуклеотиды, кодирующие последовательность отщепления фактора Ха Ile-Glu-Gly-Arg. ПЦР-праймеры получали с помощью синтезатора ДНК (модель 392; Applied Biosystems). Фрагменты ДНК получали после 30 циклов амплификации (95oС, 20 с, 45oС, 20 с, 72oС, 30 с; GeneAmp PCR System модели 9600; Perkin Elmer) и фрагменты очищали. Продукт ПЦР cafl расщепляли с помощью Sacl и BamHI, лигировали с надлежащим образом расщепленной плазмидой puC18 и трансформировали Е. coli JM109 путем электропорации. В дальнейшем, продукт ПЦР IcrV-линкера расщепляли с помощью BamHI и HindIII и лигировали с промежуточной плазмидой с образованием рекомбинантной плазмиды placFV6. Колонию, содержащую placFV6, идентифицировали с помощью ПЦР, применяя 30-mer праймеры (5'-нуклеотиды, расположенные в положениях 54 и 794 (Price S.B. et al., 1989. J. Bacteriol. 171: 5646-5653), которые амплифицируют внутренний сегмент гена IcrV. Для подтверждения нуклеотидной последовательности клонируемой вставки проводили реакции секвенирования, задействующие placFV6 и праймеры, соответствующие генам cafl и IcrV, применяя протокол автоматизированного секвенирования с применением Taq-полимеразного цикла с помощью меченных флюоресцентной меткой дидезоксинуклеотидов (CATALYST Molecular Biology Labstation; Applied Biosystems). Продукты реакции анализировали, применяя автоматизированный секвенатор ДНК (модель 373А; Applied Biosystems).DNA manipulations
Chromosomal DNA was isolated from Y. pestis by the Marmur method (Marmur, J. 1961, J. Kol. Biol. 3: 208-218). Genes encoding F1 antigen (cafl) and V antigen (IcrV) were amplified from Y. Pestis DNA using polymerase chain reaction (PCR) using 125 pmol primers homologous to the sequences between the 5'- and 3'-ends of the gene ( Galyov, EE et al. 1990. FEBS Lett. 277: 230-232; Price SB et al. 1989. J. Bacteriol. 171: 5646-5653), although only the region encoding the mature F1 antigen was amplified for cafl. The sequences of the 5'-primer F1 (F / 5'B: GATCGAGCTCGGCAGATTTAACTGCAAGC-ACC), the 3'-primer F1 (Flink / 3'A: GCATGGATCCTTGGTTAGATACGGTTACGGT), the 5'-primer V (Vlink / 5AGTAGTAGTAG): 'primers V (VG / 3'A: GCATAAGCTTCTA * GT GTCATTTACCAGACGT) also include 5'-tails encoding restriction sites Sacl, BamHI, BamHI and HindIII, respectively. In addition, nucleotide A * was changed from the published IcrV sequence (Price SB et al. 1989. J. Bacteriol. 171: 5646-5653) so that it began to include an additional termination codon (TAA) in the amplified DNA. The tail of the Vlink / 5'A primer also included nucleotides encoding the cleavage sequence of factor Xa Ile-Glu-Gly-Arg. PCR primers were obtained using a DNA synthesizer (model 392; Applied Biosystems). DNA fragments were obtained after 30 amplification cycles (95 ° C, 20 s, 45 ° C, 20 s, 72 ° C, 30 s; GeneAmp PCR System Model 9600; Perkin Elmer) and the fragments were purified. The cafl PCR product was digested with Sacl and BamHI, ligated with a properly digested puC18 plasmid, and transformed with E. coli JM109 by electroporation. Subsequently, the PCR product of the IcrV linker was digested with BamHI and HindIII and ligated with the intermediate plasmid to form the recombinant plasFID placFV6. A colony containing placFV6 was identified by PCR using 30-mer primers (5'-nucleotides located at positions 54 and 794 (Price SB et al., 1989. J. Bacteriol. 171: 5646-5653), which amplify the internal Segment of the IcrV gene. To confirm the nucleotide sequence of the cloned insert, sequencing reactions using placFV6 and primers corresponding to the cafl and IcrV genes were performed using an automated sequencing protocol using Taq polymerase cycle using fluorescently labeled dideoxynucleotides (CATALYSTlecular iology Labstation; Applied Biosystems): Reaction products were analyzed using an automated DNA sequencer (Model 373A; Applied Biosystems).
Последовательность ДНК и производная аминокислотная последовательность клонируемого гибридного белка показана в примере 1. Гибридный белок состоит из F1- и V-антигенов, разделенных сшивкой, состоящей из шести аминокислот Gly-Ser-lle-Glu-Gly-Arg. Его клонируют правее промотора lac и в одной рамке с кодируемым вектором фрагментом LacZ'. Таким образом, полный гибридный белок содержит девять дополнительных аминокислот на N-конце (Met-Thr-Met-Ile-Thr-Asn-Ser-Ser-Ser) и накапливается в цитоплазме. The DNA sequence and derivative amino acid sequence of the cloned hybrid protein is shown in Example 1. The hybrid protein consists of F1 and V antigens separated by crosslinking of six amino acids Gly-Ser-lle-Glu-Gly-Arg. It is cloned to the right of the lac promoter and the LacZ 'fragment in the same frame as the vector encoded. Thus, a complete fusion protein contains nine additional amino acids at the N-terminus (Met-Thr-Met-Ile-Thr-Asn-Ser-Ser-Ser) and accumulates in the cytoplasm.
Экспрессия слитого белка F1/Vy E.coli
Культуры E.coli JM109/placFV6 выращивали на LB, содержащем 1000 мкгмл-1 ампициллин, при 37oС до тех пор, пока поглощение (600 нм) не становилось равным 0,3. Затем к культуре добавляли изопропил-β-D-тиогалактопиранозид (ИТГП) до конечной концентрации 1 мМ и выращивание продолжали в течение последующих 5 часов. Цельные клеточные лизаты бактерий получали, как описано в Sambrook et al. (Sambrook J. et al. 1989, Molecular Cloning, a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, Laboratory Press, New York) и экспрессию гибридного белка F1/V исследовали путем SDS-ЭПАГ на 10-15% градиентных гелях (Phastsystem, Pharmacia Biotech) и вестерн-блоттинга (Sambrook J. et al. 1989, Molecular Cloning, a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, Laboratory Press, New York). Отпечатки метили с помощью кроличьей анти-V сыворотки в разведении 1/4000 или Mab F13G8-1 в разведении 1/250 и белковые ансамбли визуализировали с помощью вторичных антител, меченных коллоидным золотом (Auroprobe BLplus, Cambio) или антимышечных вторичных антител IgA, конъюгированных с пероксидазой хрена (Sigma).Expression of fusion protein F1 / Vy E. coli
Cultures of E. coli JM109 / placFV6 were grown on LB containing 1000 μgml -1 ampicillin at 37 ° C. until absorbance (600 nm) became 0.3. Then, isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (ITHP) was added to the culture to a final concentration of 1 mM and cultivation was continued for the next 5 hours. Whole bacterial cell lysates were prepared as described in Sambrook et al. (Sambrook J. et al. 1989, Molecular Cloning, a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, Laboratory Press, New York) and expression of the F1 / V fusion protein was examined by SDS-EPAG on 10-15% gradient gels (Phastsystem, Pharmacia Biotech ) and Western blotting (Sambrook J. et al. 1989, Molecular Cloning, a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, Laboratory Press, New York). Imprints were labeled with rabbit anti-V serum at a dilution of 1/4000 or Mab F13G8-1 at a dilution of 1/250, and protein ensembles were visualized using secondary antibodies labeled with colloidal gold (Auroprobe BLplus, Cambio) or anti-muscle IgA secondary antibodies conjugated to horseradish peroxidase (Sigma).
В лизатах JM109/placFV6 путем вестерн-блоттинга с анти-V- и анти-F1-сыворотками определяли гибридный белок с приблизительной молекулярной массой 54,2 кДа. Данный продукт не определялся в контрольных лизатах JMl09/pUC18. In JM109 / placFV6 lysates, a fusion protein with an approximate molecular weight of 54.2 kDa was determined by western blotting with anti-V and anti-F1 sera. This product was not detected in control lysates JMl09 / pUC18.
Электропорация в Salmonella typhimurium SL3261
Плазмидную ДНК экстрагировали и очищали из JM109/ placFV6, применяя кит Qiaprep (Qiagen), и электропорировали в штамм LB5010 S.typhimurium (r-m+). Далее, модифицированную placFV6 выделяли и электропорировали в штамм SL3261 S. typhimurium (aroA his). Для прививания мышам бактерии выращивали на LB, содержащем 100 мкгмл-1 ампициллин, в течение 18 часов без перемешивания. После промывания клетки ресуспендировали в 10% глицерине в фосфатно-буферном растворе (ФБР) и хранили при -70oС. Клеточные суспензии размораживали и, при необходимости, разводили в ФБР перед инъекцией.Electroporation in Salmonella typhimurium SL3261
Plasmid DNA was extracted and purified from JM109 / placFV6 using the Qiaprep kit (Qiagen) and electroporated into S. typhimurium strain LB5010 (r - m + ). Next, the modified placFV6 was isolated and electroporated into S. typhimurium strain (aroA his) SL3261. For inoculation into mice, bacteria were grown on LB containing 100 μg -1 ampicillin for 18 hours without stirring. After washing, the cells were resuspended in 10% glycerol in phosphate-buffered saline (PBS) and stored at -70 ° C. Cell suspensions were thawed and, if necessary, diluted in PBS before injection.
Иммунизация rV
В данном исследовании применяли самок мышей Ваlb/с в возрасте шести недель, выращенных в особых условиях, свободных от патогенов (Charles River Laboratories, Margate Kent, UK). Группа из 19 мышей внутривенно (в/в) получала 0,2 мл первично иммунизирующие дозы приблизительно 5•106 КОЕ SL3261/pFV6 на 0 и 14 дни. Для сохранения placFV6 in vivo мышам также подкожно (п/к) вводили 50 мкл суспензии ампициллина тригидрата (150 мгмл-1 ; Penbritin injectable suspension РОМ; SmithKline Beecham Animal Health) в течение 5 дней после каждой иммунизации. В дополнение к этому, группы по 15 мышей иммунизировали в/в на 0 день разовой 0,1 мл дозой приблизительно 5•106 КОЕ SL3261 или внутрибрюшинно (в/б) на 0 и 14 дни 0,1 мл смеси 10 мкг V и 10 мкг F1, адсорбированных на Alhydrogel. Необрабатываемую группу из 10 одновозрастных мышей применяли в качестве контроля.Immunization rV
In this study, six-week old female Balb / c mice grown under special conditions free of pathogens were used (Charles River Laboratories, Margate Kent, UK). A group of 19 mice intravenously (iv) received 0.2 ml of primary immunizing doses of approximately 5 x 10 6 CFU SL3261 / pFV6 on days 0 and 14. To keep placFV6 in vivo, mice were also subcutaneously (sc) injected with 50 μl ampicillin trihydrate suspension (150 mg ml -1 ; Penbritin injectable suspension POM; SmithKline Beecham Animal Health) for 5 days after each immunization. In addition, groups of 15 mice were immunized iv on day 0 with a single dose of 0.1 ml at a dose of approximately 5 • 10 6 CFU SL3261 or intraperitoneally (iv) on days 0 and 14 with 0.1 ml of a mixture of 10 μg V and 10 mcg F1 adsorbed on Alhydrogel. An untreated group of 10 same age mice was used as a control.
На 7 день пять мышей из групп, получавших SL3261/pFV6 или SL3261, забивали и их селезенки отбирали. Органы гомогенизировали в 5 мл ФБР с помощью stomacher (Seward Medical Ltd.) в течение 30 с. Гомогенаты серийно разводили в ФБР и сеяли на L-агар или L-агар, содержащий 100 мкгмл1 ампициллина, для определения числа бактерий на селезенку (см. табл. 2)
Измерение титра сывороточных антител
На 42 день отбирали образцы крови из хвостовой вены мышей, иммунизированных SL3261/placFV6, и образцы группировали. Титры сывороточных анти-V- и анти-F1-антител измеряли с помощью модифицированного ELISA (Williarason,E.D. and R.W.Titball. 1993. Vaccine 11: 1253-1258). Вкратце, V (6 мкгмл-1 в ФБР) или F1 (2 мкгмл-1) наносили на планшет для микротитрования и на планшете в двойном экземпляре готовили серии разведений тестируемых сывороток. Связавшиеся антитела определяли, применяя конъюгаты антимышиных поливалентных Ig, меченных пероксидазой. Титр специфичных антител определяли как максимальное разведение сыворотки, позволяющее получить показатель поглощения больше чем 0,1 единицы, после вычитания поглощения, имеющего место при неспецифическом связывании, определенного в контрольных сыворотках. Титр сывороточных антител также определяли во всех группах мышей до контрольного заражения Y.pestis.On day 7, five mice from the groups receiving SL3261 / pFV6 or SL3261 were sacrificed and their spleens were removed. The organs were homogenized in 5 ml of PBS using a stomacher (Seward Medical Ltd.) for 30 s. The homogenates were serially diluted in the FBI and plated on L-agar or L-agar containing 100 μg 1 ampicillin to determine the number of bacteria per spleen (see table 2)
Serum antibody titer measurement
On day 42, blood samples were taken from the tail vein of mice immunized with SL3261 / placFV6, and the samples were grouped. Titers of serum anti-V and anti-F1 antibodies were measured using a modified ELISA (Williarason, ED and RWTitball. 1993. Vaccine 11: 1253-1258). Briefly, V (6 μgml −1 at the FBI) or F1 (2 μgml −1 ) was applied onto a microtiter plate and a series of dilutions of the test sera were prepared on the tablet in duplicate. Bound antibodies were determined using conjugates of anti-mouse polyvalent Ig labeled with peroxidase. The titer of specific antibodies was determined as the maximum dilution of serum, allowing to obtain an absorption index of more than 0.1 units, after subtracting the absorption that occurs with nonspecific binding determined in control sera. The titer of serum antibodies was also determined in all groups of mice before the control infection of Y. pestis.
На 42 день титры анти-V- и анти-F1-антител у мышей, получавших SL3261/placFV6, составили 1:5120 и 1:2560 соответственно. On day 42, anti-V and anti-F1 antibody titers in mice treated with SL3261 / placFV6 were 1: 5120 and 1: 2560, respectively.
Контрольное заражение Y.pestis
На 57 день группы по 5 или 7 мышей из иммунизированных и контрольных групп подвергали подкожному контрольному заражению 0,1 мл аликвотами штамма GB Y. pestis, содержащими 7,36•102 или 7,36•104 КОЕ. Штамм GB выделяли из организма смертельно заболевшего чумой человека, и его подкожная среднелетальная доза (MLD) для мышей Ва1b/с составляет <1 КОЕ (Russel, P.et al. 1995. Vaccine 13: 1551-1556). Мышей наблюдали в течение 14 дней и, если возникала необходимость, регистрировали время до смерти. Для тестирования на предмет присутствия Y. pestis образцы крови, печени и селезенки высевали на агар с конго красным и инкубировали при 28oС в течение 48 часов (см. таблицу 3).Control infection Y.pestis
On day 57, groups of 5 or 7 mice from the immunized and control groups were subcutaneously infected with 0.1 ml aliquots of GB Y. pestis strain containing 7.36 x 10 2 or 7.36 x 10 4 CFU. Strain GB was isolated from the body of a terminally ill person with plague, and its subcutaneous average lethal dose (MLD) for Ba1b / c mice was <1 CFU (Russel, P. et al. 1995. Vaccine 13: 1551-1556). Mice were observed for 14 days and, if necessary, time to death was recorded. For testing for the presence of Y. pestis, blood, liver, and spleen samples were plated on Congo red agar and incubated at 28 ° C. for 48 hours (see table 3).
Claims (29)
7. Вакцина по п.3 или 4, где указанная ДНК содержит ДНК, обладающую SEQ ID N0: 10.6. The vaccine according to claim 5, where the specified DNA is located in a frame with the lacz or nirβ promoter.
7. The vaccine according to claim 3 or 4, where the specified DNA contains DNA having SEQ ID N0: 10.
13.03.1995 по пп.1-13, 24 и 26;
05.12.1995 по пп.14-19 и 25;
13.03.1996 по пп.20-23 и 27-30;
13.03.1995, 05.12.1995 и 13.03.1996 по п.31.Priority on points:
03/13/1995 according to claims 1-13, 24 and 26;
12/05/1995 according to claims 14-19 and 25;
03/13/1996 according to claims 20-23 and 27-30;
03/13/1995, 12/05/1995 and 03/13/1996 according to paragraph 31.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB9505059.7A GB9505059D0 (en) | 1995-03-13 | 1995-03-13 | Vaccines |
| GB9505059.7 | 1995-03-13 | ||
| GB9518946.0 | 1995-09-15 | ||
| GBGB9524825.8A GB9524825D0 (en) | 1995-12-05 | 1995-12-05 | Vaccines |
| GB9524825.8 | 1995-12-05 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU97116840A RU97116840A (en) | 1999-10-20 |
| RU2197988C2 true RU2197988C2 (en) | 2003-02-10 |
Family
ID=26306670
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU97116840/13A RU2197988C2 (en) | 1995-03-13 | 1996-03-13 | Antiplague vaccine |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2197988C2 (en) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2248217C2 (en) * | 2003-05-22 | 2005-03-20 | Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока (НИПЧИ Сибири и ДВ) | Method for preparing immunogenic preparation from yersinia pestis ev |
| RU2288275C1 (en) * | 2005-03-29 | 2006-11-27 | Федеральное государственное учреждение здравоохранения "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Method of assay of virulence loss by plague microorganism strain because of loss of pigmentation region |
| RU2439155C1 (en) * | 2010-06-02 | 2012-01-10 | Федеральное государственное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФГУН ГНЦ ПМБ) | NUCLEOTIDE SEQUENCE, CODING IMMUNOGENIC POLYPEPTIDE LcrV(G113), CAUSING PROTECTIVE IMMUNE RESPONSE AGAINST Yersinia pestis; RECOMBINANT PLASMID DNA pETV-I-3455, CODING IMMUNOGENIC POLYPEPTIDE LcrV(G113); RECOMBINANT STRAIN Escherichia coli BL21(DE3)/pETV-I-3455 - PRODUCER OF IMMUNOGENIC POLYPEPTIDE LcrV(G113); POLYPEPTIDE LcrV(G113) AND METHOD OF ITS OBTAINING |
| RU2671525C2 (en) * | 2015-12-07 | 2018-11-01 | Российская Федерация, от имени которой выступает Министерство обороны Российской Федерации | Recombinant vaccine preparation of prolonged action for prevention of plague in mammals and humans and method of preparation thereof |
| RU2727258C1 (en) * | 2019-10-29 | 2020-07-21 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФКУЗ "РосНИПЧИ "Микроб" Роспотребнадзора) | Method for increasing immunogenicity of vaccine strain of plague microbe |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995018231A1 (en) * | 1993-12-24 | 1995-07-06 | The Secretary Of State For Defence In Her Britannic Majesty's Government Of The United Kingdom Of Great Britain And Northern Ireland | Vaccine compositions comprising live bacterial vectors for protection against yersinia pestis injection |
| RU2046145C1 (en) * | 1992-07-29 | 1995-10-20 | Государственный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии | Recombinant strain of salmonella minnesota - a producer of plague microbe capsule antigene |
-
1996
- 1996-03-13 RU RU97116840/13A patent/RU2197988C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2046145C1 (en) * | 1992-07-29 | 1995-10-20 | Государственный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии | Recombinant strain of salmonella minnesota - a producer of plague microbe capsule antigene |
| WO1995018231A1 (en) * | 1993-12-24 | 1995-07-06 | The Secretary Of State For Defence In Her Britannic Majesty's Government Of The United Kingdom Of Great Britain And Northern Ireland | Vaccine compositions comprising live bacterial vectors for protection against yersinia pestis injection |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| LEARY S.E.C. et al. Expression of Yersinia pestis V antigen in attenuated Salmonella typhimurium: Development of a novel vaccine for plauge. Contrib Microbiol. Immuno. - 1995, 13(0), p.216-217. OYSTON P.C.F. et al. Immunization with live recombinant Salmonella typhimurium aroA producing Fl antigen protects against plauge. Infection and immunity. - 1995, February, vol.63, No 2, p.563-568. * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2248217C2 (en) * | 2003-05-22 | 2005-03-20 | Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока (НИПЧИ Сибири и ДВ) | Method for preparing immunogenic preparation from yersinia pestis ev |
| RU2288275C1 (en) * | 2005-03-29 | 2006-11-27 | Федеральное государственное учреждение здравоохранения "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Method of assay of virulence loss by plague microorganism strain because of loss of pigmentation region |
| RU2439155C1 (en) * | 2010-06-02 | 2012-01-10 | Федеральное государственное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФГУН ГНЦ ПМБ) | NUCLEOTIDE SEQUENCE, CODING IMMUNOGENIC POLYPEPTIDE LcrV(G113), CAUSING PROTECTIVE IMMUNE RESPONSE AGAINST Yersinia pestis; RECOMBINANT PLASMID DNA pETV-I-3455, CODING IMMUNOGENIC POLYPEPTIDE LcrV(G113); RECOMBINANT STRAIN Escherichia coli BL21(DE3)/pETV-I-3455 - PRODUCER OF IMMUNOGENIC POLYPEPTIDE LcrV(G113); POLYPEPTIDE LcrV(G113) AND METHOD OF ITS OBTAINING |
| RU2671525C2 (en) * | 2015-12-07 | 2018-11-01 | Российская Федерация, от имени которой выступает Министерство обороны Российской Федерации | Recombinant vaccine preparation of prolonged action for prevention of plague in mammals and humans and method of preparation thereof |
| RU2727258C1 (en) * | 2019-10-29 | 2020-07-21 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФКУЗ "РосНИПЧИ "Микроб" Роспотребнадзора) | Method for increasing immunogenicity of vaccine strain of plague microbe |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3813173B2 (en) | Vaccine for plague | |
| CN101969990B (en) | Compositions and methods for enhancing the immune response against Eimeria | |
| Yokoyama et al. | Oral passive immunization against experimental salmonellosis in mice using chicken egg yolk antibodies specific for Salmonella enteritidis and S. typhimurium | |
| JP5746333B2 (en) | Vaccines and methods for reducing Campylobacter infection | |
| JP2004159660A (en) | Deletion mutants as cholera vaccines | |
| US5888810A (en) | Campylobacteri jejuni flagellin-escherichia coli LT-B fusion protein | |
| Hajam et al. | Incorporation of membrane-anchored flagellin into Salmonella Gallinarum bacterial ghosts induces early immune responses and protection against fowl typhoid in young layer chickens | |
| CA2323576C (en) | Bacteria attenuated by a non-reverting mutation in each of the aroc, ompf and ompc genes, useful as vaccines | |
| US10603370B2 (en) | Compositions and methods of preparing Leptospira | |
| US8431138B2 (en) | In ovo vaccination of Campylobacter in avian species | |
| Iankov et al. | Protective efficacy of IgA monoclonal antibodies to O and H antigens in a mouse model of intranasal challenge with Salmonella enterica serotype Enteritidis | |
| RU2197988C2 (en) | Antiplague vaccine | |
| JPH11504206A (en) | Helicobacter antigen for defense | |
| JP2009509496A (en) | Immunological protein of Lawsonia intracellularis | |
| TW200418874A (en) | Passive vaccine for the prevention of campylobacter colonization, and its preparation method | |
| US20010038844A1 (en) | Methods and vaccines for protection against campylobacter infections | |
| EP1766008A1 (en) | Phage screening assay | |
| Schuijffel | A strategic approach for immunity-based selection of cross-protective Ornithobacterium rhinotracheale antigens | |
| McPherson | Localization of neutralizing epitopes in the leukotoxin of Pastuerella haemolytica | |
| MIuI et al. | pYA3081 I| ii | |
| Strain et al. | Adjuvant Activity of a Nontoxic Mutant of | |
| LT-B | Meinersmann et al. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20150314 |