RU2193202C1 - Method for predicting alcoholic renal lesion - Google Patents
Method for predicting alcoholic renal lesion Download PDFInfo
- Publication number
- RU2193202C1 RU2193202C1 RU2001125377A RU2001125377A RU2193202C1 RU 2193202 C1 RU2193202 C1 RU 2193202C1 RU 2001125377 A RU2001125377 A RU 2001125377A RU 2001125377 A RU2001125377 A RU 2001125377A RU 2193202 C1 RU2193202 C1 RU 2193202C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- alcoholic
- kidney damage
- patients
- serum
- apov
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 title claims abstract description 18
- 231100001028 renal lesion Toxicity 0.000 title abstract 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 22
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 21
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 claims description 8
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 claims description 7
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 abstract description 19
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 208000007848 Alcoholism Diseases 0.000 description 12
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 12
- 101710095342 Apolipoprotein B Proteins 0.000 description 9
- 102100040202 Apolipoprotein B-100 Human genes 0.000 description 9
- 108010010234 HDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 9
- 102000015779 HDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 9
- BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N Bilirubin Chemical compound N1C(=O)C(C)=C(C=C)\C1=C\C1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(CC2=C(C(C)=C(\C=C/3C(=C(C=C)C(=O)N\3)C)N2)CCC(O)=O)N1 BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N 0.000 description 6
- 108010062497 VLDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 6
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 6
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 208000003343 Antiphospholipid Syndrome Diseases 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 4
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 4
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 101000651298 Homo sapiens TRAF-interacting protein with FHA domain-containing protein A Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102100027651 TRAF-interacting protein with FHA domain-containing protein A Human genes 0.000 description 2
- 206010001584 alcohol abuse Diseases 0.000 description 2
- 208000025746 alcohol use disease Diseases 0.000 description 2
- 239000012568 clinical material Substances 0.000 description 2
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 208000022309 Alcoholic Liver disease Diseases 0.000 description 1
- 102000005666 Apolipoprotein A-I Human genes 0.000 description 1
- 108010059886 Apolipoprotein A-I Proteins 0.000 description 1
- 102000018619 Apolipoproteins A Human genes 0.000 description 1
- 108010027004 Apolipoproteins A Proteins 0.000 description 1
- 102000018655 Apolipoproteins C Human genes 0.000 description 1
- 108010027070 Apolipoproteins C Proteins 0.000 description 1
- 102000013918 Apolipoproteins E Human genes 0.000 description 1
- 108010025628 Apolipoproteins E Proteins 0.000 description 1
- 102000006410 Apoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010083590 Apoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000942 Lactalbumin Proteins 0.000 description 1
- 102000004407 Lactalbumin Human genes 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000002795 fluorescence method Methods 0.000 description 1
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 210000003904 glomerular cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007981 phosphate-citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, нефрологии, конкретно к способам диагностики алкогольного поражения почек. The invention relates to medicine, nephrology, and specifically to methods for diagnosing alcoholic kidney damage.
Известные способы заключаются в диагностике при остром токсическом поражении почек. Known methods are to diagnose acute toxic kidney damage.
К ним относятся рентгенодиагностика, ультразвуковое исследование, непрямая радиоизотопная реноангиография, радиоизотопная ренография I и II варианты, биохимические методы (определение содержания мочевины, креатинина), флюоресцентный метод определения общей концентрации альбумина, метод определения циркулирующих иммунных комплексов. Ферментативный метод определения холестерина и триглицеридов. These include X-ray diagnostics, ultrasound, indirect radioisotope renoangiography, radioisotope renography I and II options, biochemical methods (determination of urea, creatinine), fluorescence method for determining the total concentration of albumin, a method for determining circulating immune complexes. An enzymatic method for the determination of cholesterol and triglycerides.
Результаты, полученные при применении того или иного способа диагностики алкогольного поражения почек, несут только часть информации о патогенетическом процессе, развивающемся в почках при этой патологии, но не могут являться критериями диагностики, не являются специфическими в связи с общностью данных и при других заболеваниях почек неалкогольного генеза, что безусловно снижает их точность и информативность. The results obtained when using this or that method of diagnosing alcoholic kidney damage, carry only part of the information about the pathogenetic process that develops in the kidneys with this pathology, but cannot be diagnostic criteria, they are not specific due to the generality of data and other non-alcoholic kidney diseases genesis, which certainly reduces their accuracy and information content.
Наиболее близким способом диагностики алкогольного поражения почек к предлагаемому является ферментативный способ определения уровня холестерина и триглицеридов, предложенный Никитиным С.В. [6] с соавт. Данный способ применяется у больных хроническим алкоголизмом с нарушениями липидного обмена или клиническими проявлениями антифосфолипидного синдрома (АФС). The closest way to diagnose alcoholic kidney damage to the proposed is an enzymatic method for determining the level of cholesterol and triglycerides, proposed Nikitin S.V. [6] et al. This method is used in patients with chronic alcoholism with impaired lipid metabolism or clinical manifestations of antiphospholipid syndrome (APS).
Для анализа используются сыворотки, полученные в день эксперимента. Концентрацию холестерина (ХС) и липопротеидов высокой плотности (ЛПВП) измеряют на автоанализаторе. Сканирование фракции липопротеидов проводят на денситометре. For analysis, sera obtained on the day of the experiment are used. The concentration of cholesterol (cholesterol) and high density lipoproteins (HDL) is measured on an autoanalyzer. Scanning fractions of lipoproteins is carried out on a densitometer.
Принцип известного способа заключается в осаждении липопротеидов очень низкой плотности (ЛПОНП) и липопротеидов низкой плотности (ЛПНП) в растворах полиэтиленгликоля (ПЭГ). Раствор А использовали для осаждения ЛПОНП и ЛПНП, а раствор В - для осаждения всех классов липопротеидов, оставляя в насадочной жидкости только фракцию липопротеидов высокой плотности - ЛПВП3.The principle of the known method is the deposition of very low density lipoproteins (VLDL) and low density lipoproteins (LDL) in solutions of polyethylene glycol (PEG). Solution A was used to precipitate VLDL and LDL, and solution B was used to precipitate all classes of lipoproteins, leaving only a fraction of high density lipoproteins - HDL 3 in the packed liquid.
При кажущейся простоте указанный способ имеет свои недостатки. Следует отметить особо, что антифосфолипидный синдром (АФС) у больных хроническим алкоголизмом с поражением почек является одним из важнейших звеньев патогенеза алкогольной нефропатии и основанием для развития морфологических изменений, типичных для нее. Антифосфолипидные антитела (АФА), вызывающие повреждения липидного слоя мембраны клеток клубочков почек, взаимосвязаны с аполипопротеином В (АпоВ), по уровню которого в сыворотке крови можно судить о напряженности процесса повреждения почек. With apparent simplicity, this method has its drawbacks. It should be noted especially that antiphospholipid syndrome (APS) in patients with chronic alcoholism with kidney damage is one of the most important links in the pathogenesis of alcoholic nephropathy and the basis for the development of morphological changes typical of it. Antiphospholipid antibodies (AFA), which cause damage to the lipid layer of the membrane of the glomerular cells of the kidneys, are interrelated with apolipoprotein B (ApoB), by the level of which in the blood serum it is possible to judge the intensity of the process of kidney damage.
Поэтому, исходя из вышесказанного, недостатком ферментного метода определения холестерина и триглицеридов является, в первую очередь, то, что данным способом диагностики можно определить только уровень фракций ЛПВП, который присутствует в надосадочной жидкости. Напротив, липопротеиды низкой и очень низкой плотности (ЛПОНП и ЛПНП), в состав которых входит и фракция АпоА, осаждаются. Therefore, based on the foregoing, the disadvantage of the enzyme method for determining cholesterol and triglycerides is, first of all, that this diagnostic method can only determine the level of HDL fractions that are present in the supernatant. In contrast, low and very low density lipoproteins (VLDL and LDL), which also include the ApoA fraction, are precipitated.
Липопротеиды высокой плотности дают информацию об общем состоянии липидного обмена у больных хроническим алкоголизмом и не могут отражать, даже косвенно, состояния поражения почек при алкогольной болезни. Поэтому определение их уровня в крови в таком случае малоинформативно. High density lipoproteins provide information on the general state of lipid metabolism in patients with chronic alcoholism and cannot reflect, even indirectly, the state of kidney damage in alcoholic disease. Therefore, the determination of their level in the blood in this case is uninformative.
Вторым, не менее серьезным недостатком этого способа диагностики является то, что на показатели фракции липопротеидов высокой плотности в сыворотке крови влияет присутствие примесей, в частности билирубина, которые искажают результаты, снижая точность способа. The second, no less serious drawback of this diagnostic method is that the presence of impurities, in particular bilirubin, which distort the results, reducing the accuracy of the method, affects the performance of the high-density lipoprotein fraction in the blood serum.
За норму показателей, определенных данным способом, принимали содержание в сыворотке крови здоровых лиц содержания триглицеридов N - 1,44±0,12 ммоль/л, ЛПВП - 1,12±0,05 ммоль/л, ЛПВП3 - 0,98±0,05 ммоль/л. Что согласуется с данными литературы [1].For the norm of indicators determined by this method, the content of triglycerides N in the blood serum of healthy individuals was 1.44 ± 0.12 mmol / L, HDL - 1.12 ± 0.05 mmol / L, HDL 3 - 0.98 ± 0.05 mmol / L. What is consistent with the literature [1].
При определении указанных показателей у больных хроническим алкоголизмом с поражением почек ни в одном случае не выявлено отклонения от нормальных данных, что еще раз подтверждает малую точность и низкую информативность данного способа диагностики алкогольного поражения почек. When determining these indicators in patients with chronic alcoholism with kidney damage, in no case were deviations from normal data found, which once again confirms the low accuracy and low information content of this method for the diagnosis of alcoholic kidney damage.
Технической задачей, решаемой предлагаемым изобретением, является повышение информативности и точности способа. The technical problem solved by the invention is to increase the information content and accuracy of the method.
Поставленную задачу решают применением нового способа диагностики алкогольного поражения почек, включающего определение уровня липопротеидов и их фракций в сыворотке крови, причем определяют фракции липопротеидов низкой плотности и при увеличении фракции АпоВ более чем на 100% диагностируют алкогольное поражение почек,
Способ осуществляют следующим образом.The problem is solved by the use of a new method for the diagnosis of alcoholic kidney damage, including determining the level of lipoproteins and their fractions in the blood serum, and fractions of low density lipoproteins are determined, and with an increase in the ApoV fraction by more than 100%, alcohol kidney damage is diagnosed,
The method is as follows.
1. Кровь из локтевой вены забирают натощак, в период воздержания от приема алкоголя, который в среднем был равен 22,1 ± 1,2 дня. 1. Blood from the ulnar vein is taken on an empty stomach, during the period of abstinence from drinking alcohol, which on average was 22.1 ± 1.2 days.
2. Отделяют сыворотку. 2. Separate the serum.
3. Очищают сыворотку от примесей:
а) с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии высокого давления (ВЭЖХ) по методу V.Laemmli [2], в процессе которой чистоту полученных белков оценивают с помощью дискового электрофореза в полиакриламидном геле [2] . Первый пик содержит АпоВ, второй - АпоА -I, АпоЕ и третий пик - аполипопротеины С;
б) белок фракции первого пика (АпоВ) используют в качестве антигена для иммунизации кроликов в количестве 100 мкг по схеме Полякова Л.М. [3];
в) γ-глобулиновую фракцию при очистке сыворотки получают троекратным осаждением 50% (NH4)2SО4 с последующим диализом против 0,01 М, фосфатного буфера, при рН 7,4, содержащего 0,15M NaCl и 0,01% NaN3.3. Purify the serum from impurities:
a) using high-performance liquid chromatography high pressure (HPLC) according to the method of V. Laemmli [2], during which the purity of the obtained proteins is evaluated using disk electrophoresis in polyacrylamide gel [2]. The first peak contains ApoB, the second - ApoA-I, ApoE and the third peak - apolipoproteins C;
b) the protein of the first peak fraction (ApoB) is used as an antigen for immunization of rabbits in an amount of 100 μg according to the scheme Polyakov L. [3];
c) the γ-globulin fraction during serum purification is obtained by threefold precipitation of 50% (NH 4 ) 2 SO 4 followed by dialysis against 0.01 M phosphate buffer at pH 7.4 containing 0.15 M NaCl and 0.01% NaN 3 .
4. Конечный этап очистки включает ионообменную хроматографию на ДЭАЭ - сефарозе. Полученные антитела хранят в замороженном виде при температуре 70oC.4. The final purification step involves ion exchange chromatography on DEAE - Sepharose. The resulting antibodies are stored frozen at a temperature of 70 o C.
5. Идентификацию кроличьих антител к АпоВ сыворотки крови человека проводят с помощью двойной радиальной иммунодиффузии по Ouchterlonyo [4]. 5. The identification of rabbit antibodies to ApoV human serum is carried out using double radial immunodiffusion according to Ouchterlonyo [4].
Антитела дают одну полосу преципитации с изолированными ЛПНП и ЛПОНП человека и с сывороткой крови человека. Для установления оптимального разведения антител на планшет сорбируют полученный по схеме Полякова Л.М. [3] антиген в избыточном количестве 1000 мкг в ячейку при температуре 4oС в течение ночи или в течение 1 ч при температуре 37oС. Образцы антител раститровывают при последовательном двукратном разведении буфером, содержащим 0,05% твина-20 и 0,5% бычьего сывороточного альбумина. В наших условиях оптимальное разведение антител составило 1:1000 и 1:2000.Antibodies give one precipitation band with isolated human LDL and VLDL and human serum. To establish the optimal dilution of antibodies on a tablet, the polyakov L.M. [3] an antigen in excess of 1000 μg per cell at 4 ° C overnight or for 1 h at 37 ° C. Antibody samples are triturated by serial dilution twice with a buffer containing 0.05% Tween-20 and 0, 5% bovine serum albumin. In our conditions, the optimal dilution of antibodies was 1: 1000 and 1: 2000.
6. Количество АпоВ в сыворотке крови определяют методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа (тИФА) [1]. 6. The amount of ApoV in blood serum is determined by indirect enzyme-linked immunosorbent assay (TIFA) [1].
Полистироловые планшеты ("Nunc", Дания) инкубируют в течение ночи при температуре 4oС или в течение 1 ч при температуре 37oС со 100 мкл стандартной сыворотки крови человека ("Calbiochem", США), содержащей 1,2,5,10,20,50,100 нг АпоВ в 0,01 М фосфатно-солевом буфере (ФСБ). После инкубации незанятые места сорбции блокируют смесью 2% овальбумина и 0,5% лактальбумина. После каждого этапа связывания планшеты трижды отмывают ФСБ, содержащем твина-20 (ФСБТ). В подготовленные планшеты добавляют по 100 мкл специфических антител в разведении 1:1000 в 0,01 М растворе ФСБТ. Связавшиеся с АпоВ первые антитела на следующем этапе насыщают вторыми антителами. Для этого используют козьи антитела, меченные пероксидазой (Био.С, Новосибирск), которые разбавляют в количестве 100 мкл в каждую ячейку в разведении 1: 2000. Планшеты инкубируют в течение 1 ч при температуре 37oС. После пятикратного отмывания ФСБТ проводят ферментативную реакцию. В ячейки вносят по 200 мкл свежеприготовленного субстрата орто-фенилендиамина ("Serva", ФРГ) в концентрации 20 мг на 100 мл 0,1 М фосфатно-цитратного буфера, рН 5,0, содержащего 0,006% Н2О2. Через 30 мин ферментативную реакцию останавливают добавлением 50 мкл 10н. H2SO4 и измеряют экстинкцию при длине волны λ=492 нм на многоканальном фотометре ("Multisan Flow", Англия). В качестве отрицательного контроля принимают значения оптической плотности в ячейках, в которых вместо антигена добавляют по 100 мкл ФСБ.Polystyrene plates (Nunc, Denmark) were incubated overnight at 4 ° C or for 1 hour at 37 ° C with 100 μl of standard human serum (Calbiochem, USA) containing 1.2.5, 10,20,50,100 ng ApoB in 0.01 M phosphate-buffered saline (PBS). After incubation, unoccupied sorption sites are blocked with a mixture of 2% ovalbumin and 0.5% lactalbumin. After each binding step, the plates are washed three times with FSB containing Tween-20 (FSBT). 100 μl of specific antibodies are added to the prepared plates at a dilution of 1: 1000 in a 0.01 M solution of FSBT. The first antibodies bound to ApoB in the next step are saturated with second antibodies. To do this, use goat antibodies labeled with peroxidase (Bio.S, Novosibirsk), which are diluted in an amount of 100 μl per cell at a dilution of 1: 2000. The plates are incubated for 1 h at a temperature of 37 o C. After washing five times with FSBT, an enzymatic reaction is carried out . 200 μl of a freshly prepared substrate of ortho-phenylenediamine (Serva, Germany) at a concentration of 20 mg per 100 ml of 0.1 M phosphate-citrate buffer, pH 5.0, containing 0.006% H 2 O 2, was added to the wells. After 30 minutes, the enzymatic reaction was stopped by the addition of 50 μl 10n. H 2 SO 4 and measure the extinction at a wavelength of λ = 492 nm on a multichannel photometer ("Multisan Flow", England). As a negative control, the absorbance values in the cells are taken, in which, instead of antigen, 100 μl of FSB are added.
Выбор критериев основан на изучении клинического материала. Было обследовано 96 пациентов, страдающих хроническим алкоголизмом мужчин с признаками алкогольного поражения почек, составивших I основную группу обследования. Средний возраст 38,2±1,1 лет. Давность злоупотребления алкоголем более 10 лет. II группу сравнения составили 72 больных, страдающих хроническим алкоголизмом мужчин без признаков алкогольного поражения почек. Средний возраст 42,0±1,1 года. Давность злоупотребления алкоголем более 10 лет. И III группу составили 54 мужчины, не страдающие хроническим алкоголизмом, но имеющие различные заболевания почек неалкогольного генеза. Средний возраст 51,1±1,2 год. The selection of criteria is based on the study of clinical material. Ninety-six patients with chronic alcoholism in men with signs of alcoholic kidney damage were examined, making up the first main group of examination. The average age is 38.2 ± 1.1 years. The age of alcohol abuse is more than 10 years. The comparison group II consisted of 72 patients suffering from chronic alcoholism in men without signs of alcoholic kidney damage. The average age is 42.0 ± 1.1 years. The age of alcohol abuse is more than 10 years. And the III group consisted of 54 men who do not suffer from chronic alcoholism, but who have various kidney diseases of non-alcoholic origin. The average age is 51.1 ± 1.2 years.
Предложенным способом диагностики (тИФА) определяли содержание АпоВ в сыворотке крови пациентов. За норму этого показателя были приняты данные, полученные у здоровых лиц (n=16). Содержание АпоВ у них равнялось 0,94±0,001 г/л, что соответствовало данным литературы, где доверительный интервал Δ= 0,90-0,72 г/л, а средние результаты у мужчин были 0,83±0,1 г/л. При обследовании было выявлено, что самый высокий показатель содержания АпоВ в сыворотке крови был у пациентов I группы с алкогольным поражением почек и составил в среднем 3,38±0,02 г/л. Что касается уровня АпоВ у больных II и III групп, то он составил 1,16±0,02 г/л и 1,14±0,01 г/л соответственно и достоверно не отличался от показателя у здоровых лиц. The proposed diagnostic method (TIFA) determined the content of ApoV in the blood serum of patients. The data obtained from healthy individuals (n = 16) were taken as the norm of this indicator. The content of ApoV in them was 0.94 ± 0.001 g / l, which corresponded to the literature, where the confidence interval Δ = 0.90-0.72 g / l, and the average results in men were 0.83 ± 0.1 g / l An examination revealed that the highest serum ApoV content was in group I patients with alcoholic kidney damage and averaged 3.38 ± 0.02 g / l. As for the level of ApoV in patients of groups II and III, it was 1.16 ± 0.02 g / l and 1.14 ± 0.01 g / l, respectively, and did not significantly differ from that in healthy individuals.
Показатель уровня АпоВ в I группе был достоверно выше (р<0,05), чем во II группе и у здоровых лиц (р<0,002). В процентом отношении повышение уровня АпоВ в сыворотке крови у больных хроническим алкоголизмом с поражением почек (I основная группа) составило 359,57% или в 3,5 раза по сравнению с нормой. Таким образом, повышение содержания АпоВ у больных I группы относительно нормальных показателей произошло на 259,57%, в то время как содержание АпоВ у пациентов II группы, страдающих хроническим алкоголизмом без поражения почек, повысилось относительно нормы только на 23% и составило 123,4%, а у пациентов III группы - на 21% и составило 121,27%. Следовательно, повышение АпоВ в сыворотке крови у больных хроническим алкоголизмом более чем на 100% можно считать критерием алкогольного поражения почек. The ApoB level in group I was significantly higher (p <0.05) than in group II and in healthy individuals (p <0.002). In percentage terms, an increase in the level of ApoV in blood serum in patients with chronic alcoholism with kidney damage (main group I) was 359.57%, or 3.5 times compared with the norm. Thus, the increase in the content of ApoV in patients of group I relative to normal values occurred by 259.57%, while the content of ApoV in patients of group II suffering from chronic alcoholism without kidney damage increased by only 23% relative to the norm and amounted to 123.4 %, and in patients of group III - by 21% and amounted to 121.27%. Therefore, an increase in serum ApoV in patients with chronic alcoholism by more than 100% can be considered a criterion for alcoholic kidney damage.
На основании клинического материала проведена корреляция с результатами, полученными при применении ферментативного способа определения холестерина и предлагаемого способа непрямого твердофазового иммуноферментного анализа. Выявлено, что при использовании первого способа возникали трудности при заборе крови для исследования. Согласно требованиям способа использовались сыворотки, взятые в день исследования, а это исключало возможность забора крови у большого количества пациентов одновременно. Кроме того, каждый раз для определенного количества проб необходимо было готовить свежие растворы ПЭГ ("А" и "В") и выверять их молекулярную массу, которая должна была находиться в пределах 20 000, что вызывало определенные трудности и увеличивало время исследования. При сканировании на денситометре приходилось делать поправку на наличие в сыворотках билирубина, содержание которого было тем выше, чем выраженнее клинические признаки сопутствующего алкогольного поражения печени. Based on the clinical material, a correlation was made with the results obtained using the enzymatic method for determining cholesterol and the proposed method for indirect enzyme-linked immunosorbent assay. It was revealed that when using the first method there were difficulties in taking blood for research. According to the requirements of the method, serums taken on the day of the study were used, and this excluded the possibility of blood sampling in a large number of patients at the same time. In addition, each time for a certain number of samples, it was necessary to prepare fresh PEG solutions ("A" and "B") and calibrate their molecular weight, which should be within 20,000, which caused certain difficulties and increased the study time. When scanning with a densitometer, it was necessary to correct for the presence of bilirubin in the serum, the content of which was the higher, the more pronounced the clinical signs of concomitant alcoholic liver damage.
Предлагаемый способ диагностики путем непрямого твердофазного иммуноферментного анализа, помимо своей патогенетической обоснованности, являл большую точность полученных результатов по сравнению с предыдущим способом ввиду применения высокоочищенного от примесей билирубина апопротеина В (АпоВ). Кроме того, в процессе исследования применялись стандартные наборы сывороток крови человека, козьи антитела, меченные пероксидазой, стандартный раствор субстрата орто- фенилендиамина и твина-20. Это значительно сокращало время исследования и позволяло одномоментно определить уровень АпоВ в большом количестве проб. The proposed diagnostic method by indirect enzyme-linked immunosorbent assay, in addition to its pathogenetic validity, showed greater accuracy of the results compared to the previous method due to the use of highly purified bilirubin impurities apoprotein B (ApoB). In addition, the study used standard sets of human blood serum, goat antibodies labeled with peroxidase, a standard solution of the substrate of orthophenylenediamine and tween-20. This significantly reduced the study time and made it possible to simultaneously determine the level of ApoV in a large number of samples.
Большим достоинством способа, несомненно, являлось и то, что в результате получали данные об уровне содержания такой узкоспецифичной фракции липопротеидов, как АпоВ, которую получить первым способом было невозможно. Следовательно, и информативность способа непрямого твердофазного иммуноферментного анализа значительно выше. The great advantage of the method, undoubtedly, was that as a result, data were obtained on the level of the content of such a highly specific fraction of lipoproteins as ApoB, which was impossible to obtain with the first method. Therefore, the information content of the method of indirect enzyme-linked immunosorbent assay is much higher.
Преимущества предлагаемого способа диагностики алкогольного поражения почек заключаются в следующем. The advantages of the proposed method for the diagnosis of alcoholic kidney damage are as follows.
1. Возможность дифференцированного подхода к лечебной тактике, назначение более обоснованных, узкоспецифических лечебных препаратов в более ранние сроки, быстрое достижение максимального эффекта лечения, уменьшение количества койко-дней, возможность более точного прогнозирования. 1. The possibility of a differentiated approach to medical tactics, the appointment of more reasonable, highly specific therapeutic drugs at an earlier date, the rapid achievement of the maximum treatment effect, a decrease in the number of hospital days, and the possibility of more accurate prediction.
2. Исследование можно проводить в обычной иммунологической и биохимической лаборатории. 3. Экономическая выгода составляет в среднем 94% по сравнению с внедрением способа-прототипа (54%). 2. The study can be carried out in a conventional immunological and biochemical laboratory. 3. The economic benefit is on average 94% compared with the implementation of the prototype method (54%).
Список литературы
1. Поляков Л.М., Потеряева О.Н., Панин Л.Е. // Лабораторное дело.-1991.- 9.-С.24-27.List of references
1. Polyakov L.M., Poteryaeva O.N., Panin L.E. // Laboratory business.-1991.- 9.-S.24-27.
2. Laemmli V. // Nature.- 1970. Vol.227.- P.680-685. 2. Laemmli V. // Nature.- 1970. Vol.227.- P.680-685.
3. Поляков Л.М., Потеряева О.Н. // Лабораторное дело,- 1990.- 6.-С.11-14. 3. Polyakov L. M., Poteryaeva O. N. // Laboratory, - 1990.- 6.-S.11-14.
4. Ouchterlony О.// Progr. Allergy.- 1958.- Vol.5.-Р. 1-77. 4. Ouchterlony O.// Progr. Allergy.- 1958.- Vol.5.-P. 1-77.
5. Kosther G., Molinari E., Ficher P. // Clin. Chem.- 1979.- Vol.25.- P. 939-942. 5. Kosther G., Molinari E., Ficher P. // Clin. Chem .- 1979.- Vol.25.- P. 939-942.
6. Никитин С. В. , Волков Е.И., Творогова М.Г. и соавт. Сопоставление методов выделения липопротеидов высокой плотности // Клин. лаб. диагностика. - 1992.- 1-2.-С.7-10. 6. Nikitin S. V., Volkov E. I., Tvorogova M. G. et al. Comparison of methods for the isolation of high density lipoproteins // Klin. lab. diagnostics. - 1992.- 1-2.-C.7-10.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2001125377A RU2193202C1 (en) | 2001-09-14 | 2001-09-14 | Method for predicting alcoholic renal lesion |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2001125377A RU2193202C1 (en) | 2001-09-14 | 2001-09-14 | Method for predicting alcoholic renal lesion |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2193202C1 true RU2193202C1 (en) | 2002-11-20 |
Family
ID=20253180
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2001125377A RU2193202C1 (en) | 2001-09-14 | 2001-09-14 | Method for predicting alcoholic renal lesion |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2193202C1 (en) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2092850C1 (en) * | 1991-07-16 | 1997-10-10 | Научно-исследовательский институт психического здоровья Томского научного центра СО РАМН | Method of diagnosis of alcoholism |
-
2001
- 2001-09-14 RU RU2001125377A patent/RU2193202C1/en active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2092850C1 (en) * | 1991-07-16 | 1997-10-10 | Научно-исследовательский институт психического здоровья Томского научного центра СО РАМН | Method of diagnosis of alcoholism |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| БЫКОВА Л.Г. Функциональное состояние почек при хронической алкогольной интоксикации. В: Актуальные вопросы теоретической и практической медицины. - Челябинск, 1993, с.25-26. MALMENDIER CL et al. Plasma levels of apolipoproteins A-I, A-II and В in alcoholism. Relation to the degree of histological liver damage, and to liver function tests. Hepatogastroenterology, 1983, dec, 30(6), p.236-239. * |
| ТАРАСОВА Н.С. Сочетание низкой активности каталазы с активацией перекисного окисления липидов в сыворотке крови при поражении почек у больных хроническим алкоголизмом. - Клиническая медицина, 1998, 76, №9, с.43-44. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hesse et al. | Measurement of apolipoprotein E (apoE) in cerebrospinal fluid | |
| EP3504555B1 (en) | Apolipoprotein f as a biomarker for non-alcoholic fatty liver disease | |
| US5118606A (en) | Methods for detecting cellular pathology by assaying spectrin and spectrin breakdown products | |
| Levitt et al. | A rapid and simple assay to determine if macroamylase is the cause of hyperamylasemia | |
| JP2004530904A (en) | Detection of kidney disease by protein profiling | |
| US20150072360A1 (en) | Biomarkers of pulmonary hypertension | |
| EP0514928B1 (en) | Method of diagnosing renal diseases by detecting albumin fragments | |
| Dzurik et al. | The prevalence of insulin resistance in kidney disease patients before the development of renal failure | |
| JP4751555B2 (en) | Diagnostic assays for stroke | |
| Warshaw et al. | Macroamylasemia and other chronic nonspecific hyperamylasemias: chemical oddities or clinical entities? | |
| NO303852B1 (en) | Procedure for detecting analyte variants, as well as kits for performing the method | |
| AU2019470252A1 (en) | Test strip and method for measuring urine Aβ amyloid protein | |
| Yamada et al. | A rapid method for measuring serum amyloid A protein by latex agglutination nephelometric immunoassay | |
| WO2012146778A2 (en) | Method for indicating a renal disease in a patient | |
| EP0856158B1 (en) | Assay for the diagnosis of dementia | |
| Wai-Hoe et al. | Proteomics and detection of uromodulin in first-time renal calculi patients and recurrent renal calculi patients | |
| Xiao et al. | Human urine proteome: A powerful source for clinical research | |
| US11029314B2 (en) | Methods for diagnosis, differentiation and monitoring using urine proteins as markers in IgA nephropathy | |
| RU2193202C1 (en) | Method for predicting alcoholic renal lesion | |
| US8420331B2 (en) | Type IV collagen-like immunoreactive peptide | |
| US5834214A (en) | Detection of pancreatitis-associated protein for screening for cystic fibrosis | |
| KR102319190B1 (en) | Biomarkers for predicting prognosis of kidney disease | |
| JP3998245B2 (en) | Method and kit for measuring oxidized apolipoprotein AI and oxidized lipoprotein containing the same | |
| Lorton et al. | Procalcitonin serum levels in children undergoing chronic haemodialysis | |
| FUKUI et al. | Plasma endotoxin concentration and endotoxin binding capacity of plasma acute phase proteins in cirrhotics with variceal bleeding: an analysis by new methods |