RU2195673C2 - Method of assay of antithrombin iii activity - Google Patents
Method of assay of antithrombin iii activity Download PDFInfo
- Publication number
- RU2195673C2 RU2195673C2 RU2000130498/14A RU2000130498A RU2195673C2 RU 2195673 C2 RU2195673 C2 RU 2195673C2 RU 2000130498/14 A RU2000130498/14 A RU 2000130498/14A RU 2000130498 A RU2000130498 A RU 2000130498A RU 2195673 C2 RU2195673 C2 RU 2195673C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- ala
- antithrombin iii
- pna
- arg
- activity
- Prior art date
Links
- 108090000935 Antithrombin III Proteins 0.000 title claims abstract description 23
- 102000004411 Antithrombin III Human genes 0.000 title claims abstract description 21
- 229960005348 antithrombin iii Drugs 0.000 title claims abstract description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 230000000694 effects Effects 0.000 title abstract description 20
- 238000003556 assay Methods 0.000 title abstract 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 17
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims abstract 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims abstract 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims abstract 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 11
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 238000003771 laboratory diagnosis Methods 0.000 abstract 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 11
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 6
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 102100022977 Antithrombin-III Human genes 0.000 description 2
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 2
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- OIXLLKLZKCBCPS-RZVRUWJTSA-N (2s)-2-azanyl-5-[bis(azanyl)methylideneamino]pentanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N.OC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N OIXLLKLZKCBCPS-RZVRUWJTSA-N 0.000 description 1
- TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 4-nitroaniline Chemical compound NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 230000003024 amidolytic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 108010072035 antithrombin III-protease complex Proteins 0.000 description 1
- 125000001584 benzyloxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC1=CC=CC=C1)* 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 1
- 230000002439 hemostatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N phenylmethyl ester of formic acid Natural products O=COCC1=CC=CC=C1 UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в диагностике и контроле лечения различных заболеваний, в том числе сердечно-сосудистых, хирургических, гематологических и других, при которых в крови изменяется активность антитромбина III. Этот показатель характеризует изменение активности важнейшего естественного антикоагулянта и степень тяжести заболевания. Снижение активности антитромбина III имеет место при ДВС-синдроме, последний же представляет собой наиболее частый вид патологии гемостаза. Поэтому поиск удобных способов определения активности антитромбина III в плазме крови больных является актуальной задачей. Для этой цели используют амидолитические методы, основанные на реакции взаимодействия этих белков с хромогенными пептидными субстратами, в результате которого происходит гидролиз субстрата и образуется окрашенное вещество - pNa (п-нитроанилин). Известно несколько синтетических пептидных субстратов, специфичных для одного из компонентов системы гемостаза - тромбина, на основе которого определяют активность антитромбина III [1, 2]. The invention relates to medicine and can be used in the diagnosis and control of the treatment of various diseases, including cardiovascular, surgical, hematological and others, in which the activity of antithrombin III changes in the blood. This indicator characterizes the change in the activity of the most important natural anticoagulant and the severity of the disease. A decrease in the activity of antithrombin III occurs with DIC, the latter is the most common type of hemostasis pathology. Therefore, the search for convenient methods for determining the activity of antithrombin III in the blood plasma of patients is an urgent task. For this purpose, amidolytic methods are used, based on the reaction of interaction of these proteins with chromogenic peptide substrates, as a result of which the substrate is hydrolyzed and a colored substance is formed - pNa (p-nitroaniline). Several synthetic peptide substrates are known that are specific for one of the components of the hemostatic system, thrombin, on the basis of which antithrombin III activity is determined [1, 2].
В качестве ближайшего аналога рассмотрим метод определения данной активности с помощью трипептида HD-Phe-Pip-Arg-pNa. HCl [3]. Этот субстрат (выпускаемый фирмой "Behring", Германия) получил самое широкое распространение и применяется для определения активности антитромбина III в плазме крови по остаточной активности тромбина, взятого в избытке, после образования комплекса тромбин-антитромбин III. As the closest analogue, we consider a method for determining this activity using the HD-Phe-Pip-Arg-pNa tripeptide. HCl [3]. This substrate (manufactured by Behring, Germany) is most widely used and is used to determine the activity of antithrombin III in blood plasma by the residual activity of thrombin taken in excess after the formation of the thrombin-antithrombin III complex.
Определение проводится следующим способом. К 0,05 мл исследуемой плазмы крови добавляют 1 мл тромбина (концентрация исходного раствора 10 мг/мл, активности 27,5 ед/мл), инкубируют 5 мин при 37oС, добавляют 0,10 мл 3 мМ раствора субстрата и либо определяют прирост оптической плотности за 1 мин спектрофотометрически при 405 нм, либо после двухминутной инкубации пробы при 37oС реакцию останавливают добавлением 0,5 мл 20%-ной уксусной кислоты, после чего определяют оптическую плотность раствора при 405 нм. Активность Антитромбина III выражают в % и определяют по формуле:
%АТIII=(Аконтроль-Аобразец)xFL,
где: Аконтроль - оптическая плотность контрольного образца, Аобразец - оптическая плотность исследуемого образца, FL - коэффициент, зависящий от температуры измеряемых раствором, который при 37oС составляет 688 [4].The determination is carried out as follows. To 0.05 ml of the studied blood plasma add 1 ml of thrombin (initial solution concentration 10 mg / ml, activity 27.5 u / ml), incubate for 5 min at 37 ° C, add 0.10 ml of a 3 mM substrate solution and either determine the increase in optical density in 1 min spectrophotometrically at 405 nm, or after a two-minute incubation of the sample at 37 ° C, the reaction is stopped by adding 0.5 ml of 20% acetic acid, after which the optical density of the solution is determined at 405 nm. The activity of antithrombin III is expressed in% and is determined by the formula:
% ATIII = (A control -A sample ) xF L ,
where: A control is the optical density of the control sample, A sample is the optical density of the test sample, F L is a coefficient depending on the temperature measured by the solution, which at 68 ° С is 688 [4].
Синтез пептида HD-Phe-Pip-Arg-pNa.HCl осуществляют методами классической пептидной химии. Он представляет собой трудоемкий многостадийный процесс, включающий (исходя из свободных аминокислот в зависимости от схемы) 10-12 стадий [5]. The synthesis of the HD-Phe-Pip-Arg-pNa.HCl peptide is carried out using classical peptide chemistry methods. It is a laborious multi-stage process, including (based on free amino acids depending on the scheme) 10-12 stages [5].
Задача. Разработать способ определения активности антитромбина III с помощью хромогенного субстрата, легко доступного для синтеза. Задачу решают путем использования в качестве хромогенного пептидного субстрата вещество z-Ala-Ala-Arg-pNa. HBr, где z - бензилоксикарбонил, Aia-аланин, Arg-аргинин, pNa-п-нитроанилин, НВr-бромистоводородная кислота. Task. To develop a method for determining the activity of antithrombin III using a chromogenic substrate readily available for synthesis. The problem is solved by using the substance z-Ala-Ala-Arg-pNa as a chromogenic peptide substrate. HBr, where z is benzyloxycarbonyl, Aia-alanine, Arg-arginine, pNa-p-nitroaniline, HBr-hydrobromic acid.
Способ получения z-Ala-Ala-Arg-pNa.HBr значительно проще и включает всего 7 стадий, причем две из них представляют собой ферментативные реакции, протекающие практически с количественным выходом [6]. The method of obtaining z-Ala-Ala-Arg-pNa.HBr is much simpler and includes only 7 stages, moreover, two of them are enzymatic reactions proceeding practically with a quantitative yield [6].
Способ в общем виде
Метод определения антитромбина III повторяет существующий метод и отличается только использованием в качестве субстрата тромбина вещества, отвечающего химической формуле z-Ala-Ala-Arg-pNa.HBr.The method in General
The method for determining antithrombin III repeats the existing method and differs only in the use of a substance corresponding to the chemical formula z-Ala-Ala-Arg-pNa.HBr as a thrombin substrate.
К 0,05 мл исследуемой плазмы крови добавляют 1 мл тромбина, инкубируют 5 мин при 37oС, добавляют 0,10 мкл 3 мМ раствора субстрата z-Ala-Ala-Arg-pNa. HBr, инкубируют 2 минуты при 37oС, останавливают реакцию добавлением 0,5 мл 20%-ной уксусной кислоты и определяют оптическую плотность раствора при 405 нм. Активность антитромбина III выражают в процентах к норме и вычисляют по формуле:
где: АТIIIстандарт. - известное содержание АТIII в стандартной плазме; Астанд. - оптическая плотность стандартной плазмы; Аобразец - оптическая плотность исследуемого образца плазмы.To 0.05 ml of the studied blood plasma add 1 ml of thrombin, incubate for 5 min at 37 o C, add 0.10 μl of a 3 mm solution of the substrate z-Ala-Ala-Arg-pNa. HBr, incubated for 2 minutes at 37 o C, stop the reaction by adding 0.5 ml of 20% acetic acid and determine the optical density of the solution at 405 nm. Antithrombin III activity is expressed as a percentage of normal and calculated by the formula:
where: ATIIIstandard. - known content of ATIII in standard plasma; Astand. - optical density of a standard plasma; Arazobet - optical density of the studied plasma sample.
Способ иллюстрируется следующими примерами. The method is illustrated by the following examples.
Пример 1 (контроль к примеру 2). Определение активности антитромбина III в пуле плазмы 10 здоровых доноров с помощью набора реактивов фирмы Behring (Германия). Example 1 (control for example 2). Determination of antithrombin III activity in a plasma pool of 10 healthy donors using a reagent kit from Behring (Germany).
К 0,2 мл исследуемой плазмы крови добавляют 1 мл тромбина, инкубируют 5 мин при 37oС, добавляют 0,10 мкл 3 мМ раствора субстрата HD-Phe-Pip-Arg-pNa. HCl, инкубируют 2 мин при 37oС, останавливают реакцию добавлением 0,5 мл 20%-ной уксусной кислоты. Оптическая плотность раствора при 405 нм составила 0,12 ΔА/мин и была принята за 100%.To 0.2 ml of the studied blood plasma, add 1 ml of thrombin, incubate for 5 min at 37 ° C, add 0.10 μl of a 3 mM solution of the substrate HD-Phe-Pip-Arg-pNa. HCl, incubated for 2 min at 37 o C, stop the reaction by adding 0.5 ml of 20% acetic acid. The optical density of the solution at 405 nm was 0.12 ΔA / min and was taken as 100%.
Пример 2. Определение активности антитромбина III в пуле плазмы 10 здоровых доноров с помощью предложенного субстрата z-Ala-Ala-Arg-pNa.HBr. Example 2. Determination of the activity of antithrombin III in the plasma pool of 10 healthy donors using the proposed substrate z-Ala-Ala-Arg-pNa.HBr.
Определение проводят как в примере 1, но используют раствор субстрата z-Ala-Ala-Arg-pNa. HBr. Оптическая плотность раствора при 405 нм составила 0,118 ΔА/мин, что соответствует 98,3% антитромбина III. The determination is carried out as in example 1, but using a solution of the substrate z-Ala-Ala-Arg-pNa. HBr. The optical density of the solution at 405 nm was 0.118 ΔA / min, which corresponds to 98.3% antithrombin III.
Пример 3. Определение активности антитромбина III в крови больных с ДВС-синдромом (диагноз инсульт и вторичный гнойный менингит) с помощью субстрата HD-Phe-Pip-Arg-pNa.HCl фирмы Behring (Германия). Example 3. Determination of the activity of antithrombin III in the blood of patients with DIC (diagnosis of stroke and secondary purulent meningitis) using a substrate of HD-Phe-Pip-Arg-pNa.HCl from Behring (Germany).
Определение проводят как в примере 1, но используют раствор субстрата z-Ala-Ala-Arg-pNa. HBr. Оптическая плотность раствора при 405 нм составила 0,070 ΔА/мин, что соответствует 58,3% антитромбина III. The determination is carried out as in example 1, but using a solution of the substrate z-Ala-Ala-Arg-pNa. HBr. The optical density of the solution at 405 nm was 0.070 ΔA / min, which corresponds to 58.3% antithrombin III.
Пример 4. Определение активности антитромбина III в крови больных с ДВС-синдромом (диагноз инсульт и вторичный гнойный менингит) с помощью субстрата z-Ala-Ala-Arg-pNa.HBr. Example 4. The determination of the activity of antithrombin III in the blood of patients with DIC-syndrome (diagnosis of stroke and secondary purulent meningitis) using a substrate of z-Ala-Ala-Arg-pNa.HBr.
Определение проводят как в примере 1, но используют раствор субстрата z-Ala-Ala-Arg-pNa. HBr. Оптическая плотность раствора при 405 нм составила 0,067 ΔА/мин, что соответствует 55,5% антитромбина III. The determination is carried out as in example 1, but using a solution of the substrate z-Ala-Ala-Arg-pNa. HBr. The optical density of the solution at 405 nm was 0.067 ΔA / min, which corresponds to 55.5% of antithrombin III.
Таким образом, из примеров 1 и 2 следует, что заявленный способ определения этих ферментов по чувствительности не уступает методу, изложенному в ближайшем аналоге. А примеры 3 и 4 свидетельствуют о том, что способ с применением пептида z-Ala-Ala-Arg-pNa. HBr достаточно чувствителен и позволяет достоверно определить активность антитромбина III при более низком его содержании в крови больных. Thus, from examples 1 and 2 it follows that the claimed method for determining these enzymes in sensitivity is not inferior to the method described in the closest analogue. And examples 3 and 4 indicate that the method using the peptide z-Ala-Ala-Arg-pNa. HBr is quite sensitive and can reliably determine the activity of antithrombin III at a lower content in the blood of patients.
Литература
1. Lottenberg R., Hall J.A., Fenton J.W. et.at., Thromb. Res., 1982, 28, 3, р. 313-32.Literature
1. Lottenberg R., Hall JA, Fenton JW et.at., Thromb. Res., 1982, 28, 3, p. 313-32.
2. Sender S.A., Fenton J.W., Clin. Chen., 1986, 32, 6, р. 934-7. 2. Sender S. A., Fenton J. W., Clin. Chen., 1986, 32, 6, p. 934-7.
3. Antithrombin III., Behring E, Berichrom, 1990. 3. Antithrombin III., Behring E, Berichrom, 1990.
4. Band N.U., Mattler L.E., Haemost., 1988, 7, 2-3, р. 98-104. 4. Band N.U., Mattler L.E., Haemost., 1988, 7, 2-3, p. 98-104.
5. Sushil K. Sharma, Francis J. Castelino, Trombosis Research, 57, 1990, 127-138. 5. Sushil K. Sharma, Francis J. Castelino, Trombosis Research, 57, 1990, 127-138.
6. Voyushina T.L., Terent'eva E.Yu., Stepanov V.M., Biomed. Biochim. Acta, 50 1991, 209-212. 6. Voyushina T.L., Terent'eva E.Yu., Stepanov V.M., Biomed. Biochim. Acta, 50 1991, 209-212.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2000130498/14A RU2195673C2 (en) | 2000-12-06 | 2000-12-06 | Method of assay of antithrombin iii activity |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2000130498/14A RU2195673C2 (en) | 2000-12-06 | 2000-12-06 | Method of assay of antithrombin iii activity |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2195673C2 true RU2195673C2 (en) | 2002-12-27 |
| RU2000130498A RU2000130498A (en) | 2003-07-20 |
Family
ID=20243008
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2000130498/14A RU2195673C2 (en) | 2000-12-06 | 2000-12-06 | Method of assay of antithrombin iii activity |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2195673C2 (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1007004A1 (en) * | 1981-07-31 | 1983-03-23 | Всесоюзный кардиологический научный центр АМН СССР | Lymphatic micro vessel condition investigation method |
| RU2121690C1 (en) * | 1998-01-16 | 1998-11-10 | Общество с ограниченной ответственностью фирма "Технология-Стандарт" | Method of determining plasminogen and plasmin inhibitors levels in blood plasma |
| RU2125266C1 (en) * | 1996-05-12 | 1999-01-20 | Чувашский государственный университет им.И.Н.Ульянова | Method of determining plasmin fibrinolytic activity in blood |
-
2000
- 2000-12-06 RU RU2000130498/14A patent/RU2195673C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1007004A1 (en) * | 1981-07-31 | 1983-03-23 | Всесоюзный кардиологический научный центр АМН СССР | Lymphatic micro vessel condition investigation method |
| RU2125266C1 (en) * | 1996-05-12 | 1999-01-20 | Чувашский государственный университет им.И.Н.Ульянова | Method of determining plasmin fibrinolytic activity in blood |
| RU2121690C1 (en) * | 1998-01-16 | 1998-11-10 | Общество с ограниченной ответственностью фирма "Технология-Стандарт" | Method of determining plasminogen and plasmin inhibitors levels in blood plasma |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Antithrombin III., Behring E, Berichrom, 1990. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4784944A (en) | Prothrombin time determining reagent and methods of using and preparing the same | |
| Heldebrant et al. | The activation of prothrombin: I. Isolation and preliminary characterization of intermediates | |
| US7118880B2 (en) | Kits for screening for blood coagulation disorders | |
| Abildgaard | Inhibition of the thrombin‐fibrinogen reaction by heparin and purified cofactor | |
| Pangburn et al. | Kinetic and thermodynamic analysis of the control of C3b by the complement regulatory proteins factors H and I | |
| EP0608235B1 (en) | Method for the diagnosis of blood coagulation disorders | |
| US4563420A (en) | Process for assaying the activity of tissue plasminogen activator, and kit suitable for use in said process | |
| JP3533012B2 (en) | Method for detecting protein C / protein S system failure | |
| Vinazzer et al. | Protein C: comparison of different assays in normal and abnormal plasma samples | |
| DK156668B (en) | PROCEDURE FOR QUANTITATIVE DETERMINATION OF BLOOD COAGULATION FACTOR XII IN HUMAN PLASMA | |
| JPH06504682A (en) | Protein S chromogen assay | |
| RU2195673C2 (en) | Method of assay of antithrombin iii activity | |
| US5221614A (en) | Method and reagent for determining the biological activity of antithrombin III by measuring coagulation time | |
| EP1774327A2 (en) | Methods and kits for measuring adamts13/fxi complexes | |
| RU2121690C1 (en) | Method of determining plasminogen and plasmin inhibitors levels in blood plasma | |
| US20210317505A1 (en) | Improved detection of anticoagulants in body fluids | |
| CA2039173C (en) | Factor ix chromogenic assay | |
| US5753510A (en) | Calibrator for use in test methods for detecting a defective coagulation factor V | |
| JP3127263B2 (en) | Part VIII: Ca factor chromogen assay | |
| Carter et al. | Cabbage seed protease inhibitor: a slow, tight-binding inhibitor of trypsin with activity toward thrombin, activated Stuart factor (factor Xa), activated Hageman factor (factor XIIa), and plasmin | |
| Valeri et al. | Reaction of antithrombin with proteases. Evidence for a specific reaction with papain | |
| RU2039983C1 (en) | Method for determining leukocytic elastase activity in plasma | |
| CA2037434A1 (en) | Functional assay for determining the protein s activity | |
| CZ88093A3 (en) | Application of prothrombin fragments | |
| Hatton et al. | The effect of heparin adsorbed on sepharose-lysine on the inactivation of thrombin by anti-thrombin III |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20031207 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent | ||
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20051207 |